RELATÓRIO DE PÓS-DOUTORADO FINAL Flávia Yoshie Yamamoto Avaliação da toxicidade dos poluentes presentes no Rio Doce após rompimento da barragem do Fundão (MG) através de diferentes biomarcadores em peixes Relatório de Pós-doutorado realizado pela Universidade Estadural Paulista (UNESP), Instituto de Biociências do Campus do Litoral Paulista - São Vicente Supervisor: Denis Moledo de Souza Abessa Supervisor BEPE: Romà Tauler (IDAEA – CSIC) Agência de formento – FAPESP -Número do Processo: 2016/15229-1 Período de vigência: 01/09/2018 a 27/01/2023 São Vicente, 2023 EQUIPE COLABORADORA DA PESQUISA Coleta e identificação das espécies de peixes do Rio Doce1  Tiago Cesarim Pessali – Museu de Ciências Naturais da PUC Minas (MG) Análises químicas  Msc. Guacira Eufrásio – UNESP CLP (NEPEA)  Prof. Rubens Cesar Lopes Figueira – USP (Instituto Oceanográfico)  Msc. Mayara Padovan dos Santos – UFPR (Grupo de Química Ambiental)  Prof. Marco Tadeu Grassi - UFPR (Grupo de Química Ambiental)  Dra. Gabrielle Melo Fernandes– UFC (Instituto de Ciências do Mar)  Msc. Lorena Sampaio Nascimento– UFC (Instituto de Ciências do Mar) Prof. Rivelino Martins Cavalcante – UFC (Instituto de Ciências do Mar) Análises bioquímicas  Kaori Onishi – UNESP CLP (NEPEA)  Isabella Beverari – UNESP CLP (NEPEA)  Thaisa Ralha Rodrigues – UNESP CLP (NEPEA) Análises Histológicas  Msc. Cláudia Neves Correa – UNESP CLP (Laboratório de Morfologia Animal)  Kaori Onishi – UNESP CLP (NEPEA)  Msc. Gabriela P. Marinsek – UNESP CLP (Laboratório de Morfologia Animal)  Prof. Ciro Alberto de Oliveira Ribeiro – UFPR (Laboratório de Toxicologia Celular)  Prof. Cláudia Feijó Ortolani-Machado – UFPR (Laboratório de Toxicologia Celular)  Msc. Larissa A. Batista – UFPR (Laboratório de Reprodução e Comunidade de Peixes)  Prof. Dr. Luís F. Fávaro – UFPR (Laboratório de Reprodução e Comunidade de Peixes) Análises Moleculares  Prof. Ciro Alberto de Oliveira Ribeiro – UFPR (Laboratório de Toxicologia Celular)  Prof. Katherine M. Spercoski – UFPR (Laboratório de Fisiologia da Reprodução) Análises de genotoxicidade  Dra. Laís Fernanda Oya Silva – UFPR (Laboratório de Citogenética Animal e Mutagênese Ambiental) Análises de embriotoxicidade  Prof. Juan Ramon Esquivel Garcia – Unisul e piscicultura Panamá  Msc Vinicius C. S. de Paula – UTFPR (Laboratório de Ecotoxicologia UTFPR)  Msc. Angie Thaisa Costa Souza – UFPR (Modelagem Matemática) Análises Estatísticas Multivariadas, Análise Quimiométrica e Metabolômica  Prof. André Andian Padial UFPR (Departamento de Ecologia e Conservação)  Prof. Roma F. Tauler – IDAEA (Barcelona, Espanha)  Profa. Silvia Lacorte Bruguera – IDAEA (Barcelona, Espanha)  Dra. Carmen Bedia Girbés – IDAEA (Barcelona, Espanha)  Dra. Ana Lópes Antia – IDAEA (Barcelona, Espanha)  Msc. Carlos Pérez-López– IDAEA (Barcelona, Espanha) 1 Participação nas coletas: Matheus Mascarin, Gabriel.M. Alves, Guilherme.F. Guerra, Beatriz. Moreno, Giam.L. Altafim, Ana.M. Schafaschek, Kaori Onishi, José.F.S. Abreu (APARD Association) RESUMO DO PROJETO INICIAL Durante várias décadas as atividades de mineração no Brasil, particularmente na Região do Quadrilátero Ferrífero, são responsáveis por causar impacto ambiental com a geração de resíduos de minérios que acabam sendo destinados aos corpos hídricos. Com o desastre ambiental do rompimento da barragem do Fundão (MG) milhões de litros de rejeitos de minérios de ferro foram mobilizados à bacia do Rio Doce, gerando um grande prejuízo socioeconômico e ambiental. Análises químicas na água já detectaram ao longo do percurso do rio elevadas concentrações de elementos como Fe, Al, Mn, e os de maior potencial tóxico como As, Cd e Pb após o acidente. Porém, ainda restam ser investigadas a presença e a distribuição destes poluentes, bem como a possível ocorrência de contaminantes orgânicos, em diferentes compartimentos ambientais, como o sedimento e os organismos expostos. Além disso, são necessárias outras análises que considerem os efeitos toxicológicos causados nos organismos expostos a curto, médio e longo prazo. Desta forma, os reais danos socioambientais causados devem ser avaliados adequadamente através de diversas abordagens que investiguem tanto os aspectos abióticos como os bióticos deste ecossistema. Este projeto tem como objetivo avaliar a qualidade ambiental após o acidente, por meio da detecção e quantificação dos poluentes (metais e compostos orgânicos) presentes nos compartimentos abióticos (água e sedimento) e bióticos (tecidos dos peixes), associados às diferentes respostas biológicas desencadeadas nos peixes nativos da bacia do Rio Doce, modelos animais adequados para este estudo, em fase adulta para: i) avaliar a saúde geral dos peixes em diferentes locais e períodos de coleta; ii) verificar os principais mecanismos de defesa e de adaptação ativados nos peixes, após exposição aguda aos compostos tóxicos; iii) avaliar possíveis alterações nos processos reprodutivos dos peixes; e nas fases iniciais do desenvolvimento: iv) verificar a embriotoxicidade e v) desenvolver um modelo matemático que permita prever os efeitos em níveis populacionais a longo prazo. Com estes resultados será possível avaliar de forma mais adequada os efeitos adversos causados na ictiofauna deste ambiente impactado para auxiliar nas tomadas de decisões das autoridades públicas. INTRODUÇÃO Este Relatório Científico Final contempla todas as atividades desenvolvidas durante todo o período de vigência da bolsa (01/09/2018 a 27/01/2023), incluindo o BEPE, sendo apresentadas as informações referentes aos Relatórios Parciais I e II (01/09/2018 a 31/07/2021), já avaliados pela Assessoria Científica da FAPESP, juntamente com as atividades realizadas no último período (01/08/2021 a 27/01/2023). Inicialmente, todas as atividades realizadas foram listadas resumidamente, sendo posteriormente descritas em maiores detalhes nos seus respectivos anexos. Também são fornecidos esquemas metodológicos de todas as análises realizadas durante o pós- doutorado para suas respectivas publicações concluídas ou em andamento, a fim de facilitar a compreensão dos trabalhos desenvolvidos. As atividades foram apresentadas conforme a seguinte ordem: 1. Listagem das atividades realizadas em todo o Período do pós-doutorado (pág. 5- 12), incluindo palestras e participações em eventos científicos, orientações/coo- rientações de alunos, revisões de artigos e participação de bancas, e a listagem das publicações; 2. Esquemas metodológicos representativos de todas as análises realizadas durante o pós-doutorado, referentes a cada publicação (concluídas ou em andamento, pág. 13), e a conclusão das atividades desenvolvidas durante o pós-doutorado; 3. ANEXO I – Informações detalhadas referentes aos Relatórios Parciais I e II; 4. ANEXO II - Publicações resultantes do auxílio da FAPESP, referentes a todos os períodos; 5. ANEXO III – Relatório da BEPE e das atividades do Plano de transferência do conhecimento adquirido no exterior. Realizações durante todo o período do pós-doutorado (01/09/2018 a 27/09/2023): Palestras em eventos científicos2 Data Evento Trabalho apresentado/publicado Agradeciment o FAPESP 11/2020 III Simpósio de Zoologia de Vertebrados Neotropicais Efeitos tóxicos sobre a ictiofauna associados à contaminação por rejeitos da barragem do fundão no rio doce SIM 08/2020 I SEMANA DA BIOLOGIA UNINTER Estudo da poluição das águas em bacias hidrográficas brasileiras SIM Disciplina Desastres ambientais: a utilização de organismos como ferramenta de avaliação (UNISANTA) Efeitos tóxicos sobre a ictiofauna associados à contaminação por rejeitos da barragem do fundão no rio doce SIM 11/2021 XVII Semana de Biologia Marinha e do Gerenciamento Costeiro Avaliação da toxicidade dos poluentes presentes no Rio Doce após rompimento da barragem do Fundão (MG) através de diferentes biomarcadores em peixes SIM 02/2022 IDAEA Weekly Seminars Exploring chemical and biological data to understand the impacts of the pollutants in the Doce River, Brazil, after the mining dam collapse SIM 11- 13/04/202 3* 72ª Reunião Ordinária da CT-Bio - Belo Horizonte/MG. Avaliação da toxicidade dos poluentes presentes no Rio Doce após rompimento da barragem do Fundão (MG) através de diferentes biomarcadores em peixes (oral) SIM * Evento futuro, convite para apresentação no ANEXO 1 Participação em eventos científicos2 Data Evento Trabalho apresentado/publicado Reserva Técnica FAPESP 09/2018 XV Congresso Brasileiro de Ecotoxicologia (Aracaju, SE) - NACIONAL Avaliação de efeitos transgeracionais de triclosan e triclocarban em concentrações ambientais para D. magna; Avaliação da ecotoxicidade crônica dos fotoprotetores NÃO 2 Cópias dos certificados no ANEXO II octocrileno e 2-etilhexil-4- metoxicinamato em Daphnia magna 10/2018 Workshop - Sustainable Water Management in Mining and Post- Mining (Belo Horizonte, MG)# - INTERNACIONAL Policy paper: A new vision of sustainable management in mining and post-mining landscapes NÃO Data Evento Trabalho apresentado/publicado RT 11/2018 Workshop – Dia D do Rio Doce (Ouro Preto, MG) - NACIONAL NÃO 06/2019 Fundao Dam Science Meeting (SETAC) - INTERNACIONAL (Brazília, DF) Deformities in fish embryos exposed to the elutriate from the Doce River during initial stages of development SIM 16-19/ 09/2021 XVI Congresso Brasileiro de Ecotoxicologia - NACIONAL (ECOTOX, Online) Combination of multiple chronic contamination sources and a major environmental disaster explain the levels of hazardous inorganic and organic chemicals in the Doce River (Minas Gerais, Brazil) SIM 26-29/ 09/2021 Setac Latin America 14th Biennial Meeting (Valdivia, Chile/ Online) - INTERNACIONAL Earlier biomarkers in fish evidencing stress responses and tolerance to metal and organic pollution along the Doce River Basin SIM 29/11- 02/12/2021 9th Ibero-American Congress on Contamination and Environmental Toxicology (Blumenau, SC/ Online) - INTERNACIONAL From molecular endpoints to modeling longer-term effects in fish embryos exposed to the elutriate from Doce River SIM 15-19/ 05/2022 SETAC Europe 32nd Annual Meeting (Copenhagen, DE) - INTERNACIONAL Exploring chemical and biological data to understand the impacts of the pollutants in the Doce river, Brazil, after the mining dam collapse (Poster) SIM 10-11/ 10/2022 18th Annual Workshop On Emerging High-Resolution Mass Spectrometry (HRMS) And LC- MS/MS Applications In Environmental Analysis And Food Safety (Barcelona, ES) - INTERNACIONAL LC-HRMS-based metabolomics as a powerful approach to elucidate mechanisms of action of environmental chemicals from Doce River in brazilian fish embryos (Poster) NÃO # Evento financiado pela Academia Brasileira de Ciências, concedido aos pesquisadores selecionados pela Instituição, com a publicação de um Science Policy Report. https://europe2022.setac.org/ https://europe2022.setac.org/ https://europe2022.setac.org/ https://europe2022.setac.org/ Orientações concluídas: Trabalho de conclusão de curso de graduação 1. Thaisa Ralha Rodrigues. Avaliação dos danos em macromoléculas dos peixes do Rio Doce através de biomarcadores bioquímicos. 2019. Trabalho de Conclusão de Curso. (Graduação em Ciências Biológicas) - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. Orientador: Flávia Yoshie Yamamoto. Co-orientações concluídas: Trabalho de conclusão de curso de graduação 2. Kaori Onishi. Avaliação da hepatotoxicidade dos poluentes do rio doce através das análises histopatológicas no fígado dos peixes. 2021. Trabalho de Conclusão de Curso. (Graduação em Ciências Biológicas) - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. Orientador: Denis M.S. Abessa Dissertação de mestrado 1. Monike Felipe Gomes. Avaliação da ecotoxicidade, genotoxicidade e de biomarcadores bioquímicos do Triclosan antes e após fotólise (2017-2019). Dissertação (Mestrado profissional em Ciência e Tecnologia Ambiental) - Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior. (Coorientador). 