HÉLIO KUSHIMA AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIULCEROGÊNICA DOS EXTRATOS E FRAÇÕES DAS FOLHAS DE Davilla elliptica St. Hil. E Davilla nitida (Vahl) Kubitzki (DILLENIACEAE) ORIENTADORA: PROFA. DRA. CLÉLIA AKIKO HIRUMA-LIMA CO-ORIENTADOR: PROF. DR. WAGNER VILEGAS Botucatu –SP 2006 Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências de Botucatu da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas, Área de Concentração: Farmacologia FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: SELMA MARIA DE JESUS Kushima, Hélio. Avaliação da atividade antiulcerogênica dos extratos e frações das folhas de Davilla elliptica St. Hil.E Davilla nitida (Vahl) Kubitzki (DILLENIACEAE) / Hélio Kushima. – 2006. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Botucatu, 2006. Orientadora: Clélia Akiko Hiruma-Lima Co-orientador: Wagner Vilegas Assunto CAPES: 21000000 1. Farmacologia 2. Plantas medicinais (Cerrado) - Controle biológico CDD 581.634 Palavras-chave: Davilla elliptica; Davilla nitida; Dilleniaceae; Gastroproteção; Plantas medicinais. Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo Auxílio financeiro Agradecimentos À Profa. Dra. Clélia Akiko Hiruma-Lima, por ter me acolhido como seu aluno, mesmo sabendo que sou confuso e esquecido. E por ter se empenhado em orientar e auxiliar nos momentos críticos do meu mestrado. Ao Prof. Dr. Wagner Vilegas seus alunos Clenilson e Daniel, do Departamento de Química Orgânica, Instituto de Química da UNESP de Araraquara- SP, pelo envio dos extratos e frações, e também pela caracterização fitoquímica. À Profa. Dra. Cláudia Helena Pellizzon, do Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências da UNESP de Botucatu-SP pelo auxílio na realização das etapas referentes aos estudos morfológicos, assim como aos seus alunos de iniciação, Paulo (Rita), Ariane (Sponja) e o Guilherme (Da Puta), pelas instruções e por auxiliarem em partes importantes no projeto. À Profa. Dra. Alba Regina Monteiro Souza-Brito, do Departamento de Fisiologia e Bioquímica, Instituto de Biociências da Unicamp, Campinas-SP, por disponibilizar o laboratório. E aos alunos de seu laboratório, Victor, Maíra, Anderson, Fabi, Ana, Elis, Érica, Débora, Cibele, (muitos alunos, com certeza esqueci alguém) pelo auxílio prestado e pela atenção despendida comigo. À Profa. Dra. Lúcia Regina Machado da Rocha por sempre me chamar atenção para coisas importante, como comer, dormir, entregar relatórios no prazo e também por disponibilizar o laboratório para uso À Profa. Dra. Regina Kiomi Takahira, do laboratório de Análises Clínicas do Hospital Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP de Botucatu-SP, por disponibilizar o uso dos equipamentos para as análises de toxicidade. À FAPESP, pelo auxílio financeiro sem o qual não teria desenvolvido o projeto (proc. no 04/06207-7). A todos do laboratório, os moleques (Fábio-Nervoso, Thiago-Mingo, Victor- Cebóla, Roney) e as meninas (Raquel-Pocotó, Enxente, Melada, Zeila, Paty, Caty, foram muitas que passaram pelo laboratório) pelo coleguismo e auxílio no desenvolvimento do projeto. Aos colegas de pós-graduação principalmente ao Léo, Érica, Aline, Carol, Deborah, que sempre prestaram auxílio com relação a dúvidas acadêmicas e não me deixavam perdido em meio a todos. A todos os docentes de diferentes departamentos do Instituto de Biociências que prestaram auxílio em diferentes pontos do mestrado, mas como são muitos docentes não tenho condição de lembrar de todos. Aos funcionários dos departamentos de farmacologia e de fisiologia (Lú, Cris, Tardivo, Paulão, Luis, Aninha) pelo auxílio no projeto pelas diferentes ações realizadas (informações, cópias, gelo e materiais diversos para experimento). Aos funcionários da seção de pós-graduação (Sérgio, Luciene, Maria Helena), por atenderem meus pedidos e solucionarem problemas para mim. E claro, a todos meus amigos que moraram comigo nas repúblicas “Juntinho no Escurinho” e “Kitanai”, mas também da “Coronel Cachaça”, como tem muitos nomes não tenho condição de escrever o nome de todos, mas mando um grande abraço pra todo mundo. E um efusivo abraço de agradecimento ao Funga e a Kero, que me ajudaram pra caramba me dando apoio na minha via profissional e pessoal. Eu sei que esqueci de muitas pessoas que foram importantes na minha vida profissional e pessoal durante o mestrado, porém eu não tenho culpa de ter a memória fraca. A parte de Agradecimentos está sendo a última porção da dissertação a ser digitada, é muito natural não conter todas as pessoas. Àqueles que eu não citei não fiquem decepcionados e peço desculpas. E agradeço de coração a todos que me ajudaram. 1 Prólogo O projeto de mestrado possibilitou a formação específica em farmacologia, com os estudos direcionados para a caracterização de atividade farmacológica de produtos naturais, sendo o objeto alvo dos estudos as úlceras pépticas. Durante a execução do projeto de mestrado, várias outras atividades foram realizadas, no intuito de enriquecer a formação profissional do aluno. Dentre estas atividades estão: Apresentação de trabalhos em Eventos Científicos • Kushima, H.; Rinaldo, D.; Hiruma-Lima, C. A.; Vilegas, W.; Rocha, L. R. M. Avaliação farmacológica de Davilla elliptica em modelos de indução de lesão gástrica, apresentado durante a XX Reunião Anual de Federação de Biologia Experimental-FeSBE, realizada na cidade Águas de Lindóia –SP, no período de 24 a 27 de agos to de 2005. • Kushima, H.; Rodrigues, C. M.; Hiruma-Lima, C. A.; Vilegas, W.; Rocha, L. R. M. Avaliação da ativdade antiúlcera de Davilla nitida (Dilleniaceae) em modelos agudos de indução de lesão gástrica, apresentado durante a XX Reunião Anual de Federação de Biologia Experimental-FeSBE, realizada na cidade Águas de Lindóia –SP, no período de 24 a 27 de agosto de 2005. • Kushima, H.; Hiruma-Lima, C. A.; Coelho-Ferreira, M.; Santos, M.A.C.; Lamarão, C. Efeitos de duas plantas Amazônica: Pradosia huberi (Ducke) Ducke e Himatanthus sucuuba (Spruce ex Müll. Arg.) Woodson, apresentado no XXXVI Congresso Brasileiro de Farmacologia e Terapêutica Experimental, realizado em Águas de Lindóia- SP, de 17 a 20 de outubro de 2004. • Hiruma-Lima C.A.; Kushima H.; Rocha L.R.M.; Cola M.; Brito A.R.M. S.; Rinaldo D.; Santos L.C.; Vilegas W. Evaluation of the gastroprotective activity • of Davilla elliptica: a brazilian “Cerrado medicinal plant, apresentado no XIII Congresso Italo-Latino Americano de Etnomedicina, realizado em Salerno, Espanha, de 22 a 25 de setembro de 2004. Disciplinas cursadas • Tópicos de atualização em Ciências (3 créditos, 45 horas-aula). • Testes estatísticos aplicados à farmacologia (4 créditos, 60 horas-aula). • Plantas medicinais (3 créditos, 45 horas-aula). • Bioquímica aplicada (3 créditos, 45 horas-aula). • Farmacologia do trato digestório (2 créditos, 30 horas-aula). • Classificação de receptores farmacológicos (3 créditos, 45 horas-aula). • Produtos naturais: validação de novos fármacos (4 créditos, 60 horas-aula) Realização estágio, cursos e participação em Eventos Cientíticos • Participação como ouvinte V Simpósio e V Reunião de Avaliação do Programa Biota/Fapesp e do mini-curso “A riqueza farmacológica da biodiversidade”, realizado na cidade Águas de Lindóia – SP, no período de 15 a 18 de novembro de 2005. • Mini-curso “Bioterismo e Ciclo circadiano em ensaios biológicos” ministrado durante o V Workshop de Pós-Graduação em Ciências Biológicas – “Pós- Graduação = Garantia de Emprego?”, realizado no Instituto de Biociências , UNESP-Botucatu, no período de 04 a 06 de novembro de 2005. • Participação como ouvinte do XX Reunião Anual da Federação de Sociedades de Biologia Experimental-FeSBE e o curso de “Organização neural do sistema de temporização circadiano”, realizado na cidade de Águas de Lindóia – SP, no período de 24 a 27 de agosto de 2005. • Aula ministrada durante o II Curso de extensão de fisiologia animal, realizado no Instituto de Biociências da UNESP- Campus de Botucatu, no período de 18 a 29 de julho de 2005, no total de 8 horas-aula. Aula ministrada durante o I Curso de extensão de fisiologia animal, realizado no Instituto de Biociências da UNESP- Campus de Botucatu, no total de 8 horas-aula, no período de 10 a 21 de janeiro de 2005. • Estágio docência, junto a disciplina de “Fisiologia”, carga horária total de 150 horas, do curso de Nutrição, Instituto de Biociências da UNESP- Campus de Botucatu, no período de 14 a 20 de novembro de 2004. • Participação como ouvinte do curso “Segurança química e m laboratórios didáticos e de pesquisa” (16 horas), realizado anfiteatro Casa da Arte da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP – Campus de Botucatu, nos dias 26 de agosto, 02,09 e 16 de setembro de 2004. • Participação como ouvinte do IV Workshop de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: “Conhecimento Científico: porque e para quem?” e do mini-curso “ Mecanismos gerais da resposta adaptativa ao estresse: habituação, sensibilização e sistema óxido nítrico (6 horas), realizado no Instituto de Biociências da UNESP- Campus de Botucatu, no período de 4 a 6 de novembro de 2004. • Participação como ouvinte do VI workshop de plantas medicinais e do mini- curso “Isolamento de produtos naturais” (6 horas) realizado no Instituto de Biociências da UNESP- Campus de Botucatu, nos dias 25 e 26 de julho de 2004. Artigos submetidos em periódicos especializados • Rodrigues, C. M.; Rinaldo, D.; Sannoiya, M.; Santo, L. C.; Kushima, H.; Hiruma-Lima, C. A.; Souza Brito, A. R. M.; Montoro, P.; Pizza, C.; Piacente, S.; Vilegas, W. Isolation and high-performance liquid chromatographic analyses of • flavonoids and phenolic compounds from Davilla nitida Vahl (Dilleniaceae). Journal of Chromatography A, submetido. • Rinaldo D.; Silva M.A.; Rodrigues C.M.; Sannomiya M.; Santos, L.C.; Kushima H.; Hiruma-Lima C.A.; Souza-Brito A.R.M.; Vilegas W. FAST PREPARATIVE SEPARATION OF FLAVONOIDS FROM THE AERIAL PARTS OF Davilla elliptica ST. HILL. BY HIGH-SPEED COUNTER- CURRENT CHROMATOGRAPHY. Química Nova, In press, 2006. • Hiruma-Lima C.A.; Andrade F.D.P.; Kushima H.; Pellizzon C.H.; Silveira G.G.; Vasconcelos P.C.P.; Villegas W.; Souza-Brito A.R.M. Evaluation of the antiulcer activity of Qualea grandiflora Mart.: a Brazilian "Cerrado" medicinal plant. Journal of Ethnopharmacology, In press, 2005. • Kushima H.; Hiruma-Lima C.A.; Santo M.A.; Viana E.; Coelho-Ferreira M.; Souza-Brito A.R.M. Gastroprotective activity of Pradosia huberi on experimentally induced gastric lesions in rodents: role of endogenous sulphydryls and nitric oxide. Journal of Ethnopharmacology, 101, 61-67, 2005. ÌNDICE I. INTRODUÇÃO 1 I.1. PLANTAS MEDICINAIS 1 I.2. AS ÚLCERAS PÉPTICAS 2 I.3. AS PLANTAS UTILIZADAS 4 II OBJETIVOS 6 III MATERIAIS E MÉTODOS 7 III.1. ANIMAIS 7 III.2. PLANTAS 7 III.3.AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE FARMACOLÓGICA DOS EXTRATOS 9 III.3.1. Toxicidade aguda e “Screening” hipocrático 9 III.3.2. Atividade Gastroprotetora 9 A. Lesões gástricas 9 B. Modelo de indução de úlcera por HCl/etanol 10 C. Indução de úlcera por etanol absoluto 11 D. Indução de úlcera por droga antiinflamatória não estereoidal (DAINE) 11 E. Estresse por contenção e frio 11 III.3.3. Mecanismo de Ação Antiulcerogênica dos Extratos 12 A. Úlceras induzidas pela ligadura de piloro e avaliação dos parâmetros do suco gástrico 12 B. Determinação do papel dos grupamentos sulfidrílicos na gastroproteção 13 C. Determinação do papel do Óxido Nítrico (NO) na gastroproteção 13 D. Determinação da motilidade intestinal 14 E. Avaliação da atividade cicatrizante 14 1) Análises Morfológicas 15 a) Avaliação macroscópica 15 b) Microscopia de luz 15 c) Morfometria 16 d) Imunohistoquímica 17 e) IMicroscopia eletrônica 17 2) Avaliação da atividade tóxica subaguda dos extratos 17 III.4. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE FARMACOLÓGICA DAS FRAÇÕES DE D. elliptica E D. nitida 18 III.4.1. Atividade Gastroprotetora e Mecanismos de Ação 18 A. Dose empregada nos experimentos com frações 18 B. Indução de úlcera por etanol absoluto 18 C. Determinação do papel do óxido nítrico (NO) na gastroproteção 19 D. Determinação do papel dos grupamentos sulfidrílicos na gastroproteção 19 E. Úlceras induzidas pela ligadura de piloro e avaliação dos parâmetros do suco gástrico 20 F. Determinação dos níveis de prostaglandina E2 basal da mucosa gástrica 20 III.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA 20 IV. RESULTADOS 22 IV.1. Davilla elliptica 22 IV.1.1. Atividade biológica do extrato etanólico de D. elliptica (DeEtOH) 22 A.“Screening” hipocrático e toxicidade aguda 22 B- Modelo de indução de úlcera por HCl/Etanol 23 C. Modelo de indução de úlcera por Etanol absoluto 24 D. Modelo de indução de úlcera por droga antiinflamatória não-esteriodal (Piroxicam) 25 E. Estresse por contenção e frio 25 F. Úlceras induzidas pela ligadura de piloro e avaliação dos parâmetros do suco gástrico 26 G. Determinação do papel dos grupamentos sulfidrílicos na gastroproteção 28 H. Determinação do papel do Óxido Nítrico (NO) na gastroproteção 29 I . Determinação da motilidade intestinal 30 J. Avaliação das atividades cicatrizantes e tóxica de DeEtOH 30 IV.1.2. Atividade farmacológica das frações enriquecidas de D. elliptica 38 A. Indução de úlcera por etanol absoluto 38 B. Determinação do papel do óxido nítrico (NO) na gastroproteção 48 C.Determinação do papel dos grupamentos sulfidrílicos na gastroproteção 50 D. Úlceras induzidas pela ligadura de piloro e avaliação dos parâmetros do suco gástrico 51 E. Determinação dos níveis de prostaglandina E2 basal da mucosa gástrica 51 IV.2. Davilla nitida 54 IV.2.1. Atividade biológica do extrato metanólico de D. nitida (DnMeOH) 54 A. “Screening” hipocrático e toxicidade aguda 54 B. Modelo de indução de úlcera por HCl/etanol 55 C. Modelo de indução de úlcera por Etanol absoluto 56 1 D. Modelo de indução de úlcera por droga antiinflamatória não-esteriodal (Piroxicam) 57 E. Úlceras induzidas pela ligadura de piloro e avaliação dos parâmetros do suco gástrico 57 F. Determinação do papel dos grupamentos sulfidrílicos na gastroproteção 59 G. Determinação do papel do Óxido Nítrico (NO) na gastroproteção 59 H. Determinação da motilidade intestinal 60 I. Avaliação das atividades cicatrizantes e tóxicas de DnMeOH 61 IV.2.2. Atividade farmacológica das frações enriquecidas de D. nitida 66 A. Indução de úlcera por etanol absoluto 66 IV.3. RESUMO DOS RESULTADOS 77 V. DISCUSSÃO 82 VI. CONCLUSÃO 96 VII. VIII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 97 ANEXO RESUMO A partir da indicação popular de Davilla elliptica (lixeirinha), para gastrites e distúrbios do trato gastrintestinal, foram realizados experimentos para avaliação da atividade gastroprotetora e cicatrizante dos extratos de etanólico de D. elliptica e metanólico de D. nitida (cipó de fogo). A seleção da espécie D. nitida baseou-se nos estudos quimiotaxonomicos, pois esta não apresenta, até o presente, indicação popular no combate a úlceras gástricas. Após a comprovação dos efeitos gastroprotetores de ambas espécies em modelos experimentais de indução de lesões gástricas por etanol acidificado, etanol absoluto, Piroxicam, estresse (contenção e frio) ( p < 0.05) os estudos passaram a ser realizados no intuito de se caracterizar os mecanismos envolvidos em tais atividades. A atividade gastroprotetora do extrato etanólico de D. elliptica indicou ter relação com os grupamentos sulfidrílicos (p < 0.05), porém não se evidenciaram relações de efeito antisecretor, óxido nítrico e motilidade intestinal (p > 0.05), enquanto o extrato metanólico D. nitida não forneceu dados do envolvimento de nenhum desses parâmetros analisados. A partir dos fracionamentos, foram obtidas três frações diferentes, sendo denominadas frações de flavonoides, taninos e aquosa. Com a realização do experimento inicial de lesão gástrica induzida por etanol absoluto, comprovou-se atividade gastroprotetora somente com o uso de duas frações de D. elliptica (aquosa e taninos) (p < 0.05). Experimentos subseqüentes demonstraram que os taninos de D. elliptica apresentam uma atividade gastroprotetora relacionada a uma ação um possível envolvimento do óxido nítrico e ciclooxigenase 2 como promotores da gastroproteção. Abstract Starting from the popular indication of Davilla elliptica (lixeirinha), for gastritis and gastrointestinal disturbances treatment, experiments were accomplished for gastroprotective activity and healing evaluation of the D. elliptica ethanolic extract and D. nitida methanolic extract (cipó-fogo). The D. nitida selection based on quimiotaxonomic studies, because it doesn't have, until the present, popular indication for peptic ulcer treatment. After gastroprotective effects proof from both species in experimental models of gastric lesions induction by acidified ethanol, absolute ethanol, Piroxicam, stress (contention and cold) (p <0.05) the studies passed to be accomplished with intention to characterize the mechanisms involved in that activities. The gastroprotective activity of D. elliptica ethanolic extract has indicated relationship with the sulphydrilic compounds (p <0.05), however relationships to antisecretory effect, nitric oxide and intestinal mobility didn’t evidence (p > 0.05), while the D. nitida methanolic extract didn't supply involvement data with none analyzed parameters. Starting from fractionation, three different fractions were obtained, designated flavonoids, tannins and aqueous fractions. Through initial gastric lesion experiment induced by absolute ethanol, it was proven gastroprotective activity only with two D. elliptica fractions (aqueous and tannins) of all used (p < 0.05). Posterior experiments demonstrated that the tannins of D. elliptica present a gastroprotective activity related to a possible action involving nitric oxide and cyclooxigenase 2 as gastroprotetion promoters. 1 I. INTRODUÇÃO I.1. PLANTAS MEDICINAIS O uso de plantas medicinais é milenar e difundido por todo o mundo, seja no uso em rituais mágicos/religiosos (Firenzouli et al., 2005) ou como medicamento (Li & Ohizumi, 2004). O emprego empírico de produtos naturais era e continua sendo, uma das formas usuais de se buscar cura e alívio para moléstias, ferimentos e males de conceituação popular, que sempre acompanharam o homem. Com a revolução industrial, deu-se o desenvolvimento da química orgânica e de produtos sintéticos para tratamentos farmacológicos (Rates, 2001). A fácil aceitação e a preferência pela drogas sintéticas se deve, em parte, a acessibilidade, eficácia e segurança desses produtos. Hoje o emprego de plantas medicinais, como medicamento, ainda é de grande importância em todo o mundo (Kinghorn, 2002), apesar de muitas vezes ser ineficiente. De acordo com a Organização Mundial de Saúde, 80% da população mundial faz uso de plantas medicinais, sendo a maioria de países em desenvolvimento (Gurib-Fakim, 2006). Dentre os fatores que definem o emprego popular das plantas nos cuidados com a saúde, está o alto preço dos medicamentos industrializados (Rates, 2001). Em termos históricos, a pesquisa de plantas medicinais tomou impulso após o isolamento da morfina no século 19 (Balunas et al., 2005). Plantas e seus derivados são as maiores fontes de drogas, movimentando cerca de 30% do mercado farmacêutico (Kirkpatrick et al., 2002). De acordo com Newman et al. (2003), entre os anos de 1981 e 2002, de 877 novas moléculas introduzidas no mercado, em torno de 49% eram substâncias isoladas de produtos naturais, semi-sintéticos, derivados de produtos naturais ou então moléculas sintetizadas tomando como modelo estruturas de origem 2 natural. Além disso, das drogas descobertas em estudos com produtos naturais, 25% pertencem ao grupo das plantas superiores (Gurib-Fakim, 2006). A possibilidade de se encontrar novas moléculas a partir de produtos naturais é imensurável (GürBüz et al., 2003). Porém, o estudo de novos compostos a partir de espécies vegetais é oneroso. Para que uma nova droga seja lançada ao mercado, gasta-se em torno de 100 a 360 milhões de dólares e no mínimo 10 anos de trabalho. Estima-se que a probabilidade de sucesso para a obtenção de novos compostos seja de 1 molécula ativa para cada 10.000 moléculas estudadas. Esses dados são referentes ao panorama de países desenvolvidos que selecionam plantas de maneira randômica aumentando os custos e o tempo gasto para se conseguir novas drogas. Mas o estudo de plantas medicinais não se restringe apenas a procura de novas moléculas, pois essas plantas podem ser empregadas em diferentes formulações, como em infusões, tinturas, extratos, frações ou no desenvolvimento de fitoterápicos (Rates, 2001). Para se realizar pesquisa com plantas medicinais, deve-se ter critérios adequados na seleção das espécies vegetais para se obter sucesso na investigação farmacológica. Segundo Holetz et al. (2002), a escolha com base no conhecimento popular (etnofarmacologia) seria óbvia, devido ao acumulo milenar das informações, o que aumenta a possibilidade de se descobrir novos compostos. Porém, a seleção com base nos constituintes químicos (potencialmente ativos) encontrados em um dado gênero ou família torna-se interessante principalmente pela possibilidade de se encontrar quantidades elevadas de compostos ativos. I.2. AS ÚLCERAS PÉPTICAS As úlceras pépticas são lesões na mucosa gástrica e duodenal provocadas por um desequilíbrio entre os fatores protetores (muco, bicarbonato, fluxo sangüíneo