UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA Francisella noatunensis orientalis EM TILÁPIAS (Oreochromis niloticus) CULTIVADAS EM TANQUES-REDE NA BACIA HIDROGRÁFICA DO RIO ARAGUARI – MINAS GERAIS FERNANDA RAGHIANTE Botucatu - São Paulo Junho/2016 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA Francisella noatunensis orientalis EM TILÁPIAS (Oreochromis niloticus) CULTIVADAS EM TANQUES-REDE NA BACIA HIDROGRÁFICA DO RIO ARAGUARI – MINAS GERAIS FERNANDA RAGHIANTE Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Medicina Veterinária – Área de Saúde Animal, Saúde Pública Veterinária e Segurança Alimentar, como critério para obtenção do título de Doutor. Prof. Dr. Germano Francisco Biondi (Orientador) Dr. Otávio Augusto Martins (Co-Orientador) Botucatu - São Paulo Junho/2016 ii Doutoranda: Fernanda Raghiante Título: Francisella noatunensis orientalis em tilápias (Oreochromis niloticus) cultivadas em tanques-rede na bacia hidrográfica do rio Araguari – Minas Gerais COMISSÃO EXAMINADORA ______________________________ Dr. Otávio Augusto Martins Presidente e Co-orientador Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – Botucatu – SP ______________________________ Prof. Dr. Luiz Carlos de Souza Titular Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – Botucatu – SP ______________________________ Prof. Dr. Paulo Francisco Domingues Titular Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – Botucatu - SP iii ______________________________ Prof. Dr. Noé Ribeiro da Silva Titular Universidade Federal de Uberlândia Diretor de ensino, Pesquisa e Extensão da Fundação de Excelência Rural de Uberlândia ______________________________ Prof. Dr. Edson José Fragiorge Titular Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Do Triângulo Mineiro – Campus Uberlândia. Prof. Dr. Jean Guilherme Fernandes Joaquim Suplente Unidade Técnica Regional de Agricultura Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento – Botucatu – SP. Dra. Anee Valéria Mendonça Stachissini Suplente Unidade Técnica Regional de Agricultura Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento – Botucatu – SP. Dra. Marianna Vaz Rodrigues Suplente Departamento de Medicina Veterinária Universidade Paulista – UNIP – Bauru – SP. Data de defesa: 07 de junho de 2016. iv Dedico esse trabalho aos meus amados filhos, Enrico e Lorenzo. É por vocês que vivo...é por vocês que cheguei até aqui! v AGRADECIMENTOS A Deus por me amparar nos momentos difíceis, me dar força interior para superar as dificuldades e mostrar o caminho nas horas incertas. Ao meu amado esposo, Rodrigo, meu especial agradecimento pelo carinho e amor com que sempre cuida da nossa família, em especial na minha ausência; pelo amor e apoio incondicional em todos os momentos, estando ao meu lado e me dando força do início ao fim desse nosso trabalho. Aos meus filhos, Enrico e Lorenzo, que à sua maneira compreenderam e aceitaram a minha ausência, me acompanharam nas vezes que moramos em Botucatu e se adaptaram de forma surpreendente a uma nova rotina, a um novo clima, sem nunca questionarem, apenas me fazendo sorrir. Aos meus pais, Lourival e Fátima, meus agradecimentos por todo apoio e incentivo durante toda minha vida, e sobretudo, nos momentos mais difíceis nos últimos três anos, suprindo minhas necessidades e ausências junto aos meus filhos e permitindo que me dedicasse à finalização do meu trabalho. Ao professor e orientador Dr. Germano Francisco Biondi, pela amizade, confiança e por mais uma vez abrir as portas da UNESP para que eu pudesse me aperfeiçoar e continuar crescendo em minha profissão. Ao meu amigo e co-orientador, Dr. Otávio Augusto Martins, pelo apoio e valiosa contribuição nos momentos finais dessa trajetória. Exemplo de ética, caráter e sabedoria que levarei sempre comigo, junto à minha profissão. A você, nossa (minha e de minha família) eterna gratidão! Ao Professor Dr. João Pessoa Araújo Júnior do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biociências de Botucatu - UNESP que possibilitou o suporte financeiro à execução do projeto junto ao Laboratório do Instituto de Biotecnologia – UNESP. Ao diretor executivo, Professor Dr. Celso Luis Marino, do Instituto de Biotecnologia – UNESP – Campus de Botucatu que permitiu gentilmente a utilização dos laboratórios para a execução do projeto. À Dra. Marianna Vaz Rodrigues, pela fundamental contribuição na execução do projeto, pelos valiosos ensinamentos e por humildemente compartilhar de seus conhecimentos de forma memorável. Aos colegas da Pós-graduação, em especial a Marina de Mattos Ferrasso e seu namorado João Pedro, pela amizade e pela imensurável ajuda e suporte em diversos momentos no final dessa trajetória. Ao meu grande amigo Aguinaldo Marques (Pena) e sua amável esposa, Vera, pelo carinho e apoio em todos os momentos que estive em Botucatu. Levarei sua amizade comigo por toda vida! Aos meus amigos Elaine Alves dos Santos e Rodrigo Faria Sousa Pereira pela amizade sincera e pela disposição em ajudar, sem medirem esforços. vi LISTA DE TABELAS Página TABELA 1. Primers utilizados para pesquisa de Francisella noatunensis orientalis 34 TABELA 2. Média ± erro padrão da massa corpórea (g) e do comprimento (cm) de Oreochromis niloticus machos e fêmeas. Análise estatística complementado com o Teste Kramer-Tukey (p<0,05) 36 TABELA 3. Associação entre a presença de Francisella spp. e sexo e comprimento das tilápias (Oreochromis niloticus) analisadas 38 TABELA 4. Porcentagem (%) da lesão macroscópica e da confirmação laboratorial da presença de Francisella spp. pela qPCR em baço de tilápias machos e fêmeas 38 TABELA 5. Valores de threshold cycle e temperatura de melting das amostras positivas e dos controles positivo e negativo para Francisella spp. realizado pela qPCR 39 TABELA 6. Distribuição e prevalência de amostras de baço de Oreochromis niloticus positivas para Francisella spp. pelo método de qPCR nos frigoríficos da região da bacia hidrográfica do rio Araguari, Minas Gerais, Brasil 40 vii LISTA DE FIGURAS Página FIGURA 1. Oreochromis niloticus 5 FIGURA 2. Tilapia rendalli 6 FIGURA 3. Oreochromis aureus 7 FIGURA 4. Oreochromis urolepis hornorum 7 FIGURA 5. Oreochromis mossambicus 8 FIGURA 6. Tanques escavados 10 FIGURA 7. Tanque escavado com proteção contra predadores naturais 10 FIGURA 8. Tanque-rede 12 FIGURA 10: Baço de tilápia com lesões sugestivas de Francisella spp. 17 FIGURA 11: Baço hipertrofiado com lesões granulomatosas 17 FIGURA 12. Alterações em tecidos de tilápias experimentalmente infectadas com Francisella noatunensis orientalis. (A). Granuloma (g) em na porção anterior de rim com predominância de macrófagos epitelióides pálidos e vacuolizados. Granulomas com núcleos escurecidos representam dissociação de linfócitos. (B) Granuloma (g) na porção posterior com túbulos renais deslocados perifericamente (setas) 18 FIGURA 13. Representação esquemática das fases da qPCR. = amostra com DNA alvo; = amostra controle; Rn = intensidade do sinal fluorescente; (a) linear; (b) exponencial inicial; (c) logarítmica linear; (d) platô 24 FIGURA 14. Representação esquemática da variação linear de amplificação conforme o número de cópias de DNA obtidas pela qPCR 25 FIGURA 15. Vista da bacia hidrográfica do Rio Araguari na mesorregião do Triângulo Mineiro, a uma distância aproximada de 207,07 Km 32 FIGURA 16. Porcentagem (%) de lesões observadas nas tilápias (Oreochromis niloticus), presentes nos frigoríficos A, B e C, localizados na bacia hidrográfica do rio Araguari, Minas Gerais, Brasil 37 FIGURA 17. Ponto de amplificação das 6 amostras positivas de baço de tilápias na qPCR para Francisella spp. em comparação com o controle positivo Francisella noatunensis orientalis. 39 FIGURA 18. Curva de Melting para as 6 amostras positivas de baço de tilápias comparadas ao controle positivo Francisella noatunensis orientalis. 40 viii SUMÁRIO CAPÍTULO 1: Tese Página RESUMO ........................................................................................................... 1 ABSTRACT........................................................................................................ 2 INTRODUÇÃO .....................................................................................................3 1. REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................... 5 1.1 Espécies de tilápias ............................................................................. 5 1.2 Situação do cultivo de tilápias no Brasil ............................................... 9 1.3 Sistemas de cultivo .............................................................................. 9 1.3.1 Tanques escavados ..................................................................... 9 1.3.2 Tanques-rede ............................................................................. 11 1.4 Francisella spp .................................................................................. 14 1.4.1 Patogenia ................................................................................... 16 1.4.2 Sinais clínicos ............................................................................. 18 1.4.3 Epidemiologia ............................................................................. 19 1.4.4 Diagnóstico................................................................................. 21 1.4.4.1 PCR .................................................................................... 22 1.4.4.2 qPCR................................................................................... 23 1.4.4.3 Sequenciamento ................................................................. 26 1.5 Prevenção e controle da franciselose ................................................ 27 1.6 Produção ........................................................................................... 30 2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS ................................................................... 30 3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 31 3.1 Número de amostras ......................................................................... 31 3.2 Amostras ........................................................................................... 32 3.3 Identificação de Francisella spp por qPCR ........................................ 33 3.3.1 Extração de DNA ........................................................................ 33 ix Página 3.3.2 qPCR .......................................................................................... 34 3.4 Sequenciamento ................................................................................ 