UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CAMPUS DE ARARAQUARA Curso de Graduação Farmácia FERNANDO AUGUSTO SANTA CATHARINA CÂNCER DE CÓLON, TAURINA E ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA – UMA REVISÃO Araraquara 2021 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CAMPUS DE ARARAQUARA Curso de Graduação Farmácia FERNANDO AUGUSTO SANTA CATHARINA CÂNCER DE CÓLON, TAURINA E ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA – UMA REVISÃO Trabalho de Conclusão de Curso submetido à Faculdade de Ciências Farmacêuticas, da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” como parte dos requisitos ne- cessários para a obtenção do Grau de Bacha- rel em Farmácia. Orientadora: Profa. Dra. Chung Man Chin. Coorientadora: Daniela Hartmann Jornada daniela.dhj@gmail.com Araraquara 2021 Diretoria do Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP – Campus de Araraquara Santa Catharina, Fernando Augusto. S233c Câncer de cólon, taurina e análise histopatológica: uma revisão / Fer- nando Augusto Santa Catharina. – Araraquara, 2021. 53 f. : il. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação – Farmácia Bioquímica) - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciên- cias Farmacêuticas. Orientadora: Chung Man Chin. Coorientadora: Daniela Hartmann Jornada. 1. Câncer de cólon. 2. Genes. 3. Diagnostico. 4. Imunohistoquimica. 5. Taurina. I. Chung, Man Chin, orient. II. Jornada, Daniela Hartmann, coorient. III. Título. Folha de aprovação digitada ou digitalizada da original AGRADECIMENTOS Primeiramente gostaria de agradecer ao meu pai por sacrificar grande parte de sua liberdade para conseguir me custear fora de casa e pela sua confiança, também aproveitar para dizer que não conseguiria sem ele e agradecerei por toda a minha vida. Também a minha família, que sem eles jamais nem teria sequer entrado na faculdade, principalmente minha tia que na verdade não merece ser chamada de tia e sim de mãe. Sem deixar minha espiritualidade de lado agradeço também a Deus por todas as minhas preces e desejos concedidos. Sendo assim completo este trabalho e concluo uma grande etapa, a melhor e onde tive o maior número de aprendizados da minha vida até o momento, nesse agrade- cimento não consigo citar todas as pessoas que tive o prazer de conhecer e me ajudaram durante a jornada, porém estarão sempre guardadas em um pedaço de minhas memórias que levarei até o final de minha vida. Também gostaria de deixar um agradecimento especial para a professora Chung por toda a ajuda e paciência durante a elaboração do trabalho e os aprendizados dentro da faculdade, também agradeço a Dra. Daniela por me ajudar e entender um pouco do mundo acadêmico e todo o seu apoio que tornou possível escrever este trabalho. Agradeço também o professor Cleverton por me dar a oportunidade de fazer uma iniciação científica e por todas as longas conversas e grande apren- dizado. Gostaria de agradecer imensamente a minha república (Ktivero) e todas as pessoas que conheci lá dentro sem exceção, pois todas contribuíram imensamente para o meu crescimento e me garantiram lembranças que ficarão para sempre. Por fim gostaria de deixar um agradecimento especial para Ariel, Krusty, Ibra, Moi- ses, Minhoca e Verde, pessoas maravilhosas que posso chamar de meus amigos e sempre estiveram ao meu lado e compartilharam momentos inesquecíveis, sempre terão minha gratidão e tenho o orgulho de levar essas amizades daqui. Ainda exis- tem pessoas que gostaria de citar, porém o texto ficaria muito longo. Também agradeço a todos os funcionários de todas as profissões que estão trabalhando na UNESP, que todo dia contribuem não só para a minha formação, mas para a for- mação de todos os alunos, mesmo que não saibam as vezes um simples bom dia dessas pessoas me motivava muito. E para a UNESP só posso devolver a minha luta pela faculdade e defesa das instituições públicas que movem esse país apesar de todas as adversidades, um muito obrigado a UNESP e a Morada do Sol. RESUMO O câncer de cólon retal (CCR) é um dos 10 tipos de câncer mais incidentes do mundo, causando quase 10 milhões de mortes somente em 2018. Nos últimos 3 anos houve aumento de 10% na mortalidade causada por CCR, demonstrando que os tratamentos existentes não são totalmente eficazes, devido a não eficácia, toxi- cidade ou não adesão. A terapia consiste na remoção cirúrgica do tumor e em al- guns casos a quimioterapia adjuvante, composta de 5-fluorouacil (5-FU), e outros fármacos associados. A taurina é um aminoácido semi essencial com potente ativi- dade antioxidante, antimutagênica e anti-inflamatória, capaz de promover proteção cardíaca e renal frente a toxicidade tecidual causada por quimioterápicos como a doxorrubicina e cisplatina. Estudos realizados no Lapdesf demonstraram que a tau- rina foi capaz de reduzir o CCR induzido quimicamente em animais e potencializar o efeito do 5FU. O presente trabalho tinha como objetivo, o estudo imuno- histoquimico para a elucidação dos marcadores envolvidos no estudo da tauri- na/5FU/CCR. Entretanto, devido à pandemia da Covid-19, impediu a finalização experimental da pesquisa. Assim, presente trabalho foi transformado em uma revi- são bibliográfica, envolvendo a CCR, genes envolvidos na CCR, diagnóstico (atua- lização da literatura sobre os métodos imunohistoquimicos) e taurina. Assim, para a revisão, foram utilizadas as palavras-chaves câncer de colon, genes, diagnostico, imunohistoquimica, taurina e a busca no banco de dados Pubmed, Lilacs, entre os períodos de 2000 - 2021. Palavras-chave: câncer de cólon, genes, diagnostico, imunohistoquimica, taurina. ABSTRACT Rectal colon cancer (RCC) is one of the 10 most common types of cancer in the world, causing almost 10 million deaths in 2018 alone. In the last 3 years there has been a 10% increase in mortality caused by RCC, demonstrating that the existing treatments are not fully effective, due to non-efficacy, toxicity or non-adherence. The therapy consists of surgical removal of the tumor and in some cases adjuvant chemotherapy, composed of 5-fluorouacil (5-FU), and other associated drugs. Tau- rine is a semi-essential amino acid with powerful antioxidant, antimutagenic and anti-inflammatory activity, capable of promoting cardiac and renal protection against tissue toxicity caused by chemotherapics such as doxorubicin and cisplatin. Studies conducted at Lapdesf demonstrated that taurine was able to reduce chemically- induced RCC in animals and enhance the effect of 5-FU. The present work had as objective, the immunohistochemical study for the elucidation of the markers in- volved in the taurine/5FU/RCC study. However, due to the Covid-19 pandemic, it prevented the experimental completion of the research. Thus, this study was changed into a literature review about RCC, including genes involved in RCC, diag- nosis (update of the literature on immunohistochemical methods) and taurine. Thus, for the review, it was used the key words colon cancer, genes, diagnosis, immuno- histochemistry, taurine in the Pubmed and Lilacs database, between periods 2000 - 2021. Keywords: colon cancer, genes, diagnosis, immunohistochemistry, taurine. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Incidência do número de casos por tipo e sexo no Brasil ....................................... 11 Figura 2. Imagem do intestino grosso .......................................................................................... 12 Figura 3. Descrição do processo de carcinogênese .................................................................. 15 Figura 4. Visão endoscópica de dois focos de elevação de adenoma .................................. 17 Figura 5. Imagens de microscopia (coloração Índigo-carmim) para diferenciação entre adenoma e adenocarcinoma (É possível observar a invasão característica do ................... 17 Figura 6. (A) Imagem dos tipos de anticorpos e sua marcação em um antígeno ; (B) Sistema Avidina – Biotina .............................................................................................................. 24 Figura 7. Imagem de uma microscopia de fluorescência com indicação da ligação antígeno-anticorpo refletido na cor verde .................................................................................... 24 Figura 8. Efeito da taurina na atividade de colite induzida por DSS ...................................... 32 Figura 9a). Gráficos de comparação da presença de sangue nas fezes do peso corporal entre os modelos, taurina e controle ............................................................................................ 36 Figura 9b). Gráficos de comparação entre os grupos modelo e taurina em relação ao peso do cólon e número de tumores ...................................................................................................... 36 Figura 10. Exame microscópico de tecidos do cólon usando coloração H&E. Imagens representativas do tecido normal do grupo de controle e pólipos inflamatórios e câncer de cólon de grupos modelo induzidos por AOM E DSS e taurina. O gráfico representa o número médio de câncer de cólon por camundongo entre o grupo modelo de controle e o grupo taurina. ................................................................................................................................... 