RESSALVA Atendendo solicitação do autor, o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 02/09/2025 Héberly Fernandes Braga Otimização da produção de amilases e pectinases por Gongronella butleri usando subprodutos agroindustriais São José do Rio Preto 2021 Câmpus de São José do Rio Preto Héberly Fernandes Braga Otimização da produção de amilases e pectinases por Gongronella butleri usando subprodutos agroindustriais Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Microbiologia, junto ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto. Orientadora: Profª. Drª. Heloiza Ferreira Alves do Prado São José do Rio Preto 2021 Héberly Fernandes Braga Otimização da produção de amilases e pectinases por Gongronella butleri usando subprodutos agroindustriais Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Microbiologia, junto ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto. Comissão Examinadora Profa. Dra. Heloiza Ferreira Alves do Prado UNESP – Câmpus de Ilha Solteira Orientadora Profa. Dra. Daniela Alonso Bocchini Martins UNESP – Câmpus de Araraquara Profa. Dra. Eleni Gomes UNESP – Câmpus de São José do Rio Preto Profa. Dra. Milla Alves Baffi UFU – Câmpus Umuarama Prof. Dr. Rodrigo Simões Ribeiro Leite UFGD – Câmpus II São José do Rio Preto 02 de setembro de 2021 A todos aqueles que acreditam na realização de seus sonhos e na concretização de seus objetivos, apesar de todas as adversidades encontradas ao longo do caminho. AGRADECIMENTOS Inicialmente a Deus, por me dar forças e estímulo nos momentos difíceis e angustiosos, e por me guardar, nos períodos de viagens e deslocamentos. Aos meus familiares próximos, especialmente minha mãe Elzimeire, por orar, torcer, e principalmente compreender meu distanciamento e ausências durante esse período de estudos; e à minha irmã Iara, por intermediar contatos no Instituto de Ciências Agrárias da Universidade Federal de Uberlândia (ICIAG/UFU), onde realizei parte dos meus experimentos. À minha orientadora, professora Dra. Heloiza, pelo acolhimento, ensinamentos, apoio e compreensão durante a realização desse trabalho. Aos professores e colegas do curso de Pós-graduação em Microbiologia do IBILCE/UNESP, com os quais tive a oportunidade de trocar experiências e adquirir conhecimentos. Ao Instituto Federal do Triângulo Mineiro (IFTM), instituição na qual trabalho como docente, que me oportunizou licenças para que pudesse concluir com êxito as disciplinas e me dedicar ao desenvolvimento desse trabalho. Ao ICIAG/UFU, nas pessoas dos professores Beno Wendling, Milla Baffi, Araína Hulmann e Elias Borges; assim como aos técnicos Luciana Alves, Beatriz Vieira, Júlia Araújo e Marcelo Dias, que possibilitaram com que eu pudesse usufruir de equimentos, instrumental, e alguns insumos, colaborando com a realização de parte do desenvolvimento dos experimentos. Aos estudantes e colegas do Laboratório de Microbiologia Ambiental (LAMIC/ICIAG/UFU), Patrísia, Jayder, Bruno e Gabriela; bem como à Bárbara (discente do Programa de Biociências do IBILCE/UNESP), Sirlene (ex-discente do doutorado em Microbiologia do IBILCE/UNESP), e Amanda (discente do curso de Ciências Biológicas da Faculdade de Engenharia do Campus de Ilha Solteira da UNESP) pela vivência, troca de experiências e auxílios, durante essa minha etapa formativa. À Liliane Andrade (Engenheira química e doutoranda em Biologia Funcional e Molecular da Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP), pela colaboração imprescindível e troca de experiências, na parte da realização das análises estatísticas desse trabalho. Às professoras doutoras Daniela Bocchini e Ana Maria Cassiolato, por terem participado da banca de qualificação e contribuído com o aprimoramento desse trabalho, ao fazerem suas considerações. E finalmente, um agradecimento a todos àqueles que direta ou indiretamente fizeram críticas, deram sugestões, e trocaram ideias, pois cooperaram para que pudesse crescer em termos acadêmicos, pessoais e profissionais. “...mais sábio é aquele que sabe que não sabe...” (GAARDER, 2002, p.71) RESUMO Objetivou-se determinar e otimizar a produção de amilases e pectinases, por Gongronella butleri sob cultivo em estado sólido (CES), em subprodutos agroindustriais (SA). Foi realizado teste de verificação lítica a 35ºC, em meio líquido e sólido com amido ou pectina; assim como o crescimento micelial em ágar padrão a 25, 30, 35 e 40ºC. A produção enzimática foi obtida pelo CES a 25, 30 e 35ºC em 72 h, sobre diferentes SA caracterizados físico-quimicamente; e as atividades determinadas pelo método de redução do ácido-3,5-dinitrosalicílico (DNS), além do dextrinizante para as amilases. A temperatura foi fixada a 35ºC, e o perfil enzimático pelo DNS foi monitorado para alguns dos SA ao longo de 120 h, visando identificar os picos de maior atividade, que ocorreram em farelo de trigo (FT) e soja (FS). O acréscimo das atividades enzimáticas nesses SA foi testado por planejamento experimental 23, a 35ºC por 72 h, combinando proporções de FT e FS, e variando o teor inicial de solução mineral e CaCl2 dos cultivos; seguido por planejamento um fator por vez, onde se monitorou o efeito de combinações de FT e FS durante 120 h. As melhores condições experimentais obtidas anteriormente foram usadas como parâmetro para se aplicar um