LUCIANA PEREIRA MACHADO ERITROGRAMA, GLUTATIONA REDUZIDA E SUPERÓXIDO DISMUTASE ERITROCITÁRIOS E METAHEMOGLOBINA EM EQUINOS DA RAÇA ÁRABE SUBMETIDOS A EXERCÍCIO EM ESTEIRA. EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO COM VITAMINA E (DL-ALFA-TOCOFEROL) Botucatu - SP 2006 LUCIANA PEREIRA MACHADO ERITROGRAMA, GLUTATIONA REDUZIDA E SUPERÓXIDO DISMUTASE ERITROCITÁRIOS E METAHEMOGLOBINA EM EQÜINOS DA RAÇA ÁRABE SUBMETIDOS A EXERCÍCIO EM ESTEIRA. EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO COM VITAMINA E (DL-ALFA-TOCOFEROL) Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Campus de Botucatu, para obtenção do Título de Mestre em Medicina Veterinária. Orientadora: Profa. Dra. Aguemi Kohayagawa Botucatu-SP 2006 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE Machado, Luciana Pereira. Eritrograma, glutationa reduzida e superóxido dismutase eritrocitários e metahemoglobina em eqüinos da raça Árabe submetidos a exercícios em esteira: efeito da suplementação com vitamina E (dl-alfa-tocoferol) / Luciana Pereira Machado. – Botucatu : [s.n.], 2006. Dissertação (mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, 2006. Orientador: Prof. Dr. Aguemi Kohayagawa Assunto CAPES: 50503030 1. Patologia clínica veterinária – Eqüinos. 2. Eqüino. 3. Vitamina E na nutrição animal. CDD 636.1089 Palavras chave: Eqüino; Fisiologia do exercício; Malondialdeído; Metabolismo oxidativo eritrocitário; Vitamina E. Dedico este trabalho aos meus pais, Feliciano e Maria Edelvira. Pessoas simples que empenharam suas vidas na formação dos filhos. Exemplos de abnegação, humildade e amor. Que eu possa merecer o orgulho de meus pais. Aos meus irmãos, Osmar e Fabiana, e aos meus cunhados Rosenir e Namour, pelo amor e apoio constante, compreendendo e suprindo minha ausência na família. À Profa. Dra. Aguemi Kohayagawa, exemplo de dedicação e sabedoria, presença alegre e carinhosa, apoio e compreensão nos momentos difíceis. Sua conversa amiga sempre me renovou as esperanças. Todo mundo ama um dia Todo mundo chora Um dia a gente chega Um outro vai embora Cada um de nós compõe a sua história E cada ser em si carrega o dom de ser capaz De ser feliz... (Almir Sater, Renato Teixeira) Este trabalho só foi possível graças à colaboração direta ou indireta de muitas pessoas. Manifesto minha gratidão a todas elas e de forma particular: À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), por possibilitar e execução deste trabalho por meio da Acessoria Científica e financiamento do Projeto de Pesquisa e pela concessão da Bolsa de Estudos, permitindo minha total dedicação ao Curso de Pós-Graduação. Ao Curso de Pós-Graduação desta Faculdade, por permitir a realização de mais uma etapa de minha vida profissional. À minha orientadora Profa. Dra. Aguemi Kohayagawa pela confiança depositada permitindo a realização deste trabalho com o qual aprendi muito, mais do que isso agradeço a oportunidade de poder desfrutar da convivência com uma pessoa de tão grandes conhecimentos científicos e sabedoria de vida. Ao Prof. Dr. Armen Thomassian agradeço não apenas por permitir a utilização do Centro de Medicina Esportiva Eqüina e da esteira para eqüinos indispensáveis à realização deste experimento, mas principalmente por compartilhar o seu amplo conhecimento em Medicina Esportiva Eqüina e pelo auxilio nos momentos de dificuldades. Às pós-graduandas Mere Erika Saito e Veridiana Fernandes da Silveira, minhas companheiras de equipe, pilares deste trabalho em todas as fases, com quem aprendi muito, agradeço a amizade, solidariedade e paciência, continuando a me ajudar mesmo quando eu estava estressada escrevendo a dissertação. Ao pós-graduando Marcos Jun Watanabe exemplo de profissionalismo, além do auxilio indispensável na utilização da esteira para eqüinos, agradeço ao companheirismo, paciência e amizade. Á pós-graduanda Regina de Cássia Veronezi, sempre disposta a ajudar no experimento mesmo nos horários mais impróprios, pelo grande auxilio nas colheitas de sangue arterial e manejo dos animais, e principalmente pela solidariedade em coisas simples como buscar um salgado quando não podia me ausentar do laboratório. Aos residentes