37 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AOM : Azoximetano APC Polipose Adenomatosa de Colo Bcl-2 Célula Beta de Linfoma CCR Câncer Colorretal CYP27A1 Citocromo P450 Família 27 Subfamília A Membro 1 DSS Dextrano Sulfato de Sódio GPx Glutationa Peroxidases HO-1 Heme Oxigenase IL-1 Interleucina Um K-RAS Homólogo oncogene viral de sarcoma de rato Kirsten LPS Lipopolissacarídeo MIP-2 Proteína Inflamatória de macrófago mRNA RNA mensageiro MST1/2 Serina / Treonina Quinase NF-κB Factor Nuclear Kappa P53 Proteina de Tumor PAF Polipose Adenomatosa Familiar PCR Reação em cadeia de polimerase PRX Peroxiredoxina TGF-β Fator de Transformação do Crescimento Beta TNF Fator de Necrose Tumoral Sumário RESUMO ..................................................................................................................................................... 4 ABSTRACT ................................................................................................................................................ 5 1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................................................... 11 2 OBJETIVO ............................................................................................................................................. 13 3 MÉTODOS ............................................................................................................................................. 13 4 MECANISMOS E VIAS DE CARCINOGÊNESE ................................................................................ 13 4.1 ESTÁGIOS DA CARCINOGÊNESE .............................................................................................................. 15 4.2 GENES ENVOLVIDOS NA CARCINOGÊNESE DA CCR ............................................................................... 17 4.3 SINTOMATOLOGIA .................................................................................................................................... 20 4.4 DIAGNÓSTICO .......................................................................................................................................... 21 4.5 TRATAMENTO ........................................................................................................................................... 22 5 MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO DE ANTÍGENOS E BIOMARCADORES ................................... 22 6 IMUNO-HISTOQUÍMICA ...................................................................................................................... 25 6.1 AVERAGE TRESHOLD MEASURE (ATM) ................................................................................................. 25 6.2 IHC PROFILER ......................................................................................................................................... 26 6.3 HIBRIDIZAÇÃO FLUORESCENTE IN SITU (FISH) ...................................................................................... 26 6.4 HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA (CGH) ...................................................................................... 27 6.5 AMPLIFICAÇÃO DO SINAL DE TYRAMIDE (TSA) ...................................................................................... 28 6.6 AUTOMAÇÃO DE MOLÉCULA ÚNICA RNASCOPE MULTIPLEXADA E HIBRIDIZAÇÃO FLUORESCENTE IN SITU E IMUNO-HISTOQUÍMICA PARA MAPEAMENTO ESPACIAIS DE TECIDOS ................................................. 28 7 TAURINA E CANCÊR DE CÓLON ..................................................................................................... 29 8 CONCLUSÃO ........................................................................................................................................ 41 9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................................... 44 11 1 INTRODUÇÃO O câncer é atualmente a segunda maior causa de morte no mundo, respon- sável por cerca de 10 milhões de mortes em 2020. O câncer colorretal (CCR) atin- ge as regiões do cólon e reto sendo terceiro tipo de câncer que mais causa mortes totalizando 1,8 milhões de casos no mundo (WHO, 2018). A Figura 1 mostra a inci- dência de casos, por sexo, no Brasil (INCA, 2021). Figura 1. Incidência do número de casos por tipo e sexo no Brasil Fonte: (INCA, 2020). 12 No Brasil a incidência foi de 626.030 neoplasias totais onde cerca de 41.000 desses casos foram de câncer colorretal segundo o Ministério da Saúde e Instituto Nacional de Câncer como se pode observar na tabela 1. (INCA, 2020) O câncer colorretal acomete regiões do cólon e o reto ocasionando no surgimento de tumo- res malignos provenientes do tecido glandular que é característico do órgão e seu desenvolvimento ocorre por via genética relacionado a susceptibilidade genética ou esporádica provenientes de mutações somáticas (STASTNA , 2019). A Figura 2 abaixo mostra a imagem do intestino grosso. Figura 2. Imagem do intestino grosso Fonte: (SANTOS, 2021). Alguns fatores como microambiente e sinalização genética como por exem- plo da proteína K-Ras, podem ser fatores cruciais para a agressividade da doença alterando seu perfil de expressão e favorecendo o seu potencial de metástase (CARVALHO et al, 2019). O assunto é extenso e o presente trabalho tem como uma revisão da literatura envolvendo câncer de cólon, diagnóstico (com ênfase no ensaio imuno-histoquimico) e taurina. 13 2 OBJETIVO Realizar revisão da literatura sobre câncer de cólon, diagnóstico (com ênfa- se no ensaio imuno-histoquimico) e taurina. 3 MÉTODOS Foi realizado revisão da literatura utilizando as palavras chave: câncer de colon, taurina, imuno-histoquímica nos bancos de dados Pubmed e Lilacs nos pe- ríodos de 2000 a 2021. A revisão foi dividida em : 1. Mecanismos e vias da carcinogênese da CCR 2. Estágios da carcinogênese 3. Genes envolvidos na CCR 4. Sintomatologia 5. Diagnóstico da CCR 6. Tratamentos 7. Métodos de identificação de antígenos e biomarcadores da CCR 8. Imuno-histoquimica: atualização da literatura 9. Taurina e CCR 4 MECANISMOS E VIAS DE CARCINOGÊNESE O câncer colorretal ocorre por duas vias conhecidas, que são a via hereditá- ria e esporádica. O CCR hereditário advém da falha ou deficiência que acomete o sistema de reparo e microssatélites resultando em problemas genéticos na célula incidente, a célula com instabilidade tende a acumular alterações genéticas (COTTI et al, 2000; SOUZA; CASAGRANDE, 2018). O resultado dessa instabilidade e alte- rações é o surgimento de doenças da via hereditária, as duas principais síndromes são a Polipose adenomatosa familiar (PAF) e a síndrome de Linch. A via genética do desenvolvimento da doença vem de uma série de mutações em oncogenes e genes supressores que levam a alterações nas vias e enzimas de sinalização mi- tógena (PANCIONE, 2012). A síndrome de Lynch resulta de mutações em genes de reparo (MLH1, MSH2 e MSH6), e a PAF ocorre por deleções nos cromossomos dos genes APC (RASKOV, 2014). A via de instabilidade de microssatélites resulta 14 de uma falha do sistema de reparo responsável por corrigir erros de base e manter a estabilidade genômica, assim células de funcionamento anormal acumulam erros em vez de corrigi-los (WIMMER, 2014). A Polipose adenomatosa familiar surge de mutações no gene APC que é um gene supressor de tumor e possui papel funda- mental na sinalização Wnt e degradação de beta-catenina, importante no desen- volvimento celular, portanto mutações nesse gene causam grande desequilíbrio no crescimento normal e função celular (TALSETH-PALMER, 2017). A outra via do CCR é a esporádica, é produto de fatores externos e exposi- ção a agentes que causam a doença (álcool, cigarro, radiação, agrotóxicos), além disso, possui fatores de risco (idade, sexo, presença e progressão de adenoma, dieta) para o desenvolvimento da doença e fatores ambientais podem levar a mu- tações genéticas, esses que são adquiridos ao longo do tempo e acumulados no genoma celular (KUIPERS, 2015). São descritos também outros fatores que po- dem estar associados ao desenvolvimento do CCR, como dieta e digestão de ali- mentos à base de nitrito/nitrogênio, alto consumo de carne, atividade física e o me- tabolismo do ácido araquidônico podendo fornecer o microambiente de inflamação, além de produzir prostaglandina E2 que induz a proliferação, suprime o sistema imune e produz fatores de crescimento vascular e de fibroblastos (MAY-WILSON, 1990). As alterações descritas ocasionam na proliferação e desenvolvimento anormal das células afetas assim como o surgimento de adenomas (LIMA, 2014). O mecanismo mais aceito para explicar o desenvolvimento de neoplasias de cólon é a sequência adenoma-carcinoma, que ocorre pela formação de adenomas que se desenvolvem para adenocarcinomas. Como grande parte do tecido do có- lon é glandular, a formação de adenomas tem grande chance de se desenvolver até carcinomas, dentro dessa evolução existem genes específicos que sofrem mu- tações para que ocorra essa progressão, assim as lesões polipoides benignas na camada mucosa tem alto potencial de malignidade. A formação dessas lesões de adenoma estão ligados a genes específicos como supressores de tumores que param de regular o desenvolvimento da célula normal, tornando-se um oncogene (ROSSI, 2008). 