UNESP – UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA INSTITUTO DE QUÍMICA CAMPUS DE ARARAQUARA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS ANALÍTICOS AMBIENTALMENTE AMIGÁVEIS PARA A DETERMINAÇÃO DE TANINOS HIDROLISÁVEIS, COMPOSTOS ANTIOXIDANTES E AMINOÁCIDOS EM ALIMENTOS Tiago Augusto Catelani Tese de Doutorado Profa. Dra. Helena Redigolo Pezza Orientadora Araraquara – SP 2017 Tiago Augusto Catelani DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS ANALÍTICOS AMBIENTALMENTE AMIGÁVEIS PARA A DETERMINAÇÃO DE TANINOS HIDROLISÁVEIS, COMPOSTOS ANTIOXIDANTES E AMINOÁCIDOS EM ALIMENTOS Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Química Profa. Dra. Helena Redigolo Pezza (Orientadora) Araraquara – SP 2017 DADOS CURRICULARES 1. Formação acadêmica 1.1. Graduação Bacharel em Química Universidade Estadual Paulista – Instituto de Química “Julio de Mesquita Filho” Período: 2007-2010 1.2. Pós-Graduação Mestrado em Química Analítica Universidade Estadual Paulista – Instituto de Química “Julio de Mesquita Filho” Período: 2011-2012 Doutorado Sanduíche Universidade do Porto – Faculdade de Farmácia (UFUP) – Porto/Portugal Período: Maio/2015 a Outubro/2015 Doutorado em Química Analítica Universidade Estadual Paulista – Instituto de Química “Julio de Mesquita Filho” Período: 2013-2016 2. Artigos publicados 2.1. Catelani, T.A.; Tóth, I.V.; Lima, J.L.F.C.; Pezza, L.; Pezza, H.R. A simple and rapid screening method for sulfonamides in honey using a flow injection system coupled to a liquid waveguide capillary cell. Talanta, v. 121, p. 281-287, 2014. 2.2. Catelani, T.A.; Bittar, D.B., Pezza, L.; Pezza, H.R. A Rapid and Eco- Friendly Method for Determination of Hydrolysable Tannins and Its Application to Honey Samples. Food Analytical Methods DOI: 10.1007/s12161-016-0454-1. 2.3. Catelani, T.A.; Castoldi, K.; Tóth, I.V.; Santos, J.L.M.; Lima, J.L.F.C.; Pezza, L.; Pezza, H.R. An eco-friendly method for analysis of sulfonamides in water samples using a multi-pumping flow system. Canadian Journal of Chemistry DOI: 10.1139/cjc-2016-0092. 2.4. Catelani, T.A., Páscoa, R.; Santos, J.R.; Pezza, L.; Pezza, H.R.; Lima, J.; Lopes, J.A. A Non-invasive Real-Time Methodology for the Quantification of Antioxidant Properties in Coffee during the Roasting Process Based on Near-Infrared Spectroscopy. Food Bioprocess Technology DOI: 10.1007/s11497-016-1843-6. 2.5. Bittar, D.B.; Catelani, T.A.; Nighogossian, K.; Barud, H.S.; Ribeiro, S.J.L.; Pezza, L., Pezza, H.R. Optimized Synthesis of Silver Nanoparticles by Factorial Design with Application for the Determination of Melamine in Milk. Analytical Letters, DOI. 10.1080/00032719.2016.1196213 3. Trabalhos publicados em congresso Euroanalysis 2015 – Congresso científico de Química Analítica realizado no período de 06 a 10 de Setembro de 2015 em Bordeaux – França. Título: An Eco-friendly method for analysis of sulfonamides in water samples using a multi-pumping system coupled to a Liquid Waveguide Capillary Cell. XXI Encontro Galego-Português de Química – Encontro realizado em Portugal em Setembro de 2015. Título: Near-infrared spectroscopy for rosting processo on-line coffee bean multiparametric determination. Enqa 2016 – Encontro Nacional de Química Analítica realizado no período de 18 a 21 de Setembro de 2016 em Florianópolis – Santa Catarina/Brasil. Título: Estudo da adulteração de cafés torrados e moídos utilizando a RMN 1H aliada à quimiometria. DEDICATÓRIA Aos meus pais, Jair e Célia, por todo apoio durante anos de estudo, pela compreensão e disponibilidade de tempo para compartilhar momentos de alegria e cansaço; Aos meus irmãos, Carlos e Elaine, por estar presentes a cada instante, pelo carinho e empurrões do dia a dia; Ao meu companheiro Ederson, por me suportar nos momentos de maior estresse e caminhar lado a lado comigo em busca do aperfeiçoamento pessoal e profissional; Às minhas sobrinhas e sobrinhos, Isabella, Aline, Heloísa, Alice, Arthur e Adryan, pelas horas de alegrias e brincadeiras que sempre me deixam com a alma mais leve; Aos meus cunhados e cunhadas, Marcos, Reginaldo, Simone e Daniele, por apoiarem cada momento do meu sonho, sempre presentes na alegria e em momentos mais difíceis; A todos amigos e familiares que de alguma forma fortaleceram o meu dia para o alcance do sucesso desse trabalho. AGRADECIMENTOS O primeiro e mais fiel agradecimento, independente do estágio, sempre é de Deus, por permitir que a cada dia melhorasse o meu modo de pensar e agir, dando-me orientação e saúde; Ao programa de pós-graduação em Química do IQ-UNESP por todas as oportunidades; À Profa. Dra. Helena Redigolo Pezza, por confiar em meu trabalho, permitindo que ao longo de seis anos pudesse mostrar meu potencial, pelas horas que passamos juntos em busca do conhecimento e pelas orientações; Ao prof. Dr. Leonardo Pezza, pela co-orientação e sugestões em todas as etapas do trabalho; Aos meus amigos de laboratório, pelas horas maravilhosas que passamos, trocando ideias sobre os mais diversos assuntos, pelos sorrisos e piadas, pelo carinho de irmão que temos um para com o outro, pelo apoio em situações difícieis; Ao prof. Dr. José Luís F. Costa Lima e prof. Dr. João Lopes pela oportunidade de desenvolver parte do meu doutorado na FFUP – Portugal; Aos amigos criados no grupo GABAI durante minha estadia em Portugal, pelo apoio no desenvolvimento do trabalho e conversas de incentivo, especialmente ao Ricardo e Rodrigo, pela paciência em ensinar conceitos novos; Ao CNPq pela bolsa de pesquisa concedida no Brasil; A CAPES pela bolsa de pesquisa de doutorado sanduíche concedida durante minha viagem a Portugal. “NUNCA DIGA:"É BOM DEMAIS PARA SER VERDADE" SE ALMEJAMOS SOMENTE A MÉDIA, SEREMOS MEDÍOCRES. SE ALMEJAMOS A EXCELÊNCIA, SEREMOS EXCELENTES!” IAGO SIMÕES “AQUI MORA A FÉ, A SUBLIME QUALIDADE DOS QUE JAMAIS DEIXARÃO DE ACREDITAR NA FORÇA SUPERIOR DO BEM.” EURÍPEDES BARSANULFO RESUMO O presente trabalho tem por objetivo apresentar as metodologias desenvolvidas para a determinação de taninos hidrolisáveis, teor de compostos antioxidantes e conteúdo de aminoácidos totais em mel, café e suplementos de academia, respectivamente, empregando reflectância difusa, infravermelho próximo e análise por imagens como técnicas analíticas. Os métodos reflectométricos foram baseados em reações clássicas descritas na literatura, realizadas utilizando papel de filtro com barreiras hidrofóbicas como suporte sólido. Os modelos para determinação de compostos antioxidantes em amostras de café foram construídos a partir de medidas realizadas em espectrofotômetro NIR, aplicando modelos quimiométricos para quantificação. Para a determinação de aminoácidos totais em suplementos de academia, a determinação foi realizada utilizando duas técnicas: reflectância difusa e análise por imagens, a primeira seguiu o mesmo procedimento que os demais métodos reflectométricos, com o adicional do uso de um dispositivo USB, utilizado como fonte de aquecimento para a promoção da reação entre o analito e o reagente cromogênico, e a segunda baseou-se na análise de fotografias tiradas a partir de um aparelho celular com flash automático, e no uso do software ImageJ para a obtenção dos valores de absorbância. Em todos os métodos desenvolvidos foram realizados planejamentos experimentais para a otimização das variáveis. A determinação de taninos hidrolisáveis em amostras de mel foi realizada através da reação entre o analito (tanino hidrolisável) e o reagente cromogênico KIO3 (iodato de potássio), em meio de tampão acetato (pH 4,75), papel de filtro com barreiras hidrofóbicas, formando um produto colorido mensurável por reflectância difusa em 525 nm. O planejamento experimental empregado forneceu como volume ótimo para cada reagente 10 µL e as concentrações otimizadas de 3,1 x 104 mg L-1 de KIO3 e pH 4,75. Os limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) obtidos foram respectivamente 12,2 e 40,8 mg L-1. A determinação de compostos antioxidantes em café foi realizada em funçao da quantificação de compostos fenólicos e flavonóides totais, além da determinação direta da capacidade antioxidante total, utilizando espectros de infravermelho próximo (NIR) para a construção de modelos quimiométricos capazes de predizer o comportamento de cada variável dentro do sistema. Os modelos construídos foram confrontados com valores de concentrações reais obtidos através da aplicação de um método espectrofotométrico comparativo para cada propriedade. A principal vantagem da utilização da técnica NIR aplicando a quimiometria é a não necessidade de etapas de tratamento das amostras e também por se tratar de uma técnica não invasiva, preservando a integridade final da amostra. Foram obtidos bons resultados na separação das amostras através de modelos quimiométricos utilizando PCA (Principal Component Analysis) e quantificação dos analitos através de modelos PLS (Partial Least Squares). O método na determinação do conteúdo de aminoácidos em amostras de suplementos de academia mostrou-se rápido para a determinação, através do uso da reação entre os analitos (aminoácidos) e o reagente cromogênico ninidrina. Foram desenvolvidas duas metodologias para a determinação: reflectância difusa associada com spot test com barreiras hidrofóbicas e análise por imagem, formando, em ambos os casos, um produto colorido (púrpura de Ruhmann) mensurado em 570 nm. O método de análise por imagem digital apresentou maior sensibilidade, porém esse não é um parâmetro importante para a comparação de metodologias, nesse caso, pois o teor de aminoácido nas amostras analisadas era elevado. O uso das barreiras hidrofóbicas permitiu a obtenção de um produto final mais homogêneo e com baixos valores de desvios nas triplicatas, aumentando a sensibilidade quando comparada com determinações por reflectância difusa na ausência das barreiras. A utilização do dispositivo USB na técnica de reflectância difusa proporcionou uma maior portabilidade ao método desenvolvido e uma maior rapidez na obtenção dos resultados. Os resultados obtidos foram satisfatórios para os dois métodos desenvolvidos e com relação aos resíduos finais, todos os quatro métodos desenvolvidos no decorrer do trabalho apresentaram valores negligenciáveis de formação de resíduos, característica de métodos ambientalmente amigáveis. Palavras-chave: Taninos hidrolisáveis, Espectroscopia de reflectância difusa, Dispositivo USB, mel, Capacidade antioxidante, Infravermelho próximo, Café, Análise por imagem digital, Suplementos alimentares/academia. ABSTRACT This study aims to present methodologies developed for the determination of hydrolysable tannin content of antioxidant compounds and content of total amino acids in honey, coffee and health supplements, in that order, using diffuse reflectance near infrared and analysis images as analytical techniques. The reflectométricos methods are based on classical reactions described in the literature conducted using filter paper as barriers hydrophobic solid support. The method for the determination of antioxidant compounds in coffee samples was constructed from measurements NIR spectrophotometer, applying chemometric models for quantification. For the determination of total amino acids in health supplements, the determination was carried out using two techniques: diffuse reflectance and analysis of images, the first followed the same procedure as the other reflectometric methods and the second was based on analysis of photographs taken from a mobile device with automatic flash, by using the ImageJ software for obtaining absorbance data. For all the methods developed experimental design for the optimization of the variables were performed. Determination of hydrolyzable tannins in honey samples was performed by reaction between the analyte (hydrolyzable tannin) and KIO3 chromogenic reagent (potassium iodate), among acetate buffer (pH 4.75) in barrier filter