e ex-residentes do Serviço de Cirurgia de Grandes Animais desta Faculdade, Andressa B. da Silveira, Brunna P. A. da Fonseca, Bruno C. Menarim, Lucas H. Alfaia, Maria Júlia A. Moreira e Rolf B. Modesto, pela amizade e ensinamentos transmitidos durante o projeto de pesquisa e pela ajuda com o manejo dos eqüinos. À Joandes Henrique Fonteque, Sandro Colla, Mario A. Ribeiro, Paulo Henrique e muitos outros que nos ajudaram com os eqüinos em momentos inesperados. Aos Prof. Dr. Francisco José Teixeira Neto e Prof. Dr. Stélio Loureiro Pacca Luna do Serviço de Anestesiologia do Hospital Veterinário desta Faculdade, pela disponibilização do aparelho de hemogasometria. Também aos residentes da Anestesiologia Fabio C. Restituti, Guilherme M. Mendes, Tatiane Giordano e Yuri K. de Carvalho que tão prontamente nos auxiliaram nas análises hemogasométricas. Aos professores de Laboratório Clínico Veterinário desta Faculdade, Profa. Dra. Regina Kiomi Takahira e Prof. Dr. Raimundo Souza Lopes sempre prontos a colaborar no que fosse preciso. Aos funcionários do Laboratório Clínico Veterinário desta Faculdade, Sueli de Oliveira Souza Emílio, Ilson A. Tavares e Luiz Antônio Matiazzi, e a Sônia Santi funcionária do Laboratório Enfermidades Parasitárias, pelo incentivo e amizade. Aos Prof. Dr. Carlos Alberto Hussni supervisor do Hospital Veterinário desta Faculdade, pelo apoio e ensinamentos transmitidos. Aos funcionários do Hospital Veterinário desta Faculdade, José Correa, Melissa Ágata Salemme, Antônio G. Donizete, Luiz Souza Pinto, Nadir Silvestre de Almeida, João Borioli Cassetari, Nelson Adriano, pela prontidão e ajuda nos momentos mais inesperados. Á Maria Luiza Cassetari, Sílvia Regina T. Estevam e Neísa Maria Cechinato, do Laboratório de Nutrição do Departamento de Saúde Pública da Faculdade de Medicina da UNESP - Botucatu, pela disponibilização do aparelho de cromatografia líquida de alta performance (HPLC) e pela auxilio nas dosagens do malondialdeído e vitamina E. Á Dr. Adriana Polachini do Valle supervisora do Laboratório de Análises Clinicas da Faculdade de Medicina da UNESP - Botucatu, pela disponibilização do aparelho Cobas Mira e a Bióloga Maria Salete Sartori responsável pelo Laborátorio de Bioquímica da mesma Faculdade, pelo auxilio nas dosagens da superoxido dismutase. Aos professores do Departamento de Estatística do Instituto de Biociências da UNESP - Botucatu, Prof Dr. José Eduardo Corrente, Prof Dr. Adalberto J. Crocci e em especial ao Prof. Cesar Augusto Taconelli, pelo auxilio na análise estatística dos dados. À secretária do Departamento de Clínica Veterinária desta Faculdade, Marlene Dias Camargo, pela amizade e apoio durante o mestrado. À Denise Aparecida Fioravanti Garcia, Maria Aparecida D. A. Manuel e Maria Regina T. Forlin da Secretaria de Pós-Graduação desta Faculdade, pelo incentivo e auxilio. Aos funcionários da Biblioteca da UNESP – Botucatu, pelos serviços prestados com tão bom humor e carinho. Aos queridos amigos, Geisa Kleemann, Juliana (jara), Juliana Zuppi, Valéria de Oliveira, Silvia Almeida, Joandes Henrique Fonteque, Kátia Sales, Daniele Duarte, Catharine Ferrazoli, Vanessa Viscardi, Fabiano Séllos, Aruaque L. F. de Oliveira e aos vários estagiários passageiros, mas marcantes e principalmente a Mere Erika Saito e Rafael Torres Neto, por compartilharem comigo o mesmo teto, quantos momentos inesquecíveis, apoio na dificuldade, até nas desavenças um aprendizado, alegria de voltar para casa após um dia cansativo de trabalho, uma verdadeira família. Aos queridos amigos que fiz em Botucatu, Adriane Jorge Mendonça e familia, Andrey Borges, Flávia Quaresma e família, José Maria Russo Junior (Jr), Lívia Figueiredo Torres, Luciano Santos da Fonseca, Andressa Inaba, Alexandre Carnieto, Karla Higino de Campos, Nayro Xavier Alencar, Karina Rodrigues dos Santos, José Paes Filho, Daniela Campagnol, Sílvia Almeida e família, Simone Argenton, Raquel Reis Martins, Satie Katagiri, Flávio Paz, Thiago Martins, Viviane von Ah, Zuel Junior e aos que não foram mencionados, mas foram todos muito importantes, me renovando as energias com sua amizade. Aos meus professores