15 4.1 Estágios da carcinogênese O processo de carcinogênese ocorre em três estágios: iniciação, promoção e progressão. Cada fase tem seu papel até que ocorra a proliferação de células malignas, essas fases mostram a transição entre o período de transformação de um adenoma em um carcinoma (MARONGIU et al, 2018). A iniciação é a primeira etapa da carcinogênese, envolve alterações celula- res estáveis que podem ser ou não induzidas por um agente pró carcinógeno e então ocorrem mutações no genoma da célula tornando-a potencialmente perigosa para o desenvolvimento da carcinogênese e formando as células iniciadas que po- dem permanecer latentes por semanas, meses ou anos (SCOTT et al 1984). Na Figura 3 é possível observar o processo de carcinogênese bem como suas fases. Figura 3. Descrição do processo de carcinogênese Fonte: (Adaptado de LAMOREABIO, 2016). As sequências do DNA responsáveis pela mutação são chamadas de pro- oncogenes que dão início a alterações, a ativação de mais de um pro-oncogene mostra-se necessária para a ativação da transformação neoplásica, mas também outros fatores somados a ativação desses genes podem ser necessários para a transformação da célula, como o meio que ela se encontra e fatores externos. Se essa célula não conseguir realizar o reparo do DNA e sofrer divisão celular, as alte- rações são herdadas para células filhas e então o processo é irreversível. Existem mecanismos para a ativação de pro-oncogenes que podem ocorrer pela super ex- 16 pressão dos genes que começam a ser transcritos em níveis muito elevados adqui- rindo atividade uma vez que latentes. Também pode ocorrer alteração na sequên- cia de um gene o alterando de uma forma benigna para uma maligna. (MALAR- KEY, 2013). A fase de promoção é a que corresponde ao crescimento celular desorde- nado das células iniciadas ocorrendo a expansão, e está associada a capacidade de anular eventos regulatórios do ciclo celular. Alguns estudos sugerem que agen- tes promotores não causam mutações por si só mas causam hiperplasia e também promovem alterações epigenéticas no DNA. Além disso células iniciadas geralmen- te são expostas por longos intervalos a agentes promotores até que a transforma- ção esteja completa, entre a iniciação e a promoção a célula começa apresentar mecanismos autorregulatórios anormais para o crescimento celular, durante este período a célula ainda consegue responder a um sinal de apoptose, por isso esta fase ainda é dita reversível (SCOTT et al, 1984). A progressão corresponde ao período de pré-malignidade e o câncer, envol- ve a disseminação e a proliferação desordenada das células aumentando o tama- nho do tumor e as populações malignas. Além disso, aumentando a heterogenei- dade e instabilidade do genoma celular devido ao acumulo de mutações. Isso facili- ta os processos de invasão e metástase. Essa fase corresponde ao surgimento das manifestações clínicas da doença (BODEY; SIEGEL, 2005). A característica marcante do adenocarcinoma colorretal é a invasão através da mucosa muscular na submucosa. Na maioria dos adenocarcinomas colorretais ocorre alterações nas glândulas (adenoma), com variabilidade no tamanho e confi- guração das estruturas glandulares. O adenocarcinoma pode surgir de um adeno- ma, mas ainda antes da formação dessa sequência da carcinogênese existe um foco que pode ser descrito com precursor do adenoma, estas são as criptas aber- rantes, que podem surgir de lesões. Geralmente essas criptas possuem um calibre aumentado e epitélio espessado com mucina reduzida que indicam as diferenças entre células sadias, conforme observado na Figura 4 e 5. (HAMILTON, 2000). 17 Figura 4. Visão endoscópica de dois focos de elevação de adenoma Fonte: (HAMILTON, 2000). Figura 5. Imagens de microscopia (coloração Índigo-carmim) para diferenciação en- tre adenoma e adenocarcinoma (É possível observar a invasão característica do tecido) Fonte: (JORNADA, 2018). 4.2 Genes envolvidos na carcinogênese da CCR A carga mutacional tumoral que são mutações adquiridas e acumuladas ao longo do tempo por diversos meios, tem sido descrita como preditor de comporta- mento tumoral e resposta imunológica, assim a formações de mutações promove a carcinogênese através da ativação e inativação de genes chaves e vias, portanto a 18 alta carga de mutações pode indicar um maior risco de formação de tumor além de representar maior sobrevida ao tumor. (KLEBANOV et al., 2019). A mutação e inativação do gene Apc é um evento chave e precoce observa- do na carcinogênese colorretal, essas alterações no gene provocam o desbalance- amento de sua função e controle das vias por esse gene, incluindo a via de sinali- zação Wnt que envolve a sinalização e degradação de β-catenina ocasionando desregulamentação de múltiplos outros processos celulares. O desequilíbrio dessa via ocasiona proliferação celular descontrolada de onde surgem as neoplasias. (ZHANG; SHAY, 2017). Dentre os genes que participam da carcinogênese existe destaque para o gene Apc que se trata de uma proteína codificada pelo gene Apc, que é responsá- vel por regular a via Wnt/ β-catenina, que é ligada ao desenvolvimento e prolifera- ção celular. O gene Apc é frequentemente descrito e relacionado à fase inicial da carcinogênese que ao sofrer mutações resulta em CCR. (CONLIN et al, 2005). O gene p53 é frequentemente descrito como o guardião do genoma celular devido a sua função de proteger a célula de danos e stress. No gene em questão tem sido associado sua perda de sua função com incidência e progressão de cân- cer mostrando que o seu papel de supressor de tumor é vital para o controle do desenvolvimento da carcinogênese (ISSAEVA, 2019). Muitas outras funções e me- canismos de controle e estabilidade celular são atribuídas ao gene p53, assim co- mo sua interação na apoptose celular e controle de reparos de danos do DNA du- rante o ciclo celular, impedindo que o DNA danificado ou inadequado passe para replicação e alastre a novas células (NEVES; GUEDES, 2012). Outro gene ligado ao desenvolvimento e progressão do CCR é uma proteína GTPase codificada pelo gene K-Ras que tem funções regulatórias em diversas vias celulares além de desempenhar papel na diferenciação e proliferação celular e seu crescimento. O gene K-Ras é frequentemente associado a fase de progressão do câncer e sua mutação está fortemente associada ao surgimento irreversível do CCR (MURUGAN et al, 2019). A proteína K-Ras tem ação regulatória, de proliferação e sobrevivência celu- lar, através de mecanismos de sinalização de GTPases, proteínas proto- 19 oncogenes frequentemente mutadas na existência de câncer colorretal. A mutação ocorre principalmente no códon 12 e poucas são observadas no códon 61, provo- cando alteração do crescimento celular. Sinais de apoptose tendem a cessar, ocor- rendo a proliferação e crescimento celular desordenado, por isso o K-Ras tem im- portância relevante nos mecanismos de câncer como proliferação celular descon- trolada e perda do sinal de apoptose. (FEARON; VOGELSTEIN, 1990). A família de proto-oncogenes Ras possuem três estruturas (H-Ras, N-Ras e K-Ras), onde o K-Ras possui maior destaque, pois fica no centro de muitas vias de transdução de sinal, controlando mecanismos de crescimento e diferenciação celu- lar com respostas altamente oncogênicas e muito freqüentes em câncer colorretal. Alterações e mutações que ocorrem no gene K-Ras desbalanceiam diferentes vias de crescimento e desenvolvimento celular (MORLA-FOLCH et al., 2017). Fica evi- dente que o gene K-RAS possui grande destaque e tem importância relevante na progressão do CCR. As mutações acumuladas ativam a sinalização de Ras alte- rando uma série de ações relacionadas ao crescimento celular, sinalização de apoptose, e diferenciação celular, levando a proliferação anormal das células sen- do assim presença de mutações K-Ras um prognóstico ruim. (CONLIN et al, 2005). O K-Ras apresenta alguns mecanismos que atuam na proliferação celular como a ativação do fosfatidilnositol-3-quinase que gera o segundo mensageiro, fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato (PIP3) de 4,5-bisfosfato de fosfatidilinositol que tem função de sobrevivência celular. Além disso a ativação de Ras ativa um série de citocinas pró-inflamatórias que podem favorecer o crescimento e sobrevivência das celulas de tumor,remodelando o seu micro-ambiente (GOEL et al, 2015). Al- gumas pesquisas ainda tentam mostrar que o K-Ras pode ser responsável pela inativação do gene supressor de tumor APC que é considerado o passo inicial para o desenvolvimento do cancer colorretal pela regulação de β-catenina. Uma sinergia nas mutações de K-Ras e Apc tem sido observadas nos casos de câncer colorre- tal, em que a adição de mutações K-Ras nos genes Apc melhoram a sinalização de β-catenina resultando em ativação de células cancerosa e sua expansão clonal. Mutações de K-Ras nos códons 12/13 do exon 2 e no códon 61 do exon 3 são mu- tações cuja presença depende da “ativação” aleatória do protooncogene K-Ras 20 durante ao tempo de vida de indivíduos saudáveis, que pode ocorrer por mutações esporádicas de replicação. (COTTI et al, 2000; CONLIN, 2005). Mutações em K-Ras também promove características facilitadoras do cân- cer: aumenta a inflamação promove a proliferação, suprime apoptose, desregula o balanço energético celular, ajuda a célula a escapar da destruição imune, aumenta a remodelação estromal, aumenta a instabilidade genômica,induz angiogênese e ativa invasão e metástase (MARGETIS et al., 2017). Em alguns estudos o K-Ras foi mostrado como necessário para a manutenção do tumor mesmo em situações que a ativação do K-Ras não é um evento de iniciação e também que a ativação de TGF-β por mutações de K-Ras é um passo importante para invasão e metásta- se do CCR (POULIN; HAIGIS, 2017). 