RESSALVA Atendendo solicitação da autora, o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 15/06/2024. Camila Gonçalves Garcia Busca por flavonoides como potencial ligante ao domínio RBD da proteína S para combate da Covid-19 por meio da plataforma DockThor São José do Rio Preto 2022 Câmpus de São José do Rio Preto Camila Gonçalves Garcia Busca por flavonoides como potencial ligante ao domínio RBD da proteína S para combate da Covid-19 por meio da plataforma DockThor Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biofísica Molecular, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biofísica Molecular, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto. Financiadora: CAPES Orientador: Prof. Dr. Marcelo Andrés Fossey Coorientadora: Profa. Dra. Gabriela Campos de Araújo São José do Rio Preto 2022 Camila Gonçalves Garcia Busca por flavonoides como potencial ligante ao domínio RBD da proteína S para combate da Covid-19 por meio da plataforma DockThor Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biofísica Molecular, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biofísica Molecular, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto. Financiadora: CAPES Banca Examinadora Prof. Dr. Marcelo Andres Fossey UNESP – São José do Rio Preto Orientador Prof. Dr. Ícaro Putinhon Caruso UNESP – São José do Rio Preto Profa. Dra. Ingrid Bernardes Santana Martins UFRJ – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho São José do Rio Preto 15 de Junho de 2022 AGRADECIMENTOS O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - 88887.506475/2020-00 001. Esta pesquisa contou com a colaboração direta ou indireta de diversas pessoas. Agradeço à minha família e amigos pelo apoio, suporte e paciência durante esse período. Ao meu orientador Prof. Dr. Marcelo Andrés Fossey pelo incentivo, apoio e disponibilidade durante esse percurso. À minha coorientadora Profa. Dra. Gabriela Campos de Araújo por toda ajuda, paciência e apoio para o desenvolvimento desse trabalho. À CAPES pelo suporte financeiro. E a todos professores que participaram desse percurso e disponibilizaram algum tempo para auxiliar a minha caminhada em uma nova área de conhecimento. “A verdade é uma coisa bela e terrível, e, portanto, deve ser tratada com grande cautela.” J. K. Rowling RESUMO O enfrentamento da pandemia, iniciada no ano de 2019 e ocasionada pelo novo coronavírus, o SARS-CoV-2, tem provocado muitos desafios para a ciência do mundo todo. É inédito o modo acelerado, pelo qual vem ocorrendo a busca por potenciais tratamentos de combate ao vírus. Na esteira dessa preocupação, esta pesquisa tem como objetivo buscar flavonoides com potencial de ligantes ao domínio RBD da proteína S, para o combate da Covid-19. A busca tem como objeto seis farmacológicos originados da flora brasileira. Trata-se de flavonoides, compostos com considerável capacidade de promover benefícios à saúde. A definição da estrutura do domínio RBD, da proteína Spike (S) do SARS-CoV-2, que foi utilizada nesta pesquisa, se deu a partir de uma busca em bancos de dados, por estruturas do SARS-CoV-2 com e sem inibidores complexados. A seleção dos seis flavonoides aplicados na busca por novos inibidores, junto ao SARS-CoV-2, foi realizada a partir do estudo de alguns trabalhos que pesquisaram os diferentes tipos desses compostos fenólicos. Em seguida, realizou-se o docking molecular dos compostos e estruturas selecionados na proteína alvo. Foram realizados dockings utilizando a estrutura RBD da proteína S, com o receptor ACE2 humano e sem a ACE2, permitindo a comparação entre os resultados encontrados. Essa comparação entre os dockings, com e sem a ACE2, permitiu observar por exemplo diferenças nas quantidades de aminoacidos encontrados e na qualificação posicional da genisteína. Desse modo, teve-se como resultado a determinação de um conjunto de compostos promissores, sendo possível destacar que a melhor correlação foi verificada nas áreas próximas às folhas β antiparalelas da estrutura analisada. Palavras chaves: Proteína S. Triagem. Docking