2. Vinicius de Carvalho Soares de Paula. Avaliação da ecotoxicidade e genotoxicidade de filtros UV em microcrustáceos dulcícolas e marinhos. (2017-2019). Dissertação (Mestrado profissional em Ciência e Tecnologia Ambiental) - Universidade Tecnológica Federal do Paraná. (Coorientador). Tese de doutorado Tobias Pereira de Morais. Avaliação da qualidade da água e detecção de desreguladores endócrinos do reservatório de Salto Segredo/Rio Iguaçu/PR. Início: 2018. Tese (Doutorado em Ecologia e Conservação) - Universidade Federal do Paraná, Companhia Paranaense de Energia. (Coorientador). Co-orientações em andamento: Tese de doutorado 1. Larissa Ajala Batista. Avaliação da bioacumulação de contaminantes ambientais e da desregulação endócrina em peixes do Rio Doce após o rompimento da barragem do Fundão, Minas Gerais. Início: 2020. Tese (Doutorado em Zoologia) - Universidade Federal do Paraná, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior. (Coorientador). 2. Ana Marta Schafaschek. Exposição de imaturos de Chironomus sancticaroli (Diptera: Chironomidae) a substrato de rejeito de mineração. Início: 2019. Tese (Doutorado em Zoologia) - Universidade Federal do Paraná, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico. (Coorientador). Participação em bancas de trabalhos de conclusão Mestrado 1. Participação em banca de Hilda Vanessa Poquioma Hernandez. Biochemical effects of 2,4-D in animals: A Meta-analytic review and an in vivo study through throphic route. 2020. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade Tecnológica Federal do Paraná. 2. Participação em banca de Natana Raquel Zuanazzi. Toxicity of 2,4-D herbicide: scientometric review and cronic bioassay in Rhamdia quelen (Siluriformes: Heptapteridae). 2020. Dissertação (Mestrado em Agroecossistemas) - Universidade Tecnológica Federal do Paraná. 3. Participação em banca de Qualificação (Mestrado em Biotecnologia) Aluna: Marina Wust Vasconcelos Título: Análise da Toxicidade Aguda e Subcrônica do Efluente Têxtil, 2020. - Universidade Tecnológica Federal do Paraná. 4. Participação em banca de Marina Wust Vasconcelos. Título: Textile effluent toxicity: a scientometric review and bioassay on bioindicators, 2021. Mestrado em Biotecnologia, Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Revisor de periódico Data Periódico 09/2018 Scientific Reports 02/2020 Marine and Freshwater Research 02/2020 Regional Studies in Marine Science 08/2020 Environmental Research 05/2021 Journal of Environmental Science and Health, Part A 01/2021 Environmental Science and Pollution Research 05/2022 Aquatic toxicology 08/2022 Science of the Total Environment 02/2023 Integrated Environmental Assessment and Management (Online) Lista de Publicações3 As atividades realizadas e os resultados obtidos durante todo o período do pós- doutorado possibilitarão a publicação de pelo menos 8 artigos de primeira autoria, resultantes do auxílio da FAPESP. Referentes às realizações do último período, foram publicados 3 artigos em revistas indexadas (Elsevier), sendo 2 de acesso aberto. Outro artigo (4º) se encontra no processo de ressubmissão após modificações (“major review”) solicitadas pelo editor. Um último artigo (5º) das atividades desenvolvidas no país encontra-se em fase de elaboração, com todas as análises concluídas. Com relação aos trabalhos realizados no exterior, dois artigos (6º e 7º) se encontram em fase final de elaboração (um deles com uma rodada de revisão do supervisor concluída) e um último (8º) em fase inicial de elaboração, mas também com as análises concluídas. Presume-se que ao menos 4 outras publicações em coautoria diretamente relacionadas a este trabalho serão obtidas brevemente (1 já aceito, outras 3 em fase inicial de elaboração com as análises concluídas). Mesmo não resultantes do auxílio da FAPESP, outras 5 publicações em coautoria, com o reconhecimento da bolsa da FAPESP, foram obtidas desde o início da vigência da bolsa. 3 Cópias dos trabalhos publicados nos ANEXOS II (apenas as primeiras páginas dos trabalhos como co- autora), III (trabalhos completos publicados, primeira autoria) e IV (trabalho completo submetido, primeira autoria) Por fim, não menos relevante, destaca-se a oportunidade de extensão do conhecimento adquirido através da apresentação dos resultados obtidos, entre os dias 12 e 13 de Abril de 2023, para a Câmara técnica de Biodiversidade (CT-Bio), parte integrante do Comitê Interfederativo presidido pelo Ibama e representantes da União, a qual objetiva avaliar os estudos dos impactos provocados pelo rompimento da barragem do Fundão. Após a apresentação em Belo Horizonte, será realizada uma outra apresentação para os pescadores do Rio Doce, no município de Rio Doce, a convite do pescador Marcinho, integrante do CT-Bio. - Primeira autoria Artigos publicados resultantes do auxílio da FAPESP 1. From molecular endpoints to modeling longer-term effects in fish embryos exposed to the elutriate from Doce River. Science of the Total Environment 846, 157332, 2022. Yamamoto, Flávia Yoshie, Souza, A.T.C., Paula, V. de C.S. de, Beverari, I., Garcia, J.R.E., Padial, A.A., de Souza Abessa, D.M. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2022.157332 2. Chemical data of contaminants in water and sediments from the Doce River four years after the mining dam collapse disaster. Data in Brief 45, 108715, 2022. Yamamoto, F.Y., Pauly, G.E., Nascimento, L.S., Fernandes, G.M., Santos, M.P., Kim, B.S.M., Carvalho, M.U., Figueira, R.C.L., Cavalcante, R.M., Grassi, M.T., Abessa, D.M.S. https://doi.org/10.1016/J.DIB.2022.108715 3. Explaining the persistence of hazardous chemicals in the Doce River (Brazil) by multiple sources of contamination and a major environmental disaster. Journal of Hazardous Materials Advances 9, 100250, 2023. Yamamoto, F.Y., Pauly, G.F.E., Nascimento, L.S., Fernandes, G.M., Santos, M.P., Figueira, R.C.L., Cavalcante, R.M., Grassi, M.T., Abessa, D.M.S. https://doi.org/10.1016/J.HAZADV.2023.100250 4. Earlier biomarkers in fish evidencing stress responses to metal and organic pollution along the Doce River Basin. Environmental Pollution, 329, 121720, 2023. Yamamoto, F.Y., Onishi, K., Ralha, T. R., Silva, L.F.O., Deda, B. Pessali, T.Y. C., Souza, C., Oliveira Ribeiro., C.A., Abessa, D.M.S. https://doi.org/10.1016/j.envpol.2023.121720 5. Linking MS1 and MS2 signals in positive and negative modes of LC-HRMS in untargeted metabolomics using the ROIMCR approach. Analytical and Bionalytical Chemistry, 415(25):6213-6225, 2023. Flávia Yoshie Yamamoto, Carlos Pérez-López, Ana Lópes Antia, Silvia Lacorte, Denis Moledo de Souza Abessa, Romà Tauler https://doi.org/10.1007/s00216-023-04893-3 Trabalhos em fase de preparação resultantes do auxílio da FAPESP https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2022.157332 https://doi.org/10.1016/J.DIB.2022.108715 https://doi.org/10.1016/J.HAZADV.2023.100250 https://www.sciencedirect.com/journal/environmental-pollution/vol/329/suppl/C https://doi.org/10.1016/j.envpol.2023.121720 https://doi.org/10.1007/s00216-023-04893-3 6. Endocrine disruption and histopathology in fish from Doce River as relevant endpoints of ecological disturbance Revista a ser submetida: Chemosphere Co-Authors: Yamamoto, F.Y., Ajala, L.B., Ortolani Machado, C.F.; Oliveira Ribeiro., C.A.b, Favaro, L.F.;Abessa, D. M. S. Artigos em fase final de elaboração resultantes do auxílio da FAPESP (primeira autoria, BEPE)4: 7. Metabolomics as a powerful approach to elucidate mechanisms of action of environmental complex mixtures from Doce River in brazilian fish embryos (first draft written, incomplete version missing conclusion of discussion) – to be submitted in Environmental Science and Technology Journal Flávia Yoshie Yamamotoab, Larissa Ajala Batistac, Mayara Padovan Santosd, Carmen Bedia Girbésa, Silvia Lacorte Brugueraa, Marcos Tadeu Grassid, Denis Moledo de Souza Abessab, Romà Taulera Fase inicial de elaboração: 8. Simultaneous detection and identification of multiple metabolites standards as powerful biomarkers in targeted and untargeted metabolomics (data analysis complete, draft not written Flávia Yoshie Yamamotoab & Ana Lópes Antiaa, Bernat Oró-Nollaa, Silvia Lacortea, Denis Moledo de Souza Abessab, Romà Taulera - Co-autoria Artigos publicados (resultantes do auxílio da FAPESP): 1. Spatial-temporal variations of inorganic contaminants in the sediments from doce river and their bioaccumulation in Corbicula fluminea Revista: Integrated Environmental Assessment Authors: Pauly, Guacira; Cruz, Ana; Trevizani, Tailisi; Kim, Bianca Sung Mi; Perina, Fernando; Yamamoto, Flavia; Figueira, Rubens; Abessa, Denis Moledo de Souza Artigos publicados (não resultantes do auxílio da FAPESP, mas com reconhecimento da bolsa): 1. Ecotoxicity of losartan potassium in aquatic organisms of different trophic levels. Reque, R., Carneiro, R. D., Yamamoto, F. Y., Ramsdorf, W. A., Martins, L. R., Guiloski, I. C., & de Freitas, A. M. (2021). Environmental Toxicology and Pharmacology, 87, 103727. https://doi.org/10.1016/J.ETAP.2021.103727 2. Levels, source appointment, and ecological risk of petroleum hydrocarbons in tropical coastal ecosystems (northeast Brazil): Baseline for future monitoring programmes of an oil spill area. Fernandes, G. M., Martins, D. A., dos Santos, R. P., de Santiago, I. S., Nascimento, L. S., Oliveira, A. H. B., Yamamoto, F. Y., & Cavalcante, R. M. (2022). 4 Trabalhos preparados como primeira autora no ANEXO V https://doi.org/10.1016/J.ETAP.2021.103727 Environmental Pollution, 296(July 2021). https://doi.org/10.1016/j.envpol.2021.118709 3. Acute toxicity characterization of organic UV-filters and chronic exposure revealing multigenerational effects in DAPHNIA MAGNA. Ecotoxicology, 31(9), 1413–1425. https://doi.org/10.1007/S10646-022-02598-4/FIGURES/1 de Paula, V. de C. S., Gomes, M. F., Martins, L. R. R., Yamamoto, F. Y., & de Freitas, A. M. (2022). 4. Sublethal effects of the herbicides atrazine and glyphosate at environmentally relevant concentrations on South American catfish (Rhamdia quelen) embryos. Environmental Toxicology and Pharmacology, 98, 104057. Bordin, E. R., Yamamoto, F. Y., Mannes, Y., Munhoz, R. C., Muelbert, J. R. E., de Freitas, A. M., Cestari, M. M., & Ramsdorf, W. A. (2023). https://doi.org/10.1016/J.ETAP.2022.104057 5. Sublethal effects of triclosan and triclocarban at environmental concentrations in silver catfish (Rhamdia quelen) embryos. Chemosphere, 263, 127985. Gomes, M. F., de Carvalho Soares de Paula, V., Rocha Martins, L. R., Esquivel Garcia, J. R., Yamamoto, F. Y., & Martins de Freitas, A. (2021). https://doi.org/10.1016/J.CHEMOSPHERE.2020.127985 Sem o reconhecimento da bolsa FAPESP 1. Science Policy Report: A new vision of sustainable management in mining and post- mining landscapes, 2019. ISBN: 978-3-8047-4026-6 Trabalhos como co-autora, em fase de preparação resultantes do auxílio da FAPESP5 Alunas de doutorado sob co-orientação: - Ana Marta Schafaschek 1. Impacts from multiple sources of pollution on Chironomids exposed to sediments of the Doce river basin 2. Changes in biochemical and molecular endpoints in Chironomus sancticaroli exposed to sediments of the Doce river basin - Larissa Ajala Batista 3. A pretty kettle of fish: bioaccumulation of metallic and organic contaminants in fishes from the Doce River Basin following the worst technological disaster of the world's mining industry 5 Resumo dos resultados obtidos pelos alunos sob co-orientação apresentados no ANEXO VI https://doi.org/10.1016/j.envpol.2021.118709 https://doi.org/10.1007/S10646-022-02598-4/FIGURES/1 https://doi.org/10.1016/J.ETAP.2022.104057 https://doi.org/10.1016/J.CHEMOSPHERE.2020.127985 Esquemas representativos de todas as análises realizadas durante o pós-doutorado: Artigo 1 - Chemical data of contaminants in water and sediments from the Doce River four years after the mining dam collapse disaster. Artigo 2 - Explaining the persistence of hazardous chemicals in the Doce River (Brazil) by multiple sources of contamination and a major