4.3 Sintomatologia A sintomatologia pode variar de acordo com a idade, estes podem incluir sangramento do reto ou sangue nas fezes; uma mudança do hábito intestinal, dor no reto ou abdômen; perda de peso e anemia. Em jovens, geralmente, a sintoma- tologia já é avançada e as chances de cura são menores, comumente associado ao fato da procura para resolução para o problema ser tardia (CARNEIRO NETO, 2006). Ainda, a sintomatologia varia de acordo com a localização do tumor, a ane- mia pode ocorrer em casos de perda continua de sangue nas fezes e a dor abdo- minal esta relacionada a perfuração intestinal e peritonite. Deve-se atentar para outros sintomas, como: dor em hipocôndrio direito, sa- ciedade precoce, anorexia, perda de peso. Esses tipos de sintomas para pacientes já confirmados de CCR podem alertar para metástases distantes (FELISBERTO et al, 2021; MALLMANN et al., 2017). Ainda, para identificar a doença deve estar atento as queixas dos pacientes tentando a recordação de quando começaram os sintomas, incluindo alterações intestinais e comportamento, também pode ser feito pelo teste de sangue oculto nas fezes (TSOF) e colheita de amostra de muco retal tentando identificar a presença de mucinas anormais, podendo então ser utilizado como um marcador. A colonoscopia e caracterização de lesões suspeitas por his- topatologia são também formas de diagnóstico, depois do estabelecimento do di- 21 agnóstico é recomendado o estadiamento para saber em qual estágio se encontra a doença (PINTO, 2010). 4.4 Diagnóstico Para a detecção do CCR são realizados exames de rotinas com o intuito de revelar quaisquer elementos que indiquem ou possam progredir ao mesmo, como lesões pré-cancerígenas no cólon e reto, por isso exames e triagens são de grande importância para que se possa identificar o CCR em estágios precoces (SMITH, 2017; MONTMINY et al 2019). O diagnóstico é geralmente realizado por colonos- copia, análises histopatológicas e imuno-histoquímica. Os tecidos são analisados para a identificação da presença de marcadores utilizando anticorpos, com o avan- ço da técnica e com o aumento de anticorpos presentes e estudo do mesmo, os resultados estão cada vez mais precisos. Além de identificar os marcadores tam- bém é possível identificar as características morfológicas adquiridas do tecido com a presença da patologia. Como o diagnóstico pode ser invasivo, novos testes têm sido utilizados e desenvolvidos, como por exemplo os testes de DNA em fezes com múltiplos alvos que são utilizados em triagem, métodos com auxilio de computação gráfica e com- paração como colonografia por tomografia computadorizada. O desenvolvimento de testes séricos e urinários também tem sido alvo de pesquisas para rastreamen- to da doença em pacientes assintomáticos, buscando metabólitos produzidos por microbiomas na mucosa adenomatosa e no CCR (MACARI et al., 2002; PICKHARDT et al., 2003; WANG et al 2010a; WANG, et al 2010b; AHLQUIST et al., 2012; IMPERIALE et al, 2014; REX et al, 2017; LEMES et al, 2020). Alguns estudos foram realizados para análises histopatológicas de CCR, usando cortes de intestino de cães que continham sinais da doença. As caracterís- ticas da histopatologia em relação aos adenomas se baseavam em infiltração de neutrófilos e macrófagos, com presença de hemorragia, superprodução de mucina, angiogênese, proliferação de fibroblastos e formação de osteoide. A principal ca- racterística observada foi a infiltração e invasão para outras áreas do tecido, inclu- 22 indo a presença de células epiteliais irregulares. (WATANABE, 2016; SAITO et al, 2018). 4.5 Tratamento O tratamento do câncer colorretal é realizado de acordo com o estágio em que se encontra (estadiamento). Após o estadiamento, é avaliado as opções de acordo com os efeitos adversos e riscos para cada paciente. Os tratamentos mais utilizados e disponíveis até então são os tratamentos invasivos locais (cirurgia, ra- dioterapia, ablação e embolização) e sistêmicos pela administração de medica- mentos por via oral como capecitabina, trifluridina e tipiracil e também intraveno- sos como o 5-fluoracil e irinotecano. Pode -se optar por terapias-alvo ou imunote- rapial, e dependendo do estágio pode-se realizar a combinação de tratamentos combinartratamentos. (ONCOGUIA, 2020a; ONCOGUIA, 2020b). O câncer de cólon é estudado em camundongos a cerca de 80 anos, onde estudos de camundongos alimentados com agentes cancerígenos eram relatados, assim o alimento contendo esses agentes cancerígenos levava o animal a desen- volver a doença. Existem algumas vantagens em usar camundongos para o estu- do, como a rápida indução e fácil observação da seqüência adeno-carcinoma, já que a reprodução é muito parecida com a de humanos. O modelo mais usado é o com 1,2 dimetil-hidrazina (DMH) e seu mecanismo consiste na produção de subs- tâncias reativas (azoximetano e metilazoximetanol) ao DNA. Para a formação des- ses reativos precisam antes ser ativados por diversas enzimas, que ocorre no fíga- do, e então seus produtos são transportados até o cólon onde ocorre ação muta- gênica nas células e formação de criptas aberrantes (ROSENBERG et al, 2009a; ROSEMBERG, et al., 2009b). 5 MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO DE ANTÍGENOS E BIOMARCADORES A identificação de antígenos e biomarcadores da doença e sua análise ocor- rem por imuno-histoquímica, técnica que permite a visualização desses biomarca- 23 dores no tecido examinado através da conjugação do antígeno e anticorpo em te- cidos e amostras (RIZZARDI et al., 2012). A associação do complexo depende da afinidade entre o antígeno e o anticorpo, sendo que quanto mais específico for o anticorpo a determinado antígeno, maior será a afinidade e a ligação ocorrerá mais facilmente assim como a visualização na lâmina. A técnica se baseia em dois mé- todos sendo um direto e outro indireto. O método direto utiliza apenas um anticorpo que se liga diretamente no an- tígeno em um único passo sendo mais rápido que o indireto, porém é menos sen- sível e o sinal é menor já que não ocorre amplificação. O método indireto ocorre pela ligação de um anticorpo primário no antígeno e em sequência a ligação de um anticorpo secundário no primário e ainda pode ocorrer maiores amplificações pelas ligações de mais anticorpos no secundário e assim por diante, então esse método é mais sensível devido a amplificação dos anticorpos. Ainda existem tecnologias para melhorar essa visualização como a utilização da Avidina-Biotina que iram se ligar no anticorpo secundário amplificando a visualização (RIZZARDI et al., 2012). A Figura 6 mostra. a representação de um sistema Avidina-Biotina. A 24 Figura 6. (A) Imagem dos tipos de anticorpos e sua marcação em um antígeno ; (B) Sistema Avidina – Biotina Fonte: (MARASSÁ, 2004). A técnica de imunofluorescência é usada para a detecção de antígenos es- pecíficos onde os anticorpos estão ligados a um corante fluorescente que emitem luz ao absorver raios ultravioleta, é utilizado nessa técnica um microscópio de fluo- rescência, necessita ser realizada de maneira rápida pois o cromóforo do anticorpo tende a ficar mais fraco a visualização. Figura 7. Imagem de uma microscopia de fluorescência com indicação da ligação antígeno-anticorpo refletido na cor verde Fonte: (McMANNUS; 1998-2019). B 25 6 IMUNO-HISTOQUÍMICA A análise imuno-histoquímica é uma técnica empregada para propósitos de pesquisa e diagnóstico onde ocorre a identificação e localização de antígenos e marcadores de interesse através da ligação formada no complexo antígeno- anticorpo no tecido, essa reação irá produzir uma coloração, facilitando a visualiza- ção em lâminas. Além da imuno-histoquímica clássica também existem outros mé- todos de visualização como a imunofluorescência, no qual são utilizados fluorófo- ros como marcadores que irão refletir a luz absorvida sinalizando a reação que po- de ser visualizada. (FURUKAWA et al, 2017). A imuno-histoquímica é um método amplamente utilizado para análises teci- duais e identificação de biomarcadores devido à sua versatilidade e facilidade para utilização, se mostrando assim um método muito importante para diagnósticos. Porém o método necessita de tempo além de possuir uma análise subjetiva o que pode se tornar passível de viés. Se torna necessário então métodos mais rápidos e também que sua pontuação seja menos subjetiva e mais quantitativa de modo que ocorram menos erros de leitura. A atual técnica para avaliar e método de pontuação para avaliação de amos- tra consiste na análise da porção corada da amostra em relação a sua intensidade e porcentagem e recebe então um valor de 0 a 3. Tornando a análise subjetiva e além disso alguns fatos como fundo alto, deposição variável de manchas e artefa- tos podem interferir e distorcer resultados, o que também torna o método manual inviável em larga escala. Novos métodos passam a ser apresentados para diag- nóstico, onde a nova geração de testes tenta tornar os resultados mais eficientes, rápidos e automatizados. 