delineamento composto central rotacional (DCCR), visando obter o ponto ótimo de produção enzimática, tendo como fatores umidade inicial do meio; temperatura e tempo de cultivo. O fungo desenvolveu-se em meio líquido e sólido contendo amido ou pectina, formando massa micelial em até 24 h. A expansão micelial apresentou diferença significativa (p ≤ 0,05) inicial nas temperaturas testadas, após 72 h, não sendo observado crescimento a 40ºC. Dos SA avaliados, 88,9% induziram atividade amilolítica dextrinizante inferior a 2,5 U mL-1 em ao menos uma das temperaturas, sendo a maior atividade (9,6 U mL-1) observada a 35ºC em FT. As atividades amilolíticas pelo DNS foram ≥ 7,0 U g-1, em todas temperaturas testadas, quando se empregou FS e FT, e para este houve aumento de 31% da atividade pectinolítica de 25ºC para 35ºC. O pico de atividade amilolítica pelo DNS foi atingido em 72 h para FT (13,7 U g-1) e 96 h para FS (16,0 U g-1); os outros SA mantiveram perfis de atividade inferiores a 3,8 U g-1. A atividade pectinolítica atingiu pico de 41,7 U g-1 para FT, e 33,0 U g-1 para FS em 48 h e após emprego do planejamento 23 foi observado acréscimo de 82% na atividade amilolítica e 33% na pectinolítica, quando comparado à média individualizada em FT e FS. As maiores atividades amilolíticas (15,97 U g-1) e pectinolíticas (128,92 U g-1), tenderam a ocorrer em 48 h, e na combinação FT:FS (25%:75%), não diferindo de FT:FS (50%:50%), para pectinases, após planejamento um fator por vez. A ótima produção enzimática (amilases = 32,35 U g-1; pectinases = 246,62 U g-1) obtida por DCCR foi atingida em 61,37% umidade inicial, 30ºC e 68 h de cultivo. Os resultados indicam potencial de produção enzimática, em especial pectinases, por G. butleri quando em FT e FS. Palavras–chave: Biomassa vegetal. Bioprocesso. Fungos isolados do Cerrado. Produção enzimática. Resíduos agroindustriais. ABSTRACT The objective was to determine and optimize the production of amylases and pectinases by Gongronella butleri under solid state cultivation (SSC) in agro-industrial by-products (AP). A lytic verification test was carried out at 35ºC, in liquid and solid medium with starch or pectin; as well as mycelial growth on standard agar at 25, 30, 35 and 40ºC. The enzymatic production was obtained by SSC at 25, 30 and 35ºC in 72 h, on different physicochemically characterized AP; and the activities determined by the method of reduction of 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS), in addition to the dextrinizer for amylases. The temperature was fixed at 35ºC, and the enzymatic profile by DNS was monitored for some of the AP over 120 h, in order to identify the peaks of higher activity, which occurred in wheat bran (WB) and soybean (SB). The addition of enzymatic activities in these AP was tested by experimental design 23, at 35ºC for 72 h, combining proportions of WB and SB, and varying the initial content of mineral solution and CaCl2 of the crops; followed by planning one factor at a time, where the effect of combinations of WB and SB was monitored during 120 h. The best experimental conditions previously obtained were used as a parameter to apply a central composite rotational design (DCCR), in order to obtain the optimum point of enzyme production, having as factors the initial moisture of the medium; temperature and time of cultivation. The fungus developed in a liquid and solid medium containing starch or pectin, forming mycelial mass within 24 h. The mycelial expansion showed a significant difference (p ≤ 0.05) at the initial temperatures tested, after 72 h, with no growth being observed at 40ºC. Of the AP evaluated, 88.9% induced dextrinizing amylolytic activity less than 2.5 U mL-1 in at least one of the temperatures, with the highest activity (9.6 U mL-1) being observed at 35ºC in WB. The amylolytic activities by DNS were ≥ 7.0 U g-1, at all temperatures tested, when SB and WB were used, and for this there was an increase of 31% in pectinolytic activity from 25ºC to 35ºC. The peak of amylolytic activity by DNS was reached in 72 h for WB (13.7 U g-1) and 96 h for SB (16.0 U g-1); the other AP maintained activity profiles below 3.8 U g-1. The pectinolytic activity reached a peak of 41.7 U g-1 for WB, and 33.0 U g-1 for SB in 48 h and after the use of planning 23, an increase of 82% in the amylolytic activity and 33% in the pectinolytic activity was observed, when compared to the individualized average in WB and SB. The highest amylolytic (15.97 U g-1) and pectinolytic (128.92 U g-1) activities tended to occur within 48 h, and in the WB:SB (25%:75%) combination, not differing from WB:SB (50%:50%), for pectinases, after planning one factor at a time. The optimal enzyme production (amylases = 32.35 U g-1; pectinases = 246.62 U g-1) obtained by DCCR was reached at 61.37% initial moisture, 30ºC and 68 h of cultivation. The results indicate potential for enzyme production, especially pectinases, by G. butleri when in WB and SB. Keywords: Vegetable biomass. Bioprocess. Fungi isolated from the Cerrado. Enzymatic production. Agro-industrial waste. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 – Percentual de empresas de biotecnologia no Brasil por área de atuação em 2011.............................................................................................. 