molecular. Covid-19. DockThor. ABSTRACT Facing the pandemic, which began in 2019 and caused by the new coronavirus, SARS-CoV-2, has caused many challenges for science around the world. The accelerated way in which the search for potential treatments to combat the virus has been taking place is unprecedented. In the wake of this concern, this research aims to seek flavonoids with potential as S-protein ligands to combat Covid-19. The search has as its object six pharmacological products originated from the Brazilian flora. These are flavonoids, compounds with considerable capacity to promote health benefits. The use of the Spike (S) protein of SARS- CoV-2 as a target was defined from a search in databases, for structures of SARS-CoV-2 with and without complexed inhibitors. The definition of the six flavonoids used in the search for new inhibitors, together with SARS-CoV-2, was carried out from the study of some works that researched the different types of these phenolic compounds. Then, the molecular docking of the selected compounds and structures in the target protein was performed. Dockings were performed using the RBD structure of protein S, with the human ACE2 receptor and without the ACE2, allowing the comparison between the results found. This comparison between the dockings, with and without ACE2, allowed us to observe, for example, differences in the amounts of amino acids found and in the positional qualification of genistein. Thus, the result was the determination of a set of promising compounds, being possible to highlight that the best correlation was verified in the areas close to the antiparallel β sheets of the analyzed structure. Keywords: Protein S. Screening. Molecular Docking. Covid-19. DockThor. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1: Probabilidade de contagio do vírus relacionada a utilização de máscaras...................................................................................................16 Figura 2: Quadro com casos mundiais de contaminação e mortes de COVID-19 datado de 14/11/2020 .............................................................17 Figura 3: Quadro com casos mundiais de contaminação, mortes e aplicações de vacinas datado de 21/10/2021 ..........................................17 Figura 4: Ilustração da cepa da SARS-CoV-2..........................................18 Figura 5: Constituição do vírus..................................................................23 Figura 6: O genoma do coronavírus de RNA de cadeia simples, de aproximadamente 26 a 32 kb. Organizado na ordem de 5ʹ o trecho de leitura aberto (ORF1a/b) que representa dois terços do genoma de CoV e codifica a grande poliproteína, que posteriormente será clivada em PP1a e PP1ab . O terço de 3ʹ do genoma do CoV codifica as proteínas estruturais (S, E, M e N), essenciais para ligação vírus na célula hospedeira e montagem do virion.............................................................24 Figura 7: ciclo SARS-CoV-2 na célula hospedeira...................................26 Figura 8: Representação da Covid ...........................................................27 Figura 9: Estrutura Covid, Spike e RBD....................................................28 Figura 10: Ligação Spike e ACE2..............................................................30 Figura 11: Estrutura geral de um flavonóide..............................................31 Figura 12: Representação chave-fechadura.............................................33 Figura 13: Formação do complexo proteína-ligante..................................34 Figura 14: Energia mínima e o melhor resultado entre receptor ligante.....35 Figura 15: Configuração de grade utilizada pelo DockThor.......................37 Figura 16: Representação geométrica do ângulo de torção......................38 Figura 17: Ligações entre dipolos atomicos/moleculares.........................39 Figura 18: Representação da Lei de Coulomb.........................................39 Figura 19: Representação dos mínimos locais encontrados ...................41 Figura 20: Distribuição aleatória X Distribuição de Cauchy......................42 Figura 21: Processo metodológico do desenvolvimento de uma pesquisa na área de docking molecular...................................................................44 Figura 22: Estrutura 6LGZ : RBD(laranja) e ACE2(verde).........................45 Figura 23: Gráfico aminoácidos mais frequentes encontrados..................56 Figura 24: Gráfico de frequência de aminoácidos encontrados referentes a tabela 4...................................................................................................58 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Descrição dos flavonoides selecionados ...................................47 Tabela 2: Coordenadas utilizadas para os dockings direcionados.............50 Tabela 3: Resultados................................................................................53 Tabela 4: Análise dos aminoácidos encontrados em maior quantidade.....57 Tabela 5: Representação final dos ligantes pelo PyMOL...........................58 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ......................................................................................13 1.1 Bioinfirmática .......................................................................................21 1.2 Sequenciamento genético e estrutura do vírus ................................22 1.3 Proteína S ..............................................................................................27 1.4 Polifenóis: os flavonoides e sua ação antivira ..................................30 2 OBJETIVO E FUNDAMENTAÇÃO ........................................................32 2.1 Fundamentação teórica (modelagem matemática, definição de docking, descrição matemática da plataforma utilizada) .................33 2.2 Definição e análise matemática da afinidade (score) e da plataforma Dockthor.............................................................................36 3 MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................43 3.1 Métodos .................................................................................................43 3.2 Identificação do alvo molecular e seleção de flavonoides ..............44 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................49 5 CONCLUSÃO.........................................................................................61 REFERÊNCIAS ......................................................................................62 12 1 INTRODUÇÃO Desde dezembro de 2019, quando foi feita a comunicação oficial da cidade de Wuhan à OMS sobre a nova cepa a população mundial vem enfrentando um novo tipo de coronavírus, o SARS-CoV-2 que gerou uma situação pandêmica, a qual fez com que o mundo repensasse o modo de vida e a rotina à qual tinha se adaptado. O SARS-CoV-2 é um dos agentes causadores dessa síndrome respiratória aguda grave – SARS- Severe Acute Respiratory Syndrome. A denominação Covid-19 deriva das palavras Corona VIrus Disease e o algarismo 19 refere-se ao ano de surgimento da síndrome, 2019. O Covid-19 entra para a História das pandemias, no ano de 2020, de modo semelhante à Peste Bubônica no Século XIV, à Varíola em 1896-1980, à Gripe Espanhola entre 1918 e 1920 e, em menor escala, à Gripe Suína-H1N1em 2009. Nesse novo momento histórico que passamos, assim como nos outros citados, as maiores taxas de mortalidade registradas se dão em especial, nos espaços geográficos que apresentam maior vulnerabilidade social. Ou seja, onde as condições socioeconômicas são mais precárias e há uma maior dificuldade em se realizar o isolamento social, uma das medidas preventivas dessa nova doença, considerando que ainda não havia vacinas ou remédio para sua prevenção. (GUIMARÃES et. al. 2020) Nesse sentido, Guimarães (2020) desenvolveu uma pesquisa, na qual analisou 8 aspectos principais, quais sejam: “ 1) a área total da ocorrência de casos da Covid-19 no Brasil; 2) a área total da ocorrência de casos de Covid-19 nos 5.570 municípios