da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul em especial à Profa Josephina Montanari Rosa Rangel que me contagiou com seu amor pela Patologia Clínica, ao Prof. Dr. Rafael de Rossi e a Prof a. Dr a. Verônica Jorge Babo, que sempre acreditaram em mim e me apoiaram. Ao Dr. Pedro Paulo Pires do Setor de Sanidade Animal da Embrapa Gado de Corte e à Maristela Martins Halverson do Laboratório Veterinário Vet Analysis, pelos ensinamentos, pelo incentivo e pelas oportunidades durante a vida acadêmica que influenciaram a minha trajetória profissional. Às residentes Renata Couto, Cynthia Lucidi, Sandra Curotto e Gracy Canto Gomes do Laboratório Clinico Veterinário desta Faculdade, pela amizade e incentivo. Aos grandes amigos que deixei em Campo Grande que mesmo longe estão sempre presentes torcendo por mim, Sandra Regina Nervis, Valéria de Oliveira, Juliana Valdez Varela, Marcio César Seixas, Denise Forte, Marcos Hiroshi Mitsutsu, Mariana Pinheiro Alves Vincenzi, Robson Ferreira Cavalcante de Almeida, Sandra Regina Goularte, Willian Shingo Tanaka, Mara Lucy Marcon (in memorian), Marcos Henrique de Godoy, Simone Nervis, Mabel Saldanha, Cláudio Roberto Madruga Júnior, Márcia Cristina Barbosa, Carolina de Lacerda, Fabrício Buthevicius e Débora Ribeiro de Toledo. À amiga Valeria de Oliveira por ceder seu dom artístico na arte gráfica da dissertação. À Fonoaudióloga Ivanira Ayako Tamashiro, do Serviço de Otorrinolaringologia da Faculdade de Medicina de Botucatu/UNESP, pelo trabalho carinhoso que tem me ajudado a superar minhas dificuldades de fonação. À cidade de Botucatu e seus cidadãos, que tão bem me acolheram e que sempre ocuparão um espaço carinhoso em minhas lembranças, vim apenas para estudar, mas hoje sou um pouquinho botucatuense. E principalmente, a Deus que com sua sabedoria e bondade infinita guiou-me em todos os momentos. MACHADO, L.P. Eritrograma, glutationa reduzida e superóxido dismutase eritrocitários e metahemoglobina em eqüinos da raça Árabe submetidos a exercício em esteira. Efeito da suplementação com vitamina E (dl-alfa- tocoferol). 2006. 99 p. Dissertação (Mestrado em Clínica Veterinária) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu. RESUMO O objetivo deste trabalho foi avaliar o metabolismo oxidativo eritrocitário em eqüinos submetidos ao exercício em esteira de alta velocidade, e o efeito da suplementação com vitamina E. Oito eqüinos adultos da raça Árabe, machos e fêmeas, foram divididos em: grupo controle (GC) e grupo suplementado com vitamina E (GE) (1000 UI/animal/dia). Todos os animais foram submetidos a duas provas (P1 e P2) de exercício progressivo em esteira, P1 (pré-treinamento) e P2 (pós-treinamento). O protocolo de exercício para as duas provas iniciou-se à 1,8m/s por 5 min, 4m/s por 3min, 6m/s por 2min seguido de fases de 1min em velocidades crescentes até que os animais conseguissem manter-se em exercício, com a esteira inclinada a 7%. Entre as provas foi realizado um protocolo de treinamento com a esteira em posição horizontal, por 20 dias. Foram colhidas amostras de sangue antes, durante e até 120 horas após o exercício, para a determinação do eritrograma, proteínas plasmáticas totais (PPT), glutationa reduzida (GSH), superóxido dismutase (SOD), metahemoglobina, fragilidade osmótica eritrocitária (FO), malondialdeído (MDA) e vitamina E séricos, atividade enzimática sérica do aspartato aminotransferase (AST) e da creatinaquinase (CK), lactato sanguíneo e hemogasometria. Os resultados foram comparados pelos testes não paramétricos de Mann-Whitney e Friedman. Apesar de serem observadas diferenças significativas apenas em poucas variáveis, foi possível verificar elevações no eritrograma e PPT por contração esplênica e/ou redução do volume plasmático, e aumento do volume eritrocitário por tumefação. Observou-se “anemia do esporte” entre 24h e 120h pós-exercício. A metahemoglobina foi compatível com níveis fisiológicos e a FO aumentou durante o exercício em ambos os grupos. A elevação do MDA comprova a lipoperoxidação por efeito do exercício, atenuado no GE pela suplementação com vitamina E. O exercício induziu ainda aumento do AST, CK, lactato e acidose metabólica. Palavras-chave: eqüino; fisiologia do exercício; malondialdeído; metabolismo oxidativo eritrocitário; vitamina E. MACHADO, L.P. Erythrogram, erythrocyte reduced glutathione and superoxide dismutase, methemoglobin in Arabian horses submitted to exercise on high- speed treadmill. Effect of the supplementation with vitamin E (dl-alfa- tocopherol). 