paper hydrophobic, forming a colorful measurable product by diffuse reflectance at 525 nm. The experimental design provided as great volume for each reagent 10 L and concentrations optimized 3.1 x 104 mg L-1 KIO3 and pH 4.75. The Limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) were obtained respectively 12,2 and 40,8 mg L-1. The determination of antioxidant compounds in coffee was performed by quantification of phenolic and flavonoids, as well as direct determination of total antioxidant capacity using infrared spectra close (NIR) to build chemometric models capable of predicting the behavior of each variable within of the system. The models developed were compared with actual concentration values obtained by applying a comparative spectrophotometric method for each composition. The main advantage of the use of techniques such as NIR applying chemometrics is the need for treatment steps of the samples and also because it is a non-invasive technique, preserving the final integrity of the sample. Good results were obtained for the separation of samples through chemometric models using PCA (Principal Component Analysis) and quantification of analytes through PLS (Partial Least Squares) models. The method for the determination of amino acid content in samples of gymnasium supplements was shown to be rapid for the determination through the use of the reaction between the analytes (amino acids) and the chromogenic reagent ninhydrin. Two methodologies were used for the determination: diffuse reflectance associated with spot test with hydrophobic barriers and image analysis, in both cases, a color product (Ruhmann purple) measured at 570 nm. The digital image analysis method presented higher sensitivity, but this is not an important parameter for the comparison of methodologies, in this case, since the amino acid content in the samples analyzed was high. The use of the hydrophobic barriers allowed the obtaining of a more homogeneous final product with low values of deviations in the triplicates, increasing the sensitivity when compared with determinations by diffuse reflectance in the absence of the barriers. The results obtained were satisfactory for the two methods developed and in relation to the final residues, all four methods developed in the course of the work presented negligible residue formation values. Keywords: Hydrolysable tannins, Diffuse reflectance spectroscopy, Honey, USB device, Antioxidant capacity, Near infrared, Coffee, Digital image analysis, Food supplements / gym. LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Estruturas do (a) ácido gálico, (b) ácido elágico, (c) galotanino e (d) elagitanino. 34 Figura 2 - Estrutura dos representantes das classes de composto fenólico (ácido gálico), flavonóides ((+)-catequina) e padrão para a determinação da capacidade antioxidante total das mais diversas amostras. ............................................................................................................ 35 Figura 3 - Mecanismo radicalar de um antioxidante primário onde ROO (radicalar) e R (radicalar) são radicais livres, AH é um antioxidante com um átomo de hidrogênio e A (radicalar) é um radical. ..................................................................................................................... 36 Figura 4 - Estrutura química dos antioxidantes sintéticos hidroxibutilanisol e hidroxibutiltolueno. ............................................................................................................................. 37 Figura 5 - Estruturas químicas de 16 dos 20 principais aminoácidos constituintes das proteínas. No retângulo em linha cheia verifica-se um exemplo de cadeia lateral R da molécula de arginina e nos retângulos em linhas tracejadas estão indicadas as estruturas dos aminoácidos utilizados para o estudo apresentado nessa tese. ......................................... 38 Figura 6 - Formação de uma ligação peptídica através da condensação de duas moléculas do aminoácido glicina. ....................................................................................................................... 39 Figura 7 - Número de publicações de trabalhos relativos à matriz mel, em função do ano, no período de 1950 a 2016. ................................................................................................................... 40 Figura 8 - Número de publicações de trabalhos relativos à matriz café, em função do ano, no período de 1950 a 2016. .............................................................................................................. 42 Figura 9 - Distribuição (em % de citações) dos suplementos consumidos por usuários. ...... 45 Figura 10 - Número de publicações de trabalhos relativos à matriz suplementos, em função do ano, em uma faixa de tempo de 1950 a 2016. ......................................................................... 46 Figura 11 - Espectros de reflectância obtidos a partir da reação entre aminoácidos e ninidrina em pH 4,75. ......................................................................................................................... 51 Figura 12 - Vista superior do acessório de reflectância Labsphere modelo RSA-HP-53. ..... 52 Figura 13 - Número de publicações de trabalhos relativos à técnica de reflectância difusa, em função do ano, em uma faixa de tempo de 1970 a 2016. ..................................................... 53 Figura 14 - Representação do espectro eletromagnético. A – raio X até o visível (10-10 a 10-6 m), B – Infravermelho próximo, C – Infravermelho médio, D – Infravermelho distante e E – micro-ondas a rádio (10-2 a 103 m). ................................................................................................. 58 Figura 15 - Esquema de funcionamento de um FTNIR. .............................................................. 60 Figura 16 - Esquema de análise de uma amostra qualquer através da técnica FT-NIR e posterior aplicação de modelos quimiométricos PCA e PLS. ..................................................... 62 Figura 17 - Distribuição de número de publicações de trabalhos relacionados com a técnica NIR e NIR+Quimiometria por década no período de 1960 a 2016. ........................................... 65 Figura 18 - Representação gráfica de obtenção dos dados em uma análise por imagem digital. (A) figura obtida através de uma câmera de celular, em destaque para a região selecionada para a obtenção dos resultados. (B) Resultados obtidos para a região considerando os três canais RGB. (C) Histograma de avaliação da imagem obtida para o intervalo de 0-255. Para os três canais. ......................................................................................... 69 Figura 19 - Esquema simplificado de obtenção de imagens via equipamento até a obtenção gráfica. .................................................................................................................................................. 70 Figura 20 - Esquema simplificado da adição dos reagentes no papel de filtro e a formação do produto transiente colorido mensurável em 525 nm. ............................................................ 100 Figura 21 - Gráfico de superfície de resposta (A) e sua respectiva curva de nível (B) para as variáveis Conc. de Iodato de potássio e pH do sistema tampão estudado. ........................... 106 Figura 22 - Curva analítica obtida para o método proposto com linearidade de 40,0 a 740 mg L-1, equação AR (525 nm) = 0,011 + 1,703 x 10-4 Cácido tânico e R2 = 0,998. ....................... 108 Figura 23 - Espectros entre a reação das soluções de lavagem dos filtros 0,45 µm para (A) solução padrão de ácido tânico e (B) amostra de mel selecionada para o estudo. .............. 109 Figura 24 - Curva analítica obtida para o método comparativo com linearidade de 50,0 a 400 mg L-1, equação A (715 nm) = -0,005 + 3,000 x 10-3 Cácido tânico e R2 = 0,999. ........................ 112 Figura 25 - Formação do complexo catequina-cloreto de alumínio. ....................................... 116 Figura 26 - Reação entre compostos fenólicos e o componente molibdênio do reagente de Folin. ................................................................................................................................................... 117 Figura 27 - Reação de descoloração do radical ABTS por um composto antioxidante. ...... 118 Figura 28 - Representação do processo de torra para a obtenção dos espectros utilizando a sonda, onde *P5 representa uma torra lenta de potência 50% e *P7 uma torra rápida de potência 70%. ................................................................................................................................... 120 Figura 29 - Fluxograma indicando o preparo das amostras de café para a metodologia comparativa juntamente com a obtenção das soluções diluídas dos extratos. ...................... 121 Figura 30 - Gráficos de temperaturas para as torras lenta e rápida no intervalo de 0 a 25 minutos de torrefação. ..................................................................................................................... 124 Figura 31 - Espectros brutos (sem pré-processamento) com a representação das cinco regiões selecionadas para o estudo (R1: 10000 – 7300 cm-1, R2: 7300 – 6700 cm-1, R3: 6700 – 5350 cm-1, R4: 5350 – 5000 cm-1 e R5: 5000 – 4000 cm-1).......................................... 125 Figura 32 - Espectros infravermelho obtidos através do tratamento de dados das amostras de café durante o processo de torrefação. Em (A) encontra-se o espectro bruto dos dados coletados; (B) Espectro dos dados coletados após aplicação do pré-processamento descrito anteriormente; (C) espectro bruto confinado na região de determinação química e (D) espectro pré-processado na região de determinação química (350 a 700 pontos ou 6700 a 5350 cm-1). ......................................................................................................................................... 127 Figura 33 - Esquema simplificado de demonstração do processo de obtenção da imagem até a etapa final de caracterização de impressão digital. .......................................................... 128 Figura 34 - Gráfico de análise multivariada PCA indicando a separação em 8 diferentes grupos que indicam o tempo de torra lenta das quatro diferentes amostras analisadas. .... 129 Figura 35 - Gráfico de análise multivariada PCA indicando a separação em 6 diferentes grupos que indicam o tempo de torra rápida das quatro diferentes amostras analisadas. .. 130 Figura 36 - Gráfico de análise multivariada PCA para a separação em classes, considerando as quatro origens diferentes das amostras de café. ................................................................... 131 Figura 37 - Gráfico de análise multivariada PCA para a separação em classes, considerando os dois tipos de variedades das amostras selecionadas, onde ▼ indica a variedade Arabica e ӿ a variedade Robusta. ............................................................................... 132 Figura 38 - Valores experimentais VS predição PLS cross-validada para o modelo de fenólicos totais (▼ representa o conjunto de validação e ● representa o conjunto de calibração). Fonte: Elaborado pelo autor ..................................................................................... 135 Figura 39 - Valores experimentais VS predição PLS cross-validada para o modelo de flavonóides totais (▼ representa o conjunto de validação e ● representa o conjunto de calibração). ........................................................................................................................................ 135 Figura 40 - Valores experimentais VS predição PLS cross-validada para o modelo de capacidade antioxidante total (▼ representa o conjunto de validação e ● representa o conjunto de calibração). .................................................................................................................. 