environmental disaster Figura 1. Esquema representativo das análises realizadas para o primeiro e segundo artigos. Conforme o esquema acima apresentado, este trabalho publicado descreve sobre as análises dos contaminantes inorgânicos e orgânicos detectados na água e sedimentos da Bacia do Rio Doce. Toda a organização das coletas (quatro campanhas em 2019; preparo do material e organização da logística), bem como parte dos procedimentos de extração das amostras (orgânicos/água, inorgânicos/sedimento) foram realizados na Instituição Sede (UNESP-CLP). Os resultados foram obtidos através de parcerias com os grupos de pesquisa coordenados pelos: Prof. Rubens Cesar Lopes Figueira – USP (Instituto Oceanográfico), Prof. Marco Tadeu Grassi - UFPR (Grupo de Química Ambiental) e Prof. Rivelino Martins Cavalcante – UFC (Instituto de Ciências do Mar). Artigo 3 - From molecular endpoints to modeling longer-term effects in fish embryos exposed to the elutriate from Doce River Figura 2. Esquema representativo das análises realizadas para o terceiro artigo. Este artigo referente ao teste de toxicidade com embriões de peixes nativos expostos aos elutriatos do Rio Doce foi publicado na Revista Science of the Total Environment após convite para submissão com a apresentação dos resultados no Congresso Internacional 9th Ibero-American Congress on Contamination and Environmental Toxicology. Uma vez que os embriões de jundiás foram obtidos na Piscicultura Panamá6 (Paulo Lopes, SC, parceria com o professor Juan R.E. Garcia – Unisul), o experimento foi realizado na UTFPR (duração de 1 semana), para evitar um maior tempo de deslocamento, e as amostras obtidas foram transportadas congeladas e analisadas na Instituição sede (UNESP-CLP). O desenvolvimento do modelo matemático foi realizado em parceria com a aluna Msc. Angie Thaisa Costa Souza (UFPR) (Modelagem Matemática) e as análises multivariadas através da colaboração do Prof. André A. Padial (UFPR). 6 Foram realizadas buscas de outras pisciculturas no Estado de São Paulo que pudessem fornecer os embriões de jundiás, porém não houve sucesso na pesquisa. Artigo 4 - Earlier biomarkers in fish evidencing stress responses to metal and organic pollution along the Doce River Basin Figura 3. Esquema representativo das análises realizadas para o quarto artigo. Em azul estão indicadas as análises concluídas e em laranja as análises que não puderam ser finalizadas. Para este artigo foram realizadas análises de biomarcadores bioquímicos em diferentes órgãos dos peixes coletados no Rio Doce, correlacionados com a presença dos poluentes detectados na água e sedimentos do rio. Todas as análises bioquímicas foram realizadas na Instituição sede com o auxílio de três alunas de Iniciação científica (Kaori Onishi, Isabella Beverari e Thaisa R. Rodrigues) do curso de Ciências Biológicas da UNESP-CLP. A análise da expressão da metalotioneína foi realizada na UFPR com o auxílio do Dr. Claudemir Souza e colaboração com o Prof. Ciro A.O. Ribeiro. Por fim as análises de genotoxicidade foram conduzidas pela Dra. Laís Oya da UFPR. Artigo 5 - Endocrine disruption and histopathology in fish from Doce River as endpoints of greater ecological relevance Figura 4. Esquema representativo das análises realizadas para o quinto artigo Para este artigo objetivou-se descrever os efeitos nos peixes, dos poluentes presentes no Rio Doce, através de biomarcadores de maiores níveis de organização biológica (maior relevância ambiental) do que os apresentados no artigo 4. Análises multivariadas foram utilizadas para integrar os dados dos biomarcadores deste estudo (desregulação endócrina e a histologia) com os dados químicos reportados nos artigos 1 e 2, e provavelmente serão realizados também com os dados de bioacumulação (doutorado da aluna Larissa Batista). Parte das análises histológicas do fígado foram realizadas pela aluna de IC Kaori Onishi (bolsista Fapesp) e outra parte em parceria com Msc. Cláudia Neves Correa e Gabriela Pustiglione Marinsek, realizadas na Instituição Sede (UNESP-CLP). A análise de microscopia eletrônica de varredura foi realizada no Centro de Microscopia Eletrônica da UFPR através de uma parceria com a Prof. Cláudia Feijó Ortolani- Machado. Por fim, a análise da histologia das gônadas foi conduzida pela aluna Msc. Larissa Ajala Batista sob supervisão do Prof. Dr. Luís F. Fávaro – UFPR (Laboratório de Reprodução e Comunidade de Peixes). Referente a outras colaborações e co-orientações com auxílio da Fapesp, serão publicados artigos: com os dados de bioacumulação dos peixes coletados, pela aluna Larissa Batista (UFPR); com dados de biomarcadores de Chironomidae expostos ao sedimento do Rio Doce pela aluna Ana Schafaschek (UFPR); com os dados dos testes de toxicidade com sedimento e águas do Rio Doce pela aluna Guacira Pauly. Trabalhos resultantes do estágio desenvolvido no exterior (BEPE) Artigo 6. Linking MS1 and MS2 signals in positive and negative modes of LC-HRMS in untargeted metabolomics using the ROIMCR approach Figura 5. Fluxo de trabalho da análise ROIMCR para a identificação de aminoácidos em solução padrão ou amostras de embriões de peixe, através de conjuntos de dados arranjados de modos de ionização positivos e negativos. Para cada modo de aquisição, os conjuntos de dados MS1 e MS2 também são combinados para facilitar a identificação dos recursos. Artigo 7. Metabolomics as a powerful approach to elucidate mechanisms of action of environmental complex mixtures from Doce River in brazilian fish embryos Figura 6. Fluxo de trabalho da abordagem metabolômica baseada em LC-HRMS combinada com ROIMCR para a análise de dados na identificação dos principais metabólitos alterados em amostras de embriões de peixes após exposição a diferentes misturas de contaminantes inorgânicos e orgânicos (isolados e combinados) presentes no Rio Doce. As misturas de contaminantes nos grupos de tratamento foram selecionadas de acordo com as fontes de poluição presentes ao longo do rio Doce e considerando as concentrações ambientais relevantes desses produtos químicos. Além do método de Resolução de Curva Multivariada, outras análises multivariadas foram aplicadas para observar as diferenças nos padrões de regulação dos metabólitos sob distintas condições de exposição química. Artigo 8. Simultaneous detection and identification of multiple metabolites standards as powerful biomarkers in targeted and untargeted metabolomics Figura 7. Diferentes misturas de metabólitos padrões foram selecionadas para serem usadas como poderosos biomarcadores em metabolômica direcionada e não direcionada. Seis misturas diferentes foram preparadas para abordar metabólitos de aminoácidos (1), nucleosídeos (2), ácidos orgânicos (3), outros metabólitos polares (4), hormônios lipídicos e outros metabólitos hidrofóbicos (5) e uma mistura de surrogates e padrões internos. Adicionalmente, foi realizada uma mistura big mix contendo um total de 95 compostos com a combinação de todas as 6 misturas, diluídas em diferentes concentrações para obtenção de uma curva padrão para sua quantificação na abordagem alvo. Conclusão das atividades realizadas durante todo o pós-doutorado De forma geral, é possível observar que os objetivos propostos inicialmente no Projeto foram alcançados com sucesso: i) Realização de análises químicas de contaminantes inorgânicos e orgânicos presentes na água, sedimentos e tecidos dos peixes; ii) Avaliação da saúde geral de diferentes espécies de peixes adultos coletados no Rio Doce, através do uso de múltiplos biomarcadores de diferentes níveis de organização biológica; iii) Avaliação dos efeitos tóxicos dos poluentes do Rio Doce nos estágios iniciais do desenvolvimento em embriões de jundiás e a aplicação do modelo matemático para simulação dos efeitos a longo prazo. Além disso, foram incluídos os experimentos para a abordagem metabolômica e análises quimiométricas da mistura de padrões de metabólitos para aplicações na metabolômica não-alvo. Com relação aos resultados inicialmente esperados, também é possível verificar uma correspondência com os alcançados, principalmente referentes: i) ao desenvolvimento de uma ferramenta integrada para avaliar os impactos, baseada em múltiplas linhas de evidência: ii) Geração de informações sobre os processos de recuperação na fase pós-desastre; iii) Geração de dados que auxiliem na tomada de decisões por parte das autoridades públicas e sensibilização e conscientização das agências governamentais/ Institutos ambientais sobre a importância das avaliações de risco que incluam análises ecotoxicológicas nos organismos diretamente expostos no ambiente; iv) Treinamento e capacitação de alunos de iniciação científica, de mestrado e doutorado para realização de diferentes análises (bioquímicas, morfológicas), assim como auxiliar na interpretação dos dados obtidos. Por fim, é importante mencionar que para alcançar tais resultados, diversos desafios científicos e metodológicos foram superados com êxito, dentre eles: i) a coleta amostral suficiente de peixes adultos na Bacia do Rio Doce: ii) a realização de múltiplas análises e amostras através do estabelecimento de diversas parcerias com grupos de pesquisas nacionais (UNESP-CLP, IO-USP, UFPR, UFC, UTFPR) e internacionais (IDAEA-CSIC); iii) análises de embriotoxicidade com o uso de uma espécie nativa e a modelagem matemática; iv) aprendizado de novas técnicas e abordagens nas análises multivariadas, metabolômicas e quimiométricas; v) atraso de diversas análises devido ao período da pandemia do COVID-19. Atividades concluídas desde o último período7 1. Conclusão das análises químicas – i) Releitura de amostras que excederam a curva padrão (inorgânicos); ii) agrotóxicos na água e no sedimento; POPs no sedimento 2. Conclusão das análises histopatológicas no fígado e gônadas 3. Análises multivariadas dos dados químicos, e publicação dos Artigos 1 e 2 4. Análises multivariadas do experimento com os embriões de jundiá, e publicação do artigo 3 5. Análises multivariadas das respostas dos biomarcadores, e submissão do artigo 4 6. Análises multivariadas histologia e desregulação endócrina, e redação do artigo 5 em andamento (Auxílio da aluna sob co-orientação Larissa Batista) 7. Análise Bioacumulação e redação do artigo em andamento (Co-orientação aluna Larissa Batista) 8. Análise Metabolômica dos embriões de jundiás pela proposta BEPE e redação do artigo em fases finais de elaboração 9. Análises quimiométricas pelo método ROIMCR de padrões de metabólitos para sua aplicação na Metabolômica não-alvo (referentes ao BEPE) e redação dos artigos em fases finais e iniciais de elaboração 09/21 10/21 11/21 12/21 01/22 02/22 03- 09/22 09-12/22 01- 03/2023 1 X X X X X 2 X X X X X 3 X X X X X 4 X X X 5 X X X X 6 X X X X X 7 X X X X X 8* X X X X X X 9 X X X X 7 Descrição detalhada dos resultados obtidos no último período, não apresentados nas publicações, no ANEXO VI. ANEXO I – Informações detalhadas referentes aos RELATÓRIOS PARCIAIS I e II Atividades apresentadas para o Relatório I (01/09/2018 a 31/05/2020): RESUMO (RESULTADOS PARCIAIS) Vários estudos têm mostrado os impactos ambientais da mineração e do rompimento da barragem do Fundão, no Rio Doce. Análises químicas na água detectaram ao longo do percurso do rio, elevadas concentrações de elementos como Fe, Al, Mn, e os de maior potencial tóxico como As, Cd e Pb após o acidente. Apesar dos seus efeitos na biota parecerem evidentes, poucos estudos investigaram as respostas desencadeadas nos peixes considerando toda a extensão do rio, bem como a maioria têm negligenciado a ocorrência de contaminantes orgânicos e suas misturas complexas com os metais. Desta forma, o presente projeto tem como objetivo avaliar a qualidade ambiental após o acidente, através de diversas abordagens que integrem tanto os aspectos abióticos como os bióticos deste ecossistema. Para este estudo foram coletadas amostras de água e sedimento em 8 locais da bacia do Rio Doce para a detecção e quantificação dos