adequado, NO, prostaglandina, dentre outros) e lesivos (pepsina, ácido clorídrico, H2O2, OH -, O2 -, 3 dentre outros). Estas lesões podem ser desencadeadas e agravadas pelo estresse, consumo excessivo de álcool, tabagismo, uso de drogas antiinflamatórias do tipo não- esteroidais (DAINEs) e pela presença de Helicobacter pylori no trato gastrointestinal (Wallace & Granger, 1996; Maity et al., 2003). Hoje a grande maioria das pesquisas científicas envolvendo úlceras pépticas, direciona-se principalmente para o estudo de H. pylori ou aponta esta infecção bacteriana e as DAINEs como os maiores responsáveis pela incidência desta moléstia (Watanabe & Chiba, 2002). H. pylori está presente em quase 50% da população mundial e as DAINEs são as drogas de maior uso; porém, nem todos os indivíduos infectados pela bactéria ou que se utilizam de drogas antiinflamatórias manifestam gastrites ou desenvolvem úlceras pépticas (Go, 1997; Bauer & Marker-Hermann, 2003; Perua, 2004). Fatores como estresse, alcoolismo, fumo também são importantes no desenvolvimento desta moléstia (Suzuki et al., 1998; Maity et al., 2003; Spirt, 2004). Assim, se pode dizer que a etiologia da doença não apresenta definição frente à tamanha diversidade de relações possíveis para o seu surgimento. A úlcera péptica foi considerada a maior causa de morbidade e mortalidade por mais de um século (Chan & Leung, 2002). Ela ainda é considerada um grande fator sério de morbidade, havendo alto índice de morte em casos extremos, como em úlceras hemorrágicas promovidas pelo estresse (Sontaj, 1997; Spirt, 2004). Nos Estados Unidos, aproximadamente 4 milhões de pessoas apresentam úlceras pépticas, sendo que a cada ano 350 mil novos casos são relatados, 100 mil pacientes são hospitalizados e pelo menos 3000 pessoas morrem em decorrência dessa enfermidade (Cotram, 1999). A importância clínica das úlceras pépticas levou ao desenvolvimento de drogas capazes de aliviar os sintomas e até mesmo possibilitar a cura. Drogas tais como as pertencentes à família de antagonistas de receptores H2 (cimetidina) ou de inibidores de bomba protônica (lansoprazol) são efetivas e muito utilizadas no tratamento dos 4 sintomas; porém, o uso prolongado dessas drogas pode levar a efeitos adversos como risco de câncer (La Vechia & Tavani, 2002; Raghunath et al., 2005). Isso demonstra a necessidade de mais estudos para a compreensão desta doença, assim como a busca por métodos e drogas capazes de promover a sua remissão. Schmeda-Hirschmann & Yesilada (2005) recentemente apresentaram a grande variedade de substâncias químicas isoladas, mistura de ervas e extratos de plantas cujas atividades terapêuticas foram comprovadas em modelos experimentais de indução de úlcera, o que indica, portanto, o importante potencial das plantas e de seus princípios ativos na descoberta de novas terapêuticas para as úlceras pépticas. I.3. AS PLANTAS UTILIZADAS As plantas estudadas neste trabalho pertencem à família Dilleniaceae, que é composta por 11 gêneros (Acrotrema, Curatella, Davilla, Didesmandra, Dillenia, Doliocarpus, Hibertia, Pachynema, Pinzona, Schumacheria e Tetracera) sendo formada por cerca de 400 espécies (Biodiversity, 2004). São representadas por plantas arbóreas, arbustivas e lianas, que apresentam folhas alternas inteiras, peninérveas, sem estípulas e no geral com sílica impregnada nas células epidérmicas tornando-as ásperas ao toque (Barroso et al., 1978 apud Oliveira & Castro, 2003). A espécie Davilla elliptica St. Hil. é uma planta arbustiva de até três metros de altura, encontrada freqüentemente no Cerrado, Campo Cerrado, Cerradão e Campo Cerrado sobre encosta (Silva et al. 2001). Conhecida popularmente como sambaibinha, muricizinho, lixeirinha, lixeira e lixinha, apresenta como indicações medicinais o uso da infusão da planta em banhos para tratar de hematomas; as raízes servem para o tratamento de hemorróidas, possui ainda efeito adstringente, tônico e laxativo sob a forma de infusão. É utilizada no tratamento de hérnias (cataplasma) e como 5 anticoncepcional. O infuso das folhas é utilizado no combate a diarréia e úlceras gástricas (Pott & Pott, 1994; Silva et al. 2001; Rodrigues & Carvalho, 2001) e o banho com suas folhas frescas é indicado em caso de linfatismo, inchações e orquites (Rodrigues & Carvalho, 2001). Até o presente não existem estudos farmacológicos relatados para esta espécie. Estudos fitoquímicos preliminares com a espécie D. elliptica tem relatado a presença de compostos fenólicos, saponinas, cumarinas, terpenos, alcalóides, esteróides e flavonóides em sua constituição (Calvo, et al. 2002). Davilla nitida (Vahl) Kubitzki conhecida popularmente como sambaibinha, cipó-de-fogo e lixeirinha de rama é um arbusto trepador encontrado no Cerrado e pode atingir quatro metros de altura. Até o presente não existem trabalhos envolvendo esta planta quanto as suas propriedades farmacológicas e composição fitoquímica. Estudos fitoquímicos indicam que outra espécie do mesmo gênero, a Davilla rugosa Poreit, apresenta em sua constituição flavonóides, saponinas e mucilagens (Matheucci, 1996). As atividades farmacológicas já relatadas para D. rugosa incluem atividade antiúlcera do caule e estimulante da atividade motora dos ramos sendo que todas as atividades foram atribuídas as frações mais polares (Guaraldo et al. 2000; 2001). A potencialidade de D. nitida apresentar ações farmacológicas, em vista de uma correlação taxonômica sustentada pelos compostos encontrados em membros do mesmo gênero, foi decisiva na sua escolha como alvo de estudo deste trabalho. 6 II. OBJETIVOS 1-Avaliar as atividades gastroprotetoras dos extratos e frações de Davilla elliptica e Davilla nitida 2-Caracterizar os efeitos citoprotetor, cicatrizante e/ou antisecretor dos extratos e frações de ambas as espécies. 7 III. MATERIAIS E MÉTODOS III.1. ANIMAIS Foram utilizados camundongos Swiss albinos machos (25-40g) e ratos machos Wistar (150-200g), para os experimentos de lesões gástricas e determinação dos mecanismos de ação antiulcerogênica, provenientes do Biotério Central da UNESP- Botucatu, aclimatados às condições do biotério setorial por pelo menos sete dias antes da manipulação experimental, sob temperatura (23 ± 2°C) e ciclo claro-escuro de 12 horas controlado. Os animais foram alimentados com ração Guabi® e água ad libitum. Todos os experimentos obedeceram a protocolos experimentais (no 017, 018, 019, 020, 021 e 022/04-CEEA; no 018 e 019/05-CEEA) aprovados, previamente pela Comissão de Ética na Experimentação Animal, do Instituto de Biociências da UNESP – Botucatu. O número de animais por grupo experimental variou de 5 a 21. III.2. PLANTAS As folhas de Davilla elliptica e Davilla nitida foram coletadas, respectivamente, em Monte do Carmo e Palmas, estado do Tocantins, pela Profa. Dra. Clélia A. Hiruma- Lima, da UNESP, Campus de Botucatu - SP. A identificação botânica ficou a cargo da Profa. Solange Lolis e as exsicatas depositadas no Herbário da Universidade Federal do Tocantins sob os números 4583 (D. elliptica) e 3849 (D. nitida). As folhas de D. elliptica e D. nitida foram devidamente secas e trituradas em moinho de faca. Os extratos e frações de ambas espécies foram obtidos a partir do seguinte esquema de extração (figura 1). 8 Os solventes utilizados na extração, assim como, os rendimentos dos extratos e frações podem ser evidenciados na tabela 1. Folhas (500 mg) Trituração e adição de 2 mL de solvente apolar por 7dias (3 vezes) Extrato Apolar Extrato Polar Maceração com 2 mL de solvente polar por 7dias (3 vezes) Partição acetato/água (1:1) Fr. aquosa Fr. de flavonoides Fr. de taninos Figura 1 – Figura esquemática da técnica de extração para obtenção dos extratos e frações de Davilla elliptica e Davilla nitida Tabela 1 - Efeito do extrato etanólico de D. elliptica sobre o processo de cicatrização em lesões causadas por ácido acético Davilla elliptica Davilla nitida Solventes Rendimentos dos extratos Solventes Rendimentos dos extratos EtOH 18,69% MeOH 11,7% CH2Cl2 1,80% CHCl3 1,11% Frações Rendimentos Frações Rendimentos Aquosa 10% Aquosa 17% Flavonoides 10% Flavonoides 26% Taninos 80% Taninos 57% 9 A partir dos rendimentos das frações pode-se constatar que os constituintes majoritários de ambas espécies são os taninos, havendo muito mais taninos na constituição de D. elliptica. III.3. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE FARMACOLÓGICA DOS EXTRATOS III.3.1 Toxicidade aguda e “Screening” hipocrático. Estudos foram realizados a fim de se constatar possíveis efeitos tóxicos agudos dos extratos que podem estar relacionados a alterações de comportamento, a ocorrência de mortes e de modificações macroscópicas de órgãos vitais como fígado, rins, coração, baço e pulmão. Foram utilizados camundongos Swiss machos, divididos aleatoriamente em grupos para os respectivos tratamentos: salina (controle) e extratos de DeEtOH e DnMeOH na dose única submáxima de 5000 mg/kg. Os tratamentos foram realizados pela via oral (p.o.) e os parâmetros comportamentais observados, foram aqueles descritos por Malone & Robichaud (1962) e Souza Brito (1994), sendo as análises feitas aos 30, 60, 120, 240 e 360 minutos após a administração dos extratos (anexo1). Os parâmetros de toxicidade aguda foram monitorados através do registro do número de mortes de animais por grupo. Como parâmetro adicional de toxicidade, o peso dos animais foi monitorado durante 14 dias após o início do experimento e ao final deste período todos os animais foram sacrificados para análise dos órgãos vitais. Estes foram devidamente pesados, no intuito de se avaliar possíveis alterações morfológicas detectadas macroscopicamente. III.3.2 Atividade Gastroprotetora A. Lesões gástricas 10 Para avaliar a atividade antiulcerogênica dos extratos e direcionar os estudos de fracionamento, foram realizados experimentos de indução de úlcera gástrica com base em fatores etiológicos da doença no homem como estresse, drogas antiinflamatórias não esteroidais e o álcool. Cada modelo experimental apresenta os seus respectivos grupos controle positivo (cimetidina, lansoprazol ou carbenoxolona) e negativo (salina) dependendo da especificidade de cada modelo. Os animais, antes de cada tratamento, foram mantidos em gaiola especial (para evitar coprofagia), sem maravalha e com água ad libitum. Em todos os experimentos de indução de úlcera, as lesões ulcerativas foram medidas e classificadas de acordo com a severidade (Szelenyi & Thiemer, 1978) em lesões nível 1 (pontos hemorrágicos < 1mm), nível 2 (úlceras de 1 a 3 mm de extensão) e nível 3 (úlceras profundas > 3mm de extensão). Para cada grupo de tratamento foi calculado um índice de lesões ulcerativas (I.L.U.) obtido através da equação: I.L.U. = (∑∑∑∑ lesões nível 1) + (2 X ∑∑∑∑ lesões nível 2) + (3 X ∑∑∑∑ lesões nível 3) B. Modelo de indução de úlcera por HCl/Etanol Este método foi baseado no modelo de Mizui & Doteuchi (1983), com modificações. Após 24 horas de jejum, os grupos experimentais, compostos por camundongos Swiss machos, foram tratados com os respectivos extratos 50 min. antes da indução de lesão gástrica por etanol acidificado. Grupos de animais receberam lansoprazol 30 mg/kg (controle positivo), salina (controle negativo) e os extratos nas doses 100, 250 e 500 mg/kg. Todos os tratamentos foram feitos por via oral, em dose volume final de 10 mL/kg e a ulcerogênese foi induzida pela administração de 0,2 mL da solução lesiva de 0,3M HCl/etanol 60%. Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical 1 hora após a administração do agente lesivo, os estômagos retirados, o pH do suco gástrico determinado e os estômagos abertos ao longo da grande 11 curvatura para então serem prensados em placas de vidro, escaneados e realizados os procedimentos de medida e classificação das lesões gástricas pelo I.L.U. C. Indução de úlcera por Etanol absoluto Baseado no modelo descrito por Morimoto et al. (1991), ratos Wistar machos foram divididos aleatoriamente em grupos para seus respectivos tratamentos (salina, lansoprazol 30 mg/kg e extratos nas doses de 100, 250 e 500 mg/kg). Cada tratamento foi administrado por via oral em dose volume de 10 mL/kg. Decorridos 60 minutos, 1mL do agente lesivo (etanol 99,5%) foi aplicado em todos os animais. Transcorrido 1 hora deste tratamento, todos os animais foram sacrificados e os estômagos foram analisados de acordo com os procedimentos descritos previamente. D. Indução de úlcera por Droga Antiinflamatória Não Esteroidal (DAINE) O experimento foi realizado segundo a metodologia descrita por Rainsford (1987), com modificações. Foram utilizados camundongos Swiss, machos de 30g, submetidos a jejum por um período de 36 horas. As lesões gástricas foram induzidas pela administração de Piroxicam na dose de 30mg/kg, por via subcutânea. Os tratamentos (p.o.) com os extratos nas doses de 100, 250 e 500 mg/kg, cimetidina 100 mg/kg (controle positivo) e salina (controle negativo) foram realizados 30 minutos antes da administração dos agentes indutores. Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical 4 horas após o estímulo lesivo para a retirada dos estômagos e posterior quantificação das lesões gástricas (I.L.U.). E. Estresse por contenção e frio A metodologia utilizada foi a descrita por Levine (1971) com modificações. Após 36 horas de jejum, os camundongos foram tratados com o extrato (100, 250 e 500 12 mg/kg), cimetidina 100 mg/kg (controle positivo) e salina (controle negativo), por via oral (10 ml/Kg), 30 minutos antes do estímulo indutor das lesões gástricas por estresse. O estresse foi produzido através da imobilização das patas dianteiras e traseiras do animal e sua contenção através de contensores de PVC com 11 cm de comprimento x 3,8 cm de diâmetro. Estes contensores foram imediatamente dispostos em geladeira (4°C), por um período de 4 horas. Após este tempo os animais foram mortos por deslocamento cervical, os estômagos retirados e abertos no sentido da maior curvatura para a contagem e classificação das lesões gástricas, como descrito anteriormente. III.3.3. Mecanismos de ação antiulcerogênica dos extratos A. Úlceras induzidas pela Ligadura de piloro e avaliação dos parâmetros do suco gástrico. Foi adotado o modelo descrito por Shay (1945) com modificações, onde os parâmetros do suco gástrico foram avaliados sob o efeito dos extratos administrados oral ou intraduodenalmente no intuito de avaliar o efeito local ou sistêmico dos extratos. Após 24 horas de jejum os camundongos, sob anestesia, sofreram uma incisão longitudinal logo abaixo da apófise xifóide para a amarradura do piloro. A administração das amostras vegetais (500 mg/kg), cimetidina 100 mg/kg (controle positivo) ou salina (controle negativo), foi realizada logo após a amarradura, por via intraduodenal ou 30min. antes nos tratamentos por via oral. A dose única dos extratos (500 mg/kg) foi utilizada com base nos resultados obtidos nos experimentos anteriores, por ser considerada a mais efetiva em indução de proteção. Logo após a ligadura do piloro, suturou-se as incisões e 4 horas após a cirurgia os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical e a incisão reaberta. Logo em seguida foi realizada uma ligadura da cárdia (para preservação do conteúdo gástrico) para a retirada do estômago. O conteúdo estomacal foi coletado e, em seguida, 13 determinado o volume do suco gástrico, o pH e a concentração de íons hidrogênio na secreção gástrica através de titulação com NaOH 0,01N em bureta digital modelo EM, através da fenolftaleína como indicador. A concentração total de ácido foi expressa em mEq/ml/4h e o pH determinado por fitas de pH (Merck®, Alemanha). Quando possível, as lesões gástricas foram avaliadas segundo o cálculo do I.L.U. B. Determinação do papel dos grupamentos sulfidrílicos na gastroproteção (Matsuda et al. 1999). Ratos Wistar machos permaneceram em jejum por 24 horas. Os animais foram separados em 6 grupos, onde 3 grupos sofreram administração de uma injeção intraperitoneal de NEM (N-ethilmaleimida), enquanto os 3 restantes receberam salina pela mesma via. A droga NEM apresenta a propriedade de quelar as pontes de dissulfeto, responsáveis pela manutenção da conformação barreira mucosa. Cada animal, dos grupos correspondentes, recebeu um volume de 10mL/kg numa dose de 10mg/kg de NEM. Decorridos 30 minutos, cada grupo experimental recebeu (p.o.) seu tratamento correspondente (salina, carbenoxolona 100 mg/kg e extratos 500 mg/kg). Depois de 60 minutos, os animais receberam um volume fixo de 1mL de etanol absoluto (p.o), sendo sacrificados após 1 hora deste último tratamento. Os estômagos foram retirados e abertos pela grande curva, para então suas lesões serem medidas e o I.L.U. calculado. C. Determinação do papel do Óxido Nítrico (NO) na gastroproteção (Arrieta et al. 2003). Ratos Wistar machos em jejum por 24 horas, foram divididos em 6 grupos, onde 3 receberam injeção intraperitoneal de L-NAME (N-nitro-L-arginina metil ester), inibidor da NO-sintase, enquanto os outros 3 grupos receberam salina pela mesma via. Após 30 14 minutos, os grupos sofreram administração oral dos respectivos tratamentos (salina, carbenoxolona 100 mg/kg e extratos 500 mg/kg). Após 60 minutos, os animais foram tratados pela via oral com 1mL de etanol absoluto 99,5%. Os animais foram sacrificados após 1 hora, os estômagos removidos e abertos na grande curvatura de maneira a permitir a contagem e avaliação das lesões para se calcular o índice de lesão ulcerativa. D. Determinação da motilidade intestinal. Seguindo o método descrito por Baggio et al. (2003), camundongos Swiss macho, em jejum de 6h e divididos em 5 grupos, receberam seus respectivos tratamentos orais: salina, atropina 5 mg/kg e extratos (100, 250 e 500 mg/kg). Após trinta minutos, todos os animais receberam carvão ativado 10% p.o. num volume de 10mL/kg. Os animais foram sacrificados 30 min. após o último tratamento. O passo seguinte foi retirar todo o intestino delgado juntamente com o estômago, para medir o comprimento total do intestino e a distância percorrida pelo carvão ativado. Os dados obtidos foram transformados em uma relação de distância percorrida e comprimento total do intestino para análise estatística. E. Avaliação das atividades cicatrizante (Okabe & Amagase, 2005) Os animais foram aleatoriamente divididos em 3 grupos, pesados e anestesiados com éter para a realização de uma incisão longitudinal logo abaixo da apófise xifóide. A parede anterior do estômago foi exposta e um volume de 0,05 ml de ácido acético a 30%, injetado na camada submucosa da junção do fundo com o antro. Imediatamente em contato com o ácido, houve a formação da lesão hemorrágica profunda. Logo em 15 seguida, realizou-se a sutura e os animais retornaram ao biotério em caixas de contenção normais, com alimento e água ad libitum para sua completa recuperação. Os animais foram tratados durante 14 dias com salina, cimetidina 100 mg/kg e os extratos na dose de 250 mg/kg. Após o tratamento de 14 dias, todos os animais foram sacrificados e tiveram os estômagos retirados, para avaliação macroscópica da área de cicatrização, realização das análises morfológicas e de toxicidade. 1) Análises Morfológicas a) Avaliação macroscópica Os estômagos dos animais submetidos aos tratamentos, após sua retirada, foram abertos pela curvatura maior e as lesões foram medidas no maior e menor diâmetro para posterior cálculo da área. A área foi calculada com base na fórmula a seguir: A = πRr; onde A = área total calculada; R = Raio maior; r = raio menor da lesão. b) Microscopia de luz O material destinado à microscopia de luz foi fixado em solução de ALFAC (formalina 30%; álcool 80%; ácido acético), após distender cuidadosamente a amostra em uma placa de isopor e fixada com alfinetes, por 24 horas, a temperatura ambiente. As peças foram desidratadas e incluídas em paraplast. Posteriormente, os blocos foram cortados em 10 µm de espessura em micrótomo de maneira semi-seriada, onde foi coletado todo corte múltiplo de cinco até aproximadamente 20% do volume da peça. As lâminas cortadas por esse método semi-seriado foram submetidas à coloração de hematoxilina e eosina (H&E) (Behmer et al., 1976) e PAS (Periodic Acid of Schiff; Vacca, 1985), sendo destinadas para a execução de análises morfológica e morfométrica. 16 c) Morfometria A análise morfométrica foi feita no analisador de imagens Leica Q-Win Standard Versão 3.1.0 (Reino Unido) acoplado ao microscópio Leica DM existente no laboratório de analises de imagens do Setor de Histologia do Departamento de Morfologia, sob a orientação da Profa. Dra. Claudia Helena Pellizzon. As medidas das áreas de regeneração e da mucosa normal foram feitas por medidas lineares da luz até a muscular da mucosa (figura 2), seguindo a metodologia descrita por Ishiara & Ito (2002), com modificações. Além das medidas semi-automáticas, descritas acima, foram também realizadas contagens das células positivamente marcadas para as diversas reação imunohistoquímicas em número de campos fixos. A. Representação da região não lesada onde: M= Mucosa, composta de epitélio de revestimento e suas glândulas, lâmina própria e a muscular da mucosa; S= Submucosa; Me= Muscular externa; Se= Serosa. B. Região lesada, onde a seta indica a submucosa exposta. R= Área de regeneração; M1= Epitélio de revestimento mais glândulas e lâmina própria; M2= Muscular da mucosa; S= Submucosa; Me= Muscular externa; Se= Serosa; I= Invasão de células do tecido conjuntivo (modificado de Ishihara & Ito, 2002). Figura 2: Esquema representativo da região do estômago, onde foi realizado o experimento. 