35 Figura 2 – Mapa dos hotspots de biodiversidade da Terra, incluindo o Cerrado ............................................................................................................ Figura 3 – Distribuição geográfica de espécies de Paecilomyces no Brasil, inferida a partir de dados recuperados da base speciesLink ............................ Figura 4 – Basidiomas de Auricularia nigricans (a), A. fuscosuccinea (b), A. mesenterica (c) e A. delicata (d) ....................................................................... Figura 5 – Basidioma fresco de Phlebopus beniensis (a) e detalhe da micofagia por larvas de inseto (b) ..................................................................... Figura 6 – Tipos fitofisionômicos do Cerrado ................................................... Figura 7 – Biomas brasileiros, cidades e estados, tipos de cultivos agrícolas e vegetação nativa onde as amostras de solo foram coletadas ........................ Figura 8 – Biotransformação de progesterora (1) em 11 α- hidroxiprogesterona (2) por Rhizopus arrhizus ................................................. Figura 9 – Desenho esquemático das estruturas morfológicas gerais de fungos pertencentes ao subfilo Mucoromycotina e fotomicrografia do esporângio de Gongronella butleri ................................................................... Figura 10 – Fórmulas estruturais da amilose e amilopectina ........................... Figura 11 – Representação esquemática da ação das enzimas envolvidas na degradação do amido ....................................................................................... Figura 12 – Representação esquemática da estrutura das substâncias pécticas ............................................................................................................ Figura 13 – Ação das esterases sobre a molécula de pectina .......................... Figura 14 – Ação das polimetilgalacturonases e poligalacturonases sobre a molécula de pectina ......................................................................................... Figura 15 – Ação de β-eliminação catalisada por liases sobre a molécula de pectina ............................................................................................................. Figura 16 – Desenvolvimento celular de Gongronella butleri a 35ºC ± 0,5 por 24 horas, em meio líquido (a), e sólido (b, c), contendo amido .......................... 36 38 39 40 43 45 49 55 59 60 63 64 65 65 85 Figura 17 – Crescimento micelial (cm) médio (± desvio padrão) de Gongronella butleri em diferentes temperaturas ao longo do tempo, em Potato Dextrose Agar (PDA) ............................................................................ Figura 18 – Determinação do pH (média ± desvio padrão) inicial dos meios de cultivo com e sem adição de solução mineral nutritiva ................................. Figura 19 – Determinação do teor percentual de cinzas (média ± desvio padrão) inicial dos meios de cultivo com e sem adição de solução mineral nutritiva ............................................................................................................ Figura 20 – Atividade amilolítica (U mL-1) dextrinizante média de Gongronella butleri, em cultivo em estado sólido por 72 horas, em diferentes temperaturas e subprodutos agroindustriais .......................................................................... Figura 21 – Atividade amilolítica (U g-1) média, pelo método de redução do ácido-3,5-dinitrosalicílico, de Gongronella butleri em cultivo em estado sólido por 72 horas, sob diferentes temperaturas e subprodutos agroindustriais ........ Figura 22 – Atividade pectinolítica (U g-1) média, pelo método de redução do ácido-3,5-dinitrosalicílico, de Gongronella butleri em cultivo em estado sólido por 72 horas, sob diferentes temperaturas e subprodutos agroindustriais ........ Figura 23 – Perfil da atividade amilolítica (U g-1) média de Gongronella butleri (a) e proteína total (mg mL-1) média (b), em diferentes subprodutos agroindustrais, pelo método de redução do ácido-3,5-dinitrosalicílico, em cultivo em estado sólido a 35ºC ao longo de 120 horas .................................... Figura 24 – Perfil da atividade pectnolítica (U g-1) média de Gongronella butleri (a) e proteína total (mg mL-1) média (b), em diferentes subprodutos agroindustriais, pelo método de redução do ácido-3,5-dinitrosalicílico, em cultivo em estado sólido a 35ºC ao longo de 120 horas .................................... Figura 25 – Perfil da atividade amilolítica e pectinolítica (U g-1) média de Gongronella butleri, em farelo de trigo e farelo de soja, pelo método de redução do ácido-3,5-dinitrosalicílico, em cultivo em estado sólido a 35ºC ao longo de 120 horas ........................................................................................... Figura 26 – Atividades enzimáticas específicas (U mg-1) e teor de proteínas totais (mg mL-1) de Gongronella butleri em cultivo em estado sólido a 35ºC por 72 h, após planejamento experimental fatorial 23, com três repetições do ponto central .................................................................................................... 