136 Figura 41 - Gráfico de vetor de regressão e verificação da significância dos comprimentos de onda nos modelos PLS para capacidade antioxidante das amostras de café. ................ 138 Figura 42 - Representação esquemática da obtenção do produto da reação entre aminoácidos e ninidrina utilizando um dispositivo USB como fonte de aquecimento para promover a reação. .......................................................................................................................... 144 Figura 43 - Reação entre ninidrina e aminoácido sugerida na literatura para a formação do produto colorido de Ruhmann. ....................................................................................................... 146 Figura 44 - Gráfico de Pareto obtido do planejamento fatorial completo apresentado na Tabela 26, indicando a ordem de influência que cada variável apresente no sistema. ........ 153 Figura 45 - Gráfico de interações indicando a relação entre as três variáveis do sistema, concentração de ninidrina, pH do meio tamponado e tempo de aquecimento do spot test. 154 Figura 46 - Gráfico de superfície de resposta e respectiva curva de nível obtidos através do planejamento com ponto central apresentado na Tabela 27 (Secador como fonte de aquecimento). ................................................................................................................................... 156 Figura 47 - Gráfico de superfície de resposta e respectiva curva de nível obtidos através do planejamento com ponto central apresentado na Tabela 27 (Dispositivo USB). ................... 158 Figura 48 - Gráfico de Pareto obtido do planejamento fatorial completo apresentado na Tabela 29, indicando a ordem de influência que cada variável apresente no sistema. ........ 160 Figura 49 - Gráfico de interações indicando a relação entre as três variáveis do sistema, concentração de ninidrina, pH do meio tamponado e tempo de reação. ................................ 161 Figura 50 - Gráfico de superfície de resposta e respectiva curva de nível obtidos através do planejamento com ponto central apresentado na tabela 30. ..................................................... 163 Figura 51 - Curva analítica obtida para o método proposto com linearidade de 20,0 a 350 mg L-1, equação AR (570 nm) = 0,069 + 0,013 Caminoácido e R2 = 0,998. ................................... 166 Figura 52 - Curva analítica obtida para o método proposto com linearidade de 20,0 a 350 mg L-1, equação IR (canal verde) = 0,007 + 0,026 Caminoácido e R2 = 0,997. ............................. 168 Figura 53 - Gráfico de estudo de interferentes obtidos através da determinação de aminoácidos pelos dois métodos propostos. Figura A representa o gráfico de interferentes para a metodologia de reflectância difusa (com aquecimento) e Figura B para a metodologia de análise por imagens digitais (sem aquecimento). .................................................................. 170 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Características de alguns trabalhos encontrados na literatura empregando a técnica de reflectância difusa. .......................................................................................................... 55 Tabela 2 - Tabela informativa sobre os tipos de ondas, comprimento de onda e sua frequência de alcance. ....................................................................................................................... 58 Tabela 3 - Tabela de parâmetros bioquímicos medidos direta e indiretamente pela técnica NIRS. .................................................................................................................................................... 59 Tabela 4 - Características dos principais sistemas de cores utilizados em análises digitais. 68 Tabela 5 - Características de alguns trabalhos encontrados na literatura empregando cromatografia líquida de alta eficiência para a determinação de taninos. ................................ 78 Tabela 6 - Características de alguns trabalhos encontrados na literatura empregando a técnica espectrofotometria na região UV-VIS para a determinação da capacidade antioxidante, teor de flavonóides ou fenólicos totais. ................................................................... 83 Tabela 7 - Características de alguns trabalhos encontrados na literatura empregando a técnica de cromatografia líquida para a determinação da capacidade antioxidante, teor de flavonóides ou fenólicos. ................................................................................................................... 86 Tabela 8 - Alguns dos principais aminoácidos e seus respectivos valores de comprimentos de onda de máxima absorção e coeficiente de absorção. ........................................................... 89 Tabela 9 - Características de alguns métodos encontrados na literatura empregando a técnica de espectrofotometria na região UV-VIS para a determinação de aminoácidos. ...... 91 Tabela 10 - Características de alguns trabalhos encontrados na literatura empregando a técnica cromatografia líquida na determinação de aminoácidos. ............................................... 94 Tabela 11 - Estudo da influência dos sistemas tampão na reação. ........................................ 101 Tabela 12 - Estudo da influência da ordem de adição analito/reagente. ................................ 101 Tabela 13 - Estudo da reação entre taninos hidrolisáveis e iodato de potássio. ................... 103 Tabela 14 - Planejamento com ponto central das variáveis estudadas (superfície de resposta). ........................................................................................................................................... 105 Tabela 15 - Figuras de mérito da metodologia desenvolvida para a determinação de taninos hidrolisáveis em mel. ....................................................................................................................... 107 Tabela 16 - Curva analítica para o método de reflectância difusa desenvolvido. ................. 108 Tabela 17 - Quantificação das amostras de mel pelas metodologias proposta e comparativa. ............................................................................................................................................................. 111 Tabela 18 - Curva analítica obtida para o método comparativo. .............................................. 112 Tabela 19 - Valores de recuperação da metodologia proposta. ............................................... 113 Tabela 20 - Estudo da temperatura das amostras de café em função do tempo. ................. 123 Tabela 21 - Parâmetros das metodologias aplicadas. ............................................................... 133 Tabela 22 - Modelos de calibração PLS para os três diferentes métodos químicos usando a região espectral 6700-5350 cm-1. .................................................................................................. 137 Tabela 23 - Amostras de suplementos analisadas nos dois métodos desenvolvidos e seus respectivos conteúdos declarados no rótulo. ............................................................................... 143 Tabela 24 - Estudo preliminar do sistema tampão utilizado para o desenvolvimento do método de determinação de aminoácidos em amostras de suplementos. ............................. 148 Tabela 25 - Estudo da ordem de adição entre solução do analito, do reagente cromogênico e tampão para a obtenção do máximo valor de absorbância na determinação na técnica de reflectância difusa. ........................................................................................................................... 150 Tabela 26 - Planejamento fatorial completo (23) com 3 variáveis e 8 experimentos realizado para a otimização do método de reflectância difusa desenvolvido para a determinação de aminoácidos. ..................................................................................................................................... 152 Tabela 27 - Matriz de planejamento experimental com ponto central (superfície de resposta) com duas variáveis e 13 experimetos para o método de reflectância difusa. ........................ 155 Tabela 28 - Variáveis otimizadas para o método de reflectância difusa desenvolvido. ....... 157 Tabela 29 - Planejamento fatorial completo (23) com 3 variáveis e 8 experimentos realizado para a otimização do método de análise por imagens digitais desenvolvido para a determinação de aminoácidos. ...................................................................................................... 159 Tabela 30 - Matriz de planejamento experimental com ponto central (superfície de resposta) com duas variáveis e 13 experimetos para o método de análise por imagem digital. .......... 162 Tabela 31 - Variáveis otimizadas para o método de reflectância difusa desenvolvido. ....... 164 Tabela 32 - Figuras de mérito obtidas para o método de reflectância difusa. ....................... 165 Tabela 33 - Curva analítica obtida para o método proposto com linearidade de 20,0 a 350 mg L-1, equação AR (570 nm) = 0,069 + 0,013 Caminoácido e R2 = 0,998. ................................... 166 Tabela 34 - Figuras de mérito obtidas para o método de análise por imagens digitais. ...... 167 Tabela 35 - Curva analítica obtida para o método proposto com linearidade de 20,0 a 350 mg L-1, equação IR = 0,007 + 0,026 Caminoácido e R2 = 0,997 ....................................................... 168 Tabela 36 - Quantificação de aminoácidos nas amostras de suplementos através das técnicas reflectância difusa (desenvolvida) e espectrofotometria (comparativa). .................. 171 Tabela 37 - Adição de padrão e recuperação em duas amostras de suplementos (tablete e em pó) para o estudo de interferência de matriz do método de reflectância difusa desenvolvido. .................................................................................................................................... 172 Tabela 38 - Quantificação de aminoácidos nas amostras de suplementos através da técnicas análise por imagem digital (desenvolvida) e espectrofotometria (comparativa). .... 173 Tabela 39 - Adição de padrão e recuperação em duas amostras de suplementos (tablete e em pó) para o estudo de interferência de matriz do método de análise por imagem digital desenvolvido. .................................................................................................................................... 175 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ABTS - 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) BCAA – Branched Chain Amino Acids (Aminoácidos de Cadeia Ramificada) CCD – cromatografia em camada delgada CLAE – cromatografia líquida de alta eficiência C18 – grupo octadecilsilano ligado à sílica DNA – (desoxirribonucleic acid) ácido desoxirribonucleico DPR – desvio padrão relativo FIA – (flow injection analysis) análise por injeção em fluxo FMOC – grupo 9-fluoretil-metil FT-NIR – infravermelho próximo com transformada de Fourier HPLC/DAD/ESI-MS – High Performance Liquid Chromatography acoplada a um detector Diodo Array Detection e Espectrometria de Massa IUPAC – International Union of Pure and Applied Chemistry LOD – limit of detection (limite de detecção) LOQ – limit of quantification (limite de quantificação) MPFS – Multi pumping flow system (sistema em fluxo com multibombas) NIR – Near InfraRed (infravermelho próximo) PCA – (principal component analysis) análises de componentes principais p-DAC – para-dimetilaminocinamaldeído PLS – (partial least squares) mínimos quadrados parciais PTFE – politetrafluoretileno RMN – ressonância magnética nuclear TFA – ácido trifluoracético UV/VIS – ultravioleta/visível LISTA DE SÍMBOLOS A/Abs – Absorbância AR – densidade óptica para medida de reflectância difusa b – caminho óptico c – concentração ε – absortividade molar λ ou λmáx – comprimento de onda ou comprimento de onda de absorção máxima I – intensidade de radiação refletida Io – intensidade de radiação incidente R – medidade de reflectância difusa r – coeficiente de correlação linear s – desvio padrão relativo / coeficiente de dispersão k – coeficiente de absorção molar SUMÁRIO CAPÍTULO I – INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 29 1.1. Considerações Gerais................................................................................................................. 