17 d) Imunohistoquímica Como mais um indicativo de mecanismo de ação e avaliação de efeito cicatrizante do extrato, lâminas histológicas foram preparadas para a realização de marcação especificas de células em processo de proliferação celular com o anticorpo NCL-PCNA (Nova Castra®), marcador de células em fase S (síntese) da interfase, que necessita de recuperação antigênica através de microondas e tampão citrato 0.01M (Kitajima et al., 1995). e) Microscopia eletrônica Amostras representativas dos estômagos foram fixados em glutaraldeído 3% overnight a 4 ºC, e processado rotineiramente no Centro de Microscopia Eletrônica do Instituto de Biociências de Botucatu, onde os cortes ultrafinos foram analisados no microscópio eletrônico de transmissão, modelo CM-10 - Philips, levando-se em consideração alterações ultraestruturais em decorrência da administração dos extratos. 2) Avaliação da atividade tóxica subaguda dos extratos Como parâmetros adicionais de atividade biológica, foram avaliados os possíveis efeitos tóxicos subagudos dos extratos sobre os animais submetidos ao tratamento diariamente com os extratos durante 14 dias. Os parâmetros analisados foram peso corporal e da análise macroscópica dos órgãos vitais: coração, pulmões, fígado, baço e rins. Além disso, o sangue dos animais foi coletado para análise de alterações de parâmetros bioquímicos e enzimáticos, que compreendem a avaliação dos níveis séricos de γ-GT (gama glutamiltransferase), uréia, creatinina, AST (aspartato aminotransferase) e ALT (alanina aminotransferase), quantificados utilizando-se o analisador bioquímico automático SBA-200 e kits cinéticos e colorimétricos CELM®, Brasil, disponibilizado 18 para uso pelo laboratório de Análises Clínicas do Hospital Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP, Campus de Botucatu, sob orientação da Profa. Dra. Regina.Kiomi Takahira. III.4. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE FARMACOLÓGICA DAS FRAÇÕES DE D. elliptica E D. nitida III.4.1. Atividade gastroprotetora e mecanismos de ação A. Doses empregadas nos experimentos com frações As doses das frações de 25, 50 e 100 mg/kg de foram determinadas a partir da uma relação com aquelas empregadas nos controles positivos (30 mg/kg para o lansoprazol, 100 mg/kg para cimetidina ou carbenoxolona). Uma vez que as drogas padrão são substâncias puras, o uso de doses similares a desses controles e a comprovação de atividade gastroprotetora pelo uso das frações (mistura de várias substâncias), indicariam sua potencia, havendo um direcionamento dos estudos para a elucidação dos mecanismos ação envolvidos com tal atividade. B. Indução de úlcera por Etanol absoluto (Morimoto et al., 1991) Este modelo foi realizado como descrito anteriormente. Após o sacrifício dos animais, os estômagos foram removidos para a medida das lesões. Parte das amostras foram imersas em solução fixadora (ALFAC) para a inclusão em parafina e confecção de lâminas histológicas. Diferentes protocolos de coloração e imunohistoquímicos foram realizados no intuito de se caracterizar mecanismo de ação de ambas as plantas, sendo eles: • Hematoxilina-Eosina – cora estruturas basófilas e acidófilas (Behmer et al., 1976); 19 • PAS (Periodic Acid of Schiff)– cora especificamente muco (Vacca, 1985); • HSP 70 (Heat Shock Protein) - anticorpo SC1060, Santa Cruz Biotechnology® ( Guo et al., 2002); • COX 2 (Ciclooxigenase 2) – anticorpo 160106, Cayman Chemical® (Berenguer et al., 2002) • SOD (Superóxido Dismutase) – anticorpo SC 8637, recuperação antigênica com uso de microondas (Miranda et al., 2000). C. Determinação do papel do Óxido Nítrico (NO) na gastroproteção (Arrieta et al. 2003). Foi utilizado o mesmo protocolo descrito anteriormente, onde os alvos de investigação foram as frações enriquecidas na dose única de 100 mg/kg. Após o sacrifício dos animais os estômagos foram removidos e abertos na grande curvatura de maneira a permitir a contagem e avaliação das lesões para se calcular o índice de lesão ulcerativa. D. Determinação do papel dos grupamentos sulfidrílicos na gastroproteção (Matsuda et al. 1999). Seguindo a descrição do modelo experimental dada anteriormente, tendo como alterações, o uso de frações na dose única de 100 mg/kg, buscou-se a relação dos grupamentos sulfidrílicos com a atividade gastroprotetora das frações. Após o sacrifício dos animais os estômagos foram retirados e abertos pela grande curva, para então suas lesões serem medidas e o I.L.U. calculado. 20 E. Úlceras induzidas pela Ligadura de piloro e avaliação dos parâmetros do suco gástrico. Através do mesmo modelo experimental de Shay (1945) descrito anteriormente no estudo como os extratos, estudou-se a atividade das frações (na dose 100 mg/kg) sobre o suco gástrico. F. Determinação dos níveis de prostaglandina E2 basal da mucosa gástrica Após 18 horas de jejum, ratos Wistar machos foram divididos em 4 grupos, onde 2 receberam injeção subcutânea de indometacina (30 mg/kg), enquanto os outros 2 grupos receberam salina pela mesma via. Trinta minutos depois, os grupos sofreram administração oral dos respectivos tratamentos (salina e frações 100 mg/kg). Passados 30 minutos os animais foram sacrificados e seus estômagos retirados para o preparo do material. A porção do corpo estomacal foi raspada para a retirada da mucosa gástrica, em seguida pesada e suspensa em 1mL de tampão fosfato de sódio (10 mM) de pH 7.4. O tecido foi homogeneizado com o uso de um Polytron PT-10-35 (Kinematica AG- Switzerland) e incubado em banho-maria, a 37oC por 20 minutos. A prostaglandina E2 contida no tampão foi mensurada com o uso de um kit imunoenzimático (RPN222- Amersham) e a leitura realizada em leitor de ELISA. III.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA Os resultados foram expressos na forma de média ± desvio padrão ou mediana e intervalos interquartis (Q1 e Q3) dos parâmetros avaliados. Os valores obtidos foram submetidos à análise de variância de uma via (ANOVA), seguida pelo teste de Dunnet ou Kruskal-Wallis e teste posterior de Dunn, quando o número de grupos era maior que 2. Na análise entre dois grupos, recorreu-se ao uso do teste “t” de Student ou Mann- 21 Whithney. As análises estatísticas utilizadas obedeceram a classificação (paramétricos ou não-paramétrico) de acordo com cada experimento executado, onde a significância mínima considerada foi de p < 0.05. 22 IV. RESULTADOS IV.1. Davilla elliptica IV.1.1. Atividade biológica do extrato etanólico de D. elliptica (DeEtOH) A.“Screening” hipocrático e toxicidade aguda A administração da dose de 5000 mg/kg de DeEtOH não provocou alterações nos parâmetros comportamentais analisados (dados não apresentados) quando comparados aos obtidos com o grupo de animais tratados com salina. O monitoramento diário dos pesos dos animais não indicou variação significativa em relação ao grupo controle negativo (figura 3) e também não ocorreram mortes durante o período de observação. Outro parâmetro analisado foi o peso relativo dos órgãos, obtidos da razão entre o peso do órgão e peso total do animal que foi transformada em Arcoseno para fins de adequação estatística. Após a realização do teste “t” de Student, verificou-se a não existência de diferença significativa ( p > 0.05 ) entre os grupos (tabela 2). 36 38 40 42 44 46 48 50 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Dias P e s o ( g ) Salina DeEtOH 5g/kg Figura 3 – Evolução do peso corporal (g) de camundongos tratados com dose única do extrato etanólico de D. elliptica (DeEtOH)(5g/kg) 23 Dados da razão dos órgãos e peso corpóreo expressos em média (arcoseno) ± erro padrão da média. B- Modelo de indução de úlcera por HCl/Etanol DeEtOH apresentou significativo efeito gastroprotetor com a maior dose utilizada do extrato (500 mg/kg), obtendo-se 65% de proteção, em relação ao grupo controle negativo, muito próximo do resultado obtido com o lansoprazol (69%). As menores doses do extrato também apresentaram redução das lesões, porém não expressaram efeito de importância estatística (figura 4). Tabela 2 - Efeito da administração aguda do extrato etanólico de D. elliptica (DeEtOH) sobre os órgãos dos animais Tratamentos (p.o.) N Fígado Coração Pulmão Rins Mortalidade Salina 06 12,28 ± 0,24 4,13 ± 0,10 4,58 ± 0,15 6,41 ± 0,21 0 DeEtOH 5g/kg 07 12,34 ± 0,35 4,00 ± 0,10 4,56 ± 0,07 6,42 ± 0,17 0 0 35 70 105 140 175 210 Salina Lansoprazol DeEtOH 100mg/kg DeEtOH 250mg/kg DeEtOH 500mg/kg * 69% 34% 56% * 65% Tratamentos (p.o.) I. L .U . Medianas e intervalo Q1 e Q3 dos índices de lesões ulcerativas dos grupos experimentais (n=6-7). Os números de porcentagem indicam a proteção em relação à salina. * p < 0.05 (Kruskall, Dunn). Figura 4 – Ação do extrato etanólico de D. elliptica (DeEtOH) em modelo de indução de úlcera por HCl/Etanol em camundongos 24 C. Modelo de indução de úlcera por Etanol absoluto A dose de 500 mg/kg de DeEtOH apresentou o melhor efeito gastroprotetor, com promoção de 96% de proteção em relação ao grupo tratado com salina, porém em decorrência da severidade do agente lesivo, os animais tratados com lansoprazol não apresentaram o efeito gastroprotetor esperado (p > 0.05), mas sua atividade antisecretória pode ser comprovada pela observação do aumento do pH (figura 5), que foi observada somente neste grupo. Medianas e intervalo Q1 e Q3 dos índices de lesões ulcerativas e pH dos grupos experimentais (n=5-6). Os números de porcentagem indicam a proteção em relação a salina. * p < 0.05 e ** p < 0.01 (Kruskall -Wallis, Dunn) 0 4 8 12 16 20 Salina Lansoprazol DeEtOH 100mg/kg DeEtOH 250mg/kg DeEtOH 500mg/kg Tratamentos (p.o.) pH * 30mg/kg Figura 5 - Efeito do extrato etanólico D. elliptica no modelo de indução de úlcera por etanol absoluto em ratos 0 35 70 105 140 175 210 Salina Lansoprazol DeEtOH 100mg/kg DeEtOH 250mg/kg DeEtOH 500mg/kg Tratamentos (p.o.) 19% 07% 65% ** 96% I. L .U . (m m ) I. L .U . 25 D. Modelo de indução de úlcera por droga antiinflamatória não-esteroidal (Piroxicam) O extrato novamente apresentou efeito gastroprotetor, em relação ao grupo controle negativo, na maior dose (500 mg/kg) e pode-se observar uma tendência de redução da quantidade das lesões gástricas (figura 6) de maneira dose-dependente. E. Estresse por contenção e frio DeEtOH apresentou ação gastroprotetora, em relação aos animais do grupo controle negativo, nas doses de 250 e 500 mg/kg, com proteção da mucosa gástrica de 83% e 75%, respectivamente, frente as lesões induzidas pelo estresse (figura 7). Medianas e intervalo Q1 e Q3 dos índices de lesões ulcerativas dos grupos experimentais (n=8). Os números de porcentagem indicam a proteção em relação à salina. ** p < 0.01 (Kruskall -Wallis, Dunn) Figura 6 - Efeito do extrato etanólico de D. elliptica (DeEtOH) em modelo de indução de úlcera por droga antiinflamatória não esteroidal (Piroxicam) em camundongos 0 10 20 30 40 50 60 Salina Cimetidina 100mg/kg DeEtOH 100mg/kg DeEtOH 250mg/kg DeEtOH 500mg/kg Tra tamentos (p.o.) I. L .U . ( m m ) 30% 65% ** 74% 60% I. L .U . 