87 91 93 95 96 97 99 102 105 107 Figura 27 – Diagrama de Pareto dos efeitos padronizados das variáveis independentes sobre a atividade amilolítica, após cultivo em estado sólido de Gongronella butleri, a 35ºC por 72 horas, empregando planejamento experimental fatorial 23, com três repetições do ponto central .......................... Figura 28 – Diagrama de Pareto dos efeitos padronizados das variáveis independentes sobre a atividade pectinolítica, após cultivo em estado sólido de Gongronella butleri, a 35ºC por 72 horas, empregando planejamento experimental fatorial 23, com três repetições do ponto central .......................... Figura 29 – Diagrama de Pareto dos efeitos padronizados das variáveis independentes sobre a redução percentual da viscosidade de uma solução de pectina, após cultivo em estado sólido de Gongronella butleri, a 35ºC por 72 horas, empregando planejamento experimental fatorial 23, com três repetições do ponto central .............................................................................. Figura 30 – Perfil enzimático médio (U g-1) de Gongronella butleri (a, b) e proteína total média (mg mL-1) (c), em diferentes combinações de farelo de trigo e farelo de soja, pelo método de redução do ácido-3,5-dinitrosalicílico, em cultivo em estado sólido a 35ºC ao longo de 120 horas .............................. Figura 31 – Colonização de Gongronella butleri a 35ºC por 48 h, sobre substratos farelo de trigo e farelo de soja combinados em diferentes proporções ....................................................................................................... Figura 32 – Atividades enzimáticas (U g-1) e teor de proteínas totais (mg mL- 1) de Gongronella butleri em cultivo em estado sólido sobre composição de substrato fixado em 25% de farelo de trigo e 75% de farelo de soja, após emprego de delineamento composto central rotacional (DCCR), com quatro repetições no ponto central .............................................................................. Figura 33 – Diagramas de Pareto dos efeitos padronizados das variáveis independentes sobre a produção de amilases e pectinases, após cultivo em estado sólido de Gongronella butleri, empregando delineamento composto central rotacional (DCCR), com quatro repetições do ponto central ................. Figura 34 – Curvas de contorno e gráficos de superfície de resposta, referentes aos efeitos das variáveis independentes sobre a atividade amilolítica (U g-1) de Gongronella butleri, após cultivo em estado sólido sobre 108 110 112 114 115 118 121 25% de farelo de trigo e 75% de farelo de soja, empregando delineamento composto central rotacional (DCCR), com quatro repetições no ponto central Figura 35 – Curvas de contorno e gráficos de superfície de resposta, referentes aos efeitos das variáveis independentes sobre a atividade pectinolítica (U g-1) de Gongronella butleri, após cultivo em estado sólido sobre 25% de farelo de trigo e 75% de farelo de soja, empregando delineamento composto central rotacional (DCCR), com quatro repetições no ponto central .................................................................................................... Figura 36 – Colonização de Gongronella butleri sobre proporção de substrado fixado (25% de farelo de trigo e 75% de farelo de soja), em diferentes condições experimentais obtidas por delineamento composto central rotacional (DCCR), com quatro repetições no ponto central ................. 123 124 126 LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Fatores codificados do planejamento experimental 23 .................... 79 Tabela 2 – Planejamento experimental fatorial 23, com três repetições do ponto central .................................................................................................... 80 Tabela 3 – Planejamento um fator por vez, combinando-se os substratos A e B em diferentes proporções ............................................................................. 81 Tabela 4 – Níveis codificados e reais das variáveis independentes para a fermentação do Delineamento composto central rotacional (DCCR) ............... Tabela 5 – Matriz do planejamento experimental DCCR (valores decodificados e codificados) para os fatores umidade (%); temperatura de incubação (ºC); e tempo de cultivo (h) .............................................................. Tabela 6 – Parâmetros (médias ± desvio padrão) físico-químicos dos substratos agroindustriais, sem adição de solução mineral nutritiva, empregados no cultivo em estado sólido de Gongronella butleri ...................... Tabela 7 – Parâmetros (médias ± desvio padrão) físico-químicos dos substratos agroindustriais adicionados da solução mineral nutritiva (10 mL) empregados no cultivo em estado sólido de Gongronella butleri ...................... Tabela 8 – Redução percentual e numérica no teor de sólidos solúveis e açúcares redutores totais dos sistemas de cultivo contendo diferentes substratos, após adição inicial de solução mineral nutritiva .............................. Tabela 9 – Atividades amilolíticas específicas (U mg-1 proteína) médias de Gongronella butleri, em diferentes subprodutos agroindustrais, pelo método de redução do ácido-3,5-dinitrosalicílico, em cultivo em estado sólido a 35ºC ao longo de 120 horas ...................................................................................... Tabela 10 – Atividades pectinolíticas específicas (U mg-1 proteína) médias de Gongronella butleri, em diferentes subprodutos agroindustrais, pelo método de redução do ácido-3,5-dinitrosalicílico, em cultivo em estado sólido a 35ºC ao longo de 120 horas ...................................................................................... Tabela 11 – Resultados da atividade amilolítica e pectinolítica, pelo método de redução do ácido-3,5-dinitrosalicílico, de Gongronella butleri em cultivo em estado sólido a 35ºC por 72 horas, após planejamento experimental fatorial 23, com três repetições do ponto central ........................................................... 