brasileiros e no Distrito Federal; 3) onde ocorrem casos da Covid-19 nas regiões brasileiras (macrorregiões do IBGE e espaços opacos e luminosos) no período determinado: Ti; 4) como evoluíram os casos da Covid- 19 pelo território brasileiro; 5) como evoluiu, período a período, a ocorrência de casos da Covid-19 em um conjunto de municípios brasileiros; 6) o grau de correspondência espacial entre as áreas de ocorrência de casos de Covid-19 e seus fatores de risco, bem como as vulnerabilidades socioespaciais; 7) no conjunto de todos os municípios, quais são os que apresentam maior semelhança segundo os casos da Covid-19? E de óbitos? Considerar regiões metropolitanas, capitais, cidades médias e interioranas; 8) no período de Ti, 13 como evoluiu a correspondência espacial entre a ocorrência de casos da Covid- 19 localmente’’ (GUIMARÃES et. al. 2020, p.125). A partir do mapeamento daqueles oito aspectos, Guimaraes concluiu que o vírus se espalhou com mais intensidade nas áreas com menor isolamento. A direção, o tempo e a intensidade dos casos de Covid-19 apresentaram importante relação com a questão econômica. O autor demonstrou como a Covid-19 se dispersou de forma variada no território brasileiro, sendo influenciada por circunstancialidades, com destaque para as condições socioeconômicas (GUIMARÃES et. al. 2020, p.136). À luz dos estudos de Guimarães (2020), é possível reforçar, além de outros aspectos, que o isolamento social definido pela Organização Mundial de Saúde (OMS), com o aval de diversos especialistas, como a principal medida de combate à Covid-19., teve importante impacto na dispersão da doença. Além dele foram recomendadas também outras medidas, como é o caso dos hábitos de higiene mais rigorosos. Uma outra medida protetora comprovada logo no início, pela ciência, por meio de dados estatísticos, foi o uso de máscaras, descritos na figura 3. Foi evidenciado que em um par de pessoas, onde uma delas (pessoa A) está contaminada pelo vírus (portador) e a outra (pessoa B) não; caso a pessoa A esteja sem máscara e a pessoa B com máscara há uma probabilidade de 70% de que haja o contágio, no caso contrário, o portador do vírus estando de máscara e a pessoa B não, há uma probabilidade de contaminação em torno de 5%. Essa porcentagem cai para 1,5% quando ambas as pessoas estão fazendo uso de máscara. 14 Figura 1: Probabilidade de contágio do vírus relacionada a utilização de máscaras Fonte adaptada: Iamarino, 2020 Trata-se de medidas mais difíceis de se adotar em populações em condições socioeconômicas desfavorecidas, por isso se encaixam nos motivos da maior taxa de mortalidade se concentrar entre essas populações, conforme apontado por Guimarães (2020). No que se refere à importância da vacinação, as figuras 1 e 2 apresentam uma comparação dos casos no período de novembro de 2020, quando as principais medidas eram o isolamento e uso de máscaras e em outubro de 2021 quando já havia vacinas disponíveis para uma quantidade considerável de pessoas ao redor do mundo. Na figura 2 é possível analisar o número de casos diários, por meio do gráfico presente no canto inferior direito, comparado ao número de casos diários presentes no gráfico em vermelho no canto superior direito na figura 3. Essa comparação deixa evidente a queda de casos diários após o início das vacinações, uma vez que em novembro de 2020 os casos diários chegaram a aproximadamente 600.000 e, em outubro de 2021, após o início da vacinação, é perceptível uma média de 310.478,5 casos diários (média realizada com os dados do dia 1/10 ao 20 /10). 