35 3.5 Análise estatística .............................................................................. 36 4. RESULTADOS............................................................................................. 36 5. DISCUSSÃO ................................................................................................ 41 6. CONCLUSÃO .............................................................................................. 45 7. REFERÊNCIAS ........................................................................................... 45 CAPÍTULO 2: Artigos Científicos Journal of Fish Diseases: Authors Guidelines 67 Artigo: Prevalence of Francisella spp. in Oreochromis niloticus cultivated in cages system 80 Revista Brasileira de Higiene e Sanidade Animal: Normas para publicação 104 Artigo: Francisella spp. em tilápias no Brasil: uma revisão 112 Hepatomegalia e esplenomegalia em Oreochromis niloticus cultivadas em sistema de tanques-rede 132 x CAPÍTULO 1: TESE Francisella noatunensis orientalis EM TILÁPIAS (Oreochromis niloticus) CULTIVADAS EM TANQUES-REDE NA BACIA HIDROGRÁFICA DO RIO ARAGUARI – MINAS GERAIS RESUMO A franciselose em peixes podem causar sérias perdas econômicas aos produtores. Os objetivos dessa pesquisa foram estimar e identificar a prevalência de Francisella noatunensis orientalis em Oreochromis niloticus cultivadas em tanques-rede na bacia hidrográfica do rio Araguari – Minas Gerais – Brasil. Foram coletadas aleatoriamente 150 amostras de baço de Oreochromis niloticus oriundas de cultivos em tanques-rede localizados em reservatórios de hidrelétricas localizadas na bacia hidrográfica do rio Araguari - Minas Gerais, Brasil e abatidas em três frigoríficos distintos. Foram mensurados o comprimento padrão (cm) e a massa corpórea (g) dos peixes. Antes da coleta do baço, foi identificado o sexo dos peixes. O baço foi utilizado para identificar a Francisella spp. pelo método de qPCR. As fêmeas apresentaram uma massa corpórea e um comprimento padrão menores significativamente (p<0,0001) quando comparados com os machos. Não foi observada relação significativa entre essas variáveis com a presença da bactéria (p>0,05). Os resultados da qPCR identificaram a Francisella spp. em seis amostras, correspondendo a prevalência de 4 %. Dessas, duas foram encaminhadas para a realização do sequenciamento do gene iglC pertencente à região 16S do RNA ribossômico, o qual identificou a presença de Francisella noatunensis orientalis em ambas. Esse achado de prevalência pode levar à instauração, por parte dos órgãos governamentais, de condutas de vigilância dos casos de franciselose no país, devido às importantes perdas econômicas geradas por seu agente etiológico. Palavras-chave: franciselose, diagnóstico, qPCR, sanidade aquícola. 2 ABSTRACT Francisellosis in fishes can cause serious economic losses to producers. The aims of this research were to estimate and verify the prevalence of Francisella noatunensis orientalis in Oreochromis niloticus grown in cages system in Araguari river hydrographic basin – Minas Gerais state – Brazil. It was collected, randomly, 150 spleen samples of Oreochromis niloticus derived crops in cages located in hydroelectric reservoirs placed in Araguari river hydrographic basin – Minas Gerais state – Brazil, from three different slaughterhouses. It was measured the fishes standard lenght (cm) and the body mass (g). Before the collection of the spleen, the gender of the fishes was identified. The spleen was used to identify the Francisella spp. by qPCR method. The female showed a body mass and significantly smaller standard lenght (p<0,0001) when compared with males. It was not observed a significant relationship between these variables with the presence of bacterium (p>0,05). The qPCR results identified Francisella spp. in six samples, representing a prevalence of 4 %. From these, two were directed to the achievement of the sequencing of the gene iglC belonging to the 16S ribosomal RNA identified the presence of Francisella noatunensis orientalis on both. This prevalence finding may lead to the establishment, from government departments, monitoring behavior of francisellosis cases in Brazil, due to major economic losses generated by its etiological agent. Key words: francisellosis, diagnosis, qPCR, aquaculture health. 3 INTRODUÇÃO A aquicultura, uma arte milenar de origem asiática, é traduzida na atualidade como a atividade do setor primário mais promissora a atender a deficiência de nutrição da população global. Isso se deve não apenas ao fato de fornecer proteína animal de qualidade, mas também por ser uma forma de reduzir a pobreza pela geração de oportunidades de trabalho para pessoas de baixa qualificação profissional nos ambientes rurais e urbanos (ROCHA; RODRIGUES, 2015). Nas últimas cinco décadas, a produção global de peixes provenientes tanto de pesca extrativa quanto da aquicultura tem aumentado, sendo a China o maior produtor mundial de pescado (FAO, 2014). Nesse contexto, o Brasil ocupa o 17º lugar no ranking em aquicultura e a 25ª posição na pesca extrativista (BRASIL, 2010). Em relação apenas à produção continental, o Brasil encontra-se em 9º lugar, chegando a produzir 388.700 toneladas, equivalente a 0,9 % da produção total, enquanto que a China é líder absoluta com uma produção de 24.817.311 toneladas, o que corresponde a 60,1 % da produção de peixes mundial em continente (FAO, 2015a). O Brasil possui um relevante potencial para o desenvolvimento da aquicultura em suas diversas regiões, cada qual com sua especificidade produtiva. Nos parques aquícolas continentais brasileiros os peixes mais cultivados são: tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), tambaqui (Colossoma macropomum), pacu (Piaractus mesopotamicus) e pirapitinga (Piaractus brachypomus) (BRASIL, 2016). O Estado de Minas Gerais é o segundo maior produtor de tilápias da região sudeste, atrás apenas do estado de São Paulo (BRASIL, 2011). Na região do Triângulo Mineiro - Minas Gerais - Brasil, não há estimativa do volume de produção de tilápias, uma vez que 90 % dos piscicultores atuam na ilegalidade (BRASIL, 2016). Essa falta de fiscalização gera desinformação referente a possíveis patógenos que podem estar presentes nesses cultivos. O pescado ainda não ocupa papel de destaque da produção de proteína animal no Brasil. O consumo de peixes recomendado pela OMS é de 12 quilogramas/habitante/ano sendo que a população brasileira consome 14,5 4 enquanto o consumo per capita mundial é de 19,2 quilogramas/habitante/ano (FAO, 2014; BRASIL, 2015a). A tilápia do Nilo é a principal espécie cultivada no Brasil, devido principalmente à sua precocidade, fácil adaptação a diversos tipos de ambiente e sistemas de criação, excelentes taxas de crescimento e ótima aceitação pelo consumidor (TAVARES; PALHARES, 2011; KUBITZA et al., 2012). Além disso, a carne de tilápia é muito apreciada, por ser saborosa, com baixo teor de gordura (0,9 %) e de calorias (172 Kcal/100 g de carne). Outra vantagem é o fato desse peixe apresentar um rendimento de filé em torno de 30 % a 40 %, o que o torna bastante interessante para industrialização (NOGUEIRA; RODRIGUES, 2007). A espécie O. niloticus apresenta um bom desempenho em sistemas intensivos de produção e vem se adaptando com sucesso a cultivos em tanques- rede (FURLANETO et al., 2006). Esse sistema de criação de peixes tem sido uma ótima alternativa para aproveitamento dos ambientes aquáticos inexplorados, dispensando o desmatamento e evitando problemas com erosão e assoreamento (CARDOSO et al., 2005). Um dos grandes entraves da aquicultura é a densidade populacional em relação à área de criação, pois propicia maiores concentrações de matéria orgânica, desenvolvimento de algas e outros micro-organismos que causam impacto ambiental e nos animais. A criação em tanques-rede favorece a alta densidade, gerando estresse nos peixes, tornando-os aptos ao desenvolvimento de diversas infecções. Dentre os patógenos de maior ocorrência em piscicultura, destacam-se as bactérias que causam grandes prejuízos econômicos e sanitários (BARTON, 2002; ELLIS et al., 2002; NORTH et al., 2006). Nesse contexto, as bactérias pertencentes do gênero Francisella tem sido muito estudadas devido a sua característica emergente. Nesse gênero, destaca- se a espécie Francisella noatunensis orientalis, responsável por perdas econômicas na produção de peixes. Essa espécie é responsável por causar principalmente granulomas multifocais em órgãos internos como baço, rins e fígado (SOTO et al., 2009a, 2012), levando a sérios prejuízos econômicos aos produtores (LIMA, 2007). A identificação das bacterioses em peixes é realizada através da verificação dos sinais clínicos, isolamento de bactérias, técnicas bioquímicas e moleculares, como por exemplo, reação em cadeia da polimerase (PCR), em 5 especial a PCR em tempo real (qPCR), seguidas de métodos baseados em análises de sequenciamento da subunidade ribossomal 16S RNAr (JANDA; ABBOTT, 2007). Medidas de prevenção e tratamento no cultivo de tilápias devem ser adotadas na tentativa de diminuir os riscos eminentes ofertados por esse micro- organismo. Para tal, o diagnóstico laboratorial e o manejo adequado são fundamentais para a manutenção da sanidade do plantel. 1. REVISÃO DE LITERATURA 1.1 Espécies de tilápias A tilapicultura é originária da Ásia, há mais de quatro mil anos. Seu expressivo crescimento nas últimas três décadas tem feito desse grupo de peixes um dos mais cultivados de forma extensiva no mundo. Nesse âmbito, a tilápia do Nilo, Oreochromis niloticus (Linnaeus, 1758) (Figura 1) é a principal espécie cultivada (EL-SAYED, 2006; SOTO et al., 2014). FIGURA 1. Oreochromis niloticus (Fonte: STIASNY, 2003). A chegada da tilápia ao Brasil, data da década de 1950, quando a espécie Tilapia rendalli (Boulenger, 1897) (Figura 2) foi importada de Élisabethville (Congo Belga), atual República Democrática do Congo – África (GURGEL, 6 1998), para povoamento dos reservatórios hidrelétricos da empresa “Light” no Estado de São Paulo. Em 1971, o Departamento Nacional de Obras Contra a Seca (DNOCS) introduziu essa espécie com o objetivo de povoamento dos reservatórios da região nordeste (OLIVEIRA et al., 2007; BARROSO et al., 2015). FIGURA 2. Tilapia rendalli (Fonte: NICO et al., 2016a). Nesse momento da história da introdução da tilápia no Brasil alguns entraves foram identificados. A baixa taxa de crescimento de T. rendalli e a alta prolificidade e consanguinidade de O. niloticus causou a disseminação descontrolada da tilápia nos reservatórios brasileiros tendo como resultado baixos índices de produtividade (OLIVEIRA et al., 2007). A partir daí outras espécies foram sendo trazidas da África, dentre elas Oreochromis aureus – tilápia azul (Steindachner, 1864) (Figura 3), Oreochromis urolepis hornorum – tilápia de Zanzibar (Trewavas, 1966) (Figura 4) e Oreochromis mossambicus – tilápia de Moçambique (Peters, 1852) (Figura 5) com o objetivo de repovoamento para práticas de pesca artesanal e segurança alimentar (BARROSO et al., 2015). 