2006. 99p. Thesis (Master in Clinical Veterinary) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu. ABSTRACT The objective of this study was to evaluate the oxidative erythrocyte metabolism in equines submitted to exercise on high-speed treadmill and the effect of vitamin E supplementation. Eight adults Arabian horses, males and females, were divided: control group (CG) and group supplemented with vitamin E (EG), (1000 UI/animal/day). All the equines were submitted to exercise with two incremental tests (T1 and T2). Exercise protocol for two tests started with 1.8m/s for 5 min, 4m/s for 3 min, 6m/s for 2 min and right after, periods of 1 min, challenging the equines with increasing speeds until the animals had no condition to keep the exercise on a treadmill inclined at 7%. Between the tests, a training protocol was performed for 20 days. Blood samples were taken before, during, and until 120 hours after exercise to determine erytrogram, erythrocyte reduced glutathione (GSH), superoxide dismutase (SOD), methemoglobin, erythrocyte osmotic fragility (EOF), total plasmatic protein (TPP), seric malondialdehyde (MDA) and vitamin E, seric enzymatic activity of aspartate aminotransferase (AST) and creatine kinase (CK), blood lactate and blood- gas. The results were compared by non-parametric Mann-Whitney and Friedman tests. Although differences were detected in only a few variables, it was possible to see increase in erytrogram and TPP by spleenic contraction and/or decrease of the plasma volume, and increase the erythrocyte volume by swelling. “Sport anemia” was observed between 24h and 120h after the exercise. The methemoglobin was compatible with the physiological levels and the EOF increased during the exercise in both groups. The MDA elevation confirm the liperoxidation by exercise effect, less intense EG by the supplementation with vitamin E. The exercise also induced increase of AST and CK enzymes, increase of blood lactate and metabolic acidosis. Key-words: equine; physiology of exercise; malondialdehyde; erythrocyte oxidative metabolism; vitamin E. LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS [HCO - 3] - Íon bicarbonato µµmol/gHb - Micromol por grama de hemoglobina µmol/L - Micro mol por litro AST - Aspartato aminotransferase ATP - Adenosina trifosfato bpm - Batimentos por minuto CHCM - Concentração de hemoglobina corpuscular média CK - Creatinoquinase ctCO2 - Concentração total de gás carbônico DDE - Distribuição do diâmetro dos eritrócitos EDTA - Ácido etilenodiaminotetracético EM - Metabolismo oxidativo de Embden-Meyerhorf EROs - Espécies reativas ao oxigênio FC - Freqüência cardíaca fL - Fentolitro FO - Fragilidade osmótica eritrocitária FR - Freqüência respiratória g/dL - Grama por decilitro G-6-PD - Glicose-6-fosfato-desidrogenase GC - Grupo controle GE - Grupo suplementado com vitamina E GSH - Glutationa reduzida GSHPx - Glutationa peroxidase GSHRed - Glutationa redutase GSSG - Glutationa oxidada H+ - Íon hidrogênio H2O2 - Peróxido de hidrogênio H50 - Concentração de cloreto de sódio que induz 50% de hemólise Hb - Hemoglobina He - Número de eritrócitos m/s - Metros por segundo M0 - Momento de colheita ao repouso, antes do exercício MDA - Malondialdeído MetHb - Metahemoglobina mg/dL - Miligramas por decilitro mmHg - Milímetros de mercúrio mmol/L - Milimol por litro mpm - Movimentos por minuto NaCl - Cloreto de sódio NADH - Nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida NADPH - Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida nmol/mL - Nanomol por mililitro O2 - Oxigênio molecular O2 •• - - Ânion superóxido oC - Graus Celsius OH•• - Radical hidroxila P1 - Primeira prova de exercício (antes do treinamento) P2 - Segunda prova de exercício (pós-treinamento) PaCO2 - Pressão parcial de gás carbônico PaO2 - Pressão parcial de oxigênio