6.1 Average Treshold Measure (ATM) O método de medida do limite médio, Average treshold measure (ATM)) é um método que utiliza imagens digitais da amostra para realizar as análises, que produz uma pontuação que representa o nível de expressão do antígeno na ima- 26 gem e ainda não precisa da especificação do limite de intensidade, além disso po- de ser aplicado em uma ampla variedade de imagens com o mínimo de interven- ção ou manipulação do operador. Por causa disso, os resultados são reprodutíveis, ou seja, fornecem o mesmo resultado para uma determinada imagem. O método se resume basicamente na escolha de um limiar de intensidade de coloração para a imagens. Acima desse limiar é declarado manchado relacionando a presença de antígeno, podendo então, distinguir a área afetada, acabando com a subjetividade do analista, quando analisado manualmente, para o cálculo da pontuação (CHOUDHURY et al, 2010). 6.2 IHC Profiler Com o avanço do processamento digital de imagens passaram a ser utiliza- dos programas de softwares para auxiliar a leitura da IHC com o intuito de melho- rar a eficácia e seu score. Um plug conhecido como IHC Profiler que é compatível com um software de imagem gráfica (ImageJ) mostrou como pode ser feito esse novo tipo de leitura assistida por um programa que usa deconvolução de cores e um perfil de pixels computadorizado para a pontuação automática da imagem, e também sem nenhuma parcialidade já que é feita por um software. O método funciona na primeira etapa através da deconvolução dos espec- tros de cores DAB / hematoxilina realizada por vetores de densidade óptica que leva a separação dos espectros, a imagem então manchada com o DAB ( diamino benzidina corante marrom) é levada para outra tela onde ocorre a análise pixel a pixel onde pode ser realizada uma pontuação da imagem e decidir o resultado da análise. A precisão da técnica pode chegar em cerca de 88% de eficiência quando comparado a de uma análise patológica manual e o programa pode ser baixado do site da Sourceforge (https://sourceforge.net/(https://sourceforge.net/ pro- jects/ihcprofiler/). (VARGHESE et al., 2014; JAFARI et al., 2017). 6.3 Hibridização fluorescente In Situ (FISH) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7193989/#B52 27 Hibridização fluorescente in situ (FISH) é um método histoquímico que per- mite a visualização, identificação, enumeração e localização simultânea de nucleo- tídeos alvos e também mutações genéticas. O princípio básico é o anelamento da sonda que é um marcador complementar com a sequência alvo, para a visualiza- ção em microscópio epifluorescente, no qual a sonda é uma sequência de oligonu- cleotídeos complementares marcados com um fluoróforo que se anelaram a um alvo possibilitando a identificação e visualização de marcadores. A variedade de técnicas FISH pode ser usada em conjunto com métodos al- ternativos de análise molecular, como a próxima geração sequenciação e citome- tria de fluxo. Essas técnicas se complementam, permitindo uma compreensão mais profunda das sequências de ácidos nucleicos. Esse tipo de método pode revelar a localização específica de ácidos nucleicos em cromossomos ou tecidos diferente de IHC que localiza proteínas específicas em cortes teciduais, isso torna o método importante para estudos de processos fisiológicos e também patogênese de doen- ças além de poder ser usado para identificar funções de genes específicos e reali- zar mapeamento genético. (NEVES; GUEDES, 2012; PAN et al, 2020). A técnica consiste no desenvolvimento de uma sonda como mencionado acima que é uma cadeia de nucleotídeos complementar a desejada na investiga- ção, que marcada e anexada a um corante ou um sistema de fluoróforo. A sonda realiza uma hibridização em temperatura elevada com sua fita complementar na célula de amostra desnaturada, depois que ocorre a hibridização, pode-se através de um microscópio específico fazer a análise que possibilitará a visualização do corante em forma de luz caso a fita complementar exista no tecido e seja hibridiza- da (O'CONNOR, 2008). 6.4 Hibridação genômica comparativa (CGH) A hibridação genômica comparativa (CGH) é uma técnica que permite a de- tecção de alterações no número de cópias cromossômicas fornecendo uma visão geral das alterações cromossômicos em todo o genoma celular, detectando condi- ções genéticas que podem ser causadas por essas mutações. O método se baseia 28 na comparação entre o sinal de uma amostra e de um controle, ondes o DNA são marcados com fluorófos, as amostras são hibridizadas, scaneadas através de mi- cro sondas e uma varredura de todo o genoma é realizada ocorrendo a detecção de perda ou ganho de material genético, deleções, mutações etc. (KOLINSKY et al. 2020; WEISS,1999). 6.5 Amplificação do Sinal de Tyramide (TSA) A amplificação do sinal de tyramide (TSA) é uma nova técnica projetada pa- ra aprimorar a detecção de alvos de baixa abundância (por exemplo, proteínas e sequências de ácidos nucleicos). Ele pode ser facilmente integrado a qualquer aplicativo que utilize peroxidase de rábano silvestre (HRP) em seu protocolo. Es- sas aplicações incluem ELISA, imunocitoquímica (ICC), imuno-histoquímica (IHC) e hibridização in situ (FISH). É um método de detecção mediado por enzimas que utiliza a atividade catalítica de HRP para a deposição covalente de tiramida marca- da em proteínas alvo próximas ou sequências de ácidos nucleicos in situ. Na pre- sença de peróxido de hidrogênio (H2O2), o HRP converte substratos da tiramida marcados em radicais de tiramida de alta reatividade e curta duração que se ligam rapidamente a resíduos de tirosina no local da enzima e proximal. Essas marcações podem ser detectadas por técnicas cromogênicas ou fluo- rescentes padrões. A técnica é basicamente idêntica a IHC convencional, porém existe a etapa onde ocorre a ligação com a enzima HPR (horseradish peroxidase) e depois com o substrato de tiramina,. O método apresenta vantagens como a detecção de alvos de baixa abundância que geralmente são mais difíceis de ser detectados, maior precisão e sensibilidade, fácil integração com aplicativos ICC,IHC, FISH e conservação de anticorpos.(FAGET; HNASKO, 2015). 6.6 Automação de Molécula Única RNAscope Multiplexada e Hibridização flu- orescente In Situ e Imuno-histoquímica para Mapeamento espaciais de teci- dos 29 O método tem foco na aplicação do sistema de RNAscope LS Multiplex As- say (Diagnóstico Celular Avançado) que combina a amplificação do DNA ramifica- do com amplificação do sinal de tiramida e assim possa ocorrer análises em FISH. Inicialmente o RNA alvo é hibridizado em sequências de nucleotídeos complemen- tar ao RNA alvo. Essas amostras são rotuladas de acordo com sua ramificação que serão mais tarde amplificadas onde os amplificadores são marcados com tira- minas conjugadas com o fluoróforos, essa tiramina é enzimaticamente convertida em intermediários oxidados que irão se ligar a a proteínas alvos depositando um grandes números de fluoróforos possibilitando a detecção da sonda. Essa técnica pode ser combinada com a IHC para aumentar a precisão da análise. (ROBERTS, 2020). 