30 1.1.1. Alimentos ................................................................................................................................. 30 1.1.2. Segurança alimentar .............................................................................................................. 31 1.1.3. Rotulagem ................................................................................................................................ 32 1.2. Analitos utilizados no desenvolvimento das metodologias de reflectância difusa com barreira hidrofóbica e análise por imagem digital ........................................................................... 33 1.2.1. Taninos ..................................................................................................................................... 33 1.2.2. Compostos antioxidantes – fenólicos e flavonóides ......................................................... 35 1.2.3. Aminoácidos ............................................................................................................................ 37 1.3. Amostras utilizadas no desenvolvimento e aplicação das metodologias de reflectância difusa com barreira hidrofóbica, infravermelho próximo com quimiometria e análise por imagem digital ...................................................................................................................................... 39 1.3.1. Mel ............................................................................................................................................ 39 1.3.2. Café .......................................................................................................................................... 41 1.3.2.1. Café Arábica e Robusta (duas principais variedades de café) ..................................... 43 1.3.3. Suplementos alimentares de academia .............................................................................. 44 CAPÍTULO II – CONSIDERAÇÕES GERAIS ................................................................................ 48 2.1. Espectroscopia de Reflectância Difusa em papel com barreira hidrofóbica ...................... 49 2.1.1. Espectros de reflectância difusa ............................................................................................ 51 2.1.2. Instrumentação ......................................................................................................................... 51 2.1.3. A espectroscopia de reflectância difusa ............................................................................... 52 2.1.4. Barreiras hidrofóbicas .............................................................................................................. 55 2.2. Infravermelho Próximo e Quimiometria .................................................................................... 57 2.2.1. Instrumentação ......................................................................................................................... 60 2.2.2. Quimiometria ............................................................................................................................. 61 2.2.3. O Infravermelho próximo na literatura e quimiometria ....................................................... 64 2.3. Análises por Imagens Digitais ................................................................................................... 66 CAPÍTULO III - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA – MÉTODOS PARA A DETERMINAÇÃO DOS ANALITOS EM ESTUDO .................................................................................................................. 72 3.1. Taninos .......................................................................................................................................... 73 3.1.1. Espectrofotometria na Região UV-VIS ................................................................................ 73 3.1.2. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência(CLAE) ............................................................... 75 3.1.3. Outras técnicas e prodecimentos ......................................................................................... 79 3.1.3.1. Análise por Injeção em Fluxo (FIA – Flow Injection Analysis) ...................................... 79 3.1.3.2. Cromatografia em camada delgada (TLC – Thin Layer Chromatography) ................ 80 3.2. Capacidade antioxidante – teor de compostos fenólicos e flavonóides ............................. 81 3.2.1. Espectrofotometria na região UV-VIS ................................................................................. 81 3.2.2. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) .............................................................. 84 3.2.3. Outras técnicas e procedimentos .......................................................................................... 87 3.2.3.1. Análise por Injeção em Fluxo (FIA) .................................................................................... 87 3.2.3.2. Eletroquímica e (bio)sensores ............................................................................................ 88 3.3. Aminoácidos ................................................................................................................................. 88 3.3.1. Espectrofotometria na Região UV-VIS e colorimetria ....................................................... 88 3.3.2. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) e CLAE/Espectrometria de Massas92 3.3.3. Outras técnicas e procedimentos ......................................................................................... 95 3.3.3.1. Análise por Injeção em Fluxo (FIA) ................................................................................... 95 3.3.3.2. Cromatografia Gasosa (CG) e CG-tandem-espectrometria de massa ....................... 96 CAPÍTULO IV - DESENVOLVIMENTO DE UMA METODOLOGIA RÁPIDA E AMBIENTALMENTE AMIGÁVEL PARA A DETERMINAÇÃO DE TANINOS HIDROLISÁVEIS E APLICAÇÃO EM AMOSTRAS DE MEL ...................................................................................... 97 4.1. Materiais e equipamentos .......................................................................................................... 98 4.2. Reagentes e soluções ................................................................................................................ 98 4.3. Preparo de reagentes e soluções ............................................................................................. 99 4.3.1. Solução padrão de ácido tânico ............................................................................................. 99 4.3.2. Solução de KIO3 (reagente cromogênico) ............................................................................ 99 4.3.3. Solução tamponante (CH3COOH/NaOOCCH3 – pH 4,75) ................................................ 99 4.3.4. Amostras e preparo das amostras ......................................................................................... 99 4.2. Experimental ............................................................................................................................... 100 4.2.1. Metodologia proposta........................................................................................................... 100 4.3. Resultados e discussão ............................................................................................................ 100 4.3.1. Estudo da reação entre taninos hidrolisáveis e Iodato ................................................... 102 4.3.2. Estudo dos interferentes ...................................................................................................... 104 4.3.3. Planejamento Experimental ................................................................................................ 104 4.3.3.1. Planejamento fatorial com ponto central (superfície de resposta) ............................. 104 4.3.4. Curva analítica e figuras de mérito para o método proposto ......................................... 107 4.3.5. Estudo do isolamento do analito de interesse ................................................................... 109 4.3.6. Análises das amostras de mel ............................................................................................ 110 4.3.6.1. Quantificação das amostras pelos métodos proposto e comparativo ....................... 110 4.3.7. Metodologia comparativa .................................................................................................... 111 4.3.8. Curva analítica para o método comparativo ..................................................................... 111 4.3.9. Estudo da interferência de matriz (Adição de padrão e recuperação) ......................... 112 4.4. Conclusões ................................................................................................................................. 113 CAPÍTULO V - Desenvolvimento de um método não-invasivo em tempo real baseado em uma metodologia de espectroscopia do infravermelho próximo para a quantificação da capacidade antioxidante em café durante o processo de torra ................................................ 115 5.1. Materiais e equipamentos ....................................................................................................... 116 5.2. Preparo de reagentes e soluções ........................................................................................... 116 5.2.1. Flavonóides totais .................................................................................................................. 116 5.2.1.1. Soluções de cloreto de alumínio hexaidratado (AlCl3 6H2O), hidróxido de sódio (NaOH) e nitrito de sódio (NaNO2) – determinação do conteúdo de flavonóides totais ........ 117 5.2.1.2. Solução padrão de (+) -catequina – determinação de flavonóides totais .................. 117 5.2.2. Fenólicos totais ....................................................................................................................... 117 5.2.2.1. Soluções do reagente Folin (fosfotungstato e fosfomolibdato de sódio) e carbonato de sódio (Na2CO3) - determinação do conteúdo de fenólicos totais ......................................... 118 5.2.2.2. Solução padrão de ácido gálico – determinação de fenólicos totais .......................... 118 5.2.3. Capacidade antioxidante total .............................................................................................. 118 5.2.3.1. Soluções do reagente ABTS (2, 2'-azino-di(3-etillbenzotiazolina-6-sulfonato) e do persulfato de potássio (K2S2O8) – Capacidade antioxidante total ............................................. 119 5.2.3.2. Solução do padrão de Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxilico) – determinação da capacidade antioxidante total ........................................................................ 119 5.3. Experimental ............................................................................................................................... 119 5.3.1. Metodologia proposta aplicada ............................................................................................ 