7 FIGURA 3. Oreochromis aureus (Fonte: NICO et al., 2016b). FIGURA 4. Oreochromis urolepis hornorum (Fonte: RAZAK, 2014). 8 FIGURA 5. Oreochromis mossambicus (Fonte: U.S. FISH AND WILDLIFE SERVICE, 2011). As espécies O. niloticus, O.aureus, O. mossambicus, e O. urolepis hornorum tem se destacado na aquicultura mundial devido à expressão de algumas características zootécnicas como taxa de crescimento, tolerância ao frio, tolerância à salinidade, maturação sexual e prolificidade (OLIVEIRA et al., 2007). A tilápia é um peixe tropical com relativa resistência a variações no ambiente. Suportam bem oscilações de temperaturas, onde seu crescimento é favorecido a temperaturas entre 26ºC e 28ºC, sendo os valores letais abaixo de 8ºC e acima de 42ºC. Apresenta rusticidade em relação ao nível de oxigênio dissolvido na água, com ótimo em concentração de 3 mg L-1, suportando viver por curtos períodos de tempo em concentrações de 1 mg L-1. O potencial Hidrogeniônico (pH) ideal da água para seu cultivo é em torno de 7 e 8, suportando valores limites de 3 e 12 por um curto período. Além disso, as tilápias podem se adaptar a águas salobras, onde há grande variação em relação à salinidade no ambiente aquático (ZANIBONI-FILHO, 2004). 9 1.2 Situação do cultivo de tilápias no Brasil O Brasil apresenta um expressivo potencial para o desenvolvimento da aquicultura, pois comporta aproximadamente 12 % da água doce disponível no planeta. São mais de cinco milhões de hectares de lâminas d´água disponíveis em reservatórios de usinas hidrelétricas e bacias particulares e também uma extensa costa marítima, em torno de 8400 Km, passível de uso para produção em cativeiro (CREPALDI et al., 2006). A produção da tilápia já ocorre em 1878 municípios brasileiros, sendo restrita pela legislação ambiental apenas à bacia amazônica. Nos últimos anos, o cultivo de tilápia teve um aumento médio anual entre 20 % e 25 %, em 2014 foram 198,49 mil toneladas despescadas, valor equivalente a 41,9 % do total da piscicultura do país (IBGE, 2014). Fato favorecido pela autorização por parte do governo, do uso das águas da União para fins aquícolas (BRASIL, 2004). Desse total produzido, 99 % é consumido internamente (BARROSO et al., 2015). 1.3 Sistemas de cultivo 1.3.1 Tanques escavados Apesar do grande crescimento no cultivo de tilápias em tanques-rede no Brasil, grande parte da produção deste peixe vem do cultivo em tanques escavados, também chamados de viveiros (Figura 6). Esse tipo de criação impõe ao produtor alguns desafios para um manejo adequado e eficiente. O principal deles é a despesca realizada com redes de arrasto convencionais. Nesse método, peixes podem saltar por sobre a rede ou escapar por debaixo da mesma, se enfiando no lodo do tanque e dependendo do caso, até morrendo (KUBITZA, 2009). 10 FIGURA 6. Tanques escavados (Fonte: arquivo pessoal). Devido a essa dificuldade na despesca, geralmente a engorda de tilápias cultivadas em viveiros é feita em fase única, onde os alevinos são estocados e engordados até o peso de mercado sem nenhuma intervenção. Alguns produtores optam por realizar a engorda em duas etapas: a primeira é o berçário onde os alevinos são recriados em local protegido (Figura 7) até alcançarem 10 a 100 gramas e a segunda, onde os então juvenis são engordados até atingirem o peso comercial desejado (KUBITZA, 2009). FIGURA 7. Tanque escavado com proteção contra predadores naturais (Fonte: arquivo pessoal). 11 Outro fator relevante é a presença de sabores indesejáveis no pescado cultivado nesse sistema, conhecido como off-flavor (TUCKER, 2000). O ambiente límnico vem sofrendo grandes alterações ao longo dos anos, devido à urbanização e expansão das indústrias. Como consequência, ocorre a perda na qualidade da água de cultivo, o que propicia um ambiente aquático alterado, levando à produção de duas substâncias que são a principal causa do off-flavor nos peixes: Geosmina (GEO) e 2-metilisoborneol (MIB), compostos orgânicos responsáveis, respectivamente, pelo cheiro de terra e de bolor ou mofo na água (SOUZA et al., 2012). Vantagens estão associadas ao cultivo de tilápias em viveiros, dentre elas a menor incidência de doenças e a maior eficiência nas conversões alimentares reduzindo o uso de ração e custo de alimentação. Para a viabilização desta última, o produtor deve investir em equipamentos e estruturas que facilitem a despesca e possibilitem a classificação dos peixes por tamanho. Além disso, as tilápias são eficientes no aproveitamento do plâncton, alimento natural disponível nos tanques. Tais fatores quando associados, podem diminuir o custo de produção em viveiros (KUBITZA, 2009). A piscicultura é uma atividade que pode gerar significativos impactos ambientais, tanto na sua instalação quanto em sua operação. Esse problema se agrava nos cultivos em tanques escavados. Na tentativa de minimizar esse problema nesse tipo de criação, algumas práticas podem ser adotadas, como: (a) uso de ração balanceada e de forma racional, evitando sobras; (b) uso dos efluentes para fertirrigação; (c) construção de viveiros preferencialmente em áreas já degradadas; (d) redução na taxa de renovação de água; (e) uso de lagoas de decantação para tratamento de efluentes aliado à colocação de filtros; (f) praticar o policultivo para potencializar o uso do espaço e dos recursos naturais e (g) cultivar preferencialmente espécies da bacia hidrográfica onde está localizada a piscicultura (FARIA et al., 2013). 1.3.2 Tanques-rede Tanques-rede são estruturas flutuantes para cultivo de peixes, constituídas por redes ou telas, em diversas formas e tamanhos, com função de reter um determinado número de indivíduos, com fluxo constante de água (Figura 8). Basicamente são estruturas constituídas de uma armação para sustentação de 12 telas de diâmetro entre 19 e 25 milímetros, com flutuadores e comedouros apoiados, com uma tampa, também de tela, para evitar fugas dos peixes e ataque de predadores. Sinalizadores utilizando tambores de PVC de 50 a 200 litros, na cor amarela ou luminosos, são exigidos pela Marinha em cultivos em águas da União (TANIGUCHI et al., 2014). FIGURA 8. Tanque-rede (Fonte: arquivo pessoal). O sistema de tanques-rede para o cultivo de tilápias é um dos mais utilizados atualmente e o mais produtivo por unidade de cultivo. É uma modalidade de criação intensiva que tem como principal objetivo o aumento da produtividade por área trabalhada com consequente ganho em lucratividade. Isso se deve ao fato do método permitir o uso múltiplo e racional dos recursos hídricos (represas, rios, lagos) que são abundantes no Brasil, dispensando o desmatamento; apresentar menor custo fixo por produção quando comparado a outros sistemas de cultivo e ainda, possibilitar produção escalonada, obtendo a colheita ao longo de todo o ano (TANIGUCHI et al., 2014). Na implantação desse sistema, deve-se considerar algumas características relevantes aos tanques-rede para se evitar prejuízos. O material vazado deve ter diâmetro suficiente para permitir a maior troca possível de água com o ambiente e ser resistente o bastante para suportar o peso dos peixes e impedir evasões através da tela, e ainda, ser de material resistente a corrosão e que permita a remoção dos dejetos gerados pelos peixes evitando seu acúmulo dentro dos 13 tanques. Deve ser de custo acessível e ser capaz de possibilitar a retenção da ração dentro do tanque até que seja totalmente consumida (CYRINO; CONTE, 2006). O cultivo de tilápias em tanques-rede facilita o monitoramento e a despesca pois nesse sistema é possível a observação frequente dos peixes, o que favorece o manejo sanitário e o controle de predadores. Porém, algumas desvantagens em seu uso são observadas, como: (a) o risco de encrustamento e rompimento da tela da gaiola com perda da produção; (b) total dependência do sistema de arraçoamento; (c) necessidade de fluxo de água constante através das redes; (d) a alta densidade gerando estresse aos animais; (e) diminuição da qualidade da água pelo acúmulo de matéria orgânica favorecendo a introdução de doenças e/ou peixes no ambiente prejudicando a população natural e (f) o acúmulo de fezes e metabólitos embaixo dos tanques-rede causando impacto ambiental (LONGHI et al., 2012). Além disso, a criação de peixes em tanques-rede pode levar à eutrofização artificial no ambiente, devido ao acúmulo de resíduos gerados no manejo oriundos de alimentos não digeridos e metabólitos, que elevam a concentração de nitrogênio e fósforo na água, proporcionando a proliferação excessiva de algas e plantas aquáticas. Isso aliado a fatores como baixos índices pluviométricos, baixa umidade relativa do ar e altas temperaturas afetam diretamente o volume de águas nos reservatórios e consequentemente em sua vazão, agravando o processo de eutrofização. Dependendo da intensidade desse processo, o resultado pode ser profundas alterações no ambiente aquático comprometendo a estabilidade do ecossistema (FERREIRA et al., 2005; BARROSO et al., 2015). A forma de cultivo mais utilizada em tanques-rede é o bifásico, onde na primeira fase, a de pré-engorda, alevinos com peso médio em torno de um grama são estocados em tanques de alevinagem até atingirem entre 20 e 30 gramas de peso. Daí, passam para a segunda fase, a de engorda, onde permanecem por cerca de 120 dias até atingirem o peso comercial que varia de 600 a 850 gramas. Nesse cultivo o ciclo total de engorda da tilápia ocorre em torno de 180 dias. Outra opção é o cultivo trifásico. A diferença para o bifásico está na primeira fase, que é dividida em duas. Os alevinos de um grama de peso ficam estocados em tanques com malha de 5 milímetros por pelo menos 21 dias, até atingirem 14 peso médio de dez gramas. Daí são transferidos para tanques com malha de 8 milímetros de diâmetro onde permanecem por 30 a 40 dias até atingirem peso superior a 20 gramas. Antes de sua transferência para os tanques de engorda, os peixes, nesse sistema, passam por classificação entre pequenos, médios e grandes e são distribuídos para outros tanques conforme seu tamanho (NOGUEIRA; RODRIGUES, 2007). Em cultivos em tanques-rede, a densidade de tilápias varia entre 30 a 50 Kg m-3 ao final de cada ciclo. As formulações de rações específicas para esse tipo de criação permitem um rápido crescimento dos peixes com uma excelente performance em um período relativamente curto de tempo, e dependendo das condições climáticas da região, é possível produzir até dois ciclos por ano (ENGLAND, 2014). O equilíbrio entre a saúde dos peixes cultivados, proliferação de patógenos e a qualidade do ambiente aquático é essencial para o sucesso na produção em tanques-rede. Qualquer fator que desequilibre esse sistema, como por exemplo, manejo inadequado, alterações bruscas de temperatura, nutrição desequilibrada, deterioração da água; favorecem a proliferação de parasitos e de agentes patogênicos fúngicos, virais e bacterianos (ZANOLO; YAMAMURA, 2006; KUBITZA et al., 2013). 