poluentes (metais e compostos orgânicos), assim como a captura de 474 peixes adultos (lambaris, jundiás e mandis), em duas estações do ano de 2019, para a avaliação dos parâmetros biológicos: bioacumulação, biomarcadores bioquímicos, moleculares, histopatológicos. Adicionalmente foi realizado um teste de toxicidade com embriões de jundiá expostos ao elutriato do Rio Doce durante 96hpf para verificar as respostas desencadeadas nas fases iniciais do desenvolvimento. Os resultados preliminares mostraram que os peixes coletados no Alto Rio Doce (local mais próximo do rompimento da barragem) apresentaram mais respostas de toxicidade: como elevados níveis de peroxidação lipídica, menores níveis de antioxidantes, alterações morfológicas nucleares nos eritrócitos e nas brânquias, assim como maiores taxas de deformidades nos embriões, sendo provável que estas respostas estejam associadas aos elevados níveis de metais presente neste ambiente. Já no médio Rio Doce os peixes apresentaram danos no DNA, assim como a expressão da vitelogenina em peixes machos, e deformidades nos embriões o que sugere que outras fontes de poluição locais possam estar causando estes efeitos. Enquanto no baixo Rio Doce, a maior atividade da AChE nos peixes do baixo Rio Doce, pode representar uma resposta de exposição à outros contaminantes na região, como os pesticidas. Portanto, os resultados sugerem que diferentes fontes de poluição, pontuais e difusas, desencadeiam distintas respostas nos peixes, não havendo um gradiente de contaminação contínuo ao longo do Rio Doce. Com a conclusão das análises e a integração de todos os dados deste estudo, através da estatística multivariada, será possível fornecer um diagnóstico mais completo da qualidade ambiental da Bacia do Rio Doce, servindo de suporte para tomadas de decisões por parte das autoridades públicas. ENUNCIADO DO PROBLEMA As atividades de mineração e a agricultura representam setores básicos da economia mundial que são responsáveis por causar consideráveis impactos ambientais. Normalmente, a extração de minérios implica em uma alteração no meio ambiente significativa, devido à supressão da vegetação e aos processos de contaminação da água e do solo decorrentes da geração de resíduos tóxicos sem os devidos controles apropriados (Mechi & Sanches, 2010). Entre as principais regiões de mineração no Brasil, pode-se citar o Quadrilátero Ferrífero (QF), localizado no centro-sudeste do estado de Minas Gerais, onde ocorre intensa extração do minério de ferro, além da exploração de manganês e ouro, em menor escala (Roeser & Roeser, 2010). A ampla atividade garimpeira realizada por mais de 300 anos no QF, teve como uma de suas piores consequências a liberação do mercúrio no ambiente devido ao seu uso para a amalgamação do ouro (Varejâo, Bellato, & Fontes, 2009). Outro elemento mobilizado no ambiente como subproduto do ouro é o Arsênio, o qual se encontra na primeira posição da lista de prioridade das substâncias perigosas da Agência de Substâncias Tóxicas e Registro de Doenças (ATSDR, 2014). Estima-se que somente na região do QF em torno de 390.000 toneladas de As tenham sido introduzidas no ambiente (Borba, Figueiredo, & Matschullat, 2003). Já o ferro, mesmo sendo um metal essencial com exploração relativamente mais recente no QF, também contribui significativamente com o quadro de contaminação crônica de metais existente no local (Rodrigues et al., 2014). Este cenário é evidenciado pelas altas concentrações de metais, como Fe, Hg, e do metaloide As detectados no trecho próximo à nascente da Bacia do Rio Doce (Alto Rio Doce), no município de Mariana, onde se encontram três grandes reservatórios de rejeitos de ferro da empresa Samarco (Rhodes, 2010). Além do impacto da mineração do QF, a Bacia do Rio Doce está sujeita a outras atividades humanas como a agricultura, bovinocultura e indústrias, as quais predominam nos trechos do médio e baixo Rio Doce. Nas regiões urbanas, com destaque para a cidade de Governador Valadares, ocorre também intensa descarga de efluentes domésticos e industriais sem haver um tratamento adequado (Veado, Menezes, Queiroz, Costa, & Oliveira, 2009). A atividade siderúrgica na região do Vale do aço está diretamente relacionada aos altos níveis de As e alguns metais como Al, Cr e Fe, detectados em concentrações acima dos valores máximos permitidos na água (Vasconcelos et al., 2011). Ao longo do percurso do Rio Doce, outros metais como Cr, Cu, Zn, Hg e Pb analisados no sedimento, também já foram detectados em níveis acima do recomendado pela legislação (Santolin, Ciminelli, Nascentes, & Windmöller, 2015). Tanto os metais essenciais como os não-essenciais, os quais apresentam maior potencial tóxico, quando acumulados em maiores níveis no ambiente podem causar efeitos adversos sobre a biota e provocar risco de exposição à população humana (Monroy, Maceda-Veiga, & de Sostoa, 2014; Yi, Yang, & Zhang, 2011). Apesar de a literatura descrever concentrações ambientais moderadas a altas de metais na Bacia do Rio Doce, tanto na água como no sedimento, pouco se encontra a respeito dos níveis de metais acumulados na biota, os efeitos nos organismos diretamente expostos, e os impactos crônicos de longo prazo (Almeida, 2007; Veado et al., 2009). Para agravar as condições de contaminação crônica existente na Bacia do Rio Doce, no dia 05 de novembro de 2015, ocorreu o rompimento da barragem de rejeitos do Fundão, na região de Mariana, causando a desestruturação dos ecossistemas associados. Neste evento catastrófico, considerado como o pior desastre ambiental da história do Brasil, aproximadamente 50 milhões de m3 de rejeitos de minério de ferro foram introduzidos nos corpos hídricos (Rio Gualaxo do Norte, Rio do Carmo e Rio Doce), afetando Áreas de Preservação Permanente e percorrendo mais de 600 km até alcançar o Oceano Atlântico. Além do grande prejuízo socioeconômico causado, entre eles a perda de vidas humanas, o desalojamento de populações, a interrupção do abastecimento de água e da pesca, houve também uma mortandade massiva da biodiversidade aquática, assim como da fauna e flora terrestre (IBAMA, 2015). A recuperação dos danos e o desenvolvimento de espécies na região deverão ocorrer apenas em médio e longo prazo, já que houve o comprometimento da capacidade de resiliência e processos de sucessão dos trechos atingidos. Para alguns autores, possivelmente o impacto causado será considerado como irreversível, com a extinção de espécies endêmicas ameaçadas (Miranda & Marques, 2016) e o estabelecimento de um ecossistema distinto do original. Neste caso, a dizimação da ictiofauna dos Rios Gualaxo do Norte, Carmo e Doce, em período reprodutivo, assim como a desestruturação da cadeia trófica e a alteração na qualidade da água, dificultarão a restauração de novas populações de peixes (IBAMA, 2015). Desta forma, maior atenção das autoridades públicas ainda se faz necessária para que sejam avaliados os reais danos causados neste ecossistema, assim como os potenciais riscos futuros decorrentes da (re)distribuição dos rejeitos de minérios ao longo do Rio Doce. Parte dos metais depositados nos sedimentos, após o acidente, foi mobilizada e se tornou biodisponível para os organismos. Os resultados prévios das análises químicas divulgados pelo GIAIA (2016) e pelo IBAMA (2015) confirmaram a presença de As, Cd, Pb, Cr, Mn, Ni e Se total, e Cianeto livre na água em níveis acima do permitido, de acordo com a Resolução CONAMA 357/2005 para corpos d’água de Classe II, em diversos pontos ao longo da bacia do Rio Doce. Elementos como o Mn e Se foram detectados em concentrações até 22 e 53 vezes acima das permitidas, respectivamente. As concentrações de Fe e Al dissolvidos na água estavam acima do valor permitido em alguns pontos, enquanto as concentrações de Fe e Al totais na água, mesmo não havendo padrão de legislação comparativa, estavam extremamente altas em todos os pontos de coleta afetados pela lama de rejeito. Após dois e quatro meses destas primeiras análises realizadas em Dezembro de 2015 pelo IBAMA (2015) e GIAIA (2016), respectivamente, observou-se que a maior parte destes metais voltou a estar em conformidade com os limites estabelecidos na Resolução CONAMA 357/2005, com exceção do Manganês que permaneceu acima do limite em alguns locais de coleta. No compartimento sedimento, analisado somente nos pontos do Estado do Espírito Santo, não houve um padrão definido na análise dos metais e outros parâmetros tanto para as diferentes coletas, como para os locais amostrados (IBAMA, 2015). As concentrações de Pb, Cr, Ni, Zi, Cu e Hg apresentaram alguns valores acima dos limites estabelecidos pelo CONAMA 454/2012*1, principalmente nas regiões mais próximas a montante, enquanto o As apresentou concentrações acima dos limites preconizados nos pontos mais próximos à foz do Rio Doce. Portanto, ainda são necessárias análises que investiguem melhor a distribuição dos metais e outros compostos nos diferentes 1 * CONAMA 454/2012 – Não há legislação específica para a avaliação da qualidade de sedimentos, sendo necessária uma comparação dos dados através da legislação vigente para Gestão de resíduos e produtos perigosos para material dragado, a qual pode levar à uma interpretação inapropriada dos resultados. compartimentos abióticos e bióticos, ao longo do percurso do Rio Doce, para uma avaliação mais adequada da contaminação ambiental. Com relação aos parâmetros físico-químicos analisados, observou-se um aumento brusco na turbidez da água no período do acidente, com posterior diminuição, ficando mais próximo ao limite legal (GIAIA, 2016; IBAMA, 2015). De forma semelhante, os níveis de oxigênio dissolvido também se encontraram abaixo do permitido, retornando aos níveis normais nas mesmas épocas de coleta. Apesar da importância dos parâmetros físico-químicos e das análises químicas na avaliação da qualidade da água, estas análises apresentam limitações por não informarem a biodisponibilidade e toxicidade dos compostos químicos nos organismos. As análises químicas por si só também são insuficientes para prever os reais riscos de exposição e seus potenciais efeitos na biota. Desta forma, um diagnóstico subestimando ou superestimando a qualidade da água pode ser fornecido se apenas estas análises forem consideradas, como já demonstrado em outros estudos de biomonitoramento (Santos et al., 2016; Yamamoto et al., 2016). Assim, uma avaliação de risco ideal requer a integração de dados obtidos por meio da detecção de diversos poluentes no ambiente (i.e., análises químicas dos meios potencialmente contaminados) e sua consequente bioacumulação nos organismos aquáticos, bem como os efeitos que estes compostos possam estar causando à biota (Van der Oost et al., 2003), nos diferentes níveis de organização biológica. As avaliações de risco têm como objetivo analisar as probabilidades e magnitudes das consequências e efeitos adversos das atividades humanas ou catástrofes naturais (Browning; Thomas, 2016; Bui et al., 2016; Gunasekera et al., 2015). Este processo consiste em diferentes etapas, incluindo a caracterização dos agentes estressores em potencial, assim como dos riscos de exposição (identificação dos meios contaminados, das formas químicas e do potencial tóxico dos poluentes), a caracterização dos efeitos adversos causados pela exposição aos agentes estressores, classificação e redução dos riscos, e o biomonitoramento (Cachada et al., 2016; Kühnel; Nickel, 2014). Este último pode informar melhor as associações entre os possíveis riscos de exposição e efeitos para um determinado ambiente (Laane et al., 2013), consistindo em uma rotina de avaliação dos parâmetros biológicos ao longo do tempo (SOBUS et al., 2011). Os peixes são considerados bons modelos animais para estes estudos, pois além de apresentarem características que colaboram com seu uso em diferentes desenhos experimentais, como a fácil adaptabilidade (Kapoor & Khanna, 2004), eles estão em contato direto com o ambiente aquático (Zhu et al., 2015). São organismos indicadores ambientais de grande relevância ecológica, com ampla biodiversidade e por se enquadrarem em níveis tróficos superiores, podendo responder à presença dos poluentes de forma sensível e específica, permitindo uma avaliação da toxicidade através de uma vasta gama de possibilidades metodológicas (Chovanec, Hofer, & Schiemer, 2003; Naigaga et al., 2011; Plessl, Otachi, Körner, Avenant-Oldewage, & Jirsa, 2017). Em uma mesma situação de exposição, os peixes podem naturalmente apresentar diferentes respostas entre as espécies, assim como estão sujeitos a diferentes processos de bioacumulação e biomagnificação dos poluentes (Gray, 2002; Lewis et al., 2011). Portanto, de forma ideal, estudos de biomonitoramento devem considerar análises em mais de uma espécie de peixe, preferencialmente pertencendo a níveis tróficos distintos. Várias respostas biológicas podem ser influenciadas pela exposição a substâncias químicas, sendo importante uma avaliação em diferentes subníveis de organização biológica. Uma estratégia adequada e amplamente utilizada é uma abordagem multi-biomarcadores, onde podem ser considerados diferentes órgãos-alvo, assim como várias respostas que apresentam diferentes níveis de sensibilidade aos agentes estressores, como os contaminantes químicos (Brito et al., 2012; Santos et al., 2014; Santos et al., 2016; Osório et al., 2014). Dentro do contexto ecotoxicológico, os biomarcadores representam mudanças nas respostas biológicas a nível sub organismo, desde moleculares, celulares, fisiológicas ou comportamentais, relacionadas à exposição e efeitos tóxicos dos poluentes ambientais (Gupta, 2014). Biomarcadores ideais são indicadores sensíveis e específicos de uma exposição química, refletindo a interação entre uma substância e um sistema biológico (Campion et al., 2013). Em estudos de biomonitoramento, os efeitos toxicológicos dos metais são amplamente avaliados através dos biomarcadores bioquímicos, já que um dos principais mecanismos desencadeados é o estresse oxidativo com diferentes órgãos-alvo sendo afetados (Carvalho, Bernusso, Araújo, Espíndola, & Fernandes, 2012; Gusso-Choueri et al., 2015). Metais redox-ativos como o Fe, Co, Cu e Cr estão envolvidos com as reações de Fenton, aumentando a produção do radical hidroxila, enquanto metais redox-inativos como o As, Cd e Pb podem diminuir níveis de antioxidantes como GSH (Ercal, Gurer- Orhan, & Aykin-Burns, 2001; Lushchak, 2011). As metalotioneínas, proteínas ricas em cisteínas, também são consideradas bons biomarcadores bioquímicos (Bowen & Depledge, 2006), pois são responsáveis pela detoxificação de metais, podendo proteger as células das espécies reativas de oxigênio devido à afinidade entre seus grupos tióis com os metais, como Cd e Hg (Engel & Brouwer, 1989). Para a avaliação dos efeitos neurotóxicos causados pelos metais, a Acetilcolinesterase (AChE), tanto no cérebro como no músculo, é um biomarcador muito utilizado, podendo ser verificada tanto uma inibição ou mesmo estimulação para sua atividade (Pundir & Chauhan, 2012; Schlenk, 2005). Outro parâmetro importante e frequentemente avaliado são os efeitos genotóxicos, ou seja, as alterações no material genético que podem ser a nível estrutural do DNA, inicialmente, e causar danos no DNA, resultando em efeitos mutacionais e hereditários a longo prazo (Kirsch-Volders et al., 2009; Schrader, 2016). As análises histopatológicas, as quais representam outro nível de organização biológica, podem apresentar várias vantagens como um biomarcador, pois além de constituírem um método rápido e barato, demonstram de forma objetiva o grau de comprometimento de diferentes tecidos e órgãos alvos. Diversos estudos demonstram que a exposição aos metais é capaz de causar várias alterações em órgãos alvos como o fígado e as brânquias, os quais possuem papéis chave no metabolismo de xenobióticos e processos de osmorregulação, respectivamente (de Oliveira Ribeiro, Belger, Pelletier, & Rouleau, 2002; Mela et al., 2007; Wei & Yang, 2015). Por outro lado, os efeitos endócrinos dos metais são pouco descritos na literatura, com maiores evidências de que o Cd, Hg, As, Mn e Zn possam atuar também como desreguladores endócrinos (DE) (Iavicoli, Fontana, & Bergamaschi, 2009). Estes são definidos pela Organização Mundial da Saúde (2002) como: “uma substância exógena ou mistura que altera a função do sistema endócrino e consequentemente causa efeitos adversos em um organismo intacto, ou sua prole, ou (sub)populações”. Normalmente os modos de ação dos metais não estão associados à interação direta aos receptores estrogênicos, mas sim a uma alteração nos níveis hormonais (Denier, Hill, Rotchell, & Minier, 2009). Alguns metais possuem prováveis atividades estrogênicas, como o Zn, capaz de induzir a expressão da vitelogenina em sapos machos expostos (Falfushynska, Gnatyshyna, Fedoruk, Sokolova, & Stoliar, 2016). Particularmente, os desreguladores endócrinos capazes de interferir na ação de hormônios esteroides, os quais controlam processos de reprodução, desenvolvimento e comportamentos sexuais, são amplamente estudados devido aos efeitos deletérios relacionados (Hampl et al., 2014a, 2014b). A exposição durante o desenvolvimento representa uma maior “janela de susceptibilidade”, já que estes organismos apresentam maior sensibilidade a estas substâncias, sendo de grande interesse avaliar os efeitos causados durante os estágios iniciais de desenvolvimento (Core, 2008; Uzumcu e Zachow, 2007). Grande parte dos estudos dos efeitos endócrinos estão relacionados à capacidade de interação com receptores hormonais, onde a natureza da resposta pode depender da afinidade da ligação. No cenário reprodutivo dos peixes, um dos processos mais bem caracterizado e estabelecido é a expressão da vitelogenina (Marin; Matozzo, 2004; Matozzo et al., 2008; Sumpter; Jobling, 1995). Este biomarcador molecular é amplamente utilizado no diagnóstico de ambientes aquáticos impactados pela atividade humana, devido à sensibilidade e especificidade na detecção de compostos que apresentam atividade endócrina, particularmente estrogênica, ou seja, feminizante (Carballo et al., 2005; Desforges et al., 2010; Santos et al., 2016; Gilannejad et al., 2016; Reinen et al., 2010). Considerando os distintos modos de ação desencadeados pelos DE, afetando o sistema endócrino tanto em humanos como em animais, é importante avaliar diferentes processos alvos no aspecto reprodutivo, desde uma alteração nos processos de síntese dos hormônios esteroides aos efeitos adversos causados no desenvolvimento gonadal. Apesar de serem considerados vários níveis de organização biológica, o maior foco dos estudos ecotoxicológicos é ainda direcionado aos efeitos no nível de organismos (Jorgensen, 2010). Enquanto isso várias questões relacionadas aos efeitos dos contaminantes em larga escala, ainda permanecem sem respostas (Beketov; Liess, 2012). Desta forma os modelos matemáticos vem sendo cada vez mais utilizados recentemente pois podem auxiliar a compreender como os efeitos dos poluentes a níveis individuais podem se propagar a níveis populacionais ou até de ecossistemas a longo prazo (Barrera, 2013; Brito, 2015) A modelagem pode ser definida como o processo da utilização de representações matemáticas abstratas de um sistema para analisar ou estudar as relações entre os componentes de um sistema, com o propósito de simular o comportamento de um sistema real (Dixon, 2012). O modelo “individual-based”, ou “agent-based” permite simular sistemas de populações a partir de organismos individuais discretos, sendo capaz de verificar parâmetros detalhados com alto nível de complexidade e as interações entre os indivíduos e o seu ambiente. Para cada indivíduo podem ser consideradas diversas variáveis de estado (localização espacial, característica fisiológica), atributos e os comportamentos (crescimento, reprodução, seleção do habitat) (DeAngelis & Grimm, 2014). Por estas razões, este tipo de modelo representa uma importante ferramenta, não somente para a ecotoxicologia, mas também para outras disciplinas (Gledhill & Van Kirk, 2011; Grimm et al., 2006) OBJETIVOS PROPOSTOS INICIALMENTE Avaliar a toxicidade dos poluentes presentes no Rio Doce em embriões de peixes e indivíduos adultos, com o desenvolvimento de um modelo matemático que demonstre prováveis efeitos toxicológicos à curto, médio e longo prazo. Objetivos específicos I – Detectar, por meio de análises químicas, os metais e os contaminantes orgânicos presentes na água e sedimento do Rio Doce e bioacumulados nos tecidos dos peixes (músculo, brânquias e fígado); II – Avaliar a saúde geral dos peixes adultos (Geophagus brasiliensis, Astyanax bimaculatus, Rhamdia quelen) coletados em diferentes pontos ao longo do Rio Doce em duas épocas distintas (verão e inverno) através das análises histopatológicas no fígado e brânquias, de genotoxicidade (ensaio cometa e micronúcleo das células sanguíneas) e atividade da Acetilcolinesterase no cérebro e músculo; III – Avaliar os mecanismos de defesa desencadeados nos peixes adultos após exposição aguda aos contaminantes do Rio Doce através dos biomarcadores bioquímicos de estresse oxidativo no fígado e brânquias, atividade da Metalotioneína, e enzimas de biotransformação CYP1A e GST no fígado; IV – Avaliar a desregulação endócrina afetando os processos reprodutivos dos peixes adultos coletados através da análise de expressão da vitelogenina e dosagem dos hormônios esteroides (estradiol e testosterona) no sangue, expressão da CYP3A (fígado) e CYP19A (gônadas e cérebro), histologia das gônadas de machos e fêmeas; V – Avaliar os efeitos tóxicos dos poluentes nos estágios iniciais do desenvolvimento em embriões de Rhamdia quelen expostos por 96 horas à água e sedimento do Rio doce, através das taxas de letalidade e biomarcadores bioquímicos (estresse oxidativo e acetilcolinesterase); VI – Exposição in vivo de embriões de zebrafish a uma mistura de metais nas mesmas concentrações detectadas nos locais de estudo do Rio Doce para verificar os principais mecanismos de ação desencadeados (experimento a ser realizado no exterior, com bolsa BEPE). VII - Desenvolver um modelo matemático agent-based que simule os riscos de exposição dos poluentes do Rio Doce e os efeitos nos peixes a nível populacional a médio e longo prazo. MATERIAIS E MÉTODOS Este trabalho teve a aprovação do comitê de ética no uso de animais – CEUA Instituto de Biociências do Campus Litoral Paulista Protocolo no 12/2018-CEUA (ANEXO II), assim como a autorização pelo SISBIO para captura, coleta e transporte de espécimes da fauna silvestre in situ, com o protocolo no 65973-2 (ANEXO III). Para a avaliação da influência sazonal-temporal nas análises, foram realizadas duas coletas em 2019, a primeira em Janeiro-Fevereiro de 2019 (verão e época chuvosa) e a segunda em Julho-Agosto de 2019 (inverno e época de seca). Os locais mais apropriados para a coleta foram definidos através de uma visita prévia em campo (11/2018) e com reuniões de especialistas da área e pescadores locais, permitindo a identificação das diferentes fontes de poluição ao longo do Rio, assim como a viabilidade da captura dos peixes e coleta das amostras biológicas. Considerando os diferentes impactos das atividades antrópicas, as distâncias entre os trechos da Bacia Hidrográfica do Rio Doce (Alto, Médio e Baixo Rio Doce), e os dados já disponíveis na literatura, foram selecionados criteriosamente 8 áreas de amostragem (Tabela 1, Figuras 1 a 4): TABELA 1. Locais de amostragem da Bacia do Rio Doce em 2019 e as descrições das principais atividades humanas em cada região. TRECHO Locais de Coleta Descrição das atividades humanas (ANA, 2015) Alto Rio Doce 1 – Rio Gualaxo do Norte (GUA), Município de Mariana, MG Local mais próximo do rompimento da barragem do Fundão, no município de Mariana MG. Impactado pela atual exploração do minério de Ferro, e do garimpo do ouro durante décadas, o qual ainda ocorre de maneira ilegal. 