26 F. Úlceras induzidas pela ligadura de piloro e avaliação dos parâmetros do suco gástrico Neste modelo, DeEtOH foi capaz de inibir em 73% (p < 0.05) as lesões gástricas induzidas pelo acúmulo de suco gástrico em animais submetido a ligadura de piloro quando administrado intraduodenalmente, mas o mesmo efeito não foi observado com a administração oral do DeEtOH (p > 0.05). Os demais parâmetros analisados (concentração de íons hidrogênio, volume de suco gástrico e pH) não foram alterados pela administração oral quanto duodenal do extrato (figura 8). Figura 7 - Efeito do extrato etanólico de D. elliptica (DeEtOH) em úlcera causada pelo estresse por imobilização e frio em camundongos Medianas e intervalo Q1 e Q3 dos índices de lesões ulcerativas dos grupos experimentais (n=4-11). Os números de porcentagem indicam a proteção em relação à salina. ** p < 0.01 e *** p < 0.005 (Kruskall - Wallis, Dunn). 0 30 60 90 120 150 180 Salina Cimetidina 100mg/kg DeEtOH 100mg/Kg DeEtOH 250mg/Kg DeEtOH 500mg/kg 61% 14% *** 83% ** 75% I. L .U . Tratamentos (p.o) 27 0 3 6 9 12 15 Tratamentos p H Intraduodenal Oral ** 0 4 8 12 16 20 24 Tratam entos C o n c e n tr a ç ã o d e H id ro g ê n io ( m E q /L ) Intraduodenal Oral * Figura 8 – Efeito da administração oral ou intraduodenal do extrato etanólico de D. elliptica no modelo de ligadura de piloro em camundongos 0 1 2 3 4 5 T r a tam e n to s V o lu m e d o c o n té u d o g á s tr ic o ( m L ) Sa lin a C im e t idin a 1 0 0 m g/k g D eE t O H 5 0 0 m g/k g In tr a d u o d e n a l O r a l * * Medianas e intervalo Q1 e Q3 dos índices de lesões ulcerativas, concentração de hidrogênio, volume de suco gástrico e pH dos grupos experimentais (n=9- 10). * p < 0.05 e ** p < 0.01 (Kruskall -Wallis, Dunn). 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 T r a tam e n to s I. L .U . (m m ) Sa lin a C im e t idin a 1 0 0 m g/k g D eE t O H 5 0 0 m g/k g * * 8 3 % 6 7% In tr aduodena l O ra l * 7 3% * 7 3% I. L .U . 27 28 G. Determinação do papel dos grupamentos sulfidrílicos na gastroproteção A administração da droga NEM intraperitonealmente (i.p.) provocou aumento expressivo das lesões gástricas em comparação aos grupos pré-tratados com salina pela mesma via. É possível verificar essa diferenciação em termos estatísticos pelas barras transversas traçadas no gráfico (figura 9) de maneira a comparar os pré-tratamentos com NEM e salina (i.p.). Em ambos os casos, o tratamento com DeEtOH apresentou uma proteção significativa (p < 0.05), ao promover 99% de redução das lesões no tratamento com salina (i.p.) e de 51% nos animais pré-tratados com NEM. Porém a depleção dos grupamentos sulfidrílicos reduziu de forma significativa o efeito gastroprotetor pelo tratamento com DeEtOH. Medianas e intervalos Q1 e Q3 dos índices de lesões ulcerativas dos grupos experimentais (n=6-7), com as respectivas porcentagens de proteção, * p < 0.05 e ** p < 0.01 (Kruskall - Wallis, Dunn). As barras transversais comparam as diferenças entre os pré-tratamentos com salina e NEM, **p < 0.01, ***p < 0.005 (Mann-Withney). Figura 9 - Efeito do extrato etanólico de D. elliptica (DeEtOH) frente ao depletor de grupamentos sulfidrílicos endógenos (NEM) em modelo de úlcera por Etanol I. L .U ( m m ) Pré-tratamentos (i.p.) 0 50 100 150 200 250 300 350 Salina Carbenoxolona 100 mg/kg DeEtOH 500mg/kg Salina NEM * 92% *** 99% 03% 51% *** ** Tratamentos orais *I. L .U . Grupos 29 H. Determinação do papel do Óxido Nítrico (NO) na gastroproteção A droga L-NAME foi capaz de aumentar os índices de lesão gástricos em ambos grupos controles (positivo e negativo), em relação aos grupos pré-tratados com salina. Mas a aplicação do inibidor de NO não exerceu alterações significante nos animais que receberam DeEtOH pela via oral, pois estes apresentaram significativa gastroproteção (94%) em relação ao seu respectivo grupo controle, enquanto os animais pré-tratados com salina apresentaram 97% de proteção (figura 10). Medianas e intervalos Q1 e Q3 dos índices de lesões ulcerativas dos grupos experimentais (n=7), com as respectivas porcentagens de proteção, ** p < 0.01 (Kruskall -Wallis, Dunn). As barras transversais comparam as diferenças entre os pré-tratamentos com salina e L-Name, *p < 0.05 **p < 0.01 (Mann-Withney). Figura 10 - Efeito do extrato etanólico de D. elliptica (DeEtOH) frente ao inibidor de NO endógeno (L-NAME) em modelo de úlcera por Etanol 0 50 100 150 200 250 300 350 Salina Carbenoxolona 100mg/kg DeEtOH 500 mg/kg Salina L-Name ** 97% 75% 24% ** 94% * ** Tratamentos orais Grupos I. L .U 30 I . Determinação da motilidade intestinal Neste modelo não foi possível observar modificações significativas do trânsito intestinal dos animais tratados com diferentes doses de DeEtOH, mas em todas as doses foi possível constatar um leve aumento da motilidade, porém não de maneira a se observar uma curva dose-efeito (figura 11). Medianas e intervalos Q1 e Q3 da razão entre distância percorrida e tamanho total do intestino dos grupos experimentais (n=7). p > 0.05 (Kruskall -Wallis, Dunn). J -Avaliação das atividades cicatrizante e tóxica de DeEtOH A atividade cicatrizante do extrato DeEtOH (250 mg/kg) foi avaliada 14 dias após a indução da lesão com ácido acético. DeEtOH foi capaz de diminuir o tamanho das lesões (borda externa) em comparação ao grupo de animais tratados com salina e mostrou-se mais efetiva que a cimetidina 100 mg/kg na cicatrização das lesões (tabela 3). Figura 11 – Efeito do extrato etanólico de D. elliptica (DeEtOH) sobre a motilidade intestinal de camundongos 0 0,5 1 1,5 2 Salina Atrop ina 5mg/kg DeEtOH 100mg/kg DeEtOH 250mg/kg DeEtOH 500mg/kg R el aç ão e n tr e d es lo ca m en to e co m p ri m en to d o in te st in o 31% +25% +15% +17% Tratamentos (p.o.) 31 A partir da análise das lâminas de H&E é possível notar que o tratamento com DeEtOH 250mg/kg promove um alongamento das glândulas mucosas localizadas na região de regeneração, enquanto os tratamentos com salina e cimetidina 100mg/kg não se observa tal organização (figura 12). As lâminas marcadas com o anticorpo de PCNA (marcador específico de proliferação celular), não demonstraram alteração de intensidade da coloração com a administração de DeEtOH (figura 13). As análises das lâminas coradas com PAS (cora especificamente muco), não esboçaram um aumento diferencial da produção de muco em relação à salina (figura 14). Mas ao microscópico eletrônico de transmissão, a liberação de muco pelas glândulas mucosas torna-se mais evidenciada quando comparado aos animais submetidos aos tratamentos com a salina (figura 15). Tratamentos Doses mg N Borda interna % de cicatrização Borda externa % de cicatrização Salina 10mL/kg 06 0,74 ± 0,09 -- 2,50 ± 0,29 -- Cimetidina 100 07 0,62 ± 0,09 16 2,08 ± 0,37 16 DeEtOH 250 08 0,58 ± 0,08 21 1,35 ± 0,13* 46 Dados de média ± erro padrão da média das áreas de lesão (cm2) dos diferentes tratamentos. * p < 0.05, Anova, Dunnet. Tabela 3 - Efeito do extrato etanólico de D.elliptica sobre o processo de cicatrização em lesões causadas por ácido acético em ratos 32 S a li n a C im e ti d in a 1 0 0 m g /k g D e E tO H 2 5 0 m g /k g # # * * * * * * As setas indicam a submucosa exposta. Observar em # a organização linear das glândulas tubulosas, e * a organização pouco linear das mesmas glândulas. Figura 12 – Cortes histológicos de lesões estomacais produzidas por ácido ácetico corados com H&E do efeito de cicatrização do extrato etanólico de Davilla elliptica (DeEtOH). 33 Figura 13- Análise histológica de estômagos de rato tratados com salina (10ml/Kg), cimetidina (100 mg/Kg) e Davilla elliptica (DeEtOH) 250mg/Kg, por 14 dias, em imunohistoquímica por PCNA S a li n a C im e ti d in a 1 0 0 m g /k g D e E tO H 2 5 0 m g /k g Notar que na região de re-organização da mucosa não se observa muitas células PCNA positivas (cor marrom, indicadas pelas setas) em todos os grupos. 34 Salina DeEtOH 250mg/kg Cimetidina 100mg/kg As setas indicam a presença de glândulas contendo muco. Figura 14 – Efeito do extrato etanólico de D. elliptica (DeEtOH) em lâminas histológicas coradas com PAS, durante 14 dias tratamento sobre produção de mucos em experimento lesão gástrica induzida por ácido acético. 35 S a li n a C im e ti d in a 1 0 0 m g /k g D e E tO H 2 5 0 m g /k g Figura 15 – Eletromicrografia de amostras de estômagos submetido a indução de úlcera por ácido acético e tratado por 14 dias com Salina, Cimetidina e extrato etanólico de Davilla elliptica (DeETOH). “n” indica núcleo, asterisco (*) a luz da glândula estomacal e a seta grânulos de secreção sendo liberado para luz. 36 A esses dados aliam-se as medidas morfométricas do epitélio da mucosa gástrica, que indicam uma redução significativa da altura do epitélio de regeneração nos animais tratados com cimetidina 100mg/kg e DeEtOH 250mg/kg em relação ao controle negativo (figura 16). Os estudos de toxicidade de DeEtOH 250mg/kg a partir do monitoramento diário do peso corporal (figura 17), da relação peso órgão/corpo (tabela 4) e da análise dos parâmetros séricos (tabela 5) não indicaram efeitos tóxicos subagudos pela administração de DeEtOH 250mg/kg durante 14 dias. Medianas e intervalos Q1 e Q3 da altura da região de regeneração dos diferentes tratamentos (n= 6-8). *** p < 0.005 (Kruskall -Wallis, Dunn). 0 300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 Salina Cimetidina 100mg/kg DeEtOH 250mg/kg Tratamentos (p.o.) *** *** µ m Figura 16 – Efeito do extrato etanólico de D. elliptica (DeEtOH) sobre parâmetro morfométrico (altura) da região de regeneração em lesões gástricas causadas por ácido acético em ratos 37 Tratamentos (p.o.) AST U/L ALT U/L γ-GT U/L Creatinina mg/dL Uréia mg/dl Salina 239 (186-273) 57,3 (51,3-67,3) 14,9 (12,8-19,5) 2,45 (2,37-2,57) 160 (146-175) Cimetidina 191 (188-227) 50,8 (48,7-62,6) 15 (12,1-22,1) 2,40 (2,30-2,55) 160 (159-174) DeEtOH 250mg/kg 223 (194-248) 65,5 (58-70,8) 12,5 (10,6-19,5) 2,40 (2,15-2,75) 150 (139-164) Tratamentos (p.o) N Fígado Coração Pulmões Rins Baço Mortalidade Salina 0 6 11,85 ± 0,12 3,76 ± 0,08 4,64 ± 0,14 5,38 ± 0,07 3,89 ±0,19 0 Cimetidina 100mg/kg 0 7 11,53 ± 0,23 3,64 ± 0,07 4,33 ± 0,15 5,14 ± 0,1 3,25 ±0,16 0 DeEtOH 250mg/kg 0 8 11,35 ± 0,16 3,63 ± 0,04 4,88 ± 0,2 5,11 ± 0,06 3,14 ± 0,11 0 100 140 180 220 260 300 340 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Dias de tratamento (p.o) P e s o ( g ) Salina Cimetidina 100 mg/kg DeEtOH 250mg/kg Médias dos pesos diários dos grupos experimentais (n=6-8). p > 0.05 (Anova, Dunnet). Tabela 4- Efeito da administração subaguda do extrato etanólico de D. elliptica (DeEtOH) sobre os órgãos vitais em ratos submetidos ao modelo de indução lesões gástricas por ácido acético Dados da razão dos órgãos e peso corpóreo expressos em média (arcoseno) ± erro padrão da média. Figura 17- Evolução do peso corporal de ratos frente ao tratamento diário com D. elliptica durante 14 dias em experimento de indução de lesões gástricas por ácido acético Tabela 5- Efeito da administração subaguda do extrato etanólico de D.elliptica sobre parâmetros bioquímicos de toxicidade em ratos submetidos ao modelo de indução de lesões gástricas por ácido acético Medianas e intervalos Q1 e Q3 dos parâmetros bioquímicos obtidos dos diferentes grupos experimentais (n=6-8) após 14 dias de tratamento diário. p > 0.05 (Kruskall -Wallis, Dunn). 