119 5.3.2. Preparo das torras .................................................................................................................. 120 5.3.3. Metodologia comparativa aplicada para a obtenção das concentrações dos compostos nas amostras de café para posterior formação de modelos quimiométricos baseados na metodologia NIR ................................................................................................................................ 121 5.4. Resultados e discussão ............................................................................................................ 122 5.4.1. Metodologia proposta ............................................................................................................ 122 5.4.1.1. Aquisição dos espectros FTNIR (on-line) – durante o processo de torra .................. 122 5.4.2. Processamento de análise multivariado ............................................................................. 126 5.4.3. Curvas analíticas para a determinação de fenólicos e flavonóides totais e capacidade antioxidante total ................................................................................................................................ 133 5.4.4. Modelos de regressão multivariada baseados em NIR para a determinação do conteúdo de fenólicos totais (TPC), flavonóides totais (TFC) e capacidade antioxidante total (ABTS) ................................................................................................................................................. 133 5.5. Conclusões ................................................................................................................................. 138 CAPÍTULO VI - Desenvolvimento de duas novas metodologias aplicando reflectância difusa com barreiras hidrofóbicas e análise por imagens digitais para a determinação de aminoácidos em suplementos de academia ................................................................................ 140 6.1. Materiais e Equipamentos ........................................................................................................ 141 6.2. Reagentes e soluções .............................................................................................................. 142 6.3. Amostras ..................................................................................................................................... 142 6.4. Experimental ............................................................................................................................... 143 6.4.1. Espectroscopia de reflectância difusa ................................................................................. 143 6.4.2. Análise por Imagem Digital ................................................................................................... 144 6.4.3. Preparo das amostras ........................................................................................................... 145 6.5. Resultados e discussão ............................................................................................................ 145 6.5.1. Estudo do meio tamponado e a ordem de adição das soluções .................................... 148 6.5.2. Planejamento Fatorial de Experimentos ............................................................................. 150 6.5.2.1. Planejamento Fatorial Completo (23): Espectroscopia de Reflectância Difusa com barreira hidrofóbica ........................................................................................................................... 150 6.5.2.2. Planejamento com ponto central (superfície de resposta): Espectroscopia de Reflectância Difusa com barreira hidrofóbica ............................................................................... 154 6.5.2.3. Planejamento Fatorial Completo (23): Análise por imagens digitais ........................... 159 6.5.3. Condições analíticas das metodologias desenvolvidas ................................................... 164 6.5.3.1. Espectrosocopia de reflectância difusa ........................................................................... 164 6.5.3.2. Análise por imagens digitais .............................................................................................. 167 6.5.4. Estudo dos interferentes ....................................................................................................... 169 6.5.5. Aplicação das metodologias propostas e adição de padrão e recuperação ................. 170 6.5.5.1. Reflectância Difusa com barreiras hidrofóbicas ............................................................. 170 6.5.5.2. Análise por imagens digitais .............................................................................................. 173 6.6. Conclusões ................................................................................................................................. 175 CAPÍTULO VII - Conclusões Gerais .............................................................................................. 177 REFERÊNCIAS ................................................................................................................................ 179 29 CAPÍTULO I – INTRODUÇÃO 30 1.1. Considerações Gerais Esta tese apresenta o desenvolvimento de métodos analíticos baseados nas técnicas de reflectância difusa, infravermelho próximo, reflectância difusa utilizando plataforma de papel com barreiras hidrofóbicas e dispositivo USB e análise por imagens digitais para a determinação dos diferentes analitos: taninos hidrolisáveis, compostos fenólicos, flavonóides e aminoácidos, alé da capacidade antioxidante em diferentes matrizes (mel, café e suplementos de academia). Considerações gerais sobre os estudos realizados são dadas a seguir. 1.1.1. Alimentos A preocupação com relação ao consumo dos mais variados tipos de alimentos não é algo novo, pelo contrário, há informações de 2500 anos com relação aos estudos sobre alimentos benéficos à saúde humana. O princípio de Hipócrates afirmava:” deixe o alimento ser teu remédio e o remédio ser teu alimento”, dito há certa de 2500 anos, já dava indícios que certos tipos de alimentos apresentavam efeitos benéficos sobre a saúde (Casemiro 2014). A qualidade de vida e a saúde constituem hoje uma das preocupações mais evidenciadas de alguns segmentos de consumidores, devido a três principais fatores: sedentarismo, alimentação incorreta e estresse, originando problemas sérios de saúde, como por exemplo, a obesidade, considerada um dos principais males da saúde atual. O avanço de conhecimentos no campo da saúde permitem compreender os malefícios originados por esse estilo de vida a médio e longo prazo, devido à presença de meios mais rápidos para a obtenção das informações entre os consumidores, originando maiores preocupações com relação à saúde, qualidade de vida e utilização de alimentos a favor da saúde (Oliveira e Cardoso 2010). No cenário, atual verificado pelo crescente interesse com relação aos benefícios e malefícios originados pelo consumo de alimentos, verifica-se um crescente aumento de interesse dos conhecidos “alimentos funcionais”, objetivando a contribuição para a promoção da saúde física e mental do indivíduo (Annunziata e Vecchio, 2011; Granato et al., 2010). A escolha dos alimentos muitas vezes está relacionada com a influência que eles provocam no indivíduo com relação aos benefícios à saúde, como relata uma pesquisa realizada pela Health Focus em 30 31 países ao redor do mundo, revelando que uma média de 44 % dos consumidores brasileiros são influenciados por esse “fenômeno” (Oliveira e Fernandes 2004). As análises de pesquisas com relação à alimentação e nutrição tem mostrado resultados controversos acerca da segurança e eficácia do consumo dos alimentos, nutrientes e suplementos, pois com o passar do tempo e o melhoramento das técnicas e descobertas surgem novos estudos que normalmente questionam estudos anteriores. O consumo de ovos, a citar como exemplo, foi restrito para a prevenção de riscos com relação à doenças cardiovasculares, porém, evidências científicas posteriores verificaram que havia uma mínima relação entre a restrição do consumo do alimento ovo e a redução nos riscos de derrames e doenças cardiovasculares (Hu et al., 1999; Dawber et al., 1982). O consumo de café já foi relacionado também como potencial causador da hipertensão, porém, em estudos posteriores foi verificado que embora o consumo de café esteja associado à alterações na corrente sanguínea, ele não apresenta um papel central no aparecimento da hipertensão (Klag et al., 2002). As frutas, grãos e vegetais não escaparam da análise crítica realizada por (Howard et al., 2006). A dieta realizada na base desses alimentos, segundo médicos e nutricionistas, favorecem o controle de doenças cardiovasculares. Segundo um estudo realizado com 48000 mulheres, o consumo desses alimentos não reduziu significativamente a ocorrência de tais doenças (Howard et al., 2006). Além disso, a presença das substâncias denominadas flavonóides, presentes em frutas, alguns vegetais, chocolate, café e mel, podem contribuir para a diminuição do colesterol (Hu et al., 1998). 1.1.2. Segurança alimentar Com relação ao conceito de segurança alimentar verifica-se sua origem no início do século XX, ou seja, trata-se de uma prática relativamente nova e recente se comparada ao fato de a existência do conhecimento sobre diversos alimentos datar de 2500 anos. O conceito surgiu logo após a II Guerra Mundial, quando cerca de metade da Europa foi dizimada e sem condições reais de produção alimentar (Belik, 2003) e desse modo, políticas continentais foram estabelecidas para que fosse garantido o acesso aos alimentos, independente da situação (Galeazzi, 1996). 32 Assim, a Conferência Mundial de Alimentação, organizada pela FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations), definiu que a segurança alimentar estaria presente quando “todos os indivíduos, independente do momento, obtivessem acesso físico e econômico a uma alimentação que seja segura, nutritiva e que atenda às necessidades nutricionais, proporcionando uma vida saudável” (FAO 1997). O conceito de segurança alimentar não diz respeito somente à demanda e existência de alimentos para suprir as necessidades de uma nação, mas também relaciona-se com o grau de periculosidade que a composição de determinados alimentos apresenta à saúde, por exemplo, a presença de contaminantes ou inadequação do conteúdo de determinado componente indicado no rótulo. 1.1.3. Rotulagem A rotulagem é uma etapa importante na produção de qualquer tipo de produto, principalmente os alimentares. O Decreto Federal nº 986/1969 informa que o rótulo é definido como “qualquer identificação impressa, dizeres pintados ou gravados a fogo, por pressão, aplicados sobre o recipiente, vasilhame, outro tipo de embalagem ou sobre o que acompanha seu conteúdo” (Brasil, 1969; Garcia e Carvalho, 2011). O conteúdo de cada componente presente em um determinado alimento deve ser descrito para que o consumidor esteja informado sobre todas as propriedades nutricionais do alimento. A descrição do conteúdo, denominada rotulagem, é regulamentada pela Agência de Vigilância Sanitária (ANVISA) através da RDC nº 360 de 23 de Dezembro de 2003, determinando o que deve estar presente em um rótulo, sendo obrigatório informar os ingredientes presentes e seus respectivos conteúdos, validade do produto e identificação da origem (Brasil, 2003). A partir do momento que determinado produto alimentício apresente uma rotulagem adequada, é possível realizar o desenvolvimento de metodologias capazes de determinar se aquele valor indicado no rótulo está de acordo ou não, com resultados fidedignos, uma vez que a presença dos constituintes em menor ou maior concentração pode acarretar danos à saúde do consumidor. Logo, a presença de um rótulo adequado faz com que o consumidor crie a necessidade de “estudá-lo” (Garcia e Carvalho, 2011), para verificar se determinado produto ou alimento está de 33 acordo com suas necessidades, principalmente quando possui um objetivo, como por exemplo o uso de suplementos de academia utilizados para o ganho de massa corporal. 