1.4 Francisella spp. Os micro-organismos pertencentes ao gênero Francisella foram isolados pela primeira vez em 1910, na Califórnia, nos Estados Unidos da América (EUA) e posteriormente, em 1922, descritos pelo bacteriologista americano Edward Francis (RYAN; RAY, 2004). Pertencem à família Francisellaceae, são membros do grupo das γ-proteobactérias e são cocobastonetes gram-negativos imóveis (Figura 9), álcool-ácido-resistentes, parasitas intracelulares, anaeróbios facultativos, não formadores de esporos (SOTO et al., 2012; MARTINS et al., 2015). 15 FIGURA 9. Francisella spp. aderida a macrófago (Fonte: MARTINS et al., 2015). A taxonomia do gênero Francisella spp. está em discussão e revisão. Atualmente, 5 espécies são reconhecidas: F. tularensis, F. philomiragia, F. noatunensis, F. hispaniensis e F. halioticida (OTTEM et al., 2009; HUBER et al., 2010; BREVIK, et al., 2011). A espécie F. noatunensis compreende duas subespécies: Francisella noatunensis noatunensis e Francisella noatunensis orientalis (OTTEM et al., 2009). Ambas responsáveis por causar doença granulomatosa em peixes de água doce e marinhos (SCHRALLHAMMER et al., 2011). O isolamento de Francisella noatunensis foi obtido inicialmente através do cultivo de células e posteriormente pelo cultivo em ágar coração cisteína, cuja composição inclui infusão coração de bovino (Beef Heart Infusion), peptona proteose, dextrose, cloreto de sódio, L-cistina, ágar, adicionado de 100 a 500 unidades de penicilina por mililitro de meio para redução de possível flora contaminante. As colônias características dessa espécie são pequenas, convexas e opacas, com crescimento ótimo a 22ºC. Bioquimicamente, são catalase positivas, oxidase negativas, produtoras de ácido sulfídrico. Produzem fosfatase ácida e alcalina, esterase C4, esterase lipase C8, β-lactamase e nafitol- AS-BI-fosfohidrolase. Não produzem ácido na fermentação dos carboidratos arabinose, glicose, maltose, manitol, ribose, sorbitol, sacarose e trealose (AUSTIN; AUSTIN, 2012). 16 Soto et al. (2013a) cultivaram cepas de Francisella noatunenis orientalis em ágar coração cisteína suplementado com solução de hemoglobina bovina por 72 horas a 28ºC e também, em caldo Mueller- Hinton suplementado com 0,1 % de glicose e com IsoVitaleX® (Becton Dickenson BBL, Sparks, MD, USA), um suplemento para recuperação de células injuriadas, segundo protocolo descrito por BAKER et al. (1985). O caldo foi incubado overnight a 25ºC, no agitador a 175 rpm e depois a cultura foi acrescentada de glicerol a 20 % e congelada a - 80ºC para ser usada posteriormente. Segundo Klinger-Bowen et al. (2012), bactérias do gênero Francisella isoladas de peixes não são reconhecidas como sendo zoonóticas, significando que estas não causam doença em humanos. 1.4.1 Patogenia Os mecanismos de patogenicidade da Francisella noatunensis orientalis não são totalmente conhecidos. Esses micro-organismos apresentam uma expressiva taxa de infectividade e uma notável habilidade em persisitir no ambiente (SOTO et al., 2015). Em alevinos de tilápias uma contagem igual ou superior a 23 UFC g-1 pode ser letal (SOTO et al., 2009b). As lesões mais comumente encontradas em peixes acometidos por franciselose são esplenomegalia, nefromegalia, com granulomas multifocais afetando principalmente o baço e de forma menos frequente o fígado, rins, intestinos e músculo esquelético (Figuras 10 e 11) (JEFFERY et al., 2010; COLQUHOUN; DUODU, 2011; CAMUS et al., 2013). Tais lesões caracterizam- se pela grande quantidade de cocobastonetes que se acumulam nos citoplasmas celulares ocasionando vasculite necrotizante focal e difusa, resultando na formação de granuloma (MAUEL et al., 2007; SOTO et al., 2012). Exames histopatológicos de órgãos e tecidos afetados ajudam na identificação e descrição da Francisella. Cortes histológicos de órgãos afetados revelam a presença de granulomas com centro de aspecto necrosado e geralmente preenchido com líquido. É possível observar ainda a presença de macrófagos, fibroblastos, leucócitos e um pequeno número de bactérias Gram negativas nesses granulomas (KUBITZA; KUBITZA, 2013). 17 FIGURA 10: Baço de tilápia com lesões sugestivas de Francisella spp. (Fonte: FIGUEIREDO, 2015). FIGURA 11: Baço hipertrofiado com lesões granulomatosas (Fonte: FIGUEIREDO, 2015). Soto et al. (2013b), no intuito de estudar a patogenicidade da Francisella noatunensis orientalis, desafiaram experimentalmente alevinos de tilápias com uma cepa selvagem de Francisella noatunensis orientalis. E ainda, avaliaram a dispersão da bactéria através de múltiplos órgãos e verificaram a relação com as lesões. Os autores observaram lesões granulomatosas predominadas pela presença de macrófagos com vacúolos citoplasmáticos contendo pequenas bactérias cocóides (Figura 12, A e B). Achados esses consistentes com outros 18 descritos na literatura para franciselose (BIRCKBECK et al., 2011; COLQUHOUN; DUODU, 2011). FIGURA 12. Alterações em tecidos de tilápias experimentalmente infectadas com Francisella noatunensis orientalis. (A) Granuloma, (g) na porção anterior do rim com predominância de macrófagos epitelióides pálidos e vacuolizados. Granulomas com núcleos escurecidos representam dissociação de linfócitos. (B) Granuloma, (g) na porção posterior com túbulos renais deslocados perifericamente (setas) (Fonte: adaptado de SOTO et al., 2013b). Bactérias do gênero Francisella spp. são capazes de penetrar a pele intacta ou injuriada para induzir uma resposta inflamatória local, com formação de pápulas e úlceras in situ. Através de dispersão linfohematogênica, os agentes conseguem invadir o tecido parenquimal resultando na formação de granulomas e abscessos (HSIEH et al., 2006). Klinger-Bowen et al. (2012) relataram que pode haver peixes com granulomatose em surtos de outras doenças que não a franciselose, ou seja, essa lesão por si só não confirma a presença de Francisella nas tilápias. 1.4.2 Sinais clínicos Nos peixes, a franciselose pode se manifestar de forma aguda, apresentando sinais clínicos discretos, porém com alta taxa de mortalidade. 19 Segundo Chern e Chao (1994) a mortalidade de tilápias associada a infecção natural por Francisella spp. pode alcançar 95 %. A franciselose pode também se manifestar como uma infecção subaguda ou crônica, com sintomas inespecíficos tais como anorexia, natação errática, anemia e exoftalmia. Durante a necropsia também é possível observar áreas hemorrágicas focais, perda de escamas, erosão na epiderme, nefromegalia e esplenomegalia (SOTO et al., 2009 a,b; MARTINS et al., 2015). Dentre os sinais característicos de Francisella destaca-se: (a) presença de granulomas de um a cinco milímetros, branco-amarelados, principalmente no rim e baço mas que podem ocorrer com menos frequência nas gônadas, fígado e coração; (b) nódulos brancos nas brânquias, semelhantes aos que ocorrem nas infecções por Edwardsiella tarda; (c) lesões granulomatosas na forma de pontos escurecidos na musculatura. Os sinais clínicos da franciselose podem ser semelhantes a de outras bacterioses, como por exemplo, Edwardsiella tarda. Sendo assim, o diagnóstico definitivo da doença deve ser realizado somente através da identificação do agente patogênico (KUBITZA; KUBITZA, 2013). Hiperplasia epitelial pode ser observada nas brânquias e também ascite. Além disso, lesões intramusculares podem ocorrer e afetar significativamente o processamento das tilápias (BIRCKBECK et al., 2011). 1.4.3 Epidemiologia A bactéria Francisella spp. está largamente difundida pelo mundo. Essa distribuição geográfica generalizada associada a um amplo espectro de hospedeiros e à transmissão peixe a peixe, sugerem a existência de reservatórios naturais desse micro-organismo. Nesse sentido, a previsão de surtos relacionados a franciselose é dificultada e agravada pela impossibilidade de controle efetivo por falta de informações relativas a presença ou não do agente no ambiente de cultivo (BARTHOLOMEW, 2011). A franciselose é altamente transmissível sob condições ambientais ótimas. Nylund et al. (2006) demonstraram que a transmissão horizontal da Francisella spp. ocorre em bacalhau por coabitação. Esses mesmos autores sugeriram que a introdução da bactéria em fazendas de cultivo se dá através de alevinos 20 cultivados oriundos de ninhada selvagem ou que reservatórios naturais de Francisella spp. podem estar presentes na forma de amebas, peixes selvagens ou outras espécies marinhas. Outros estudos evidenciaram que a Francisella spp. é transmitida horizontalmente, de peixe para peixe a curtas distâncias (NYLUND et al., 2006; MIKALSEN et al., 2007). Kubitza e Kubitza (2013) relataram a possibilidade da infecção e mortalidade causadas por Francisella estarem relacionadas à temperatura da água, infestações parasitárias, manejo e aumento da turbidez mineral da água. E ainda, o contato direto entre peixes sadios e infectados bem como com suas fezes, também pode ser via de infecção dentro do cultivo. Francisella isolada de tilápia não se desenvolve bem a temperaturas acima de 28ºC e quando a água está a baixas temperaturas, o sistema imunológico das tilápias se torna enfraquecido. A associação desses fatores pode explicar o fato da franciselose ocorrer com maior frequência quando a água está entre 20ºC e 25ºC. Além disso, os autores também afirmaram que protozoários são potenciais reservatórios para Francisella, portanto, peixes com alta carga parasitária são mais susceptíveis à doença. Francisella noatunensis pode estar presente em ambientes com diferentes temperaturas. Nos cultivos em climas temperados predomina a Francisella noatunensis noatunensis, devido à sua predileção por águas mais frias. Já em climas tropicais, onde a temperatura da água é mais elevada, há o predomínio da espécie Francisella noatunensis orientalis (OTTEM et al., 2009; KLINGER- BOWEN et al., 2012). 