38 IV.1.2. Atividade farmacológica das frações enriquecidas de Davilla elliptica A- Indução de úlcera por Etanol absoluto (Morimoto et al., 1991) Neste experimento foi constatada a atividade gastroprotetora das frações de DeAq e DeTan somente na maior dose utilizada neste experimento (100mg/kg). DeFla não apresentou atividade gastroprotetora neste modelo em nenhuma das doses avaliadas (figura 13). 0 50 100 150 200 250 300 350 Salina Lansoprazol DeFla 25mg/kg DeFla 50mg/kg DeFla 100mg/kg Tratamentos (p.o.) I. L .U . (m m ) 30% 9% -37% -13% 0 50 100 150 200 250 300 Salina Lansoprazol DeAq 25mg/kg DeAq 50mg/kg DeAq 100mg/kg Tratamentos (p.o.) I. L .U . (m m ) 30% ** 79%42% -39% Figura 18- Efeito das frações aquosa (DeAq), de flavonoides (DeFla) e taninos (DeTan) de D. elliptica em úlceras induzidas por etanol absoluto I. L .U . I. L .U . 39 0 50 100 150 200 250 300 350 Salina Lansoprazol DeTan 25mg/kg DeTan 50mg/kg DeTan 100mg/kg Tratamentos (p.o.) I. L .U . (m m ) 30% ** 71% -5% -74% A análise das lâminas histológicas da região da mucosa gástrica coradas de H&E, obtidas a partir do modelo de indução de lesões por etanol absoluto, demonstrou haver lesões, muitas vezes acompanhadas de hemorragia e inflamação da mucosa, principalmente nas menores doses das frações e nos grupos tratados com salina. Observa-se nas imagens das três frações (figura 19), que na dose de 100mg/kg não há lesões como nas demais doses, mostrando um efeito na conservação da integridade da mucosa. As lâminas coradas com PAS indicam uma produção/liberação pronunciada de muco pelas frações DeTan e DeFla (figura 20). Medianas e intervalo Q1 e Q3 dos índices de lesões ulcerativas dos grupos experimentais (n=5 -21). Os números de porcentagem indicam a proteção em relação à salina. ** p < 0.01 (Kruskall -Wallis, Dunn). I. L .U . 40 S a li n a L a n s o p ra z o l 3 0 m g /k g D e A q 25mg/k g 50mg/k g 100mg/k g Figura 19 -Cortes histológicos de estômagos submetidos ao modelo de indução de úlcera por etanol tratado com frações em diferentes concentrações de Davilla elliptica corados com H&E. As setas indicam pontos hemorrágicos. 41 D e F la D e T a n 25mg/kg 50mg/kg 100mg/kg 42 S a li n a L a n s o p ra z o l 3 0 m g /k g D e A q 25mg/kg 50mg/kg 100mg/kg Figura 20 - Cortes histológicos de estômagos submetidos ao modelo de indução de úlcera por etanol tratado com frações em diferentes concentrações de Davilla elliptica corados com PAS. As setas indicam secreção de muco. 43 D e T a n D e F la 25mg/kg 50mg/kg 100mg/kg 44 A contagem manual de células marcadas com o anticorpo de HSP 70 demonstrou haver um aumento de sua expressão nas menores doses, sendo reduzidas na dose de 100mg/kg nas três frações analisadas (figura 21) . 0 6 12 18 24 30 36 Salina Lansoprazol 30mg/kg DeAq 25mg/kg DeAq 50mg/kg DeAq 100mg/kg Tratamentos (p.o.) N ú m e ro d e c é lu la s H S P 7 0 p o s it iv a s 0 7 14 21 28 35 Salina Lansoprazol 30mg/kg DeFla 25mg/kg DeFla 50mg/kg DeFla 100mg/kg Tratamentos (p.o.) N ú m e ro d e c é lu la s H S P 7 0 p o s it iv a s * Figura 21- Efeito das frações aquosa (DeAq), de flavonóides (DeFla) e taninos (DeTan) de D. elliptica sobre a expressão de HSP 70 em modelo de indução de úlceras por etanol absoluto 45 0 4 8 12 16 20 Salina Lansoprazol 30mg/kg DeTan 25mg/kg DeTan 50mg/kg DeTan 100mg/kg Tratamentos (p.o.) N ú m e ro d e c é lu la s H S P 7 0 p o s it iv a s Para avaliar a participação da ciclooxigenase 2 (COX 2) na gastroproteção, as células marcadas com o anticorpo foram contadas manualmente. Os resultados indicam uma significativa presença de células que expressam COX 2 na mucosa de animais tratados com a fração DeAq 50m/kg. Observa-se também um aumento gradativo da expressão de COX 2 nos tratamentos com a fração de tanino (dose-dependente), enquanto a fração de flavonóides não esboçou atividade referente a ativação de COX 2 (figura 22). Medianas e intervalo Q1 e Q3 do número de células marcadas com o anticorpo de HSP 70 nos diferentes grupos (n=5 -21). * p < 0.01 (Kruskall -Wallis, Dunn). 46 0 20 40 60 80 100 Salina Lansoprazol 30mg/kg DeAq 25mg/kg DeAq 50mg/kg Tratamentos (p.o.) N ú m e ro d e c é lu la s C O X 2 p o s it iv a s * 0 20 40 60 80 100 Salina Lansoprazol 30mg/kg DeFla 25mg/kg DeFla 50mg/kg DeFla 100mg/kg Tratamentos (p.o.) N ú m e ro d e c é lu la s C O X 2 p o s it iv a s Figura 22- Efeito das frações aquosa (DeAq), de flavonóides (DeFla) e taninos (DeTan) de D. elliptica sobre a expressão de COX 2 em modelo de indução de úlceras por etanol absoluto 47 0 20 40 60 80 100 Salina Lansoprazol 30mg/kg DeTan 25mg/kg DeTan 50mg/kg DeTan 100mg/kg Tratamentos (p.o.) N ú m e ro d e c é lu la s C O X 2 p o s it iv a s A contagem de células marcadas positivamente com o anticorpo das superoxido dismutase (SOD) na região da mucosa gástrica de ratos submetidos aos pré-tratamentos com as frações não demonstrou resultados expressivos com nenhuma das três frações (figura 23). 0 5 10 15 20 25 30 35 Salina Lansoprazol 30mg/kg DeAq 25mg/kg DeAq 50mg/kg DeAq 100mg/kg Tratamentos (p.o.) N ú m e ro d e c é lu la s S O D p o s it iv a s Figura 23- Efeito das frações aquosa (DeAq), de flavonoides (DeFla) e taninos (DeTan) de D. elliptica sobre SOD em modelo de indução de úlceras por etanol absoluto Medianas e intervalo Q1 e Q3 do número de células marcadas com o anticorpo de COX 2 nos diferentes grupos (n=5 -21). * p < 0.05 (Kruskall -Wallis, Dunn). 48 0 5 10 15 20 25 30 35 Salina Lansoprazol 30mg/kg DeFla 25mg/kg DeFla 50mg/kg DeFla 100mg/kg Tratamentos (p.o.) N ú m e ro d e c é lu la s S O D p o s it iv a s 0 5 10 15 20 25 30 35 Salina Lansoprazol 30mg/kg DeTan 25mg/kg DeTan 50mg/kg DeTan 100mg/kg Tratamentos (p.o.) N ú m e ro d e c é lu la s S O D p o s it iv a s B - Determinação do papel do Óxido Nítrico (NO) na gastroproteção das frações aquosa (DeAq) e de tanino (DeTan) de D.elliptica. O grupo de animais tratados com a fração DeAq apresentou uma proteção significativa de 74% em relação à salina, ambos pré-tratados com L-Name, frente à mucosa submetida a lesão gástrica induzida por etanol. O pré-tratamento com DeTan Medianas e intervalo Q e Q do número de células marcadas com o anticorpo de SOD nos diferentes Medianas e intervalo Q1 e Q3 do número de células marcadas com o anticorpo de SOD nos diferentes grupos (n=5 -21). p > 0.05 (Kruskall -Wallis, Dunn). 49 não promoveu o mesmo resultado que DeAq onde se observa um aumento dos níveis de lesão quando o grupo foi pré-tratado com L-Name (figura 24). 0 100 200 300 400 500 600 700 Pré-tratamentos (i.p.) I. L .U . (m m ) Salina Carbenoxolona 100mg/kg DeAq 100mg/kg Salina L-Name 19% 21% * 68% *** 74% **** *** 0 100 200 300 400 500 600 700 Pré-tratamentos (i.p.) I. L .U . (m m ) Salina Carbenoxolona 100mg/kg DeTan 100mg/kg Salin L-Name 63% 21% * 68% 47% **** *** **** Figura 24 - Efeito das frações aquosa (DeAq) e de taninos (DeTan) de D. elliptica frente ao bloqueador de NO em modelo de úlcera por Etanol Medianas e intervalos Q1 e Q3 dos índices de lesões ulcerativas dos grupos experimentais (n=6-7), com as respectivas porcentagens de proteção, * p < 0.05, *** p < 0.005 (Kruskall -Wallis, Dunn). As barras transversais comparam as diferenças entre os pré-tratamentos com salina e L-Name, ***p < 0.005, **** p <0.001 (Mann-Withney). I. L .U . I. L .U . Grupos Grupos 50 C - Determinação do papel dos grupamentos sulfidrílicos na gastroproteção exercida pelas frações aquosa (DeAq) e de tanino (DeTan) de D. elliptica A inibição dos grupamentos sulfidrílicos endógenos não alterou a ação das frações, que mantiveram uma relação de proteção muito próxima aos animais cujo pré- tratamento foi salina (figura 25). 0 100 200 300 400 500 Pré-tratamentos (i.p.) I. L .U . (m m ) Salina Carbenoxolona 100mg/kg DeAq 100mg/kg Salina NEM 60% ** 77% 12% * 71% *** 0 100 200 300 400 500 Pré-tratamentos (i.p.) I. L .U . (m m ) Salina Carbenoxolona 100mg/kg DeTan 100mg/kg Salina NEM 52% 12% 53%** 77% *** Figura 25 - Efeito das frações aquosa (DeAq) e de taninos (DeTan) de D. elliptica frente ao depletor de sulfidrila endógena (NEM) em modelo de úlcera por Etanol Medianas e intervalos Q1 e Q3 dos índices de lesões ulcerativas dos grupos experimentais (n=5-7), com as respectivas porcentagens de proteção, * *p < 0.01 (Kruskall -Wallis, Dunn). As barras transversais comparam as diferenças entre os pré-tratamentos com salina e NEM, ***p < 0.005, (Mann-Withney). I. L .U . I. L .U . Grupos Grupos 51 D - Úlceras induzidas pela Ligadura de piloro e avaliação dos parâmetros do suco gástrico. Como parte da investigação de mecanismo de ação, foram avaliadas possíveis alterações dos parâmetros do suco gástrico em virtude da administração da fração DeTan. Porém, não se constatou atividades relacionados ao pH, concentração de íons hidrogênio e volume do suco gástrico. A atividade gastroprotetora também não foi confirmada neste experimento (figura 26). E. Determinação dos níveis de prostaglandina E2 basal da mucosa gástrica A quantidade de prostaglandina obtida a partir do raspado de mucosa gástrica após a administração de DeTan, mostrou–se relativamente reduzida, porém sem distinção (em termos estatístico) quando comparada ao grupo previamente tratados com salina. A inibição da síntese de prostaglandina pela indometacina, não promoveu uma diferença entre os tratamentos com DeTan, devido a baixa quantidade apresentada mesmo na ausência do inibidor (figura 27). 52 0 5 10 15 Salina Cimetidina 100mg/kg DeEtOH 100mg/kg Tratamentos (p.o.) p H 0 10 20 30 40 50 Salina Cimetidina 100mg/kg DeEtOH 100mg/kg Tratamentos (p.o.) C o n c e n tr a ç ã o d e H id ro g ê n io ( m E q /L ) * 0 10 20 30 40 Salina Cimetidina 100mg/kg DeEtOH 100mg/kg Tratamentos (p.o.) I. L .U . (m m ) -71% -35% Figura 26 – Efeito da administração intraduodenal da fração de taninos (DeTan) de D. elliptica no modelo de ligadura de piloro em camundongos 0 1 2 3 Salina Cimetidina 100mg/kg DeEtOH 100mg/kg Tratamentos (p.o.) V o lu m e d o c o n té u d o g á s tr ic o ( m L ) I. L .U . Medianas e intervalo Q1 e Q3 dos índices de lesão ulcerativa, concentração de hidrogênio, volume de suco gástrico e pH dos grupos experimentais (n=9-10). * p < 0.05 (Kruskall -Wallis, Dunn). 