82 84 89 90 93 101 104 107 Tabela 12 – Redução percentual da viscosidade de uma solução de pectina, devida a influência das pectinases produzidas por Gongronella butleri, sob diversas condições experimentais, empregando-se cultivo em estado sólido a 35ºC por 72 horas .......................................................................................... Tabela 13 – Atividades amilolíticas específicas (U mg-1 proteína) médias de Gongronella butleri, em diferentes combinações de farelo de trigo e farelo de soja, pelo método de redução do ácido-3,5-dinitrosalicílico, em cultivo em estado sólido a 35ºC ao longo de 120 horas ..................................................... Tabela 14 – Atividades pectinolíticas específicas (U mg-1 proteína) médias de Gongronella butleri, em diferentes combinações de farelo de trigo e farelo de soja, pelo método de redução do ácido-3,5-dinitrosalicílico, em cultivo em estado sólido a 35ºC ao longo de 120 horas ..................................................... Tabela 15 – Atividades amilolíticas e pectinolíticas médias (U g-1) de Gongronela buteri em diferentes combinações de farelo de trigo e farelo de soja, em cultivo em estado sólido a 35ºC, ao longo de 120 h ....................... Tabela 16 – Atividades enzimáticas totais (U g-1 ou U mL-1) e atividades enzimáticas específicas (U mg-1), de Gongronella butleri em cultivo em estado sólido, sobre composição de substrato fixado em 25% de farelo de trigo e 75% de farelo de soja, após emprego de delineamento composto central rotacional (DCCR), com quatro repetições no ponto central ............................. Tabela 17 – Modelos empíricos ajustados a produção de amilases e pectinases, após emprego de delinemamento composto central rotacional (DCCR) ............................................................................................................ 111 116 116 117 119 122 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AE Ácido elágico AG Ácido gálico AM Amazonas ANOVA Análise de variância ARISA Análise espacial intergênica ribossomal automatizada ART Açúcares redutores totais AS Ágar Sabouraud ATCC American type culture collection: refere-se a linhagens de micro- organismos padrão ou de referência B.O.D. Biochemical oxygen demand BSA Soro albumina bovina Capes Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CBM Carbono da massa microbiana CCD Cromatografia em camada delgada C-CO2 Carbono de gás carbônico liberado CES Cultivo em estado sólido CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência CM Casca de maracujá CSm Cultivo submerso DCCR Delineamento composto central rotacional DNA Ácido desoxirribonucleico DNS Ácido-3,5-dinitrosalicílico EC Enzyme Commission Numbers EPI Environmental Performance Index EPS Exopolissacarídeos et al. “E colaboradores” E2G Etanol de segunda geração FA Farinha do caroço de abacate FM Fibra do resíduo do processamento de mandioca FMA Fungos micorrízicos arbusculares FM-DCA 6α-fluoro-16α-metil-desoxicorticosterona 21-acetato FOS Frutooligossacarídeos FS Farelo de soja FT Farelo de trigo GO Goiás http Hype text tranfer protocol IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística KPC Klebsiella pneumoniae produtora de carbapenemase MG Minas Gerais MRSA Staphylococcus aureus resistente a meticilina MS Mato Grosso do Sul p Valor-p em estatística correspondente à probabilidade PDA Potato dextrose agar pH Potencial hidrogeniônico PHA Polihidroxialcanoatos PIB Produto interno bruto PM Palha de milho verde QA Quirera de arroz QOS Quitooligossacarídeos qMic Quociente microbiano SM Sabugo de milho sp. Espécie ainda não identificada de um determinado gênero taxonômico SP São Paulo spp. Relativo a várias espécies de um determinado gênero taxonômico SS Sólidos solúveis Sw. Refere-se às iniciais do sobrenome do primeiro botânico Olof Stwartz, que identificou taxonomicamente a espécie TO Tocantins UV Resíduo do fermentado de vinho de uvas Santa Isabel e Bordô www World wide web LISTA DE SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDA g L-1 gramas por litro % porcentagem (ou percentual; por cento) h horas Gt giga tonelada km2 kilômetros quadrados US$ unidade de medida financeira para a moeda americana (dólar) CO2 dióxido de carbono ou gás carbônico UFC g-1 unidades formadoras de colônia por grama v/v volume por volume mN m-1 milinewton por metro P2O5 pentóxido de fósforo H3PO4 ácido fosfórico H2SO4 ácido sulfúrico ppm partes por milhão ºC graus Celsius Ca3(PO4)2 fosfato tricálcio rpm rotações por minuto µg L-1 microgramas por litro nn nanômetros U g-1 unidade internacional de atividade enzimática por grama U mg-1 unidade internacional de atividade enzimática por miligrama UI unidade internacional de atividade enzimática U mL-1 unidade internacional de atividade enzimática por mililitro Da daltons min. minutos mL mililitros K2HPO4 fosfato de potássio dibásico MgSO4.7H2O sulfato de magnésio heptahidratado °Brix graus Brix g mL-1 gramas por mililitro mg g-1 miligrama por grama g gramas g m-2 gramas por metro quadrado µm micrômetro HCl ácido clorídrico M molaridade NaOH hidróxido de sódio mm milímetros (NH4)2SO4 sulfato de amônio CaCl2 cloreto de cálcio ciclos min.