1.4.4 Diagnóstico Para o diagnóstico das doenças bacterianas em peixes, as alterações comportamentais dos animais acometidos, os sinais clínicos e a taxa de mortalidade devem ser associados ao isolamento bacteriano através de métodos microbiológicos convencionais. Nesse caso, deve-se considerar as características da doença e a peculiaridade de cada agente. Algumas bactérias são facilmente isoladas em cultivos tradicionais, já outras requerem condições mais específicas para seu crescimento, o que pode se tornar inviável pela dificuldade no isolamento (ISHIKAWA et al., 2011; TOENSHOFF et al., 2012). 21 Técnicas de imuno-histoquímica que permitem a marcação de bactérias associadas a avaliação histopatológica podem facilitar a identificação etiológica e dessa forma, complementar as análises microbiológicas no diagnóstico de bacterioses (ROMANO et al., 2012). O isolamento de bactérias através de técnicas moleculares como por exemplo, reação em cadeia da polimerase (PCR), em especial a PCR em tempo real (qPCR), seguidas de sequenciamento da subunidade ribossomal 16S RNAr são os métodos mais acurados para identificação específica de bactérias (JANDA; ABBOTT, 2007). Esse fragmento do DNA genômico é conservado entre as bactérias, o que permite a identificação com alta especificidade e sensibilidade entre as espécies de micro-organismos presentes nas amostras (CLARRIDGE, 2004). No caso específico da identificação de Francisella spp. isolada de peixes, autores aplicaram a técnica de qPCR seguida pelo sequenciamento da subunidade 16S do RNAr ribossomal com resultados satisfatórios na identificação de Francisella spp. em peixes (BIRKBECK et al., 2007; OTTEM et al., 2008; JEFFERY et al., 2010; JACOB et al., 2011; KULKARNI et al.,2011; KLINGER-BOWEN et al., 2012; SOTO et al., 2012; CAMUS et al., 2013; SOTO et al., 2013b; BRETT et al., 2014; ; LIN et al., 2015; NGUYEN et al., 2015; RUANE et al., 2015). 1.4.4.1 PCR No ano de 1988, Saiki et al. descreveram a utilização da enzima DNA (ácido desoxirribonucleico) polimerase extraída da bactéria termófila, Thermus aquaticus na PCR. O uso dessa enzima permitiu que a reação fosse processada em temperaturas mais altas, melhorando a especificidade da reação e aumentando o percentual de produto amplificado, permitindo a automação do processo. Além disso, a enzima DNA polimerase possibilitou a minimização da obtenção de produtos inespecíficos, bem como a amplificação de produtos maiores que 400 pares de bases, expandindo significativamente a utilização da PCR (INNIS; GELFAND, 1990; ERLICH et al., 1991). A PCR permite que um fragmento específico da molécula de DNA seja amplificado milhares de vezes em apenas algumas horas. A técnica baseia-se 22 em ciclos que se repetem em três etapas que ocorrem a diferentes temperaturas, na presença de reagentes termoestáveis (dois primers ou iniciadores, quatro desoxirribonucleotídeos trifosfatados, a enzima termoestável Taq polimerase e tampão) e sequências específicas de DNA a serem amplificadas. Os primers são pequenos fragmentos de DNA fita simples, com orientações opostas (EISENSTEIN, 1990). A reação envolve ciclos de temperatura e se divide em três etapas: (a) desnaturação do DNA molde em fita simples; (b) hibridização ou anelamento dos primers às regiões complementares no molde; (c) extensão e síntese do fragmento de DNA (FARBER, 1996). Na etapa de desnaturação, a temperatura é elevada para 92ºC a 95ºC, quebrando as ligações do tipo pontes de hidrogênio que unem as fitas de DNA, desnaturando-as. A fita de DNA exposta é denominada template ou molde e essa se anelará a outra fita de DNA contendo a sequência iniciadora (primers). (SCHEINERT et al., 2005). Para que ocorra o anelamento, a temperatura da reação é reduzida rapidamente para 35ºC a 60ºC, dependendo do tamanho dos iniciadores utilizados. Isso permite que ocorra a hibridização DNA-DNA dos primers com a sequência alvo (EISENSTEIN, 1990). Em seguida, para que a enzima DNA polimerase realize a extensão no sentido 5’– 3’, a temperatura é elevada para 72ºC (TAYLOR et al., 1993). Este ciclo deve ser repetido dezenas de vezes e conforme os ciclos se repetem, a quantidade de DNA da sequência alvo aumenta exponencialmente e a amplificação segue uma progressão geométrica, tendo como resultado sequências de DNA homólogas ao DNA molde (TAYLOR, 1993; FARBER, 1996). Após a obtenção do produto amplificado (amplicons), uma alíquota deste é aplicada em gel de agarose, submetida à eletroforese, corada com Brometo de etídio e visualizada sob luz ultravioleta. Os resultados são obtidos pela comparação entre as amostras, da presença de bandas de mesmo peso molecular. Isso aliado à sua intensidade levam a um resultado qualitativo sobre a presença do alvo amplificado (ORLANDO et al., 1998). A eletroforese é uma técnica baseada na separação de partículas em um determinado gel de acordo com sua massa e carga. Macromoléculas que possuem carga elétrica são capazes de movimentar-se quando submetidas à um campo elétrico, sendo atraídos pelo polo de carga oposta. A eletroforese em gel 23 de agarose permite separar longos fragmentos de DNA, dependendo da concentração do gel. Geralmente se trabalha com géis de agarose de 1 % a 1,5 % dependendo do fragmento de DNA esperado. São utilizados fluoróforos como o Brometo de etídio, que se ligam ao DNA e permitem sua visualização no gel (SAMBRROK; GREEN, 2012). 1.4.4.2 qPCR A qPCR, técnica amplamente utilizada para quantificar micro-organismos de interesse clínico e em saúde pública, foi desenvolvida inicialmente no intuito de estimar o número de cópias de um gene de interesse (DOLKEN et al., 1998). No final da década de 1990, a qPCR passou a ser utilizada para quantificar vírus em humanos (CANE et al., 1999; LEWIN et al., 1999). Uma técnica que une relevante simplicidade combinada a alta sensibilidade, especificidade e rapidez nos resultados fez da qPCR referência e uma potente ferramenta em quantificação da expressão gênica (SCHMITTGEN; LIVAK, 2008; BUSTIN et al., 2009). A curva de amplificação obtida da qPCR apresenta quatro fases (Figura 13): (a) linear; (b) exponencial inicial; (c) logarítmica linear e (d) platô. Os primeiros 10 a 15 ciclos onde a emissão de fluorescência ainda não é suficiente para atingir o limiar de detecção (threshold line), corresponde à fase linear. O início da fase exponencial se dá quando essa emissão ultrapassa o limiar de detecção. Nesse ponto estabelece-se o ciclo de detecção (Cycle threshold – Ct). O aumento exponencial no sinal fluorescente corresponde a fase logarítmica linear. E quando o sinal se torna constante pela limitação dos componentes da reação, tem-se a fase platô (WONG; MEDRANO, 2005). 24 FIGURA 13. Representação esquemática das fases da qPCR. = amostra com DNA alvo; = amostra controle; Rn = intensidade do sinal fluorescente; (a) linear; (b) exponencial inicial; (c) logarítmica linear; (d) platô. Adaptada de Mocellin et al. (2003). Na reação de qPCR, os amplicons produzidos são marcados com moléculas fluorescentes ou corantes que se ligam ao DNA e são quantificados a cada ciclo. O Ct, parâmetro essencial a ser avaliado na qPCR, corresponde ao ciclo da reação no qual o sinal fluorescente do corante sinalizador atravessa uma linha arbitrária, denominada limiar (threshold line) (SCHMITTGEN; LIVAK, 2008). Em uma relação linear, o Ct é inversamente proporcional ao número de cópias do DNA alvo, ou seja, quanto maior a concentração de material genético na amostra, menor será o número de ciclos necessários para atingir o ciclo de detecção (Ct) (Figura 14) (MOCELLIN et al., 2003). 40 25 FIGURA 14. Representação esquemática da variação linear de amplificação conforme o número de cópias de DNA obtidas pela qPCR. Adaptada de Mocellin et al. (2003). A identificação da amplificação na qPCR baseia-se no uso de sondas fluorescentes específicas para uma determinada região da molécula que está sendo amplificada, através do emprego de marcadores fluorescentes que se intercalam na molécula de DNA. Dentre esses, o sistema SYBR Green® é um dos mais utilizados e consiste de um corante fluorescente altamente sensível que quando ligado à fita dupla de DNA, provoca um acréscimo significativo na fluorescência, permitindo a identificação do acúmulo do produto da qPCR durante a reação. Portanto, existe uma relação diretamente proporcional entre a intensidade da fluorescência e a quantidade de DNA alvo gerada durante a qPCR. Esse corante permanece estável durante toda a reação de amplificação (RAMOS-PAYAN et al., 2003; PAUDEL et al., 2011). A especificidade do ensaio de qPCR é determinada pelos primers e condições de reações aplicadas. Entretanto, há sempre a possibilidade de, mesmo diante da utilização de primers bem delineados, estes possam ligar entre si, formando primers-dimers, ou, ainda, pode ocorrer a amplificação de produtos inespecíficos. Diante dessas possibilidades, há a necessidade confirmação da especificidade da reação e isso é possível através da análise da curva de melting (LIFE TECHNOLOGIES, 2014). 26 Na avaliação da curva de melting (ou curva de dissociação) é possível determinar o ponto correspondente à temperatura de dissociação dos primers das sequências alvo, ou seja, permite a identificação do fragmento do produto amplificado através de uma temperatura específica, temperatura de melting (TM). A TM corresponde à temperatura onde metade das fitas de DNA está na forma de fitas simples e a outra metade na forma de dupla hélice, e devido a essa dissociação na cadeia de DNA, os corantes marcadores então são liberados e detectados. A inclusão da avaliação dessa curva é primordial para determinar se houve formação de um único produto ou se houve formação de produtos inespecíficos (PÉREZ et al., 2011; PAUDEL et al., 2011). As principais vantagens da qPCR em relação a PCR convencional é que a primeira permite que os processos de amplificação, detecção e quantificação de DNA sejam realizados em uma única etapa, obtendo resultados rápidos, diminuindo o risco de contaminação da amostra e garantindo maior precisão. Além disso, a qPCR combina detecção e quantificação através da emissão de fluorescência o que permite o monitoramento da reação em tempo real, uma vez que a cada ciclo de amplificação são gerados dados. O contrário acontece na PCR convencional, onde os dados são analisados somente ao final da reação, pela eletroforese em gel (KUBISTA et al., 2006). 