15 Figura 2: Quadro com casos mundiais de contaminação e mortes de COVID-19 datado de 14/11/2020 Fonte: Johns Hopkins University. COVID-19: Dashboard by the center for systems Science and engineering (CSSE). Disponível em: Acesso em: 14 de nov. de 2020 Figura 3: Quadro com casos mundiais de contaminação, mortes e aplicações de vacinas datado de 21/10/2021 Fonte: Johns Hopkins University. COVID-19: Dashboard by the center for systems Science and engineering (CSSE). Disponível em: Acesso em: 21 de out. de 2021 Por se tratar de uma nova doença que gerou um colapso no sistema de saúde de diversos países, lotando hospitais e sobrecarregando médicos, enfermeiros e técnicos da área de saúde, os pesquisadores tiveram que buscar em tempo recorde formas de tratamento ou de amenizar o quadro de pacientes graves, além da corrida por vacinas com eficácia satisfatória. Desse modo, https://gisanddata.maps.arcgis.com/apps/opsdashboard/index.html#/bda7594740fd40299423467b48e9ecf6 https://gisanddata.maps.arcgis.com/apps/opsdashboard/index.html#/bda7594740fd40299423467b48e9ecf6 https://gisanddata.maps.arcgis.com/apps/opsdashboard/index.html#/bda7594740fd40299423467b48e9ecf6 https://gisanddata.maps.arcgis.com/apps/opsdashboard/index.html#/bda7594740fd40299423467b48e9ecf6 16 encontramos na ciência a melhor alternativa para aliviar o trágico quadro de perdas humanas, que se abateu sobre o mundo, desde janeiro de 2020. Nesse sentido, com a pandemia do Covid-19, mais uma vez a Ciência se revelou fundamental, para a busca por respostas a situação de urgência que se apresentou para o mundo. Isso porque, pela primeira vez na história, rapidamente foi possível identificar o novo vírus como pertencente ao grupo dos coronavírus, possibilitando acompanhar essa pandemia desde o princípio e ainda criar protocolos de estudos e de aprovação de vacinas e medicamentos. (IAMARINO & LOPES, 2020). Figura 4: Ilustração da cepa da SARS-CoV-2 Fonte: https://www.sanarmed.com/coronavirus-origem-sinais-sintomas-achados- tratamentos O SARS-CoV-2 é uma mutação do SARS-CoV, que já circulava entre a população humana. Em 2003 foi registrada uma epidemia de coronavírus (SARS-CoV), que também partiu da China, chegou a atingir 26 países e causou milhares de mortes. Descobriu-se que foi um vírus transmitido de outros animais para seres humanos, tornando essencial conhecer seu hospedeiro inicial, para se analisar possíveis chances de uma epidemia assim acontecer novamente. Desse modo, foram descobertos mais de 200 tipos de coronavírus em diversos animais silvestres e, nesse caso de 2002 constatou-se que o coronavírus era https://www.sanarmed.com/coronavirus-origem-sinais-sintomas-achados-tratamentos https://www.sanarmed.com/coronavirus-origem-sinais-sintomas-achados-tratamentos 17 muito semelhante ao de morcegos que viviam na região da China. Concluiu-se ainda que o SARS-CoV foi inicialmente transmitido dos morcegos para os civetas, pequenos mamíferos asiáticos consumidos como alimento na China e na Índia. Dez anos depois, em 2012, foi identificada no Oriente Médio uma mutação de coronavírus chamada de MERS-CoV (Middle East Respiratory Sydrome COronaVírus), nesse caso o coronavírus de morcegos foi transmitido para os camelos, animais de criação na Arábia Saudita. Os camelos passaram a doença para seus tratadores, que passaram para os médicos gerando mais um grande surto. Atualmente, sabe-se que o surgimento do SARS-CoV-2 advém de mutações do antigo SARS-CoV ocorridas em populações de morcegos, que posteriormente passaram a infectar humanos e, assim como a influenza (H5N1, H1N1 e H7N9), emergiram de populações de animais comercializados vivos nos chamados “mercados úmidos”, causando infecções respiratórias graves e mortalidade nos seres humanos, assim como crises econômicas regionais e globais. (GE et al., 2013; MENACHERY et al., 2015; SONG et al., 2019; ZUMLA et al., 2016). A transmissão e infecção pelo SARS-CoV-2 ocorre de humano para humano por meio de gotículas respiratórias ou pelo convívio direto com o infectado. Essa doença sistêmica dá origem a um conjunto de sintomas, que são em geral, tosse, dores de cabeça, perda de olfato e paladar, febre e falta de ar, os quais podem aparecer entre 2 e 14 dias após a infecção. No entanto, grande parte dos infectados podem ser assintomáticos. Em casos graves podem aparecer complicações hepáticas, gastrointestinais, neurológicas, insuficiência respiratória, pneumonia grave, levando o paciente a necessitar de ventilação mecânica, ou até mesmo ao óbito. (SHANMUGARAJ et al., 2020; ZUMLA