-1 ciclos por minuto cm-2 por centímetro quadrado g gravidade (medida rotacional) µmol micromol mg mL-1 miligrama por mililitro µL microlitros KNaC4H4O6.4H2O tartarato de sódio e potássio tetraidratado Na2CO3 carbonato de sódio N normalide CuSO4.5H2O sulfato cúprico pentahidratado μg mL-1 microgramas por mililitro p/v partes por volume mM milimolar cm h-1 centímetros por hora SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ................................................................................... 2 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................. 2.1 Produção agrícola/agroinsdutrial, bioeconomia e desenvolvimento sustentável ......................................................... 2.2 Diversidade fúngica no Cerrado ..................................................... 25 28 28 35 2.2.1 Alguns espécimes relatados nos últimos anos ................................... 37 2.2.2 Algumas potenciais aplicações biotecnológicas e ameaças à diversidade fúngica ............................................................................ 41 2.3 Gongronella butleri: características gerais, emprego e possibilidades evidenciadas em estudos atuais .......................... 54 2.4 Amilases ............................................................................................ 2.5 Pectinases ......................................................................................... 2.6 Desafios e alternativas atuais associados ao problema dos resíduos agroindustriais .................................................................. 58 61 66 3 OBJETIVOS ....................................................................................... 70 3.1 Objetivo geral .................................................................................... 3.2 Objetivos específicos ....................................................................... 70 70 4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................... 72 4.1 Reativação da cepa e teste piloto de produção de amilases e pectinases ......................................................................................... 4.2 Determinação do crescimento e expansão micelial da cepa fúngica em meio de cultivo padrão sob distintas temperaturas . 72 73 4.3 Caracterização físico-química dos substratos agroindustriais ... 4.4 Cultivo da cepa fúngica sob diferentes substratos agroindustriais e temperaturas ...................................................... 74 75 4.4.1 Determinação das atividades enzimáticas ......................................... 76 4.4.2 Determinação do perfil das atividades enzimáticas e atividades específicas ......................................................................................... 4.4.3 Determinação de proteínas ................................................................ 4.5 Teste de otimização da produção de enzimas e mensuração da atividade pectinolítica por método viscosimétrico empregando planejamento fatorial 23 ................................................................... 78 78 79 4.6 Planejamento um fator por vez, seguido de delineamento composto central rotacional (DCCR) .............................................. 4.6.1 Planejamento experimental usando delineamento composto central rotacional (DCCR) .............................................................................. 81 82 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................... 5.1 Teste piloto de produção de amilases e pectinases ..................... 5.2 Crescimento e expansão micelial de G. butleri IPS 8.2 em ágar PDA, ao longo do tempo, em distintas temperaturas ................... 5.3 Características físico-químicas dos subprodutos agroindustriais ................................................................................. 5.4 Atividades enzimáticas amilolíticas e pectinolíticas sob diferentes temperaturas e tempo fixado ........................................ 5.5 Perfil de atividade enzimática em diferentes tempos de fermentação e temperatura fixada, empregando o método do ácido-3,5-dinitrosalicílico (DNS) ..................................................... 5.6 Otimização da produção enzimática empregando-se planejamento fatorial 23 ................................................................... 5.6.1 Redução percentual da viscosidade .................................................. 5.7 Efeito da combinação de substratos sobre a produção enzimática após emprego de planejamento um fator por vez, seguido de DCCR ............................................................................. 6 CONCLUSÃO ..................................................................................... 85 85 86 89 94 98 106 111 113 127 REFERÊNCIAS .................................................................................. 