1.4.4.3 Sequenciamento Na década de 1970, dois experimentos possibilitaram o desenvolvimento de métodos de obtenção da sequência de fragmentos de DNA em laboratório (MAXAM; GILBERT, 1977; SANGER; COULSON, 1975). Um desses métodos, até então chamado de terminação da cadeia ou sequenciamento dideoxi, ficou conhecido como método de Sanger de sequenciamento. Posteriormente, na década de 1980, foram desenvolvidos os primeiros protótipos de sequenciadores semiautomáticos, o que fez do método de Sanger o mais comumente utilizado para sequenciamento. Concomitantemente, o desenvolvimento de algoritmos para montagem de genomas a partir de fragmentos sequenciados, fez desse método a principal ferramenta para sequenciamento do genoma humano e de outros organismos nos anos subsequentes (LANDER et al., 2001; VENTER et al., 2001) V a ria ç ã o lin e a r d e a m p lific a ç ã o 10 5 27 O princípio da replicação de DNA foi usado por Sanger et al. (1977) para o desenvolvimento da técnica de sequenciamento. A vantagem desse processo está na habilidade da DNA polimerase em incorporar 2’-3’ dideoxinucleotídeos, nucleotídeo análogo que falta do grupo 3’-hidroxi, essencial na formação da ligação fosfodiester. O sequenciamento pelo método de Sanger requer um produto de DNA, DNA polimerase, primer, ddNTPs (didesoxirribonucleosídeos trifosfatados), dNTPs (desoxirribonuclesídeos trifosfatados) e tampão para a reação. São configuradas quatro reações distintas, cada uma contendo um nucleotídeo radioativamente marcado (ddA, ddC, ddG, ddT). Em cada etapa da extensão da cadeia de nucleotídeos, a DNA polimerase adiciona um dNTP ou o ddNTP correspondente, dependendo da concentração de cada um na reação. Quando um dNTP (adenina, citosina, guanina ou timina) é adicionado a uma extremidade 3’, a extensão da cadeia é continuada. Porém, quando um ddNTP (ddA, ddC, ddG, ddT) é adicionado a essa extremidade, a extensão cessa. Os produtos da extensão são então separados por eletroforese (APPLIED BIOSYSTEMS, 2009). 1.5 Prevenção e controle da franciselose Atualmente, não há vacinas comerciais disponíveis para a prevenção da franciselose em peixes (SOTO et al., 2014). Algumas empresas estão trabalhando no desenvolvimento de vacinas para a doença. Testes estão sendo realizados em bacalhau na Noruega, mas ainda sem resultados satisfatórios (COLQUHOUN; DUODU, 2011). Soto et al. (2011) elaboraram uma vacina feita com uma cepa de Francisella asiática mutante para um dos seus genes que conferem patogenicidade. Tilápias jovens foram desafiadas sendo submersas por 30 minutos ou 180 minutos em água contendo as bactérias mutantes. Foi observado uma mortalidade de 80 % nos peixes que não foram vacinados (controle) e de 20 % a 30 % nos peixes que receberam a vacina e que permaneceram 180 minutos na água contaminada experimentalmente. Segundo Kubitza (2008), o controle e a prevenção da franciselose em tilápias no Brasil são realizados na forma de aplicação de boas práticas na 28 produção e no manejo sanitário para a prevenção de doenças. Tais práticas abrangem: (a) monitoramento contínuo e manutenção de adequada qualidade da água nos tanques e, no caso de tanques-rede em reservatórios de hidrelétricas, uma análise criteriosa dos possíveis riscos associados e se possível, o histórico da qualidade dessa água; (b) adequada nutrição e alimentação, com ajustes nos níveis nutricionais da ração e no tamanho dos pellets conforme as fases de crescimento; (c) cuidados na introdução de alevinos, juvenis e reprodutores, dando preferência a aquisição de animais de produtores que aplicam boas práticas de manejo sanitário; (d) manter novos estoques adquiridos, separados do plantel já existente para quarentena; (e) atenção constante ao comportamento dos peixes, com remoção imediata de peixes doentes ou mortos e isolamento das unidades de produção onde esses peixes habitavam; (f) exames de rotina para detectar problemas, mesmo em lotes de peixes aparentemente sadios; (g) evitar o uso indiscriminado de terapêuticos; (h) realizar a desinfecção de equipamentos periodicamente. Para Klinger-Bowen et al. (2012) peixes acometidos por Francisella noatunensis orientalis tendem a não se alimentarem, por esse motivo, é indicado o uso de antibióticos como medida profilática, sendo a administração dos fármacos realizada dias antes da diminuição da temperatura da água, antecipando assim uma provável infecção. Já Colquhoun e Duodu (2011) afirmaram que o uso de antibióticos para tratamento da franciselose pode não oferecer efeito satisfatório e duradouro, uma vez que a bactéria é intracelular, a doença é caracterizada por alta prevalência e transmissibilidade, baixa dose infectante e causa inapetência em peixes severamente infectados. Porém, alguns estudos demonstram que a oxitetraciclina (CHERN; CHAO, 1994) e a tetraciclina (MAUEL et al., 2005; OSTLAND et al., 2006) demonstraram certo grau de eficácia para o tratamento da franciselose. Soto et al. (2011) verificaram a eficiência do florfenicol no tratamento de tilápias juvenis experimentalmente infectadas com Francisella 29 spp. e observaram uma eficiência de 100 % no grupo tratado após 30 dias do desafio, enquanto que no grupo controle, que não recebeu o medicamento, a mortalidade nesse período foi de 70 %. A United States Food and Drugs Administration (FDA) permite o uso de três antibióticos em ração de peixes: Florfenicol, Oxitetraciclina e Sulfadimetoxina/ormetropim (FDA, 2016). No Brasil, a Instrução Normativa n0 13 de 15 de julho de 2015 dispõe sobre o Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes para as cadeias de carnes e estabelece os limites máximos de resíduos de antimicrobianos que podem estar presentes na carne de peixes de cultivo. Nessa normativa, dentre os antibióticos relacionados, constam os autorizados pelo FDA com seus respectivos limites residuais permitidos na carne dos peixes (BRASIL, 2015b). É valido ressaltar que os produtores que optarem pelo uso de antibióticos devem contar com o suporte de profissional especializado e tomar como referência o antibiograma realizado contra as bactérias patogênicas isoladas de peixes doentes. E ainda, no caso de tratamento de peixes com peso próximo ao indicado para abate, deve-se respeitar o período de carência do medicamento utilizado indicado pelo fabricante (KUBITZA; KUBITZA, 2013). Os imunoestimulantes são substâncias químicas, sintéticas ou biológicas que atuam no sistema imune específico, aumentando a atividade fagocítica e bactericida das células de defesa, melhorando a resistência do peixe a doenças infecciosas. Seu uso pode ser uma interessante alternativa a ser aplicada nas boas práticas de manejo no intuito de reduzir ou não utilizar antimicrobianos no ciclo de produção de tilápias (BRICKNELL; DALMO, 2005). Diversos ingredientes utilizados na ração podem ajudar a fortalecer a resposta imunológica dos peixes às diversas enfermidades, bem como auxiliar no equilíbrio da microflora intestinal, facilitando e potencializando a absorção de nutrientes. Sob a ótica da imunonutrição, a inclusão desses ingredientes às rações tem sido uma importante prática para redução do uso de medicamentos, em especial antibióticos, resultando em uma melhor percepção e segurança no consumo da carne desses peixes (KUBITZA; KUBITZA, 2013). A eficácia dessas práticas está diretamente relacionada à qualidade sanitária dos peixes comercializados. A conscientização dos produtores em 30 relação aos riscos e da importância desse manejo preventivo são de suma importância na garantia da saúde da população. 1.6 Produção A produção de peixes no Brasil, segundo fonte do IBGE (2014) movimentou um montante de mais de dois milhões e setecentos mil reais em 2014, com uma produção total de mais de 474 toneladas. Nesse contexto, Minas Gerais aparece com uma produção total de mais de 16 toneladas de peixes produzidos, movimentando mais de 98 milhões de reais. Nesse mesmo ano, a tilápia foi a espécie mais cultivada no Brasil (198,7 toneladas) e o estado de Minas Gerais foi responsável por 16.530 toneladas desse montante (IBGE, 2014). Estudo realizado pelo Rabobank, principal banco financiador agrícola do mundo, mostra que a aquicultura pode ser, na próxima década, a nova fronteira de proteína animal no Brasil. Na pesquisa, os dados mostram que a produção de peixe em cativeiro poderá alcançar 960 mil toneladas em 2022 (BRASIL, 2015c). As tilápias são eficientes no aproveitamento de alimentos naturais, o plâncton. Em estudo realizado por Schroeder (1983) em viveiros com baixa renovação de água, cerca de 50 % a 70 % do crescimento de tilápias foi atribuído ao consumo de alimentos naturais, mesmo recebendo ração suplementar. Esse fato explica o menor custo de produção de tilápias em viveiros de baixa renovação de água comparado ao cultivo intensivo em tanques-rede (KUBITZA, 1999). 2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS A deficiência nos dados de produção das tilápias na bacia hidrográfica do rio Araguari na mesorregião do Triângulo Mineiro, Minas Gerais, Brasil, devido à ilegalidade da atividade leva à desinformação também em relação a sanidade dos peixes cultivados, ocasionando a subnotificação de doenças. Isso pode 31 gerar sérios prejuízos aos produtores e à saúde da população exposta ao consumo desses peixes. Diante do exposto, o presente estudo tem como objetivos: (a) Detectar e determinar a prevalência de Francisella noatunensis orientalis em tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus) cultivadas em tanques-rede em represas da bacia hidrográfica do rio Araguari, Minas Gerais, Brasil. (b) Identificar se a espécie Francisella noatunensis orientalis está presente nessa região, com o auxílio do sequenciamento pelo método de Sanger. 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Número de amostras Com base nas pesquisas realizadas com sanidade de O. niloticus, no Laboratório de Biotecnologia da Universidade Estadual Paulista (UNESP) no Campus de Botucatu – São Paulo – Brasil, observou-se prevalência de 10 % para Francisella spp. (RODRIGUES, 2016) *. Esse valor percentual foi utilizado para definir o número de animais a serem amostrados. Dessa forma, para o cálculo da amostragem foi utilizado o programa do site OpenEpi (DEAN et al., 2013) onde foi selecionado o método de prevalência (estudo transversal). A amostragem mínima calculada para este tipo de estudo foi de 139 animais com intervalo de confiança de 95 %. Para evitar erros de amostragem, aumentou-se o valor para 150 peixes. _____________________ *Rodrigues, M.V. Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista – UNESP – Campus de Botucatu (comunicação pessoal, 2016). 