2 – Candonga (CAN), Reservatório de Risoleta Neves, Rio Doce, MG Reservatório da UHE de Risoleta Neves, que conteve aproximadamente 10 milhoes de m3 do rejeito de Fe (1/4) introduzido no Rio Doce. Médio Rio Doce 3 – Naque, MG (NAQ) Local à jusante de indústrias siderúrgicas da Cidade de Ipatinga e da Indústria de celulose CENIBRA 4 – REFERÊNCIA (REF), Rio Corrente, Periquito, MG Este afluente do Rio Doce foi selecionado como ponto de Referência por estar localizado numa Unidade de Conservação Ambiental (Parque Estadual do Rio Corrente), e não ter sido afetado pela passagem da lama. 5 – Governador Valadares, MG (GOV) Cidade mais populosa do Rio Doce (245 mil hab.), com o lançamento do esgoto 100% não tratado no rio 6 – Aimorés, ES (AIM) Região onde a atividade agrícola começa a se intensificar Baixo Rio Doce 7 – Colatina, ES (COL) Impacto da atividade agrícola (cultivo de café) e urbana 8 – Linhares, ES (LIN) Impacto da atividade agrícola (cultivo de café) e urbana Figura 1. Mapa do Rio Doce com os 8 pontos de amostragem dos peixes, água e sedimento, e as respectivas atividades antrópicas desenvolvidas ao longo da Bacia do Rio Doce FONTE: Larissa Ajala Batista, 2020. A Região do Alto Rio Doce (Pontos 1 e 2) sofre maior impacto da atividade de mineração, enquanto o Médio (pontos 3 e 5) e o Baixo Rio Doce (pontos 6, 7 e 8) estão mais sujeitos às atividades industriais e agricultura, respectivamente. 1 – Gualaxo do Norte. 2 – Candonga. 3 – Naque. 4 – Rio Corrente (Referência). 5 – Governador Valadares. 6 – Aimorés. 7 – Colatina. 8 – Linhares. Apesar da relevância sócio-ambiental, não foi realizada a amostragem na região da foz do Rio Doce, em Regência, devido às condições de salinidade e a ocorrência de diferentes espécies de peixes, as quais não seriam adequadas para comparação com as demais localidades do Rio Doce neste estudo. Mineração Indústrias Efluentes domésticos Agricultura Figura 2. Locais de amostragem do Alto Rio Doce: Gualaxo do Norte e Candonga em MG FONTE: A AUTORA, 2019. O ponto do Rio Gualaxo do Norte é o mais próximo da barragem do Fundão e do distrito de Bento Rodrigues onde houve o soterramento de casas pelos rejeitos do minério de Ferro, e as obras de reassentamento da Nova Bento Rodrigues pela Fundação Renova. Aproximadamente 100 km distante de Bento Rodrigues e próximo à origem do Rio Doce, encontra-se o reservatório da UHE de Risoleta Neves. Figura 3. Locais de amostragem do Médio Rio Doce: Naque e Governador Valadares e o Rio Corrente Grande como ponto referência, em MG FONTE: A AUTORA, 2019. A cidade de Naque, localizada no médio Rio Doce, fica à jusante de indústrias siderúrgicas e de celulose e representa um dos locais por onde percorre a ferrovia que transporta os minérios de ferro extraídos no Alto Rio Doce. Após 60 km de percurso, encontra-se a cidade de Governador Valadares com a maior população ribeirinha do Rio Doce (superior à 250 mil habitantes). O Rio Corrente Grande, situado entre Naque e Governador Valadares, foi o local selecionado como Referência deste estudo pelo reduzido impacto ambiental, sendo pertencente à Unidade de Conservação do Parque Estadual do Rio Corrente. Figura 4. Locais de amostragem do Baixo Rio Doce: Aimorés, Colatina e Linhares em ES FONTE: A AUTORA, 2019. A partir de Aimorés a atividade agrícola e pecuária se intensifica, havendo também o impacto do despejo de efluentes domésticos das cidades de porte médio do ES, Colatina e Linhares (populações maiores que 100 mil habitantes) Coleta dos tecidos alvos dos peixes adultos Neste estudo foram coletados três grupos de peixes, pertencentes a nichos tróficos distintos (Figura 5): i ) lambari (Astyanax lacustris, Characidae); ii) siluriformes ou “bagres” (jundiá, Rhamdia quelen, Heptapteridae; e mandi, Pimelodus maculatus, Pimelodidae e a cumbaca, Trachelyopterus striatulus, Auchenipteridae); iii) cascudos (cascudo viola, Loricariichthys castaneus, Loricariidae; cascudo, Hypostomus affinis, Loricariidae). Figura 5. Peixes coletados em 2019 ao longo do Rio Doce FONTE: A AUTORA, 2019. Com o auxílio dos pescadores do Rio Doce, os peixes foram coletados utilizando os seguintes materiais: i) redes de emalhar (malhas 3, 4, 5, 6, 7, 8 cm); ii) armadilhas do tipo covo; iii) redes de arrasto (10m e 20m); iv) tarrafas; v) linha e anzol e; vi) embarcações de pequeno porte para a maioria dos locais (Figura 6). Para cada local de coleta foi feito um esforço amostral semelhante, permanecendo até 2 dias para a obtenção dos peixes. Figura 6. Material e técnicas de pesca para a captura dos peixes ao longo do Rio Doce em 2019 FONTE: A AUTORA, 2019. A-D - Redes de emalhar; E- armadilhas do tipo covo; F - tarrafas Os peixes capturados foram mantidos em caixas térmicas sob aeração constante (Figura 7) e transportados (duração máxima de 30 min) até um local apropriado para a coleta das amostras biológicas (sangue, fígado, gônadas, brânquias, cérebro e músculo, Figura 8). A sedação dos animais foi feita com o uso do anestésico benzocaína 0,02% (p- aminobenzoato de etila em etanol PA a 200 mg/L) e em seguida os peixes foram medidos e pesados para obtenção do Fator de Condição. O sangue foi coletado da veia caudal com seringas heparinizadas (para peixes de maiores portes, como os bagres), e com capilares através da punção cardíaca (peixes de menor porte, como os lambaris), sendo realizado um esfregaço sanguíneo para análises de genotoxicidade (micronúcleo). Já para as análises moleculares, o plasma foi obtido após centrifugação à 4000g por 2 min (apenas dos peixes de maior porte) à temperatura ambiente e o sobrenadante foi aliquotado em tubos contendo solução antiproteolítica 100 mM de PMSF (1:10, Sigma Aldrich) e armazenado em nitrogênio líquido a -75o C. Posteriormente, os peixes foram sacrificados com secção vertebral, e dissecados com auxílio de pinças e tesouras para remoção do fígado, gônadas, cérebro e músculo, os quais foram mantidos a -75º C em nitrogênio líquido até serem transportados para o Freezer -80º C, para posteriores análises bioquímicas e moleculares. Fígado e gônadas foram pesados para o cálculo dos índices somáticos (o peso e comprimento total do peixe foram obtidos antes da coleta do sangue). Outra parte do material de fígado, gônadas e brânquias foi fixada quimicamente para análises histopatológicas. O material biológico foi coletado próximo do local de captura dos peixes para evitar o estresse do transporte, e posteriormente foi transportado e analisado (biomarcadores) com uso da infraestrutura presente no Instituto de Biociências da UNESP (CLP), Instituto de Estudos Avançados do Mar da UNESP (IEMar-UNESP) e outras instituições colaboradoras (UFPR e UTFPR). Figura 7. Manutenção dos peixes vivos em caixa térmica sob aeração constante para a coleta de amostras biológicas. FONTE: A AUTORA, 2019. À medida que eram capturados no rio, os peixes eram mantidos sob aeração com o uso bombas compressoras à pilha e após serem transportados ao local de coleta das amostras, eram substituídos por compressores de maior potência. Figura 8. Procedimentos para a coleta das amostras dos peixes do Rio Doce. FONTE: A AUTORA, 2019. Após a anestesia dos peixes, verificada através da redução da movimentação e a perda de equilíbrio, os peixes eram pesados e medidos. Após remoção do sangue o peixe era sacrificado e os demais órgãos eram dissecados e separados para as análises. Análises dos parâmetros físico-químicos da água Os parâmetros físico-químicos da água do Rio Doce: Clorofila a (g/L), Cianobactérias (g/L), Condutividade (S/cm), temperatura (oC), turbidez (NTU), oxigênio dissolvido (mg/L), pH e precipitação média (mm), foram obtidos através de uma compilação dos dados fornecidos em relatórios semanais e mensais da Fundação Renova no mesmo período das coletas de verão (Jan-Fev) e inverno (Jul-Ago) de 2019. Para o período do verão foram considerados os dados fornecidos em 7 boletins semanais de 14/01 a 25/02, enquanto para o inverno foi feita a média dos dados fornecidos pelos três boletins mensais de Julho, Agosto e Setembro de 2019. O monitoramento automático foi feito através de equipamentos fixos ao longo da bacia do Rio Doce, fornecendo os dados dos parâmetros quali-quantitativos da água (PMQQS). (https://www.fundacaorenova.org/arquivos-e-relatorios) Análises químicas dos metais e dos contaminantes orgânicos Análises químicas na água Amostras de água (1 L por ponto em triplicata) foram coletadas pontualmente a 30 cm da superfície, no mesmo local de coleta dos peixes. Para as análises químicas dos metais (As, Al, Cd, Cr, Cu, Hg, Fe, Mn, Ni, Pb e Zn) as amostras foram acidificadas com 0,5% de HNO3 e foram armazenadas em garrafas de polipropileno mantidas refrigeradas e na ausência de luz. As amostras foram filtradas com membrana PTFE de poro 0,45 μm (Merck MilliporeTM) (Figura 9), analisadas em triplicatas e expressas em μg.L-1 (ou mg.L- 1) e comparadas com a Resolução CONAMA 357/2005, de acordo com a classe de água no local em que a amostra foi coletada. A análise química dos compostos orgânicos persistentes (hidrocarbonetos policíclicos aromáticos) foi feita de acordo com (Cavalcante et al., 2007) onde as amostras de água coletadas (1 L por ponto em triplicata) foram armazenadas em garrafas de vidro âmbar e mantidas refrigeradas na ausência de luz. Os compostos foram extraídos das amostras de água previamente filtradas (membrana PTFE de poro 0,45 μm, Merck MilliporeTM) através da extração de fase sólida com cartucho SPE C18 (Discovery  DSC-18 SPE, 0,5g/6 ml) acoplado a um sistema de vácuo manifold (VisiprepTM). As colunas foram precondicionadas com água miliq, em um fluxo de aproximadamente 5 https://www.fundacaorenova.org/arquivos-e-relatorios ml/min e os compostos eluídos com 0,5 ml de acetona, 0,5 ml de acetato de etila, 0,5 ml de hexano e por último 0,5 ml da mistura dos três solventes em iguais proporções (Figura 9). Esta etapa ainda não havia sido concluída, pois embora as extrações tenham sido concluídas, restava ainda a análise dos extratos. A detecção dos contaminantes persistentes permaneceu a ser realizada, com o uso de GC-MS/MS e HPLC-DAD, no Laboratório de Avaliação de Contaminantes Orgânicos do Instituto de Ciências do Mar da Universidade Federal do Ceará, coordenado pelo Prof. Rivelino Cavalcante. Figura 9. Procedimentos para a extração das amostras de água e sedimento para as análises químicas de metais e compostos orgânicos. FONTE: A AUTORA, 2019. A – Filtração das amostras de água com membrana PTFE de poro 0,45 μm. B – Digestão ácida das amostras de sedimento para análises químicas de metais. C e D – Extração dos compostos orgânicos da água por SPE C18. Sedimentologia As amostras de sedimento foram coletadas com o uso de pás, a 5 m de distância da margem e profundidade a partir de 30 cm, e armazenadas em frascos de polietileno brancos fosco para a análise de metais e em recipientes de alumínio para a análise de orgânicos, e mantidos a 4o C até as análises. Granulometria As análises de composição e distribuição granulométrica do sedimento foram realizadas de acordo com as normas propostas pela CETESB (L6.160). Uma fração da amostra (limite de 120g para cada ponto) de sedimento liofilizado foi separado e pesado (Figura 10). Em seguida, as amostras pesadas foram submetidas a um peneiramento úmido (água destilada) em malha de 0,062 mm para a retirada de fração lamosa, sendo subsequentemente recolocado em estufa por 2 dias na mesma temperatura de 60˚C. Depois de seco, com o auxílio de um almofariz e pistilo, a amostra foi amassada e o material peneirado por 20 minutos em agitador de peneiras eletromagnético (Bertel), utilizando-se o jogo de peneiras de 6 peças por 20 minutos. A fração retirada em cada peneira foi pesada e registrada, e com os resultados obtidos foi possível determinar os teores de areia, silte e argila, segundo a classificação de (Wentworth, 1922), assim como as classificações granulométricas de acordo com Shepard (1954). Figura 10. Análise de granulometria