48 53 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 Pré-tratamentos (s.c) P ro s ta g la n d in a E 2 (P ic o g ra m a ) Salina DeTan 100mg/kg Tratamentos orais Salina Indometacina * Figura 27 - Efeito de taninos (DeTan) de D. elliptica sobre a produção de prostaglandina na mucosa gástrica em ratos Medianas e intervalos Q1 e Q3 da quantidade de prostaglandina na mucosa dos grupos experimentais (n=5-6), p > 0.05 (Mann-Withney). As barras transversais comparam as diferenças entre os tratamentos subcutâneos, *p < 0.05 (Mann-Withney). 54 IV.2. Davilla nitida IV.2.1. Atividade biológica do extrato metanólico de D. nitida (DnMeOH) A. “Screening” hipocrático e toxicidade aguda A administração da dose 5000mg/kg de DnMeOH não provocou alterações perceptíveis nos parâmetros comportamentais analisados (dados não apresentados). O acompanhamento dos pesos dos animais durante 14 dias após o tratamento, não indicou alteração da evolução dos pesos corporais dos animais avaliados (figura 28). Após a morte dos animais, os órgãos (coração, fígado, pulmões, rins e baço) foram retirados para análise comparativa com o peso final de cada animal. A razão entre peso de cada órgão e peso corporal foi calculada e indicou a ausência de diferença significativa entre os animais tratados com o veículo e aqueles com DnMeOH (tabela 6). Variação de peso (g) dos animais monitorados (n=6 - 7) durante 14 dias. Expressam as médias de peso para cada dia. p > 0.05 (“t” de Student). 0 10 20 30 40 50 60 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Dias P e s o ( g ) Salina DnMeOH 5g/kg Figura 28 – Evolução do peso corporal (g) de camundongos tratados agudamente com extrato metanólico de D. nitida (DnMeOH) 55 Tabela 6 - Efeito da administração aguda do extrato metanólico de D. nitida (DnMeOH) sobre os órgãos de camundongos após 14 dias do tratamento Tratamentos (p.o.) N Fígado Coração Pulmão Rins Baço Mortalidade Salina 06 13,23 ± 0,23 4,11 ± 0,14 4,95 ± 0,39 6,32 ± 0,18 3,7 ± 0,19 0 DnMeOH 5g/kg 07 12,87 ± 0,23 4,19 ± 0,23 4,44 ± 0,08 6,50 ± 0,12 3,44 ± 0,18 0 B. Modelo de indução de úlcera por HCl/etanol. As doses de 100 e 500 mg/kg de DnMeOH apresentaram ação efetiva na redução das lesões gástricas quando comparadas aos animais tratados com salina, assim como o controle positivo (lansoprazol). Porém, não foi possível observar o mesmo efeito com a dose intermediária de 250 mg/kg (figura 29). 0 50 100 150 200 250 Salina Lansoprazol 30mg/kg DnMeOH 100mg/kg DnMeOH 250mg/kg DnMeOH 500mg/kg ** 81% * 52% 37% ** 64% Dados da razão dos órgãos e peso corpóreo expressos em média (arcoseno) ± erro padrão da média. Tratamentos (p.o.) I. L .U ( m m ) Medianas e intervalos Q1 e Q3 dos índices de lesões ulcerativas dos grupos experimentais (n=8 - 9). Os números de porcentagem indicam a proteção em relação à salina. * p < 0.05, ** p < 0.01 (Kruskall, Dunn). Figura 29 – Ação do extrato metanólico de D. nitida (DnMeOH) em modelo de indução de úlcera por HCl/Etanol em camundongos I. L .U . 56 C. Modelo de indução de úlcera por Etanol absoluto. DnMeOH apresentou ação efetiva na redução de lesão gástrica na maior dose (500 mg/kg), obtendo-se 89% de proteção em comparação aos grupos tratados como veículo (figura 30). O tratamento com lansoprazol também não apresentou efeito protetor esperado, mas sua atividade é comprovada pelo aumento do pH do suco gástrico. 0 50 100 150 200 250 300 350 Salina Lansoprazol 30mg/kg DnMeOH 100mg/kg DnMeOH 250mg/kg DnMeOH 500mg/kg 29% 13% 29% ** 89% Figura 30 - Efeito do extrato metanólico D. nitida no modelo de indução de úlcera por etanol absoluto em ratos 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Salina Lansoprazol 30mg/kg DnMeOH 100mg/kg DnMeOH 250mg/kg DnMeOH 500mg/kg I. L .U ( m m ) p H Tratamentos (p.o.) Tratamentos (p.o.) Medianas e intervalos Q1 e Q3 dos índices de lesões ulcerativas e pH dos grupos experimentais (n=5 - 6). Os números de porcentagem indicam a proteção em relação a salina. ** p < 0.01 (Kruskall -Wallis, Dunn) I. L .U . 57 D. Modelo de indução de úlcera por droga antiinflamatória não esteroidal (Piroxicam) É possível observar na figura 31 uma redução das lesões nos animais tratados com DnMeOH em relação aos animais tratados com o veículo. As doses que apresentaram efeito expressivo foram as de 250 (67%) e 500 mg/kg (58%). Medianas e intervalos Q1 e Q3 dos índices de lesões ulcerativas dos grupos experimentais (n=7). Os números de porcentagem indicam a proteção em relação à salina. * p < 0.05, ** p < 0.01 (Kruskall -Wallis, Dunn) E. Úlceras induzidas pela ligadura de piloro e avaliação dos parâmetros do suco gástrico A administração oral de DnMeOH (500 mg/kg), mostrou-se significativa na redução das lesões gástrica induzidas neste modelo promovendo 100% de proteção em relação ao grupo tratado com salina. Porém, não houve alterações nos demais parâmetros analisados. Obteve-se, também, proteção efetiva de 78% com a administração intraduodenal de DnMeOH, mas nenhum dos parâmetros do suco gástrico analisados também apresentou distinção significativa (p > 0.05) em relação ao grupo salina (figura 32). 0 14 28 42 56 70 84 Salina Cimetidina 100mg/kg DnMeOH 100mg/kg DnMeOH 250mg/kg DnMeOH 500mg/kg * 56% 22% ** 67% ** 58% Figura 31 - Efeito do extrato metanólico de D. nitida (DnMeOH) em modelo de indução de úlcera por Piroxicam I. L .U ( m m ) I. L .U . Tratamentos (p.o.) 58 0 5 10 15 20 25 30 T r a tam e n to s In tr aduodena l O ra l * Medianas e intervalo Q1 e Q3 dos índices de lesões ulcerativas, concentração de hidrogênio, volume de suco gástrico e pH dos grupos experimentais (n=6-10). * p < 0.05, ** p < 0.01 e ***p < 0.005 (Kruskall -Wallis, Dunn). 0 2 4 6 8 10 12 14 Tratam entos p H Intraduodenal Oral ** 0 10 20 30 40 50 T ratam e n tos Salin a Cim et idin a 1 00m gkg DnM eOH 500m g/k g Intraduodenal Oral * 83% *** 10 0% * 73% ** 78% I. L .U . 0 1 2 3 4 5 Tratam e n tos Salin a Cim et idin a 10 0m gkg DnM eOH 500m g/k g Intraduodenal Oral ** V ol um e d o co ut eú d o gá st ri co ( m L ) C on ce nt ra çã o de hi d ro gê n io ( m E q /L ) Figura 32 - Efeito da administração oral ou intraduodenal do extrato metanólico de D.nitida (DnMeOH) no modelo de ligadura de piloro em camundongos 59 F. Determinação do papel dos grupamentos sulfidrílicos na citoproteção A dose de 500mg/kg de DnMeOH mostrou-se efetiva na gastroproteção em 96% frente ao pré-tratamento com salina; porém, não foi capaz de promover o mesmo resultado frente ao pré-tratamento com o inibidor dos grupamentos sulfidrílicos (NEM), com redução da taxa de proteção de 31% (figura 33). G. Determinação do papel do Óxido Nítrico (NO) na citoproteção O pré-tratamento com L-NAME nos animais tratados com DnMeOH por via oral não promoveu diferença de resultado em relação aos animais pré-tratados com salina; ambos exerceram proteções expressivas de 84 e 90% para os respectivos pré- tratamentos. O pré-tratamento com L-NAME mostrou-se ativo no aumento das lesões induzidas pelo etanol nos animais tratados com salina pela via oral (figura 34). Figura 33 - Efeito do extrato metanólico de D. nitida (DnMeOH) frente ao depletor de sulfidrila endógena (NEM) em modelo de úlcera por Etanol 0 100 200 300 400 500 Salina Carbenoxolona 100 mg/kg DnMeOH500 mg/kg Tratamentos orais Salina NEM -7% 31% **** ** *** *** 96% ** 88% I. L .U ( m m ) Grupos Medianas e intervalos Q1 e Q3 dos índices de lesões ulcerativas dos grupos experimentais (n=7-10) com as respectivas porcentagens de proteção, **p < 0.01 e ***p < 0.005 (Kruskall -Wallis, Dunn). As barras transversais comparam as diferenças entre os pré- tratamentos com salina e NEM **p < 0.01, ***p< 0.005 e ****p < 0.001(Mann-Withney). I. L .U . 60 Medianas e intervalos Q1 e Q3 dos índices de lesões ulcerativas dos grupos experimentais (n=6-7) com as respectivas porcentagens de proteção, *p < 0.05 e ** p < 0.01 (Kruskall -Wallis, Dunn). As barras transversais comparam as diferenças entre os pré-tratamentos com salina e L-Name, **p < 0.01 (Mann-Withney). H. Determinação da motilidade intestinal Neste experimento nenhuma das doses de DnMeOH apresentou efeito sobre a motilidade intestinal. Somente a atropina mostrou-se efetiva na redução do trânsito intestinal (figura 35). Figura 34 - Efeito do extrato metanólico de D. nitida (DnMeOH) frente ao inibidor de NO endógeno (L-NAME) em modelo de úlcera por Etanol 0 100 200 300 400 500 600 Salina Carbenoxolona 100mg/kg DnMeOH 500mg/kg Salina L-Name * 90% 43% * 79% ** 84% Tratamentos orais ** Pré-tratamentos (i.p.) I. L .U ( m m ) I. L .U . Grupos 61 I - Avaliação das atividades cicatrizante e tóxica de DnMeOH Após os 14 dias de tratamentos, o grupo tratado com DnMeOH 250mg/kg não sofreu a diminuição do tamanho das lesões de forma significativa em relação ao grupo que recebeu salina (tabela 7). Tabela 7 - Efeito do extrato metanólico de D.nitida (DnMeOH) sobre o processo de cicatrização em lesões causadas por ácido acético Na análise de H&E, nota-se uma organização das glândulas gástricas no sentido da luz estomacal, formação esta distinta dos animais tratados com salina que apresentam-se sem um padrão definido de forma (figura 36). Além disso, a partir das imagens de PAS (coloração específica de muco) observa-se um aumento de muco nas glândulas mucosas dos animais tratados com DnMeOH 250mg/kg (figura 37). Tratamentos Doses N Borda interna % de cicatrização Borda externa % de cicatrização Salina 10mL/kg 08 0,35 ± 0,05 -- 1,84 ± 0,15 -- Cimetidina 100 08 0,31± 0,03 11 1,56 ± 0,20 15 DnMeOH 250 08 0,31± 0,04 11 1,66 ± 0,26 10 0 0,5 1 1,5 2 Salina Atropina 5mg/kg DnMeOH 100mg/kg DnMeOH 250mg/kg DnMeOH 500mg/kg 22% 1% 2% 8% * Figura 35 – Efeito do extrato metanólico de D.nitida (DnMeOH) sobre a motilidade intestinal R e la ç ã o e n tr e d e s lo c a m e n to e o c o m p ri m e n to d o i n te s ti n o Tratamentos (p.o.) Medianas e intervalos Q1 e Q3 da razão entre distância percorrida e tamanho total do intestino dos grupos experimentais (n=7). * p < 0.05 (Kruskall -Wallis, Dunn). Dados de média ± erro padrão da média das áreas de lesão (cm2) dos diferentes tratamentos. p > 0.05, Anova, Dunnet. 62 Figura 36 – Cortes histológicos de lesões estomacais produzidas por ácido ácetico corados com H&E do efeito de cicatrização do extrato metanólico de Davilla nitida (DnMeOH). S a li n a C im e ti d in a 1 0 0 m g /k g D n M e O H 2 5 0 m g /k g # * * As setas indicam a mucosa em re-organização. Observar em # a organização line