128 APÊNDICE A – Curvas de calibração padronizadas para a determinação de açúcares redutores totais (ART) ....................... 162 APÊNDICE B – Curvas de calibração padronizadas da solução do ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) ................................................ APÊNDICE C – Curva de calibração de soro albumina bovina (BSA) ................................................................................................. APÊNDICE D – Quadro de análise de variância (ANOVA) para o crescimento micelial de Gongronella butleri IPS 8.2 .................... APÊNDICE E – Tabelas de coeficientes e significância estatística das variáveis independentes sobre as atividades 163 164 165 enzimáticas e redução percentual da viscosidade de uma solução de pectina, após emprego de planejamento fatorial 23 .. APÊNDICE F – Tabelas de coeficientes e significância estatística das variáveis independentes sobre as atividades enzimáticas (amilase e pectinase), após emprego de delineamento composto central rotacional (DCCR) ..................... APÊNDICE G – Tabelas de análise de variância (ANOVA) para os modelos ajustados as atividades enzimáticas (amilase e pectinase), após emprego de delineamento composto central rotacional (DCCR) ............................................................................ APÊNDICE H – Gráficos das respostas reais versus preditas pelo modelo linear de regressão aplicado às atividades enzimáticas (amilase e pectinase), após emprego de delineamento composto central rotacional (DCCR) ..................... 166 167 168 169 25 1 INTRODUÇÃO O cenário global da sociedade contemporânea marcado em grande parte pelo sistema capitalista, vem ao longo dos tempos estimulando a produção e consumo desenfreados. Isso tem demandado um enorme aporte de recursos naturais e dispondo no ambiente uma grande quantidade de rejeitos e energia, que devido à sua constituição e/ou alta carga emitida, demoram a ser transformados e reutilizados naturalmente. Tal situação gera desordens e impactos negativos ao meio ambiente, além da escassez de recursos, má qualidade de vida, disputas sociais, problemas de saúde pública, dentre outros. Essa degradação ambiental, iniciada em particular no século XVIII, decorrente da Revolução Industrial, e acentuada nos anos seguintes, especialmente a partir do século XX com o advento da globalização, têm suscitado na humanidade um clamor por soluções que visem congregar o paradoxo do desenvolvimento social e econômico associado à conservação e proteção da vida e do ambiente, de modo a dar um direcionamento mais sustentável à sociedade (ONU, 2015; LAMPKOWSKI; LAMPKOWSKI, 2016). O setor agroindustrial, pautado principalmente na produção alimentícia, atua como um dos mais importantes pilares econômicos do Brasil (MOREIRA, 2016), gerando por consequência grandes quantidades de “resíduos” de biomassa que se não forem adequadamente manejados e/ou aproveitados podem trazer prejuízos em termos ambientais. Dentre as distintas aplicações desses subprodutos agrícolas e agroindustriais destacam-se o emprego para a alimentação humana e animal; como matéria prima em uma gama variada de indústrias; ou como substrato para o cultivo de micro- organismos e consequente produção de biomassa celular, bioprodutos e energia, que apresentam nesse caso, um maior valor agregado (SILVA et al., 2019). Tal aplicação se dá especialmente porque essas sobras agrícolas ou do beneficiamento industrial, ainda apresentam energia potencial metabolizável e nutrientes, que podem ser convertidos biologicamente (DE TONISSI E BUSCHINELLI DE GOES et al., 2016; PANDA et al., 2016). Segundo Hartung (2020), faz-se necessário esforços articulados que mobilizem de forma compartilhada a sociedade com vistas a se transformar a maneira de fazer 26 negócios, consumir, construir e viver, inserindo-se assim no ciclo virtuoso da bioeconomia. Nesse sentido, a busca por processos mais sustentáveis nos diferentes setores econômicos da sociedade e em específico na agricultura e cadeia agroindustrial, tem sido abordada de maneira mais estratégica ultimamente, tornando os impactos advindos da sustentabilidade mais visíveis e fáceis de serem administrados, com reflexos mais palpáveis em diversos setores (MOREIRA, 2016). Estudos recentes vêm mostrando os benefícios de se aliar e aproveitar de forma sustentável da biodiversidade e dos serviços ecossistêmicos por ela fornecidos direta e indiretamente (SILVA; VASCONCELLOS, 2018; VASCONCELLOS; BELTRÃO, 2018; JOLY et al., 2019; MARTINHO et al., 2019; PARON et al., 2019). Dentre tais serviços, pode-se destacar a bioconversão de sobras das culturas agrícolas por micro-organismos, especialmente fungos, em outros produtos e/ou energia. Saad et al. (2017), por exemplo, evidenciaram satisfatória eficiência biológica (produtividade) de conversão da palha de milho (mais de 47%) em massa micelial fresca por Ganoderma lucidum, um cogumelo potencialmente funcional e com propriedades medicinais. Já, Santos-Rocha et al. (2017) obtiveram eficiências fermentativas de conversão da biomassa da palha e sabugo de milho pré-tratados hidrotermicamente, em etanol de segunda geração em valores aproximados de 87,5% e 86,9%, respectivamente. Uma outra frente de