do sedimento do Rio Doce FONTE: A AUTORA, 2019. A – Pesagem das amostras desidratadas. B – Agitador de peneiras eletromagnético para a análise de granulometria. Análises químicas do sedimento Matéria orgânica A composição da matéria orgânica foi determinada via metodologia da oxidação da matéria orgânica via úmida de acordo com Walkley & Black (1934) modificado como proposto por Camargo et al., (2009). Cada grama do sedimento liofilizado foi oxidado com 10 ml K2Cr2O7 1N em presença de 20 ml H2SO4 PA. Após leve agitação e repouso por 30 min, foi adicionado 200 ml de água destilada, 10 ml de ácido ortofosfórico PA e 1 ml de difenilamina 1%. O excesso de dicromato remanescente da oxidação foi titulado com solução de sulfato ferroso amoniacal (SFA) 0,5N e o teor de matéria orgânica foi calculado com base no volume de SFA adicionado na titulação (Figura 11). Uma amostra sem a adição do sedimento foi utilizada como branco para comparação com as amostras. Análise química dos metais Os mesmos metais e os compostos orgânicos analisados na água permaneceram a serem quantificados na fração total do sedimento (triplicata por amostra), bem como na água intersticial, permitindo estimar a biodisponibilidade dos elementos por diferentes vias (contato dérmico – elementos dissolvidos / ingestão – sedimento integral). Para as análises de bioacumulação, amostras de músculo, fígado e brânquias dos peixes coletados foram armazenadas em um pool de 15 a 20 indivíduos por espécie e por grupo, a -75o C, e analisadas em triplicata de acordo com Cotta et. al. (2006). Após desidratação por liofilização, as amostras de material biológico e de sedimento serão digeridas em ácido nítrico (US EPA 3050B), e a detecção dos metais será realizada com Espectrofotômetro de Absorção Atômica (FAAS, Varian, AA 240FS). As concentrações dos metais nas amostras dos tecidos serão expressas em μg.g-1 de peso úmido (pesagem das amostras antes do congelamento) ou seco (pesagem após desidratação), com análise de relação entre peso seco e úmido para estimar o risco toxicológico à saúde humana, de acordo com a CETESB. Os dados obtidos poderão auxiliar na tomada de decisões das autoridades públicas no âmbito sócio-econômico e de saúde pública. Análise química dos contaminantes orgânicos Os contaminantes orgânicos persistentes (hidrocarbonetos policíclicos aromáticos), agrotóxicos (organofosforados e organoclorados) e alguns contaminantes emergentes (estradiol, etinilestradiol, estrona) estavam sendo analisados pelo Laboratório de Avaliação de Contaminantes Orgânicos (LACOR – UFC) para verificar a influência da poluição oriunda das indústrias, atividades de agropecuária e efluentes domésticos, já que o trecho afetado da bacia atravessa várias cidades e recebe suas contribuições, em termos de poluição doméstica, o que pode agravar eventuais efeitos relacionados com os resíduos de mineração. A extração dos contaminantes orgânicos foi feita de acordo com Cavalcante et al., 2008, consistindo em duas etapas, a primeira com extração de contaminantes orgânicos totais seguida de clean-up para separação em três frações com distintas polaridades (Figura 11). Na primeira etapa, 15g do sedimento liofilizado foram transferidos para um erlenmeyer, onde foram adicionados padrões surrogates (50uL de cada) e solventes extratores (25 ml de cada solvente Acetona, Acetato de etila, Diclorometano, Hexano, e a mistura dos quatro solventes em iguais proporções), sendo que a cada adição de um solvente a amostra permaneceu 20 min no ultrassom, seguida da transferência para tubos falcon de vidro e centrifugadas a 4000 rpm ´pr 15 min. Os 125 ml da mistura extratora foram transferidos para balões de fundo chato e pré-concentrados para 1 ml em rotaevaporador. O procedimento de clean up consistiu na separação dos compostos através de cromatografia por afinidade com uma coluna de Sílica, cobre, alumina e sulfato de sódio, através da adição de 40 ml de Hexano (Fração 1), 60 ml de Hexano: Diclorometano: Acetato de etila (3:3:1 – Fração 2) e 50 ml de Diclorometano:Metanol (9:1 – Fração 3). Os extratos foram concentrados em balão rotaevaporador e armazenados em vials âmbar mantidos a -20º C até as análises. Figura 11. Análises químicas do sedimento do Rio Doce FONTE: A AUTORA, 2019. A – Titulação com SFA para medir o teor de matéria orgânica do sedimento. B – Extração dos contaminantes orgânicos totais. C – Permanência das amostras no ultrassom como etapa para auxiliar no processo de extração; D – Extração dos contaminantes orgânicos em frações, por clean-up (Cromatografia de adsorção) Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPAs) na bile A concentração de metabólitos de HPAs na bile permaneceu a ser determinada de acordo com o método proposto por Hanson & Larson, 2008, com modificações. A bile foi coletada em pools de 3 a 5 indivíduos e armazenadas em frascos âmbar a -80º C. As amostras permaneceram a serem diluídas em Metanol 48% (1:1000) e plaqueadas (200 µl) em placas pretas. A leitura da fluorescência permaneceu a ser realizada de acordo com o número de anéis do HPA (2 anéis a 6 anéis de 288 a 422 nm) no leitor de microplaca TECAN Infinity® 200 Pro. BIOMARCADORES Antes da coleta do plasma, o peso e comprimento total dos peixes foram obtidos para cálculo do Fator de Condição de Fulton (KF): KF = (W / L3) x 100. W = Peso corporal em gramas L = Comprimento corporal total em centímetros Para verificar a relação entre o peso do fígado ou da gônada e o peso corporal total de cada indivíduo foi realizado um cálculo do índice hepatossomático (IHPS) e do gonadossomático (IGS). Estes biomarcadores somáticos podem indicar uma alteração no peso relativo do órgão que pode ser comparável com o de outro indivíduo. O índice hepatossomático (IHS) foi calculado a partir da fórmula: IHS = (P Fígado / P Peixe) x 100 Da mesma forma, o índice gonadossomático (IGS) de cada indivíduo foi determinado segundo a fórmula: IGS= (P Gônada / P Peixe) x 100 Foram comparados os IGS entre indivíduos de cada sexo, já que os pesos médios entre as gônadas dos machos e fêmeas variam muito. Análises Bioquímicas As amostras de fígado foram descongeladas e fragmentos de aproximadamente 100 mg de tecido foram homogeneizados (Desagregador de células Benchmark) em tampão Tris HCl 20mM, EDTA 0,1M, PMSF 1mM pH 7,4 (1:10) (Figura 12). Para o músculo e cérebro as amostras foram homogeneizadas em Tampão Fosfato 0,1M, pH 7,5. Em seguida foram centrifugadas numa velocidade de rotação de 12.000 g, a 4o C durante 30 minutos. As concentrações de proteínas totais das alíquotas de plasma, fígado, gônadas, músculo e cérebro foram determinadas para normalizar os dados obtidos nos diferentes ensaios bioquímicos (BRADFORD, 1976). Na microplaca foram adicionados 10 μL do sobrenadante de cada amostra diluída em seu respectivo tampão, seguidos de 190 μL do reativo de Bradford® (Coomassie brilliant blue, Sigma Aldrich). Para o branco foi adicionado apenas solução tampão. Foram empregadas duas réplicas de cada amostra e a leitura foi realizada em espectrofotômetro a um comprimento de onda de 595 nm. Para cada grupo ou local de coleta, foram analisados de 3 a 20 indivíduos por espécie de peixe de acordo com o número amostral obtido. Para as amostras de fígado foram realizadas as análises: LPO, Danos no DNA, GST e GSH. Já no cérebro: LPO, Danos no DNA e AChE, nas gônadas: Danos no DNAe LPO e no músculo somente AChE. Figura 12. Análises bioquímicas das amostras dos peixes do Rio Doce FONTE: A AUTORA, 2019. A – Desagregador de células Benchmark que permite a homogeneização de 24 amostras simultaneamente. B – Materiais plástico utilizados nas análises bioquímicas (micropipetas, ponteiras, microtubos, microplacas e suportes de microtubos) Peroxidação de lipídios (LPO) Os danos causados nos lipídios foram avaliados de acordo com o Método FOX (JIANG et al., 1991, 1992). O princípio do método se baseia na reação dos produtos finais da peroxidação lipídica (malondialdeídos e demais aldeídos de baixo peso molecular) com o ácido tiobarbitúrico (TBA), após acidificação e aquecimento, formam complexos colorimétricos, que consistem nas bases de Schiff., e podem ser determinados espectrofotmetricamente. A cada 150 ml de amostra homogeneizada não centrifugada foram adicionados 300 µL de ácido tricloroacético 10% e 150 µL de TBA 0,67%. As amostras foram incubadas a 70º C por 10 min, e em seguida 200 µL foram pipetados em duplicata em placas pretas e a fluorescência foi determinada a 530 nm de excitação e 590 nm de emissão em leitor fluorímetro. Para o cálculo da concentração de peróxidos lipídicos foi utilizada uma curva padrão de uma solução de tetrametoxipropano (TMP, Sigma Aldrich) a 0,001% diluído nas concentrações de 0,6; 1,5; 3; 4; 6 e 10 mM. Glutationa S-transferase (GST) A atividade da enzima GST foi mensurada de acordo com a formação de um tioéter a partir da reação do substrato CNDB com o GSH, catalisada pela GST (KEEN et al., 1976 com modificações). Na microplaca foram adicionados 20 μL de amostra, acrescidos de 180 μL do meio de reação com uma pipeta multicanal. O meio de reação foi preparado a partir de tampão fosfato a 0,1M pH 6,5; solução de GSH a 3mM (Sigma Aldrich) e solução de CDNB a 3mM (Sigma Aldrich). A absorbância foi medida em um comprimento de onda de 340 nm durante 2 min em intervalos de 12 segundos. A atividade enzimática foi determinada de acordo com o delta absorbância no intervalo de 1 minuto. Glutationa reduzida (GSH) A concentração de Glutationa reduzida (GSH) foi determinada a partir da reação com o DTNB 2,5 mM (ácido 5,5-ditiobis(2-nitrobenzóico). Para precipitação das proteínas das amostras, foi adicionado TCA (ácido tricloroacético) para chegar a uma concentração final 10%. A mistura foi centrifugada e 50 μl do sobrenadante foi pipetado na microplaca seguido de 230 μl de tampão tris-base a 0,4M, pH8,9 e 20 μL de DTNB 2,5mM. A leitura foi realizada a 415 nm e o cálculo foi feito através da equação linear obtida pela curva padrão da GSH (Sigma aldrich) nas concentrações de 160 a 5 μM (diluição seriada). Acetilcolinesterase (AChE) Para avaliar a atividade da AChE foi utilizado o método de ELLMAN et al. (1961) que tem como princípio a hidrólise do substrato acetiltiocolina pela AChE, em tiocolina e acetato. A tiocolina resultante reage com o DTNB gerando o ânion 5-Tio-2- nitrobenzoato responsável pelo aparecimento de coloração amarela que pode ser monitorado pelo aumento de absorbância a 405 nm. Amostras de músculo e cérebro foram descongeladas e homogeneizadas em tampão fosfato pH 7,5. Após a quantificação de proteínas totais das amostras, estas foram diluídas a 1mg proteínas totais .ml-1. Em uma microplaca foram adicionados 20 μL da amostra em duplicata e com uma pipeta multicanal, 130 μL de DTNB 0,75 mM, seguido de 50 μLde iodeto de acetiltiocolina a 9 mM . A leitura foi realizada a 405 nm durante 5 minutos em intervalos de 50 segundos. Análises de Genotoxicidade Danos no DNA por Precipitação alcalina As quebras nas fitas de DNA (single and double strand breaks) decorrentes da exposição aos xenobióticos podem ser quantificadas indiretamente pelo método de precipitação alcalina proposto por Olive (1988), modificado de acordo com Gagné e Blaise, 1995. Para tanto, em 25 μL da amostra homogeneizada não centrifugada foram adicionados 200 μL de SDS 2% (Tampão 10mM Tris, 10mM EDTA, 40mM NaOH) para o rompimento das membranas celulares (nuclear), seguido do acréscimo de 200 μL de KCl a 0,12M para a precipitação do DNA integro associado às proteínas (cromatina). A reação foi acelerada com a incubação da amostra a 60º C por 10 min seguido de um choque térmico a 4º C por 30 min. A amostra foi centrifugada a 8000g por 5 min e 50 μL do sobrenadante foi pipetado em microplaca preta com a adição de 150 μL do Reativo de Hoechst (1 μL/ml em tampão colato de sódio 4mM, NaCl 0,4M e trizma-acetato 0,1M pH 8,5. A fluorescência foi quantificada em leitor fluorímetro com excitação de 360 nm e emissão de 460 nm. O