1.2. Analitos utilizados no desenvolvimento das metodologias de reflectância difusa com barreira hidrofóbica e análise por imagem digital 1.2.1. Taninos Os taninos fazem parte de um grupo complexo e heterogêneo de polifenóis metabólitos especiais de plantas superiores com pesos moleculates entre 500 e 20000 Da. Eles partilham a capacidade para se ligar e precipitar proteínas, alcalóides, polissacarídeos e em alguns casos complexam-se com metais e compostos inorgânicos, onde torna-se possível sua identificação (Harbertson et al. 2012). Por se tratar de um composto naturalmente presente em plantas e em seus extratos, espera-se encontrar em grandes quantidades, dependendo da classe a qual pertence o tanino a ser estudado. Alguns alimentos, como por exemplo o mel, apresenta taninos em sua composição, mas não devido ao fato de tal composto estar naturalmente presente na matriz, e sim pelo fato de no processo de fabricação do mel, durante a etapa de transporte do pólen, realizada pelas abelhas, taninos são introduzidos na matriz, provocando diversas alterações se presente em grandes concentrações. Os taninos (Figura 1) são divididos em duas classes principais: hidrolisáveis e condensados. Taninos hidrolisáveis (Arapitsas, 2012; Melone et al., 2013; Yang e Pengzhan, 2014) consistem de um núcleo de poliol, sendo a d-glicose o núcleo mais comum, multiesterificados com ácido gálico ou algum de seus derivados. Taninos dessa classe podem apresentar clivagem hidrolítica e gerar os galotaninos e elagitaninos, respectivamente formados através das estruturas de ácido gálico e elágico. Taninos condensados (Lorenz et al., 2014; Roumeas et al., 2013; Naumann et al., 2014) são flavonóides poliméricos ou oligoméricos que consistem em unidades de catequina (3-flavonol) com carbonos ligados em posições 4 e 8 ou 4 e 6. 34 OH OH OH O OH O O O O OH OH OH OH OH OH OH O O OH OH OH O O OH OH O O O OH OH OH O O OH OH OH OO OH OH OH O O O O O O O O O O O OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH ba c d Figura 1 - Estruturas do (a) ácido gálico, (b) ácido elágico, (c) galotanino e (d) elagitanino. Fonte: Elaborada pelo autor O uso dos taninos é relatado desde os tempos mais antigos (período neolítico), onde eram utilizados isoladamente ou em combinação com outros compostos para retardar a deterioração de alimentos e também no curtimento do couro, pois são compostos orgânicos facilmente encontrados em cascas, folhas (couve, espinafre, hortelã, entre outros) e galhos de diversos tipos de plantas, além de fazer parte da composição de diversos tipos de frutas e alimentos, como bananas, uvas e mel (Falcão e Liu, 2011). Os taninos tem sido alvo de diversos estudos, principalmente pelo fato de apresentarem ação biológica contra certos microorganismos (Scalbert 1991), ação anti-carcinogênica e anti-agentes causadores de toxicidades hepáticas (Chung, Wei e Johnson, 1998). Alguns trabalhos mencionam a capacidade dos taninos em ação anti-inflamatória, cicatrizante e em alguns casos inibidores da transcriptase reversa (anti-HIV) (Kilkuskie et al., 1992; Khanbabaee e Ree, 2001) e captura de radicais livres associados à doenças degenerativas, como câncer, esclerose múltipla e arteriosclerose, onde os taninos interceptam o oxigênio radical para a formação de radicais estáveis. Com relação à presença de taninos nas mais variedades de matrizes, é importante salientar a depência da presença e quantidade com a sazonalidade, muitas vezes verificada na sazonalidade circadiana. Salmien e colaboradores 35 (Salminen et al. 2001) investigaram a variação sazonal de taninos hidrolisáveis em folhas de Betula Pubescens, encontrando mudanças nos diferentes padrões de sazonalidade. 1.2.2. Compostos antioxidantes – fenólicos e flavonóides Compostos antioxidantes apresentam grande importância devido à sua atuação no organismo humano, assim evidenciando a importância de seu estudo no campo da química (quantificação) através das mais variadas técnicas. Dentre os principais compostos antioxidantes estudados nesse trabalho, destacam-se o ácido gálico e a (+)-catequina, representantes das classes dos fenólicos e dos flavonóides, respectivamente, cujas estruturas estão apresentadas na Figura 2. O trolox, cuja estrutura também está representada, é normalmente utilizado na determinação da capacidade antioxidante total das amostras através de metodologias espectrofotométricas. O OH OH OH OH OOH OH OH OH OH CH3 CH3 CH3 CH3 O O OH CH3 Ácido gálico (+)-catequina Trolox Figura 2 - Estrutura dos representantes das classes de composto fenólico (ácido gálico), flavonóides ((+)-catequina) e padrão para a determinação da capacidade antioxidante total das mais diversas amostras. Fonte: Elaborada pelo autor Antioxidantes são substâncias que em reações de degradação oxidativa proporcionam o retardamento da reação, reduzindo a velocidade da oxidação através de um ou mais mecanismos, inibindo a formação de radicais livres ou fenômenos de complexação, por exemplo (Condelli et al., 2015). 36 Além dos fenômenos químicos ocasionados, as substâncias antioxidantes também apresentam diferentes propriedades que atuam no sentido de proteger e atuar nas mais diversas etapas do processo oxidativo, em diferentes mecanismos. Os compostos antioxidantes são classificados em duas principais classes: primários e secundários. Os antioxidantes que inibem ou retardam a oxidação por inativação de radicais livres, devido à doação de elétrons, transformando os radicais em substâncias estáveis são denominados antioxidantes primários. Os antioxidantes pertencentes à classificação de secundários apresentam um gama de ações, como por exemplo, capacidade de ligação com metais (alterando a valência do metal), conversão de espécies radicais em não radicais ou absorção de radiação ultravioleta (UV). A Figura 3 apresenta um exemplo de mecanismo radicalar de um antioxidante primário. R O O + AH R O OH + A (radical) R (radical) + AH RH + A (radical) Figura 3 - Mecanismo radicalar de um antioxidante primário onde ROO (radicalar) e R (radicalar) são radicais livres, AH é um antioxidante com um átomo de hidrogênio e A (radicalar) é um radical. Fonte: Elaborada pelo autor Do ponto de vista químico e estrutural, os antioxidantes são compostos aromáticos que contém, no mínimo, uma hidroxila, podendo ser sintéticos, como por exemplo o butilhidroxianisol (BHA) e o butilhidroxitolueno (BHT), amplamente utilizados pela indústria alimentícia, ou naturais, como por exemplo os organosulfurados, fenólicos (ácido gálico citado anteriormente), flavonóides (catequina citada anteriormente) e os terpenos, constituintes de vários alimentos e plantas. A Figura 4 apresenta as estruturas químicas dos antioxidantes sintéticos BHA e BHT. 37 OH O CH3 CH3 CH3 CH3 OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 Hidroxibutilanisol Hidroxibutiltolueno Figura 4 - Estrutura química dos antioxidantes sintéticos hidroxibutilanisol e hidroxibutiltolueno. Fonte: Elaborada pelo autor O grupo dos polifenóis, considerados antioxidantes de classe primária, incluem os flavonóides e os ácidos fenólicos, comumente encontrados em plantas e atuam como pigmentos de proteção solar, antimicrobianos, repelentes de insetos e antioxidantes. 1.2.3. Aminoácidos Os seres vivos são compostos por inúmeras biomoléculas, das quais as mais abundantes e “importantes” são as proteínas, presentes em todas as partes de uma célula. O conceito de importância dessas magníficas estruturas está justamente no fato de assumirem uma diversidade enorme de funções biológicas no organismo, com propriedades e atividades completamente distintas, atuando nos mais diferentes tecidos e estruturas corporais, como por exemplo, unhas, cabelos, penas de pássaros, músculos e anticorpos, entre outras diversas atuações, desempenhando um papel peculiar e característico. Os aminoácidos são as unidades fundamentais constituintes das proteínas. São moléculas orgânicas nas quais estão ligados, no mesmo átomo de carbono, um átomo de hidrogênio, um grupamento amino, um grupamento ácido carboxílico e uma cadeia lateral R que caracteriza cada aminoácido. Aminoácidos que possuem o grupamento amino e ácido carboxílico ligados no mesmo carbono são denominados 38 de α-aminoácidos e aqueles cujos grupamentos estão ligados em carbonos adjacentes são denominados β-aminoácidos. As estruturas de 16 dos 20 principais aminoácidos estão apresentadas na Figura 5. O NH2 CH3 OH O NH2 OH O NH2 OH NHO NH OH NH2 OH O NH2 N H N OH O N H OH O O NH2 NH2 OH O NH2 CH3 CH3 OH O NH2 OH OH O ONH2 OH OH O NH2 CH3 CH3 OH O NH2 OH CH3OH O NH2 S CH3 OH O NH2 OH OH O NH2 CH3 CH3 OH Alanina Glicina Fenilalanina Arginina Histidina Prolina Asparagina Isoleucina Serina Ác. Aspártico Leucina Treonina Metionina Tirosina Valina O NH2 N H OH Triptofano Figura 5 - Estruturas químicas de 16 dos 20 principais aminoácidos constituintes das proteínas. No retângulo em linha cheia verifica-se um exemplo de cadeia lateral R da molécula de arginina e nos retângulos em linhas tracejadas estão indicadas as estruturas dos aminoácidos utilizados para o estudo apresentado nessa tese. Fonte: Elaborada pelo autor A cadeia lateral, em muitos trabalhos denominada como cadeia lateral R da estrutura do aminoácido (exemplificada pelo retângulo cheio na Figura 5 na molécula da arginina) é que diferencia cada molécula de aminoácido com relação à estrutura química, tamanho, cargas elétricas e solubilidade em meio aquoso, além de conferir diferentes estabilidades devido às interações de hidrogênio, hidrofóbicas e eletrostáticas que mantem as estruturas das proteínas. As estruturas dos 39 aminoácidos utilizados no desenvolvimento de duas metodologias capazes de quantificá-los em amostras de suplementos de academia desenvolvidas nessa tese estão representadas na Figura 5 e destacadas pelos retângulos tracejados. Os aminoácidos presentes em alimentos normalmente encontram-se ligados covalentemente na forma de proteínas através da denominada ligação peptídica. A ligação peptídica é formada através de uma condensação entre o grupamento carboxílico de um aminoácido com o grupamento amino do outro aminoácido. A Figura 6 representa a formação de uma ligação peptídica através da condensação de duas moléculas de glicina. NH2 O OH H R + NH2 O OH H R NH2 CH2 C NH CH2 O OH O Ligação peptídica Figura 6 - Formação de uma ligação peptídica através da condensação de duas moléculas do aminoácido glicina. Fonte: Elaborada pelo autor 1.3. Amostras utilizadas no desenvolvimento e aplicação das metodologias de reflectância difusa com barreira hidrofóbica, infravermelho próximo com quimiometria e análise por imagem digital 1.3.1. Mel As análises nutricionais apresentam-se como um dos campos mais explorados e com elevado desenvolvimento nos últimos anos. Isso se deve principalmente ao fato do significativo crescimento no consumo de alimentos e ao surgimento de novas metodologias capazes de garantir suas qualidades. O mel é um produto de origem animal utilizado como fonte de alimentação e obtido a partir do néctar de plantas e o estudo da sua composição contribui para um aumento na qualidade do produto final e para a saúde dos consumidores (Uthurry et al., 2011). Um crescente número de trabalhos descritos na literatura tem sido relatados evidenciando a importância da matriz mel, cuja capacidade antioxidante possui forte potencial terapêutico (Gorjanovic et al., 2013; Ghedolf, Wang e 40 Engeseth, 2002). Além disso, o fator econômico, de grande relevância, também é um forte contribuinte para a impulsão dos estudos, visto que o consumo de mel é grande em todo o mundo, sendo que somente o