32 3.2 Amostras Nos meses de novembro e dezembro de 2015, 150 tilápias em idade adulta foram selecionadas aleatoriamente, após a insensibilização em água gelada, em três frigoríficos distintos (50 em cada estabelecimento), todos inspecionados pelo Instituto Mineiro de Agropecuária, oriundas de criatórios em tanques-rede, localizados na bacia hidrográfica do Rio Araguari que se localiza na mesorregião do Triângulo Mineiro, na porção oeste do Estado de Minas Gerais - Brasil, entre as coordenadas geográficas de 19º35’21.67’’ de latitude Sul e 44º 39’16.44’’ de longitude Oeste de Greenwich (Figura 15) o qual ocupa uma área de 20.186 Km², abrangendo parte de 20 municípios (BRITO; ROSA, 2003). FIGURA 15. Vista da bacia hidrográfica do Rio Araguari na mesorregião do Triângulo Mineiro, a uma distância aproximada de 207,07 Km (Fonte: Google Earth, 2016). Foram mensurados a massa corpórea (g) e o comprimento padrão (cm) dos animais. Em seguida, os peixes foram submetidos a necropsia conforme descrita por Noga (2010). Todas as alterações macroscópicas observadas e sexo foram anotadas em planilhas próprias para esse fim. 33 Após a abertura da cavidade celomática, o baço foi retirado com o auxílio de uma lâmina de bisturi estéril, transferido para tubo estéril devidamente identificado e imediatamente acondicionado em caixa isotérmica com temperatura de 4ºC. No laboratório, as amostras foram congeladas a -18ºC e, posteriormente, foram realizados os testes moleculares. 3.3 Identificação de Francisella spp. por qPCR 3.3.1 Extração de DNA Para a extração do DNA, foi utilizado o Kit GEneJet Genomic DNA Purification (Thermo Scientific). Foi transferido 10 mg de baço para um tubo estéril livre de ácidos nucléicos. Em seguida, esse material foi ressuspendido em 180 µL de solução de digestão, acrescido de 20 µL de Solução de Proteinase K e homogeneizado até obtenção de uma solução uniforme. A amostra foi incubada a 56ºC, sob agitação ocasional, por três horas, até a completa lise do tecido. Em seguida, foi adicionado 20 µL de solução de RNAse A e incubada a temperatura ambiente por dez minutos para se obter apenas DNA na solução eluída. Foi acrescentado 200 µL de solução de lise e homogeneizada por quinze segundos para romper a membrana citoplasmática e nuclear. Foram adicionados 400 µL de etanol a 50 %. Esse preparado lisado foi transferido para uma coluna específica do kit inserida a um tubo coletor, no qual, o DNA possui afinidade eletrostática pela membrana de sílica. O conjunto foi centrifugado por um minuto a 6000 x g. O tubo coletor foi então descartado, a coluna colocada em um novo tubo coletor e acrescida de 500 µL de tampão de lavagem I (adicionada de etanol). O conjunto foi centrifugado por um minuto a 8000 x g. O líquido que passou pela membrana de sílica foi descartado e a coluna recolocada no mesmo tubo coletor. Posteriormente, 500 µL de tampão de lavagem II (acrescida de etanol) foi adicionado e o conjunto centrifugado por três minutos a velocidade máxima (≥12000 x g). Foi descartado o tubo coletor para remover todos os resíduos celulares e sais presentes nas soluções utilizadas. A coluna foi transferida para um tubo estéril (1,5 mL) de microcentrifuga. Foi adicionado 200 µL de solução de eluição para eluir o DNA genômico. O conjunto ficou a 34 temperatura ambiente por dois minutos e foi centrifugado por um minuto a 8000 x g. Enfim, a coluna de purificação foi descartada e o DNA purificado foi imediatamente utilizado. Para a quantificação e avaliação da qualidade do purificado, foi realizada a relação de 260/280 no Nanodrop 2000c. 3.3.2 qPCR As amostras foram processadas no Laboratório do Instituto de Biotecnologia da Universidade Estadual Paulista (UNESP) no Campus de Botucatu – São Paulo – Brasil. Para a extração do DNA, o baço foi pesado em novos tubos livres de ácidos nucléicos de 1,5 mL em uma balança analítica até atingir 10 mg. Em seguida, o tecido foi macerado e submetido à extração de DNA com o Kit GEneJet Genomic DNA Purification (Thermo Scientific®) conforme recomendação do fabricante. Em seguida, foi realizada a quantificação e a avaliação da correlação de 260/280 para verificar o grau de pureza das amostras. Foram utilizadas amostras com concentração acima de 5 ng/µL e relação acima de 1,7. Após a extração de DNA, todas as amostras foram submetidas a qPCR para detecção de Francisella noatunensis orientalis. O par de primers utilizado que reconhece o gene iglC da região ribossomal 16S e o tamanho esperado do produto (SOTO et al., 2010) estão listados na Tabela 1. TABELA 1. Primers utilizados para pesquisa de Francisella noatunensis orientalis. Primer Sequência (5’ a 3’) Tamanho esperado do produto IglcF GGGCGTATCTAAGGATGGTATGAG 88 pb IglcR AGCACAGCATACAGGCAAGCTA 35 O mix da reação de qPCR foi constituído de 12,5 µL de Gotaq qPCR Mastermix 2X (Promega®), 0,5 µL (concentração 10,0 pmol/µL) de cada primer (iglC foward e iglC reverse), 4,0 µL de DNA extraído e 7,5 µL de água livre de ácidos nucléicos. Todas as amostras apresentaram relação 260/280 acima de 1,7, não havendo a necessidade de nova extração. Como controle positivo foi utilizado DNA da bactéria Francisella noatunensis orientalis previamente identificada, sequenciada e caracterizada (RODRIGUES, 2016) *. Para a realização da qPCR foi feita a desnaturação inicial a 95ºC por 15 minutos, seguido por 40 ciclos de 95ºC durante 15 segundos, 60ºC por um minuto. A reação foi realizada no termociclador Applied Biosystems 7500 Fast Real-time PCR Systems (Applied Biosystems/ Life Technologies®). Para a visualização dos resultados foram analisadas as curvas de amplificação e de melting, comparando com o controle positivo e negativo. 3.4 Sequenciamento Duas amostras positivas na qPCR, oriundas dos frigoríficos A e C, foram então purificadas do amplificado utilizando o kit Ilustra MicrospinTM S-400 HR Columns kit (GE Healthcare®) conforme recomendação do fabricante. O sequenciamento foi realizado pelo Método de Sanger (SANGER et al., 1977). Os amplicons foram sequenciados usando o BigDyeTM Terminator Cycle sequencing kit (Applied Biosystems®) no sequenciador Applied Biosystems capillary 3500 Genetic Analyser. A qualidade dos electroferogramas foi realizada no programa Sequencing Analysis version 5.4 (Applied Biosystems®). Após a obtenção das sequências, estas foram alinhadas após a remoção dos primers e gerado o consenso no software Bioedit versão 7.2.5 (Hall, 1999). Posteriormente, as sequências foram submetidas no banco de dados do genbank para pesquisa de similaridade com outras sequências com o uso do algoritmo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). _____________________ *Rodrigues, M.V. Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista – UNESP – Campus de Botucatu (comunicação pessoal, 2016). 36 3.5 Análise estatística O estudo estatístico do sexo, da massa corpórea e do comprimento das tilápias foi realizado através da análise de variância Anova e complementado com o teste de comparações múltiplas de Kramer-Tukey. O teste do Qui- quadrado foi utilizado para determinar a associação entre a prevalência da Francisella spp., o sexo e o tamanho dos peixes analisados. Para o teste do Qui- quadrado foi utilizado o Software R versão 2.14.2 de domínio público (R DEVELOPMENT CORE TEAM, 2011). Os resultados do sexo, da massa corpórea e do comprimento das tilápias foram expressos em média ± erro padrão da média. As conclusões estatísticas foram realizadas com 5 % de significância (MONTGOMERY, 2013). 4. RESULTADOS O estudo demonstrou que os peixes fêmeas apresentaram massa corpórea (g) e comprimento (cm) menores significativamente (p<0,0001) quando comparados com os machos (Tabela 2). TABELA 2. Média ± erro padrão da massa corpórea (g) e do comprimento (cm) de Oreochromis niloticus machos e fêmeas. Análise estatística complementado com o Teste Kramer-Tukey (p<0,05). Análise n Macho Fêmea Média Massa corpórea (g) 150 1 034,76 ± 19,32 B(1) 811,90 ± 36,84 A 1 003,56 ± 18,48 Comprimento (cm) 150 30,34 ± 0,20 B(2) 27,88 ± 0,43 A 29,99 ± 0,20 (1) p<0,0001; e (2) p<0,0001. 37 Algumas lesões foram identificadas nos peixes avaliados. Hepatomegalia estava presente em 21,33 % (32/150) dos peixes, esplenomegalia em 4,16 % (5/150) e úlcera nos lábios superiores em 0,66 % (1/150). Frente as lesões observadas, durante a necropsia surgiu a hipótese de se tratar de uma infecção bacteriana. Pela presença de esplenomegalia foi realizado a qPCR para Francisella spp. (Figura 16). FIGURA 16. Porcentagem (%) de lesões observadas nas tilápias (Oreochromis niloticus), presentes nos frigoríficos A, B e C, localizados na bacia hidrográfica do rio Araguari, Minas Gerais, Brasil. As variáveis sexo e comprimento foram avaliadas para verificação se essas características são fatores de risco para o desenvolvimento da franciselose, observando a não significância (p>0,05) conforme dados expressos na Tabela 3. 0 5 10 15 20 25 30 35 Frigorífico A Frigorífico B Frigorífico C Total Úlcera nos lábios superiores Esplenomegalia Hepatomegalia 38 TABELA 3. Associação entre a presença de Francisella spp. e sexo e comprimento das tilápias (Oreochromis niloticus) analisadas. Categoria Positividade qPCR Valor de p Sexo 0,16 Fêmea 9,52 % (2/21) Macho 3,10 % (4/129) Comprimento (cm) * 0,96 27,0 12,5 % (1/8) 29,0 9,52 % (2/21) 29,5 16,6 % (1/6) 30,0 12,5 % (1/28) 31,5 16,67 %(1/6) * Os dados relativos ao comprimento das tilápias listados na tabela se referem as amostras positivas. Dos 150 peixes analisados, seis foram positivos para Francisella spp. pela qPCR. Na Tabela 5, pode-se observar a prevalência de animais positivos para Francisella spp. por qPCR. TABELA 4. Porcentagem (%) da lesão macroscópica e da confirmação laboratorial da presença de Francisella spp. pela qPCR em baço de tilápias machos e fêmeas. Análise n Macho Fêmea Média qPCR 150 3,10 % (4/129) 9,52 % (2/21) 4,00 % (6/150) (1) O numerador é o número de positivo para Francisella spp. e o denominador é o número total na razão. Das amostras analisadas, seis foram positivas para Francisella spp. pelo teste de qPCR, o que corresponde a prevalência de 4 %. Os dados de threshold cycle e temperatura de melting das amostras positivas, controles positivo e negativo estão expressos na Tabela 6. 39 TABELA 5. Valores de cycle threshold e temperatura de melting das amostras positivas e dos controles positivo e negativo para Francisella spp. realizados pela qPCR. Amostra Cycle Threshold Temperatura de Melting (ºC) 1 35,831 77,550 2 28,985 77,163 3 31,716 77,337 4 34,640 77,862 5 31,406 77,687 6 28,379 76,988 Controle positivo 28,675 76,660 Controle negativo Indeterminado 61,971 Os pontos de amplificação das amostras positivas em relação ao controle, com a representação do Threshold e a curva de Melting estão demonstrados na Figuras 17 e 18, respectivamente. FIGURA 17. Ponto de amplificação das 6 amostras positivas de baço de tilápias na qPCR para Francisella spp. em comparação com o controle positivo Francisella noatunensis orientalis. 