7 TAURINA E CANCÊR DE CÓLON A taurina é um aminoácido não essencial abundantemente encontrado no corpo humano, possui diversas funções benéficas e tem sido alvo de pesquisa de- vido as recentes descobertas e aprovações em tratamentos diversos, como para o tratamento da insuficiência cardíaca congestiva, tratamento de doenças relaciona- das ao sistema nervoso central, musculares e o sistema cardiovascular. Além disso tem sido realizadas pesquisas com seu uso em doenças mitocondriais, metabóli- cas e inflamatórias, também possui funções muito importantes na expressão gêni- ca, regulação de oxidação e stress oxidativo, e metabolismo energético. (SCHAF- FER; KIM, 2018). A taurina desempenha papel importante na homeostase pois está envolvida em processos de regulação do volume celular, osmorregulação, fosforilação de proteína, estabilidade de membrana, bílis conjugação ácida, neuromodulação, ma- nutenção de cálcio de concentração e desintoxicação de xenobióticos, todos de importância vital que afetam o funcionamento de células (SCHAFFER et al 2003; MARCINKIEWICZ; KONTNY, 2014). Tem sido descrito que a taurina é um agente anti-inflamatório devido a di- versas ações, uma delas é a neutralização da oxidação de neutrófilos do qual tem como produto o ácido hipocloroso com caráter tóxico, além de diminuir a geração 30 de superóxido das mitocôndrias. Outros efeitos também foram descritos na ação antioxidante na redução contra algumas espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, como radicais peroxil (ROO.), óxido nítrico (NO), ânion superóxido (O2-) e peroxini- trito (ONOO.). (MARCINKIEWICZ; KONTNY, 2014). Outra relação ocorre entre a taurina e a glutationa (GSH) que é um impor- tante antioxidante e vital para todas as células na proteção contra a ação das espécies reativas de oxigénio, ambas possuem o mesmo precursor (cisteína). Estudos em ratos sugeriram o aumento dos níveis de GSH nos tecidos do fígado e estômago quando receberam doses de taurina por via intragástrica (SEIDEL et al, 2019; ANAND et al, 2011). Além disso, a taurina possui papel na homeostase de oxidação de lipídios, em camundongos diabéticos, a taurina promoveu reduções consideráveis nos ní- veis de malondialdeído que é um ácido graxo estável resultante da peroxidação de lipídeos que em altas quantidades podem ser prejudicial e participar de cadeias que induzem oxidações. (SEIDEL et al , 2018; ANAND et al. 2011). Em outro estudo utilizando modelo de leitões e induzidos por diquat, um in- dutor de estresse oxidativo, foram retiradas amostras de intestino e analisadas em PCR, western blot, e a morfologia do órgão em comparação com grupos de contro- le e que receberam suplementação de taurina. Os resultados mostraram que o grupo que recebeu suplementação de taurina conseguiu restaurar o nível de imu- noglobulinas sérica e reverter os danos da morfologia dos tecidos, além de diminuir o estresse oxidativo. Este estudo concluiu que a taurina pode exercer efeitos pro- tetores e regular a resposta imune além de restaurar barreira da junção intestinal depois de um estresse oxidativo. (WEN et al, 2020). O tratamento com taurina também reduz significativamente formações de le- sões gástricas induzidas por indometacina e também inibe a elevação do nível de peróxido de lipídio na mucosa gástrica, e reduz a atividade de neutrófilos evitando a sua adesão à monocamada confluente de células endoteliais da veia umbilical humana (SON, et al 1996; SON, et al 1998). Outros compostos químicos utilizados para induzir carcinogênese já tiveram seus efeitos atenuados pela ação da taurina, atuando em diversos mecanismos https://pt.wikipedia.org/wiki/Espécies_reactivas_de_oxigénio 31 relacionados a carcinogênese, além de outros efeitos provenientes desses com- postos tóxicos como por exemplo, diarreia, perda de peso, sangramento nas fezes, resposta inflamatória e danos nas criptas do intestino. (SHIMIZU et al, 2009). Estudos com pré-tratamento com taurina mostrou diminuir a peroxidação, os níveis de mRNA para marcadores inflamatórios como TNF-, IL-1, MIP-2 que podem ser determinados e quantificados em PCR. A expressão desses marcado- res tende a aumentar quando o tecido é exposto de alguma forma a um agente indutor como o DSS (Dextran sulfato de sódio), e a suplementação com taurina mostra a redução do mRNA de alguns marcadores como MIP-2 que tem papel fun- damental na infiltração de neutrófilos na mucosa intestinal, o que poderia explicar a supressão de atividades de neutrófilos pela taurina. (SHIMIZU et al, 2009). A Figu- ra 8 mostra a comparação entre quatro grupos que receberam diferentes tratamen- tos como água com ou sem 2% de taurina com ou sem 3% de DSS (um indutor de colite) em sua dieta. É possível observar nos gráficos que em comparação com o grupo que re- cebeu água padrão, o grupo que recebeu taurina teve ganho de peso, e diminuição da diarreia no grupo em que recebeu a combinação de DSS e Taurina, além de diminuir significativamente o sangramento e o encurtamento do cólon. Acredita-se que uma das causas desses efeitos da taurina devido ao efeito inibitório na secre- ção de MIP-2 (Proteína inflamatória de macrófago 2) que tem efeito pró- inflamatório além de atração a outras células participantes do processo de inflama- ção nas células do tecido epitelial intestinal. Além disso a produção de taurina cloramina, um potente agente anti- inflamatório que é produzido da reação entre a taurina e ácido hipocloroso, inibe a atividade NF-kB (fator nuclear kappa B, que é um fator de transcrição de diversos genes, inclusive genes ligados a inflamação) e outros mediadores como TNF-Alfa (Fator de necrose tumoral alfa, que apresenta diversas funções como proliferação e a diferenciação celulares, tumorigénese, morte celular apoptótica ou necrótica, (incluindo certas linhas de células tumorais), atividades imunorreguladoras, meta- bolismo lipídico, coagulação e função endotelial), PGE2 (Prostaglandina E2 que também atua em fatores de transcrição), e COX2 (Ciclo-oxigenase-2, ligada a in- 32 flamação e produção de prostaglandinas) pode ser uma das explicações para os efeitos observados. (SHIMIZU et al, 2009). Figura 8. Efeito da taurina na atividade de colite induzida por DSS Fonte: (Adaptado de SHIMIZU et al, 2009) A taurina regula negativamente mediadores pró-inflamatórios como TNF- alfa, PGE2 e COX2 em leucócitos e NF-kB ao reagir com o ácido hipocloroso, ten- do esse como seu principal mecanismo anti-inflamatório. (ELSON et al. 1995; SON et al. 1998). Mesmo que alguns estudos tenham mostrado os efeitos benéficos da tauri- na, são necessárias mais averiguações visto que em alguns estudos a sua admi- nistração em doses excessivas puderam causar efeitos no índice de diarreia, na altura das vilosidades e profundidade das criptas. (LIU et al., 2014). Alguns efeitos sinérgicos da taurina também foram avaliados como, por exemplo, em associação com a ciclofosfamida onde camundongos com doenças inflamatórias do receberam uma combinação de ambos via intravenosa ou intra- STD :água da torneira (Padrão) Tau: Grupo que só recebeu taurina DSS: Dextran sulfato de sódio DSS + Tau: Grupo que recebeu Taurina juntamente com o Dextran sulfato de sódio A: Score de Diarreia B: Score de sangramento C: Comprimento do Cólon (mm) 33 gástrica e então calculou-se fatores como a taxa de inibição tumoral, a contagem de células nucleadas da medula óssea e de leucócitos, o índice do baço, o índice do timo, a proliferação de linfócitos e a atividade fagocítica do macrófago peritone- al. Os resultados mostraram que a taxa de inibição foram maiores em grupos que receberam taurina em combinação, e também as contagem de células nucleadas da medula , leucócitos, proliferação de linfócitos e todos os outros fatores analisa- dos tiveram melhor resultado nos grupos que receberam a combinação. Já em as- sociação com a DOX (Doxorrubicina) mostraram bons resultados em grupos de associação diminuindo o peso tumoral em 40% e aumentou o efeito antitumoral em comparação com os grupos que só receberam a DOX. (ZHAO et al, 2009; WANG et al., 2009; SADZUKA et al, 2009). Foi avaliado o efeito da 5-aminosaliciltaurina atuando como um pró-fármaco em um tratamento experimental de colite induzida em roedores. Os resultados mostraram que a conjugação do 5-ASA com a taurina diminuiu a absorção sistêmi- ca do fármaco e melhorou seu alvo chegando efetivamente até o intestino grosso, além dos efeitos do 5-ASA ter ser mostrado potencializado, evidenciando que a utilização da taurina como um pró-fármaco pode ser viável já que teve pontos co- mo potencialização de efeito, diminuição da absorção sistêmica, provável redução de efeitos colaterais (JUNG et al, 2006). Durante o processo inflamatório, a taurina sofre halogenação em fagócitos e é convertida em taurina cloroamina e taurina bromamine. A TauCl liberada por neu- trófilos ativados aumenta a expressão de proteínas antioxidantes, o qual possui a capacidade de transferir seu grupo Cl- para aminas de microrganismos desempe- nhando efeito microbicida, inibindo a produção de agentes pró-inflamatórios e me- diadores NO, TNF-a, PGs e restaura o balanço oxidativo nas células no local de inflamação, aumentando a expressão de enzimas antioxidantes como HO-1,Prx, Trx, GPx e catalase conferindo proteção conta metabólitos e espécies reativas de oxigênio. Todos esses efeitos melhoram e protegem contra a inflamação e impede o desenvolvimento de sintomas patogênicos e doenças inflamatórias. (KIM; CHA, 2013). Também foi relatado a ação de inibição da ativação NFκB dependente de IL- 1β em células Caco-2 e HCT116 de carcinoma do cólon humano pela taurina. IL- 34 1β são citocinas pró inflamatórias que podem exercer papel na progressão de do- enças inflamatórias ativando o fator-kappa nuclear B (NFκB) desencadeando uma cascata de sinalização intracelular, que é relacionado a desenvolvimento de doen- ças inflamatórias e autoimunes. No estudo foi utilizado a 5-ASA e taurina-cloramina (TauCL) como agentes terapêuticos que inibiram a ativação de NFκB dependente