cálculo da concentração de DNA na amostra foi realizado com base na curva padrão obtida em concentrações do DNA de esperma de Salmão (Sigma Aldrich) que variaram de 5 a 200 μg/ml (Tampão 10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA pH 8,0). Teste de Micronúcleo Písceo A frequência de micronúcleos em eritrócitos foi determinada segundo a técnica descrita por Heddle (1973) para a montagem das lâminas. Com o sangue retirado da veia caudal foi realizado um esfregaço numa lâmina de vidro limpa posteriormente fixada com etanol PA por 30 minutos, e corado com laranja de acridina. Foram analisados 2000 eritrócitos por peixe em um aumento de 1000x no microscópio de epifluorescência. Além dos micronúcleos foram contabilizadas as alterações morfológicas nucleares segundo Carrasco et al. (1990) e a frequência de eritrócitos policromáticos segundo Ueda et al. (1992). Análises Moleculares Expressão da Vitelogenina Separação eletroforética das proteínas do plasma Para realizar o preparo da amostra, a concentração de proteínas do plasma foi determinada através do método de Bradford (1976). As proteínas foram reduzidas e desnaturadas com tampão de amostra redutor (Tris HCl 1M pH 6,8, SDS, Glicerol, Azul de bromofenol e  mercapto-etanol). Foram aplicados no gel 60 mg de proteínas por amostra, correspondendo a um volume de 15mL. As proteínas do plasma foram separadas de acordo com o tamanho através da corrida eletroforética em mini-gel de poliacrilamida 4% para gel de empilhamento e 8% para separação com aplicação de campo elétrico vertical. Foi utilizado tampão de corrida para SDS-PAGE (Tris base 25 mM, Glicina 190 mM, SDS 0,1%) e a velocidade foi ajustada para 20 mA por gel com voltagem variada. Foram utilizados marcadores de massa molecular (Rainbow BioRad) para monitoramento do perfil eletroforético da vitelogenina. Para permitir a visualização das bandas formadas após a separação eletroforética, as proteínas foram coradas com Comassie Blue (R250) permanecendo overnight no biomixer. O gel foi lavado com DESTAIN (metanol 50% + ácido acético glacial 15%) para retirar o excesso de corante. Western blotting As proteínas do gel de poliacrilamida separadas por SDS-PAGE foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (BioRad®: poro de 0,45 µm) em uma cuba contendo tampão de transferência (Tris base 25 mM, Glicina 192 mM, SDS 0,037%, metanol 20%). A velocidade da corrida foi ajustada para 100 V, com amperagem variada, durante 60 minutos. Para verificar se as proteínas do gel foram transferidas para a membrana, esta foi corada com corante Ponceau (diluído em ácido acético 1%). Após a lavagem da membrana, para retirada do corante, esta foi bloqueada com leite sem gordura 5% (Molico) em solução de TBS-T (20mM Tris pH 7.4, 120mM NaCl e 0.05% Tween 20) por 1 hora. A membrana foi incubada com anticorpo antivitelogenina (primário) de Rhamdia quelen (MOURA COSTA, 2009) para as amostras de jundiá, enquanto para as amostras de mandi (P. maculatus) foi utilizado antisoro de Geophagus brasiliensis (YAMAMOTO et al., 2017) sob agitação constante por 16 horas a 4º C, numa diluição de 1:3.000 e 1:5.000, respectivamente. As concentrações e reações dos anticorpos com as respectivas amostras foram previamente testadas para a determinação de uma reação sensível e específica para cada tipo de amostra. Após a incubação overnight, a membrana foi lavada com TBST 3 vezes para a remoção dos anticorpos primários não ligados. A membrana foi, então, incubada com anti-imunoglobulina de coelho conjugada à peroxidase (Sigma) por 1 hora numa diluição de 1:4000. A proteína foi visualizada através de um substrato quimioluminescente (Pierce ECL, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) sobre a membrana exposta a um filme de raio-X sensível (Amersham biosence) em um intervalo de até 30 minutos. ELISA competitivo Para uma detecção quantitativa mais sensível da vitelogenina plasmática, foi realizada a técnica de ELISA por competição de acordo com Yamamoto et al. (2017). O princípio da técnica consiste na competição pela ligação do anticorpo primário entre a vitelogenina purificada que está fixada na placa e a vitelogenina da amostra que foi incubada com o anticorpo overnight. Quanto maior a concentração de vitelogenina na amostra (a ser verificada) maior a quantidade de ligações com o anticorpo primário (os quais ficaram incubados overnight). Desta forma haverá menos anticorpos livres (ou disponíveis) para ligação com a vitelogenina fixada na placa. Portanto menos anticorpos primários se ligarão, assim como os secundários, e a reação será menos intensa. A reação é inversamente proporcional à concentração de vitelogenina na amostra. Inicialmente foi necessário testar qual a melhor diluição do anticorpo (1:1.000 - 1:50.000) e a quantidade da vitelogenina purificada aderida na microplaca (10, 20 e 40 ng/poço). Para este ensaio foram utilizadas microplacas de poliestireno com 96 poços (base sólida, NUNC MAXISORP) revestidos com 100 µl de 40 ng de vitelogenina purificada (melhor concentração testada) por poço em tampão carbonato-bicarbonato pH 9,6 e incubados overnight a 4º C. Para determinação de ligações não específicas foi adicionado um branco correspondente a 100 µl de tampão apenas. As placas foram lavadas 3 vezes com tampão de lavagem PBST (PBS pH 7,4 e Tween 20 0,05%) e os espaços vazios foram bloqueados com 200 µl de BSA 1% por 2 horas em temperatura ambiente. Alíquotas de 100µl das amostras de plasma diluídas previamente incubadas overnight a 4ºC com o anticorpo anti-vitelogenina recombinante (1:5.000) produzido pelo Laboratório de Toxicologia Celular (UFPR), e foram pipetadas em duplicata na placa. Para a curva padrão foram realizadas diluições das amostras de vitelogenina recombinante purificada em concentrações conhecidas (15 a 1000 ng de vtg/poço). Após 3 h de incubação, sob agitação constante em agitador orbital em temperatura ambiente, as placas foram lavadas 3 vezes com PBST. Foram adicionados 100 µl de anticorpo de cabra anti-rabbit conjugado dextran-HRP (BioRad®, 1:4000) diluídos em PBST e incubados por 1 hora e m temperatura ambiente. Após a lavagem foram adicionados 100 µl do substrato cromógeno (30 ml de tampão citrato 0,1M pH5,0, 15 mg o- Phenylenediamine (Sigma Aldrich), 15 µl H2O2) com uma pipeta multicanal. Depois de 15 minutos de reação no escuro, foram adicionados 30 µl de H2SO4 1M para parada da reação, e em seguida as placas foram lidas a 490 nm em um espectrofotômetro de microplaca. Para o cálculo, a absorbância média foi descontada do valor “branco” (ligações inespecíficas) e dividida pelo zero (ligação máxima do anticorpo) para determinação da porcentagem de ligação de cada amostra. Foi plotada uma curva padrão onde os valores foram convertidos logaritimamente para obtenção de uma regressão linear. Hormônios esteroides As concentrações de 17-estradiol no plasma dos indivíduos de ambos os sexos (10 indivíduos por sexo, por espécie e por grupo) foram determinadas através do ensaio de ELISA competitivo de acordo com Brown et al. (2003). Primeiramente, os hormônios esteroides foram extraídos através da adição do solvente éter etílico. Para cada 100 μL de plasma foram adicionados 1000 μL de éter etílico PA (Synth), misturados em vórtex por 1 min e congelados instantaneamente em gelo seco. A fração líquida do solvente contendo os hormônios esteroides foi aliquotada em outro microtubo e evaporada à temperatura ambiente dentro da capela com exaustor ligado. Os hormônios aderidos no microtubo foram ressuspendidos em tampão Tris-HCl 20mM, pH 7,4. Neste teste a coloração resultante da reação enzima-substrato é inversamente proporcional à presença do antígeno, já que esta é medida baseada na interação competitiva entre o hormônio-enzima conjugado e o estradiol por um número limitado de anticorpos. Para a realização dos ensaios, microplacas (NUNC Immuno TM plates, Maxisorp) foram cobertas com 50 µL de anticorpo anti-17β estradiol (policlonal R0008; Coralie Munro – Universidade da Califórnia, Davis, CA, USA, diluído 1:10.000). Após a pipetagem, as placas foram acondicionadas a 4ºC, por pelo menos 12 horas. A curva padrão para cada ensaio foi preparada a partir de estradiol (E8875, Sigma-Aldrich) na concentração 25.000 pg/mL, considerado o padrão mais alto. A curva foi diluída 1:1, de forma seriada, com solução de ensaio de ELISA (NaH2PO4; Na2HPO4; NaCl; BSA; pH ajustado para 7,00) oito vezes até chegar nas concentrações de 195 pg/mL, considerado o padrão mais baixo. O hormônio conjugado estradiol-HRP (Coralie Munro – Universidade da Califórnia, Davis, CA, USA) foi diluído 1: 50.000 e mantidos em 4ºC até o momento dos ensaios. A solução do substrato enzimático foi preparada imediatamente antes de sua adição na microplaca e consistia de H2O2 a 0,5M; ABTS (Calbiochem, ABTSTM Chromophore, Diammonium Salt) e solução de substrato para ELISA (ácido cítrico; pH ajustado para 4,00). Ensaios de dosagem: A microplaca já coberta com anticorpos foi lavada por cinco vezes com solução de lavagem de ELISA (NaCl; Tween 20) e o excesso de solução foi retirado batendo-se a placa em papel toalha. Foram pipetados 50µL de solução de ensaio de ELISA (NaH2PO4; Na2HPO4; NaCl; BSA; pH ajustado para 7,00) e as placas foram incubadas durante seis horas, em temperatura ambiente, com agitação suave em agitador Multi- Pulse Vortexer (modelo 099A VB4, 50/60Hz – Glass-Col®), sem pulso e em 200 rpm. Após o período de incubação, as placas foram novamente lavadas e preparadas para o ensaio propriamente dito. Foram pipetados 20 µL das soluções dos padrões, 20 µL das soluções dos controles e das amostras, todos em duplicatas, e 50 µL da solução do marcado enzimático estradiol – HRP em todos os poços, exceto nos poços considerados como branco. A microplaca foi incubada durante duas horas, em temperatura ambiente, com agitação suave em agitador Multi-Pulse Vortexer (modelo 099A VB4, 50/60Hz – Glass- Col®), sem pulso e em 200 rpm. Todo o processo de pipetagem levou, em média, 6 minutos, não ultrapassando 10 minutos. Após a incubação, a microplaca foi lavada novamente e foram adicionados 100 µL da solução do substrato enzimático em cada poço, exceto nos poços considerados como branco. A microplaca foi agitada moderadamente em agitador Multi-Pulse Vortexer (modelo 099A VB4, 50/60Hz – Glass-Col®), sem pulso e em 300 rpm até que os poços considerados como zeros chegassem em densidade óptica (OD) entre 0,7 e 1,0; quando foi feita a leitura da absorbância em 405 nm, no leitor de microplaca TECAN Infinity® 200 Pro. Para os cálculos foram utilizadas planilhas do programa Excel e do programa de estatística Prism GraphPad 8.3.1. Análises Histopatológicas Microscopia de luz As gônadas e fígados coletados para histopatologia foram fixadas em ALFAC (etanol 85%, formol 10% e ácido acético 5%) por 16 h e depois transferidos para Álcool 70%, onde permaneceram até o procedimento de inclusão. Para esta etapa, os órgãos foram desidratados em série crescente de etanol, transferidos para o xilol e paraplast plus (Sigma Aldrich) e em seguida emblocados. Cortes de 5μm de espessura foram obtidos através de Micrótomo Leica e distendidos nas lâminas com solução de albumina 20%. As lâminas foram coradas em Hematoxilina/Eosina e montadas com Entellan (Merck®). O material foi analisado de acordo com uma metodologia proposta por Leino et al., para as gônadas (2005) e Bernet et al., para o fígado (1999), com modificações e as imagens registradas em uma câmera digital acoplada ao microscópio de luz. Foram analisados 15 (ou pelo menos 3) a 20 indivíduos por espécie e por grupo. As principais alterações avaliadas no fígado foram: necroses; infiltração leucocitária; vacuolização; neoplasia; diferenciação tecidual e parasitas. Para cada alteração foi atribuído um fator de importância (w) que varia de 1 a 3 (TABELA 2). A relevância de uma lesão depende de sua importância patológica, ou seja, como ela afeta a função do órgão: 1- Importância patológica mínima, a les