estudos que se destaca é o aproveitamento das sobras agroindustriais como substrato para cultivo microbiano e consequente produção de enzimas de interesse comercial. Tal fato relaciona-se não somente com a busca atual por processos mais sustentáveis; e a versatilidade bioquímico-metabólica dos micro- organismos, que possibilita otimizar a produção desses bioprodutos (ABDULLAH et al., 2018); mas também pelo crescimento do mercado mundial de catalisadores biológicos. De acordo com pesquisa realizada pela BCC Research (2018), o mercado global de enzimas foi avaliado em 4,58 bilhões de dólares no ano de 2016, devendo atingir 7,48 bilhões em 2025, com o aumento da demanda de enzimas derivadas naturalmente. Dentre as distintas alternativas de obtenção de enzimas fúngicas, o emprego do cultivo de micro-organismos em estado sólido (CES), apresenta-se como uma técnica economicamente menos onerosa e de mais fácil realização (SANTI; BERGER; 27 SILVA, 2014; SANTOS P. et al., 2018), quando comparado à extração obtida de macerados celulares e/ou teciduais de vegetais e animais. Têm-se notado que a bioprospecção de enzimas e/ou coquetéis enzimáticos advindos do metabolismo microbiano sobre as sobras agroindustriais podem promover melhorias de rendimento, qualidade e redução de custos e energia, em meio ao desenvolvimento de processos e/ou elaboração de produtos. No rol de enzimas produzidas por atividade microbiana e empregadas comercialmente, encontram-se dentre outras, as amilases e pectinases. Segundo Mukesh Kumar et al. (2012) e Oliveira et al. (2015), essas biomoléculas correspondem juntas de 10 a 33% do mercado internacional de catalisadores biológicos, tendo uma ampla aplicação em diferentes setores da atividade humana, sejam em processos e/ou produtos da área alimentícia, bebidas, têxtil, química, entre outros (POLIZELI; SILVA, 2016; AMIN; BHATTI; BILAL, 2019). Em estudo sistematizado de revisão da literatura com relação à produção de enzimas microbianas sob cultivo em estado sólido empregando diferentes subprodutos agroindustriais, Santos P. et al. (2018) observaram que 49% das pesquisas publicadas sobre o assunto são brasileiras, tendo como principal enfoque a produção de celulases; como agente biológico mais utilizado o fungo Aspergillus niger; e como resíduos mais empregados, o farelo de trigo e sobras da fruticultura. Dado esse contexto, faz-se necessário estudar a atividade de outros micro- organismos sobre substratos alternativos, de modo a se ampliar as potencialidades de obtenção de distintas enzimas. 127 6 CONCLUSÃO Observou-se que a cepa fúngica de Gongronella butleri, isolada do solo do Cerrado, teve a capacidade de utilizar o amido e a pectina como principal fonte de carbono e energia para o seu desenvolvimento. Foi notado potencial crescimento micelial e produção de amilases e pectinases sobre os diferentes substratos agroindustriais testados, sendo o farelo de soja e trigo os que promoveram maior capacidade de indução enzimática, especialmente para pectinases. Os picos de maior produção amilolítica e pectinolítica se mantiveram dentro da faixa de 48 a 96 horas de cultivo, independentemente do substrato empregado, demonstrando eficiência da cepa para o emprego comercial, especialmente se testes mais aprodundados de otimização e de segurança biológica forem realizados. O fator que mais teve influência na produção enzimática foi o teor de umidade inicial do meio de cultivo, sendo a combinação de substratos farelo de trigo e farelo de soja, também importante para as melhores respostas obtidas. Foram observados aumentos consideráveis na atividade enzimática, especialmente pectinolítica, em comparação aos acréscimos na atividade amilolítica, quando da combinação de 25% de farelo de trigo e 75% de farelo de soja; associado ao cultivo a 30ºC por 68 h, após emprego de delinemamento composto central rotacional. Essas mesmas condições, só que num período de 65 h, seriam as mais satisfatórias para ambas enzimas, com produção de amilases iguais ou maiores a 30 U g-1 e de pectinases, iguais ou maiores a 250 U g-1; representando acréscimos respectivos em atividade de mais de 56% para amilases e 87% para pectinases, quando comparado ao uso isolado de tais substratos, num cultivo a 30ºC, por 72 h. Sugere-se, para estudos futuros, testar as características e o desempenho das atividades enzimáticas obtidas nas melhores condições aqui empregadas, em diferentes níveis de pH e temperatura; verificar o efeito residual das atividades enzimáticas dos extratos brutos após armazenamento ou manutenção sob diferentes condições; aplicar os extratos brutos enzimáticos, sobre misturas ou soluções (principalmente aquelas obtidas de vegetais que contem em sua composição pectina), visando observar os efeitos sobre a clarificação e turbidez das mesmas; e realizar experimentos utilizando condições que possam validar os modelos empíricos que foram aqui obtidos para a produção de amilases e pectinases. 128 REFERÊNCIAS ABDULLAH, R.; JAFER, A.; NISAR, K.; KALEEN, A.; IQTEDAR, M.; IFTIKHAR, T.; SALEEN, F.; NAZ, S. Process optimization for pectinase production by locally isolated fungal strain using submerged fermentation. Bioscience Journal, Uberlândia, v. 34, n. 4, p. 1025-1032, jul./aug. 2018. 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