et al., 2016). Desde o início da pandemia alguns remédios já disponíveis têm sido utilizados para tentar controlar a doença em pacientes com COVID-19. Dentre esses medicamentos que foram testados temos: a ribavirina, corticosteroides e a cloroquina/hidroxicloroquina. A ribavirina é conhecida há bastante tempo por ser um antiviral de amplo espectro e a cloroquina é rotineiramente utilizada no tratamento de enfermidades como malária, amebíase, HIV e doenças 18 autoimunes (HAAGMANS; OSTERHAUS, 2006; VINCENT et al., 2005; ZUMLA et al., 2016). Alguns estudos mais recentes, da segunda metade do ano de 2020, mostraram que a má administração desses medicamentos pode piorar o quadro de pacientes que estão contaminados e com sintomas leves. Além do fato de não serem preventivos e nem bem-sucedidos para a cura dessa infecção. Com a liberação emergencial de algumas vacinas foi possível reverter paulatinamente o quadro de colapso mundial dos sistemas de saúde, mas como observado na figura 2, em alguns países esse colapso se arrastou pelo ano de 2021. É possível observar também que a aplicação de vacinas ainda não se configurou como uma solução do problema. A doença continua a acometer pessoas num ritmo elevado. A presente pesquisa, ao optar pela utilização dos flavonoides, é influenciada pela imunoterapia, um tratamento cujo foco é a utilização de partes do sistema imunológico para o combate de determinadas doenças. Pode ser realizada estimulando as defesas naturais do sistema imunológico fazendo com que ele trabalhe com mais eficiência para atacar células infectadas. É possível efetivá-la também por meio da produção de substâncias em laboratórios que podem ser usadas para ajudar no combate a infecção Acesso em: 01/05/2022 A imunoterapia é um tratamento biológico cujo objetivo é o de potencializar o sistema imunológico. Esse método é utilizado para o tratamento das infecções e diversos tipos de doenças, incluindo câncer, doenças autoimunes como o Lúpus e Crohn, dentre outras. Coughlin e Prabhakar relatam que o uso de anticorpos monoclonais humanos (hmAbs) mostraram eficiência na terapêutica de pacientes com SARS- CoV. A maioria dos hmAbs reagiu especificamente com o domínio de ligação ao receptor (RBD) da proteína spike (S) impedindo a ligação ao receptor. Sendo assim, focaremos nesta pesquisa na proteína S do vírus, mais especificamente em seu receptor (RBD) (COUGHLIN; PRABHAKAR, 2012). No contexto da imunoterapia, os flavonoides que são o objeto desta pesquisa se constituem como compostos polifenólicos naturais nas plantas, encontrados em sementes, caules, folhas, flores e frutas. Esses compostos têm importantes efeitos bioquímicos e fisiológicos nas plantas além de atuarem como 19 antioxidantes, inibidores de enzimas, precursores de substâncias tóxicas e pigmentos tonalisantes. Os flavonóides são também um dos responsáveis pela fotossensibilização e transferência de energia, ações de hormônios e reguladores de crescimento, controle de respiração, fotossíntese, morfogênese, determinação de sexo e defesa contra infecções (PUTINHON, 2016, p. 20) . A identificação de flavonoides com maior potencial de ligação à proteína S tem como base metodológica a bioinformática. 59 5 CONCLUSÃO O estudo, por meio do Docking molecular, permite destacar como resultado que as áreas encontradas para melhor interação são próximas às folhas β antiparalelas da estrutura analisada. São regiões hidrofóbicas e os principais aminoácidos encontrados na genisteína: arginina, ácido glutâmico e tirosina; no Eriodictiol: ácido glutâmico,e ácido aspártico. 60 REFERÊNCIAS ALMEIDA, D. M. Dockthor: Implementation, upgrade and validation of a receptor-ligand Docking software. 2011. Dissertação (Mestrado em Modelagem computacional) - Laboratório Nacional de Computação Científica, Petrópolis, 2011. ALVES, C. A. S. et. al. A importância da bioinformática aplicada na parasitologia. In: VI ENCONTRO PIAUIENSE DE BIOMEDICINA, p.7 , 2021. Anais [...]. Piauí, 16 de ago. 2021. BAGLIVO, M. et al. 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