Brasil, exportou cerca de 3,76 x 104 kg e 9,20 x 105 kg de méis comuns e orgânicos, respectivamente, para os EUA em janeiro de 2015 (National Honey Report 2015). Um levantamento bibliográfico foi realizado nas principais bases de dados sobre o uso da matriz mel em inúmeras determinações para a produção de trabalhos científicos em revistas de maior circulação. A Figura 7 apresenta o número de trabalhos publicados com a matriz mel em função do ano, considerando o período de 1950 a 2016. Figura 7 - Número de publicações de trabalhos relativos à matriz mel, em função do ano, no período de 1950 a 2016. Fonte: Elaborada pelo autor Através da Figura 7, que apresenta o gráfico de barras verticais para o número de publicações de trabalhos científicos em função do ano relativos à matriz mel é possível verificar um crescente aumento no interesse em se pesquisar os mais 1950 1960 1970 1980 1990 2000 2010 2020 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 N úm er o de p ub lic aç õe s Ano 62 70 126 142 187 546 1086 2294 6239 41 diversos analitos na matriz. Poucos trabalhos foram realizados nas décadas localizadas entre os anos de 1950 a 1990, talvez parte relacionado com a dificuldade em se obter resultados com boa precisão naquela época e por outra parte pelo desinteresse associado à própria matriz, uma vez que se trata de uma matriz que demanda um conhecimento elevado, sendo considerada matriz complexa. Os avanços tecnológicos que foram surgindo a partir do ano de 1990, permitiram um aumento significativo caracterizado pelo número crescente de publicações verificado entre os anos de 2010 e 2016, onde as medidas mais precisas eram obtidas com maior facilidade. Outra justificativa plausível para o crescimento acelerado do número de publicações que envolvem a matriz mel, além do crescente interesse pela matriz que apresenta importante fator alimentício e econômico, está no fato de com o passar dos anos ter surgido a necessidade do desenvolvimento de metodologias que atingissem os mesmos objetivos que as metodologias tradicionais, porém mais simples, rápidas e com baixo consumo de reagentes. 1.3.2. Café O café é uma das bebidas mais consumidas em todo o mundo e detém a segunda posição no International Trade Marks (Mussato et al., 2011; Ramalakshmi et al., 2011). De janeiro a dezembro de 2015, o café apresentou uma porcentagem de 7 % das exportações associadas ao agronegócio brasileiro, ocupando a 5ª posição, com valor estimado em 6,16 bilhões de dólares ou 37,1 milhões de sacas de 60 kg, com exportações voltadas principalmente para os mercados do Estados Unidos, Alemanha, Itália, Japão e Bélgica. O ano de 1960 foi importante e considerado um marco relevante para a cafeicultura brasileira, que passou então por uma importante reforma, atravessando uma extensa linha, passando de uma atividade econômica pioneira, extrativista e de relevante sentido histórico para um modelo tecnológico com olhos voltados principalmente para a produtividade (Silva et al., 2014). Um novo sistema de produção e comercialização foi criado através da entrada de novas variedades e do fornecimento de nutrientes através da utilização de adubos, o que por um lado, beneficiou a produção e redução de custos, porém por outro, prejudicava a qualidade do produto brasileiro no mercado internacional. 42 Ainda segundo Silva et al., 2014, a evolução do conhecimento científico com relação às mudanças da qualidade do café não acompanhou o desenvolvimento tecnológico desenfreado, uma vez que a matriz café apresenta uma alta complexidade e também pela falta de sistemas analíticos capazes de verificar quali e quantitativamente o que era analisado de modo sensorial. A questão científica também mostrava-se “fraca” e insuficiente para a determinação de todos os aspectos que envolviam as caracterizações das amostras de café, pois eram capazes de relacionar apenas alguns parâmetros e aspectos com a qualidade do produto. A Figura 8 apresenta o número de trabalhos publicados com a matriz café em função do ano, considerando o período de 1950 a 2016. Figura 8 - Número de publicações de trabalhos relativos à matriz café, em função do ano, no período de 1950 a 2016. Fonte: Elaborada pelo autor O café é considerado um produto valioso tanto do ponto de vista alimentício como econômico. O Brasil detém números elevados de produção e comercialização 1950 1960 1970 1980 1990 2000 2010 2020 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 N úm er o de p ub lic aç õe s Ano 55 85 162 242 437 808 1257 4291 5690 43 mundial dos mais diferentes tipos de café. O país, com uma diversidade enorme de regiões ocupadas pela produção de café, produzindo tipos variados do produto, possibilita o atendimento da demanda mundial em diferentes escalas, englobando o paladar e os preços de cada produção e tipo do produto. Um conceito importante no campo da cafeicultura é o chamado blend de café, baseados em cafés naturais, despolpados, descascados, ácidos e aromáticos, além de outras características. Segundo o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, em 2015 foram disponibilizados créditos e recursos para o setor cafeeiro que ultrapassaram o valor de R$ 4,136 bilhões de reais, destinados ao custeio, estocagem, aquisição do café, capital de giro, entre outros, fator que justifica a necessidade do desenvolvimento de metodologias capazes de realizar medições analíticas para manter a qualidade dos mais diferentes tipos de café, uma vez que trata-se de um produto de alto valor agregado. Outros importantes fatores corroboram para a necessidade de novas metodologias e justificam a importância do desenvolvimento de técnicas analíticas voltadas para o produto café. O Brasil é considerado o maior produtor e exportador mundial de café, e com relação ao consumo do produto está na segunda posição, apresentando atualmente, 2,25 milhões de hectares em campos cafeeiros, 287 mil produtores (mini e pequenos), distribuídos por 15 estados brasileiros, sendo que o cultivo está majoritariamente nos estados de Minas Gerais, São Paulo, Espírito Santo, Bahia, Rondônia, Paraná e Goiás, correspondendo a aproximadamente 98,7 % de toda a produção nacional. 1.3.2.1. Café Arábica e Robusta (duas principais variedades de café) Por apresentar condições favoráveis ao cutivo dos mais variados tipos de café, o Brasil apresenta 15 regiões produtoras, variando o tipo desde o norte até o sul do país. A qualidade e aroma de cada tipo de café está intrinsicamente ligado ao clima, tipo de solo e altitude das regiões produtoras, das quais as que mais se destacam são arábica e robusta, com grande variedade de linhagens. O café do tipo arábica (Coffea arabica L.), associado ao paladar mais fino do consumidor, permite uma degustação mais elaborada do produto, com requinte e 44 maior qualidade. Esse tipo de café é originalmente produzido na região oriente do globo e se adapta facilmente em altitude acima de 800 m, predominando no Brasil, nas lavouras de Minas Gerais, Rio de Janeiro, Bahia, São Paulo, Paraná e parte do Espírito Santo. O café do tipo robusta (Coffea Canephora), também conhecido como café conilon, é utilizado como matéria prima na fabricação de cafés solúveis, com aroma e sabor únicos, teor maior de cafeína e menor acidez, quando comparado ao café arábica. No Brasil é predominantemente cultivado em regiões do Espírito Santo, Rondônia e partes de Minas Gerais e Bahia. 1.3.3. Suplementos alimentares de academia Ultimamente o uso de suplementos dos mais diversos tipos tem crescido entre os jovens por todo o mundo. Uma vez embutido na cabeça dos jovens que a utilização desses suplementos acarreta benefícios ao organismo e em conjunto com academias que favorecem a disseminação de padrões estéticos, a situação torna-se complicada e fora de controle. É exatamente nesse contexto que se insere a importância dos estudos realizados com relação à essa matriz, sejam estudos de quantificação ou adulteração, pois o uso desenfreado e crescente de suplementos faz com que cada vez mais jovens estejam expostos a agentes contaminantes, no caso da adulteração, ou estejam consumindo um produto cujo rótulo informa erroneamente a composição e seus valores, no caso da quantificação. Hirschbruch et al. (2008) desenvolveram um trabalho onde estudaram o consumo de suplementos por jovens frequentadores de academia na cidade de São Paulo e encontraram o seguinte resultado com relação à distribuição dos suplementos consumidos por usuários, representado na Figura 9. 45 Figura 9 - Distribuição (em % de citações) dos suplementos consumidos por usuários. Fonte: Elaborado pelo autor Atualmente, o cenário mostra-se equilibrado com anos anteriores, porém o aumento elevado na utilização e consumo desses produtos tem aumentado o interesse em seus estudos. A Figura 10 apresenta o número de trabalhos publicados com a matriz suplementos alimentares em geral em função do ano, considerando o período de 1950 a 2016. "Fat-burner" Vitaminas minerais Hipercalórico Maltodextrina Proteína Aminoácidos Creatinina BCAA Gel de carboidrato Bebida de recuperação Bebida esportiva 0 5 10 15 20 25 30 35 % (citações) S up le m en to s 46 Figura 10 - Número de publicações de trabalhos relativos à matriz suplementos, em função do ano, em uma faixa de tempo de 1950 a 2016. Fonte: Elaborada pelo autor Através da Figura 10, que representa o número de publicações apresentados na literatura com relação à matriz suplementos para uma pesquisa realizada em um intervalo de tempo de 1950 a 2016, é possível verificar que o número de trabalhos que utilizam a matriz suplementos de alguma forma nos estudos apresenta-se elevado desde tempos mais antigos (ano de 1950), quando comparado com outras matrizes, incluindo aquelas também estudadas no decorrer dessa tese. Nos últimos anos, como relata Hirschbruch et al. (2008), tem sido verificado um aumento significativo no uso dos mais diversos tipos de suplementos, verificado também pelo crescente aumento no interesse dos estudos relacionados a esse tipo de matriz (aumento verificado a partir do ano de 2000). Considerando o número de publicações em 2000, verifica-se que nesse ano ainda há um aumento de 47,2 % no número de publicações comparando com todas as publicações desde 1950 até 1950 1960 1970 1980 1990 2000 2010 2020 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 7388 8259 5474 2575 659529 280 164 N úm er o de p ub lic aç õe s Ano 117 47 1990, indicando que o interesse por esse tipo matriz tende a apresentar um crescimento elevado, verificado nos anos subsequentes. 