de IL-1 nas linhagens celulares, mostrando que a taurina pode atuar em mais de uma via de inflamação. (JOO et al.; LEE, 2009). A taurina foi testada também juntamente com um sistema baseado em na- nocarreadores magnéticos de óxido de ferros que servem como âncoras estáveis direcionando o ancoramento e melhorando a entrega do fármaco que no caso era a doxurrubicina. Os resultados mostraram que a taurina em ligação com o nanocar- reador teve eficácia de 70,1% no aprisionamento do fármaco mostrando que o mo- delo de nanoveículo pode ser utilizado como carreador. A taurina já foi utilizada também como enxerto em superfície de nanopartículas que serviram como agente de revestimento para moléculas de óxido de ferro, para formar um veículo utilizado para transportar doxorrubicina e avaliar sua cinética de liberação e sua ação em células cancerígenas. O veículo mostrou possuir uma ligação e funcionalização adequada e o aprisionamento do fármaco também obteve sucesso, além de tornar mais eficiente a entrega do fármaco no microambiente tumoral melhorando o efeito ao alvo. O estudo mostrou também que a taurina tem efeito positivo na sua agre- gação e utilização para formação de micro veículos eficientes. (SINGH et al, 2020). A taurina também foi capaz suprimir efeitos de agentes carcinogênicos como azoximetano (OMA) e dextrano sulfato de sódio (DSS) que promove inflamação grave e alto índice de malignidade epitelial do cólon (WANG et al. 2020). Os resul- tados demonstraram que os animais que receberam taurina tiveram um melhor resultado na supressão e desenvolvimento de carcinogênese. Nos ensaios de stai- ning em coloração HE foram observados muitos pólipos inflamatórios em ambos grupos modelo e taurina, mas as lesões de câncer no grupo taurina eram menores do que os do grupo modelo mostrando que a taurina teve certo efeito na inibição da progressão do câncer além de induzir a apoptose das células com progressão irregular e aumentam o nível de PTEN (Homólogo de fosfatase e tensina) que é 35 um gene que regula a divisão celular e apoptose, também tem um mecanismo em que interage com o gene p53 em sua estabilidade levando a célula irregular a uma apoptose. Logo, a taurina desempenha indiretamente um efeito no gene da chave da carcinogênese, o p53. O estudo sugeriu depois de todos esses resultados que a taurina contribui para a supressão da carcinogênese relacionada a inflamação. (WANG et al. 2020). Nas figuras 9 (a e b) podemos observar os efeitos apresentados pela taurina em modelos utilizando camundongos, na Figura 9 os resultados mostraram que grupos que receberam taurina tiveram melhores resultados. .O grupo que recebeu taurina apresentou uma menor perda de peso em relação aos grupos controle. Em relação à presença de sangue nas fezes e o peso do cólon, não ocorreram diferen- ças significativas entre os grupos, porém o número de tumores no grupo que rece- beu taurina se mostrou reduzido e o peso do cólon do grupo taurina se mostrou ligeiramente menor. Os resultados mostraram efeitos positivos da taurina. (WANG et al. 2020). 9a) Modelo Taurina Controle Tempo (semanas) P e s o C o rp o ra l 36 Figura 9a. Gráficos de comparação do peso corporal e da presença de sangue nas fezes e entre os modelos, taurina e controle Fonte: (WANG et al. 2020). Figura 9b. Gráficos de comparação entre os grupos modelo e taurina em relação ao peso do cólon e número de tumores Fonte: (WANG et al. 2020). A Figura 10 mostra a análise histológica do tecido do cólon, onde é possível observar que nos grupos de controle induzidos por AOM e DSS ocorreram inflama- ção e também infiltração. Ainda nos grupos que receberam taurina é possível ob- servar infiltrações que são características marcantes da fase de progressão e in- flamações estão muito menos atenuadas, isso mostra que ambos os grupos apre- sentaram lesões, porém o grupo taurina apresentou lesões menores além de inibir a progressão em comparação com os grupos controle.(WANG et al. 2020). Modelo Taurina Tempo (semanas) S c o re d e s a n g ra m e n to n a s f e z e s P e s o C ó lo n ( g ) N ú m e ro d e t u m o re s Modelo Taurina Controle Modelo Taurina Controle 9b) 37 Figura 10. Exame microscópico de tecidos do cólon usando coloração H&E. Ima- gens representativas do tecido normal do grupo de controle e pólipos inflamatórios e câncer de cólon de grupos modelo induzidos por AOM E DSS e taurina. O gráfico representa o número médio de câncer de cólon por camundongo entre o grupo mo- delo de controle e o grupo taurina. Fonte: (WANG et al. 2020). O gene p53 tem ação supressora de tumores e seu desequilíbrio pode de- sencadear a passagem de mutações célula a célula, sendo assim um gene muito importante no evento da carcinogênese. Um estudo mostrou a ação da taurina nesse gene chave que é o p53 em dois tipos de células, HT-29 (tipo mutante de p53) e (LoVo tipo selvagem), onde células humanas de câncer colorretal foram tra- tadas com diferentes concentrações de Tau e a apoptose foi analisada pela detec- ção de externalização de fosfatidilserina com citometria de fluxo, o que levou à re- pressão da proliferação celular e indução de apoptose em ambas as linhas celula- res. Além disso, os resultados demonstraram que a Taurina não reduziu atividade em células 293T renais que pode representar a não toxicidade da taurina em célu- las humanas normais. A taurina não só induziu a apoptose como também aumen- tou a expressão do PUMA (modulador de apoptose regulado pela p53), que pode ser interpretado que nem todas as suas ações estão correlacionadas com o gene p53, e também que a expressão se controlada desse gene pode ser benéfica para melhorar a ação anti-tumoral. Pelos resultados mostrarem que a ação da taurina 38 aumentou a expressão de PUMA nas duas linhagens (Lovo e HT-29) o efeito da taurina pode não estar relacionado exclusivamente ao gene p53 podendo existir outros mecanismos. O estudo sugeriu que os efeitos apresentados pela taurina de redução da proliferação celular, aumento da apoptose em células mutantes de có- lon humano e também inibir o crescimento de tumores podem ocorrer por duas vias que são regulando positivamente a expressão de PUMA e Bax (regulador apoptótico) e regulando negativamente a expressão de Bcl-2 levando a um aumen- to da atividade de caspase-3/9(proteases importantes no processo da apoptose) evidenciando uma nova base molecular para o efeito anti tumoral da Taurina. po- dendo ser utilizada para controlar o efeito p53 e ser utilizada como terapia coadju- vante na inibição do progresso cancerígeno e aumento de apoptose nessas célu- las. (ZHANG, et al 2014; YU; ZHANG; 2005). A via de sinalização Hippo controla o tamanho e crescimento de órgãos em animais através do controle da proliferação celular e apoptose, e muitos genes en- volvidos em suas cascatas são considerados supressores tumorais e a quinase estéril-20 (MST1/2) é um dos agentes principais da via Hippo e tem sido observada em canceres como o CCR, sendo um agente supressor e sua perda de função po- de levar ao CCR (SONG, et al. 2010). Os resultados de um estudo sobre os efeitos da taurina envolvendo esta via em células de CCR humanas (Caco-2 e SW620) mostraram que apoptose foi significativamente induzida em grupos de células que receberam o tratamento com taurina em relação ao controle, dose dependente (de acordo com o aumento da concentração). Os resultados mostraram, também, que as culturas de células que receberam taurina também diminuíram a proliferação dessas células. A cascata de sinalização JNK (atua na regulação do processo de apoptose) de algum modo foi ativada atuando diretamente no gene MST1(aumenta atividade de macrófagos e contribui para a inflamação) que teve ação indutiva no apoptose. Isso leva a conclusão de que essa via pode também estar relacionada ao desenvolvimento do CCR e que a taurina junto com a via de sinalização MST1- JNK, MST1-Hippo, mediada por PUMA durante o trilho da reação possui capacida- de de diminuir a proliferação das células de CCR, levando, também à apoptose. (LIU et al, 2018). 39 A taurina tem papel na excreção da bile, através de sua conjugação com ácidos biliares, aumentando a sua solubilidade em água e promovendo a absorção de lipídios e vitaminas lipossolúveis. Assim, a deficiência de taurina pode afetar diretamente na digestão e absorção dos saís biliares dificultando a obtenção de elementos essenciais, como foi mostrado em um estudo onde grupos de animais que foram tratados com uma dieta pobre em taurina apresentaram resultados anormais em seu tecido hepático que apresentaram sinais de infiltração e presença de células inflamatórias, além disso também ocorreram efeitos de anormalidades nos olhos e corações desses animais, como degeneração da retina e cardiomiopa- tia. Também, mostrou baixa expressão de CYP27A1 que sugere anormalidade mi- tocondrial e efeito em o que poderia também acontecer em seres humano por bai- xos níveis insuficientes de taurina, levando a distúrbios em todo o corpo. O estudo apoiou a ideia de que a má absorção de nutrientes lipossolúveis e lipídios pode ocorrer por defeitos genéticos congênitos ou ainda pela ausência de conjugação de ácidos biliares com aminoácidos que no caso seria a taurina. (MIYAZAKI et al, 2020). Alguns estudos correlacionaram o aumento da secreção de ácidos biliares com a alteração na microbiota do intestino que seria capaz de modificar o pH da bile gerando ácidos biliares secundários que poderiam ter relação com a promoção de tumores, assim como a conjugação da bile com a taurina que forma o ácido taurocólico que teria potencial de estimular bactérias capazes de converter a tauri- na e o ácido cólico em sulfeto de hidrogênio e ácido desoxicólico que são promoto- res de tumor e genotóxicos.