40 FIGURA 18. Curva de Melting para as 6 amostras positivas de baço de tilápias comparadas ao controle positivo Francisella noatunensis orientalis. Das seis amostras positivas, duas foram provenientes do frigorífico A e quatro do frigorífico C. A quantidade de amostras positivas distribuídas por frigorífico, com suas respectivas prevalências estão descritas na Tabela 7. TABELA 6. Distribuição e prevalência de amostras de baço de Oreochromis niloticus positivas para Francisella spp. pelo método de qPCR nos frigoríficos da região da bacia hidrográfica do rio Araguari, Minas Gerais, Brasil. Frigorífico Amostras positivas Prevalência (%) A 2/50 4 B 0/50 0 C 4/50 8 Total 6/150 4 3 6 5 4 1 2 Controle positivo 41 O resultado do sequenciamento para confirmação e identificação da espécie bacteriana encontrou 98 % de similaridade com a sequência de Francisella noatunensis orientalis, cepa FNO01, genoma completo, número de acesso CP012153, confirmando a espécie detectada pela qPCR. 5. DISCUSSÃO A proporção de O. niloticus, machos e fêmeas, relatada na pesquisa demonstra que a quantidade de machos (86 %) foi superior à de fêmeas (14 %). Isso se deve ao processo de inversão sexual aplicado na produção para controle populacional. Esse fato associado à homogeneidade das amostras no que se refere a comprimento, massa corpórea e sexo, explica a não significância dessas características (Tabelas 2 e 3) como fatores de risco à franciselose. Dentre as lesões observadas, a esplenomegalia foi a mais frequente e pode sugerir a presença de um processo infeccioso. Não foram observados granulomas multifocais em órgãos nos peixes estudados, o que sugere a não associação dessa lesão macroscópica à presença de Francisella spp. Outros estudos relatam a correlação de Francisella spp. com a doença granulomatosa principalmente em baço e rins de O. niloticus (MAUEL et al., 2005; MAUEL et al. 2007; SOTO et al. 2009b; OTTEM et al., 2009; JEFFERY et al., 2010; NGUYEN et al., 2015; LIN et al., 2015) bem como em outras espécies de peixes (FUKUDA et al., 2002; OSTLAND et al., 2006). Vale ressaltar que embora não tenha sido observado granuloma pela macroscopia, essa lesão pode ser observada pela microscopia, técnica não utilizada neste trabalho. Oliveira et al. (2014) em investigação de surtos nos estados de Minas Gerais e São Paulo, durante os anos de 2012 a 2014, submeteram O. niloticus com sintomatologia clínica a exame bacteriológico e necropsia. Os autores observaram uma maior frequência da doença em períodos de inverno, com a temperatura da água inferior a 22ºC e os animais mais susceptíveis foram alevinos, juvenis e adultos juvenis. No presente estudo, Francisella noatunensis orientalis foi isolada de peixes adultos e no verão, onde a idade do peixe e a temperatura da água não são fatores de predisposição dos animais à franciselose. 42 Um ponto importante é que embora tenha ocorrido uma prevalência baixa, mostra-se que a bactéria permanece no ambiente e pode infectar animais que apresentem o sistema imunológico deficiente ou com solução continuidade causado por traumas ocasionados por manejo, brigas ou parasitismo, ocasionando sérios prejuízos para os produtores. A qPCR para diagnóstico de doenças em peixes tem sido utilizada por ser uma técnica de alta especificidade e sensibilidade. Neste estudo foi observado que a curva de melting apresentava apenas um pico e na amplificação não foi visualizada positividade de amostras negativas, demonstrando sua especificidade. Além disso, esta técnica fornece resultados rápidos e de custo relativamente baixo para o produtor. Diversos autores aplicaram essa técnica para identificação de Francisella spp. em peixes (OTTEM et al., 2008; BIRKBECK et al., 2001; COLQUHOUN; DUODU 2011; JACOB et al., 2011; OLIVEIRA et al. 2014; RUANE et al., 2015), seguido do sequenciamento da porção 16S do RNA ribossomal para identificação de Francisella noatunenis orientalis (NYLUND et al., 2006; COLQUHOUN; DUODU, 2011; OLIVEIRA et al. 2014; NGUYEN et al. 2015; RUANE et al. 2015). Na reação de qPCR, a detecção da fluorescência para um determinado gene é proporcional a quantidade desse gene na amostra, assim quanto maior a quantidade de gene mais precocemente será detectada a fluorescência (VELASCO et al., 2006) corroborando com os resultados desse estudo como mostra a Tabela 5. Dessa forma, foi possível verificar que as amostras 2 e 6 apresentaram valores de Ct mais baixos e próximos do controle positivo. Isso demonstra que esses peixes provavelmente tinham uma carga bacteriana maior que os outros animais. Esse ponto é fundamental para avaliar o grau de infecção e sua patogenicidade. O diagnóstico da franciselose pela qPCR seguida pelo sequenciamento da região 16S RNAr tem possibilitado a identificação dos seguintes micro- organismos: Francisella tularensis com 97 % de similaridade, Francisella philomiragia com 98 % de similaridade e 99 % para outras espécies da bactéria deste gênero (OSTLAND et al., 2006; MAUEL et al., 2007; MIKALSEN et al., 2007; OTTEM et al., 2007; SOTO et al., 2009b). Resultado similar foi encontrado no presente estudo, onde o diagnóstico da franciselose pela qPCR seguida do 43 sequenciamento do gene iglC da região 16S ribossomal permitiu identificar a bactéria Francisella noatunensis orientalis com 98 % de similaridade. Os primeiros relatos reconhecidos de Francisella noatunensis orientalis em tilápias (Oreochromis spp.) aconteceram em Taiwan em 1992 (CHEN et al., 1994; CHERN; CHAO, 1994). Posteriormente, esse micro-organismo foi identificado em outras localidades como os Estados Unidos da América (MAUEL et al., 2007), mais especificamente na Costa Rica (MIKALSEN; COLQUHOUN, 2009; SOTO et al., 2009b), Indonésia (OTTEM et al., 2009) e Inglaterra (JEFFERY et al., 2010). Essa bactéria já foi relatada em outras espécies de peixes na Califórnia e no Japão, em animais importados da China (FUKUDA et al., 2002; OSTLAND et al., 2006). Na Tailândia, os vários surtos indicativos de franciselose tem ocorrido em tilápias vermelhas (Oreochromis spp.) que são cultivadas em sistema de tanques-rede desde o ano de 2012. Esses surtos foram investigados e Francisella noatunensis orientalis foi identificada como sendo o patógeno responsável pela sintomatologia clínica nos peixes (NGUYEN et al., 2015). Lin et al. (2015) investigaram um surto de doença granulomatosa em tilápias (Oreochromis niloticus x Oreochromis aureus) cultivadas em viveiros no sul da China. Os resultados confirmaram a presença Francisella noatunensis orientalis em baços com lesões. Esse foi o primeiro relato de franciselose em tilápias cultivadas em viveiro na China. As informações contidas no presente trabalho sobre a prevalência de franciselose em tilápias no estado de Minas Gerais – Brasil é de suma importância epidemiológica para posteriores definições efetivas de métodos de prevenção e controle. Leal et al. (2014) apresentaram o primeiro relato confirmado de Francisella noatunensis orientalis no país, porém não foi uma pesquisa de caráter epidemiológico. No estudo, os autores avaliaram 44 peixes (O. niloticus), alevinos e juvenis com sintomatologia clínica para franciselose, cultivadas em sistemas de tanques-rede, provenientes de surtos descritos em cinco regiões distintas do Estado de Minas Gerais, Brasil. Segundo Alfjorden e Ruane (2015), a prevalência de peixes infectados em uma população pode ser alta pelo fato da franciselose ser uma doença crônica na natureza e de alta infectividade. Esses autores, em um estudo realizado no sudeste da Noruega, relataram a prevalência de 6,8 % de Francisella 44 noatunensis em bacalhau (Gadus morhua L.). Soto et al. (2013a) observaram uma alta prevalência de Francisella noatunensis orientalis em Oreochromis mossambicus, Oreochromis hornorum, Oreochromis aureus e O. niloticus no Havaí, utilizando a técnica de qPCR para o diagnóstico. No presente estudo foi observada prevalência de Francisella spp. relativamente baixa em tilápias, porém quando se avalia o volume de produção da tilapicultura, sabe-se que a perda econômica devido a mortalidade e perda no ganho de peso é expressiva. Outro fator importante é que devido ao fato de a franciselose ter sido detectada em período de temperaturas quentes (novembro e dezembro) na região estudada, pode-se concluir que este agente pode permanecer no ambiente, sendo um grande problema para a piscicultura. Este fato é esclarecido pelo estudo realizado por Soto et al. (2015), o qual indicou a formação de biofilmes dessa bactéria em até 24 horas após a inoculação em ambiente controlado, com a água em diferentes temperaturas e níveis de salinidade. Tais fatos expressam a fundamental relevância do estudo no que se refere às práticas de prevenção a serem aplicadas pelos produtores e responsáveis técnicos no intuito de controlar a doença em seus plantéis. Práticas efetivas para o controle e prevenção da Francisella spp. nos cultivos de O. niloticus envolvem basicamente o desenvolvimento de programas sanitários de monitoramento de alevinos, controle estrito do trânsito de animais, monitoramento contínuo e manutenção de adequada qualidade da água, adequada nutrição e alimentação, desenvolvimento de vacinas a médio prazo e exames laboratoriais de rotina mesmo em lotes aparentemente saudáveis (KUBITZA, 2008). Mais estudos sobre a prevalência de Francisella spp. em tilápias devem ser realizados em outras regiões do Brasil, com o objetivo de esclarecer sobre a real situação desse micro-organismo nos plantéis e o prejuízo econômico decorrente de sua presença, o que servirão de suporte para as autoridades sanitárias. 45 6. CONCLUSÃO Os resultados desse estudo indicam que a Francisella noatunensis orientalis está presente nos criatórios de tilápias da região da bacia hicrográfica do rio Araguari, Minas Gerais, Brasil. O sexo e o tamanho dos peixes não influenciam na taxa de infecção deste micro-organismo. Mesmo com a prevalência numérica relativamente baixa, esse achado pode levar à instauração, por parte dos órgãos governamentais, de condutas de vigilância dos casos de franciselose no país, devido às importantes perdas econômicas geradas por seu agente etiológico em fazendas de cultivo de Oreochromis niloticus. 7. REFERENCIAS ALFJORDEN, A.; RUANE, N. Francisellosis of Atlantic cod (Gadus morhua L.). International Council for the Exploration of the Sea (ICES) - Identification leaflets for diseases and parasites of fish and shellfish, Leaflet No. 64, 4p. 2015. APPLIED BIOSYSTEMS. DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Applied Biosystems Chemistry Guide. Second Edition. 2009. Disponível em: https://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents/gen eraldocuments/cms_041003.pdf. Acesso em: 14 de abr. 2016. AUSTIN, B; AUSTIN, D.A. Bacterial fish pathogens. 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