48 CAPÍTULO II – CONSIDERAÇÕES GERAIS ESPECTROSCOPIA DE REFLECTÂNCIA DIFUSA EM PAPEL COM BARREIRA HIDROFÓBICA INFRAVERMELHO PRÓXIMO E QUIMIOMETRIA ANÁLISE POR IMAGENS DIGITAIS 49 2.1. Espectroscopia de Reflectância Difusa em papel com barreira hidrofóbica No passado, a utilização da espectroscopia de reflectância difusa apresentava uma limitação em comparação com outras espectroscopias, como por exemplo de absorção, pois apresentava baixa precisão das medidas, fato que não haviam muitos estudos utilizando a técnica, sendo considerada inviável para análises quantitativas (Kealey, 1972). Posteriormente, com o desenvolvimento de inúmeros instrumentos analíticos, como esferas de reflectância e fibras ópticas, foi possível a aplicação da técnica em análises quantitativas com maior precisão de resultados (Narayanaswamy, 1993; Tubino, Rossi e Magalhães, 1997). Esse avanço na instrumentação ótica propiciou a utilização da técnica de espectroscopia de reflectância difusa em análises quantitativas e observa-se que seu uso tem aumentado com o tempo, apresentando grande importância no campo da química analítica quantitativa, pois permite a associação com dispositivos de spot test (Ghauch et al.,1999). A técnica de espectroscopia de reflectância difusa tem por base a medida da radiação refletida (RF) quando a radiação atinge uma superfície irregular, como por exemplo, um papel de filtro, composta por duas componentes da radiação: a especular e a difusa (Ghauch et al., 2000). A interação entre o feixe de luz incidente e a superfície a qual incide é considerada um processo complexo, pois o tipo de componente que será associada é dependente e intrinsicamente ligado ao tipo de superfície a qual incide. A reflexão especular ocorrerá em uma superfície plana, com ângulos de incidência e reflexão idênticos (Wendlant e Hecht, 1966), porém como a maioria das superfícies apresenta certa irregularidade ou até mesmo planaridade orientada em diferentes ângulos, a radiação é então refletida em diversos ângulos, caracterizando a reflexão difusa. Após penetrar o interior do sólido, a radiação incidente provoca a reflexão difusa, que volta à superfície após sofrer múltiplas absorções e reflexões devido às inúmeras partículas presentes no sólido (Wendlant e Heicht, 1966). Inúmeros modelos foram desenvolvidos para correlacionar a intensidade da radiação difusa com uma possível determinação analítica quantitativa. O modelo de Kubelka-Munk é o que melhor descreve a espectroscopia de reflectância difusa dentre todas as teorias existentes, considerando que para soluções diluídas o 50 coeficiente de absorção molar varia linearmente com a concentração do analito (Tubino e Queiroz, 2007). Essa teoria correlaciona o coeficiente de absorção molar, coeficiente de dispersão e poder de reflectância em um meio infinitamente fino de acordo com a equação: 𝑓 (𝑅) = (1−𝑅)2 2𝑅 = 𝑘 𝑠 (Equação 1) onde: k = coeficiente de absorção molar; s = coeficiente de dispersão. Para soluções diluídas, o valor de k está associado com a absortividade molar (ε) e à concentração (C) do analito através da relação: 𝑘 = 2,303 𝑥 𝜀 𝑥 𝐶 (Equação 2) A aplicação da segunda equação fornece uma relação linear entre a concentração do analito e a função f (R), considerando concentrações altas do analito, ao passo que para concentrações baixas, além de não propiciar boa sensibilidade, pode haver um desvio de linearidade (Ghauch et al., 1999). Antes da determinação da reflectância da amostra, é necessário a determinação da reflectância absoluta do material utilizado como referência (Reinecke et al., 1988). Diversos modelos têm sido desenvolvidos para as análises quantitativas que associam as transformações matemáticas da variável dependente (concentração) com o sinal analítico. Nas medidas de reflectância são obtidos os sinais da radiação refletida (RF), análoga à transmitância (T) e por consequência pode ser associada à absorbância (A). 𝐴 = log( 1 𝑅 ) (Equação 3) Assim, o tratamento dos resultados obtidos através de medidas por reflectância difusa, é semelhante aos dados obtidos por absorbância (Equação 3), sendo os gráficos de absorbâncias construídos como função direta da concentração do analito ou de seu logarítimo (Tubino, Rossi e Magalhães, 1997). 51 2.1.1. Espectros de reflectância difusa Os espectros de reflectância difusa podem ser obtidos a partir de diferentes softwares e maneiras. Os gráficos espectrais mais comuns são dados em R (%) ou AR (equação 3), distribuídos em função da faixa de comprimento de onda selecionada previamente. A Figura 11 apresenta os espectros obtidos para um mesmo produto reacional (reação entre aminoácidos e ninidrina, na presença de tampão pH 4,75) obtidos do mesmo equipamento para medidas de reflectância (λ= 525 nm). Figura 11 - Espectros de reflectância obtidos a partir da reação entre aminoácidos e ninidrina em pH 4,75. Fonte: Elaborada pelo autor 2.1.2. Instrumentação Em geral, os instrumentos de reflectância difusa apresentam a mesma constituição, sendo ela: suporte para a amostra ou padrão, a esfera de integração 52 composta por espelhos, uma fonte de luz, o detector e um computador de registro. A Figura 12 apresenta internamente um acessório de reflectância modelo RSA-HP-53. Figura 12 - Vista superior do acessório de reflectância Labsphere modelo RSA-HP-53. Fonte: Elaborado pelo autor A função da esfera de integração é a coleta e integração de toda a radiação refletida por uma superfície. Logo, a intensidade de radiação refletida em quaisquer partes da esfera trata-se de uma medida total da radiação refletida pela esfera de integração, independente da posição e localização da fonte de radiação (Wendlandt e Hecht, 1996). As esferas de integração são variadas, porém uma característica em comum todas devem apresentar: revestimento interno por uma camada de material altamente refletor. Em tempos mais antigos, eram produzidas com material metálico revestido de tinta branca comum ou pós de MgO ou BaSO4. Atualmente os materiais utilizados para o revestimento são de politetrafluoroetileno (PTFE) ou termoplásticos (Spectralon®) (Storm e Springsteen, 2006). 2.1.3. A espectroscopia de reflectância difusa Diversos métodos por espectroscopia de reflectância difusa estão relatados na literatura. Um levantamento bibliográfico foi realizado nas principais bases de dados sobre métodos analíticos publicados em revistas científicas de vários impactos de circulação utilizando a espectroscopia de reflectância difusa. A Figura Esfera de integração Feixe de luz Espelho Suporte de referência Suporte de amostra Lâmpada 53 13 apresenta o número de trabalhos publicados utilizando a técnica de reflectância difusa em função do ano, considerando o período de 1970 a 2016. Pesquisas realizadas antes desse período não apresentaram trabalhos publicados. Figura 13 - Número de publicações de trabalhos relativos à técnica de reflectância difusa, em função do ano, em uma faixa de tempo de 1970 a 2016. Fonte: Elaborada pelo autor Pode-se observar através da Figura 13 que as publicações apresentam um perfil crescente desde 1970 até o ano de 2016, indicando a difusão do conhecimento com relação à técnica de reflectância difusa. A partir do ano de 1970, quando ocorreu o surgimento de novos acoplamentos com a técnica e com o advento de esferas de integração e fibras ópticas, verifica-se o acompanhamento do interesse em se utilizar uma ténica de menor custo e que permite a determinação do analito com precisão e menor geração de resíduos. Dentre os trabalhos descritos na literatura verifica-se a aplicação da técnica nas mais diversas áreas, podendo-se citar, por exemplo, alguns trabalhos como o método descrito por Meenakshi e Sivasamy (2017) utilizou a técnica espectroscopia de reflectância difusa para a caracterização e determinação da energia de gap do 1970 1980 1990 2000 2010 0 200 400 600 800 N úm er o de p ub lic aç õe s Ano 5 19 36 90 167 405 840 54 fotocatalisador sintetizado com nanorods de óxido de zinco utilizados em atividade fotocatalítica para auxiliar a degradação do composto 2,4 D (ácido diclorofenoxiacético). Os resultados obtidos pelos autores mostraram uma forte absorção em comprimento de onda abaixo de 400 nm e um valor absoluto de 3,2 eV para o band gap do composto sintetizado, confirmando a atividade do fotocatalisador nas regiões UV-VIS do espectro eletromagnético. O trabalho desenvolvido por Rossini et al. (2016) apresentou o desenvolvimento de uma nova metodologia ambientalmente amigável para a determinação do corante amaranto em alimentos utilizando a espectrosocopia de reflectância difusa. Os resultados apresentaram uma boa linearidade (r = 0,999) e uma faixa linear de trabalho de 1,13 x 10-6 a 1,25 x 10-5 mol L-1, com os sinais de absorbância em função da raiz quadrada da concentração do analito. Santos e Santos (2016) desenvolveram um método de análise direta de taninos totais encapsulados em matriz de sílica através da técnica de reflectância difusa. O trabalho evidenciou a boa aplicabilidade da técnica como uma ferramenta de quantificação de taninos na matriz sílica, indicando que a técnica seria de grande potencial alternativo para essa aplicação. Além das infinitas aplicações que a técnica de reflectância difusa proporciona, também tem oferecido a possibilidade de construção em laboratório de dispositivos portáteis para análises quantitativas (Matias, Oliveira e Moschim, 1997; Matias, Vila e Tubino, 2003). Matias, Oliveira e Moschim (1997) desenvolveram um sensor de fibra ótica portátil utilizado para a análise da fumaça de motores de veículo a diesel, no qual o sensor atua por amostragem da fumaça em uma fita branca de caráter adesivo e após a impregnação na fita é realizada a medida da luz refletida pela fita marcada. Um outro trabalho desenvolvido por Matias, Vila e Tubino (2003) determina o teor de Ni (II) em catalisadores através da reação de Ni (II) com dimetilglioxima, em meio de NH4OH e o teor determinado através da medida de resistência por um multímetro, correlacionada posteriormente com o sinal de reflectância. Através dos mais diversos estudos verifica-se que a espectroscopia de reflectância difusa apresenta resultados confiáveis no campo da química analítica quantitativa, com alto potencial e promissora para análises. A Tabela 1 apresenta outros trabalhos que aplicam a técnica de reflectância difusa. 55 Tabela 1 - Características de alguns trabalhos encontrados na literatura empregando a técnica de reflectância difusa. Aplicação Comprimento de onda de máxima absorção (λmáx) Referência Estudo de radiólise do polipropileno 350 nm Zagorski e Rafalski (1996) Estudo da degradação foto-induzida do TLB 355 nm Habibi e Askari (2013) Determinação de arsênio em nível traço na matriz água 400 nm Bradley et al. (2011) Determinação de cobre (II) em whisky e cachaça 559 nm de Sousa et al. (2016) Quantificação dos constituintes da bauxita e minérios de ferro 300 – 2500 nm (trabalho realizado com espectros infravermelhos e modelos quimiométricos Carioca et al. (2011) Determinação de furosemida 477 nm Luiz et al. (2013) 2.1.4. Barreiras hidrofóbicas O papel é extensivamente utilizado em química analítica e em análises clínicas, como por exemplo para separar e identificar misturas de pequenas moléculas, aminoácidos, proteínas e anticorpos (Cate et al., 2013; Bruzewicz, Reches e Whitesides, 2008; Martinez et al., 2008). Recentemente, o papel como suporte sólido tem sido utilizado de diferentes formas no âmbito analítico, proporcionando aplicações com diferentes focos e voltadas a amplificar a sensibilidade dos sinais analíticos obtidos até então e nessas derivações encontram-se os denominados PAD’s (paper-based analytical device) e barreiras hidrofóbicas comuns. As barreiras hidrofóbicas são os padrões e chaves de acesso para a produção do PAD’s. Atualmente, a utilização de barreiras hidrofóbicas associadas aos spot test tem se tornado uma importante e promissora aplicação, na qual a impressão em cera realizada através de uma impressora é utilizada para a produção das barreiras hidrofóbicas e suas principais vantagens incluem o fato do tempo necessário para o aquecimento e a respectiva temperatura estar condicionados ao tipo e espessura do papel utilizado. A formação das barreiras hidrofóbicas se dá pela impressão de uma 56 camada de cera sobre o papel e após a impressão a aplicação de um tratamento envolvendo calor a uma temperatura de 150 ºC durante 5 minutos, para que a cera possa impregnar no interior do suporte sólido e limite a região espacial através da barreira hidrofóbica formada (Carrilho, Martinez e Whitesides, 2009; Washburn, 1921). O uso de impressora de cera para a produção das barreiras hidrofóbicas é justificado pelo fato deste tipo de impressora apresentar um processo de deposição muito preciso, possibilitando o controle do volume de reagentes com um nível de exatidão da ordem de picolitros (Brunahl e Grishin, 2002; Sekitani et al., 2008). Sistemas microfabricados tem adquirido atenção especial na área de química analítica. As vantagens associadas à essa nova tendência instrumental variam desde o baixo consumo de amostras até a capacidade de integração de múltiplas etapas analíticas em um único sistema, incluindo portabilidade e baixo tempo para a finalização da análise. Os suportes s