(JASON, et al 2016). Porém ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc) que é encontrado na carne vermelha é um ácido que não pode ser sintetizado pelo organismo humano e pode interagir com microorganismos resultando em reações complexas, durante o tempo que leva o processo de digestão. O consumo habitual de alimentos ricos nesse ácido pode levar a incorporação do mesmo na superfície de células e também em carcinomas ao estar em sua forma livre. Portanto, é possível resumir que o desen- volvimento e estimulação anormal da microbiota pode ser relacionado com a dieta habitual e os componentes que permanecem no estômago assim como a quanti- dade que levam para serem digeridos e que durante esse tempo acabam intera- 40 gindo com a microbiota, e intensificando de acordo com o tempo que a sua diges- tão demanda (ZARAMELA et al. 2019). Sendo assim, são necessários mais estudos para associar a taurina ao efei- to negativo de estimulação e homeostase intestinal e da microbiota, já que é ne- cessário saber a quantidade precisa da taurina para causar essas alterações. A taurina mesmo que encontrada em origem animal também pode ser proveniente de origem vegetal, e ao ser incorporada para qualquer tipo de fim como, adjuvante de um fármaco, transportador ou até mesmo seu consumo e depois de isolada para fins antioxidantes é preciso ter sua concentração conhecida no uso. Já foi mostrado que a taurina possui diversos efeitos que regulam a microbi- ota do intestino e também atua como antioxidante como demostrado em diversos estudos. O câncer de cólon, porém está relacionado com a dieta e o consumo de alimentos ricos em gordura e carne que possui grupo heme, também tem sido mostrado que a dieta baseada em plantas está associada a um menor risco de de- senvolvimento de cânceres relacionados ao estômago e intestino. (ABU et al., 2020; KOSTKA et al. 2020). Existem muitos estudos que correlacionam o efeito da taurina na microbiota do intestino e também tendem a associar sua ação tanto com resultados benéficos pela taurina, por isso novas tecnologias como métodos de rastreamento genéticos e reprodução do ambiente intestinal e análise de bioinformática com sequencia- mento genético tem sido utilizada para clarear de vez essa questão. Para mostrar se a taurina afeta a microbiota do organismo humano, foi reali- zado um estudo que mostrou que ela não exerce efeito em sua composição, diver- sidade e metabolismo. Nesse estudo foram utilizadas amostras fecais de dois gru- pos distintos para cultivo e reprodução da microbiota daquela amostra que no caso eram um grupo presente e ausente de taurina pelo sistema fermentação em lote único (Modelo de Microbiota Intestinal Humana da Universidade de Kobe; KU- HIMM). O estudo mostrou que a taurina não teve efeito na composição da microbi- ota nos níveis de filo e gênero já que o perfil do gene 16S rRNA de espécies bacte- rianas na amostra fecal original foi mantido em cada uma das culturas com e sem taurina. O estudo também revelou que a taurina não afetou a composição dos áci- 41 dos graxos de cadeia curta produzidos nas culturas, os resultados acabaram por mostrar que os efeitos benéficos e anti-inflamatórios ocorrem independente da mi- crobiota do intestino. (SASAKI, et al. 2017). Em mais um estudo, foram utilizados roedores que foram divididos em gru- pos que receberam doses de taurina sintética e natural para comparação com um grupo controle que recebeu doses de salina, e mais tarde suas fezes foram anali- sadas através de tecnologia metagênomica, as cadeias de ácido graxos foram de- tectadas por cromatografia gasosa e as concentrações de lipopolissacarídeos e superóxido desmutase foram detectados por ELISA, e por ensaio de atividade de superóxido desmutase e LPS (YU, et al,. 2016). Os resultados do estudo mostra- ram que além de regular a microecologia intestinal a taurina inda inibiu o cresci- mento de bactérias que são nocivas e também acelerou a produção de ácido graxo de cadeia curta que é resultado da fermentação no instestino pela microbiota e tem diversas funções como fornecimento de energia, absorção de sódio e inibi o cres- cimento de organismos patogênicos. O LPS pode ser chamado de endotoxina já que é um dos principais compo- nentes da bactérias gram (-) e também sua combinação com algumas moléculas possuem um efeito tóxico. No estudo, a taurina mostrou poder reduzir conteúdo de LPS e aliviar danos no fígado. Já na superóxido dismutase que é uma enzima anti- oxidante não apresentou resultados significativos nesse estudo. A taurina segundo esses resultados pode ser considerado um nutriente para o nosso organismo, além de possuir diversos efeitos benéficos. (YU, et al. 2016). 8 CONCLUSÃO Com os avanços tecnológicos os métodos de diagnósticos também têm evo- luído, a imuno-histoquímica, uma técnica que acaba ficando estritamente realizada sobre o ponto de vista do pesquisador, hoje pode ter um suporte técnico que facili- ta a vida de quem depende de um resultado mais rápido de um diagnóstico ou até mesmo de resultados mais precisos. 42 Resumidamente os novos métodos de IHC adicionam novos recursos duran- te o processo da técnica que podem melhorar o resultado final como por exemplo diminuindo a subjetividade do pesquisador durante uma análise, aumentando a precisão do resultado em relação ao de um processo manual. Passou-se a utilizar programas de software unidos a computação gráfica para uma melhor visualização dos resultados e pontuação da imagem, além disso pode-se adicionar sondas complementares de oligo nucleotídeos que são marcados possibilitando a identifi- cação de marcadores, além de que existem métodos capazes de medir perdas ou ganhos cromossômicos que permitem identificar mutações. A IHC tem ganhos com o avanço da tecnologia e permite melhores resultados aos pesquisadores O presente trabalho possibilitou também entender o peso e gamas de vari- edades das atividades que a taurina desempenha, quando se trata de seu efeito em neoplasias a taurina mostrou possuir influência em diversas atividades relacio- nadas a carcinogênese como neutralização de oxidação em neutrófilos e lipídios, inibição na geração de superóxidos em mitocôndrias e diminuição de marcadores inflamatórios (TNF-, IL-1, MIP-2), reversão e melhora quando administrada junto a agentes pró-carcinogêncios, efeitos benéficos na microbiota intestinal, expressão gênica, regulação de oxidação e stress oxidativo, metabolismo energético proven- do ação na homeostase celular etc, e o fato de possuir grande atividade anti- inflamatória a torna alvo de pesquisas para tratamentos de neoplasias como o CCR. Os estudos evidenciaram que a Taurina também atua de alguma forma em diversas vias e genes chaves para o curso do CCR , citando alguns genes chave como P53, APC, K-Ras e vias de sinalização como as sinalizações do gene APC e p53, Wnt/Beta-Catenina, Hippo-MST1 e JNK-MST1. A maioria dos estudos pes- quisados durante a formação deste trabalho foram realizados em animais e tam- bém in vitro utilizando culturas de células humanas, a taurina mostrou possuir grande potencial terapêutico de acordo com os resultados das pesquisas sugerindo que poderia ser melhor aproveitada de diversas maneiras, principalmente como pró-fármaco ou em associações. 43 A taurina também mostrou potencial em formulações ou até mesmo como tratamento para amenizar os efeitos tóxicos que outros medicamentos agressivos podem causar. Ainda são necessários mais dados e estudos para averiguar como seria seu uso diretamente no organismo humano, talvez com este levantamento o potencial da taurina possa ficar mais evidente e novas oportunidades para seus diversos usos sejam considerados. 44 9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABU‐GHAZALEH, N.; CHUA, W. J.; GOPALAN, V. Intestinal microbiota and its as- sociation with colon cancer and red/processed meat consumption. J Gastroenterol Hepatol. v. 36, n. 1, p. 75-88.2020. https://doi.org/10.1111/jgh.1504. AHLQUIST, D.A, ZOU, H.; DOMANICO, M. et al. Next-generation stool DNA test accurately detects colorectal cancer and large adenomas. Gastroenterology. v. 142, n. 2, p. 248-256; quiz e25-6. 2012. doi: 10.1053/j.gastro.2011.10.031. Epub 2011 Nov 4. PMID: 22062357; PMCID: PMC4017869. AMERICAN CANCER SOCIETY. Cancer Facts & Figures 2017. Atlanta, GA: American Cancer Society, 2017b. 76 p. BODEY, B.; BELA BODEY JR, B.; SIEGEL, S.E. 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