PE - Momentos de colheita após o exercício pH - Potencial hidrogeniônico PPT - Proteína plasmática total SH - Grupamento sulfidrila SOD - Superóxido dismutase TA - Temperatura ambiente UI/gHb - Unidade internacional por grama de hemoglobina UI/L - Unidade internacional por litro UR - Umidade relativa do ar V200 - Velocidade na qual a freqüência cardíaca atinge 200 batimentos por minuto V4 - Velocidade na qual o lactato atinge 4mmol/L VCM - Volume corpuscular médio VG - Volume globular SUMÁRIO RESUMO ABSTRACT LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS 1. INTRODUÇÃO............................................................................................. 15 2. REVISÃO DE LITERATURA........................................................................ 17 3. OBJETIVOS................................................................................................. 28 3.1. Geral..................................................................................................... 28 3.2. Específicos........................................................................................... 28 4. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................. 29 4.1. Animais................................................................................................. 29 4.2. Delineamento experimental.................................................................. 29 4.2.1. Grupos experimentais..................................................................... 29 4.2.2. Momentos...................................................................................... 30 4.3. Adaptação à esteira de alta velocidade................................................ 31 4.4. Exame videoendoscópico do aparelho respiratório anterior com o animal em repouso e laringoscopia com o animal em movimento........ 32 4.5. Avaliação cinemática do aparelho locomotor....................................... 32 4.6. Suplementação com vitamina E........................................................... 32 4.7. Procedimentos pré-exercício................................................................ 33 4.8. Primeira prova de exercício em esteira (P1)........................................ 33 4.8.1. Protocolo de exercício................................................................... 33 4.8.2. Exame clínico e condições ambientais.......................................... 34 4.8.3. Colheita de amostras..................................................................... 34 4.9. Treinamento em esteira........................................................................ 35 4.10. Segunda prova de exercício em esteira (P2)..................................... 35 4.11. Exames laboratoriais.......................................................................... 36 4.11.1. Eritrograma.................................................................................. 36 4.11.2. Proteína plasmática total (PPT)................................................... 36 4.11.3. Glutationa reduzida eritrocitária (GSH)....................................... 36 4.11.4. Superóxido dismutase eritrocitária (SOD)................................... 37 4.11.5. Metahemoglobina ....................................................................... 37 4.11.6. Fragilidade osmótica eritrocitária (FO)........................................ 37 4.11.7. Malondialdeído (MDA)................................................................. 38 4.11.8. Vitamina E sérica ........................................................................ 38 4.11.9. Aspartato aminotransferase (AST) e creatinaquinase (CK) ....... 38 4.11.10. Lactato sanguíneo..................................................................... 38 4.11.11. Potencial hidrogeniônico (pH) sangüíneo e hemogasometria... 39 4.12. Análise estatística............................................................................... 39 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................... 40 5.1. Avaliação videoendoscópica do aparelho respiratório anterior, laringoscopia e avaliação cinemática da locomoção.......................... 40 5.2. Provas de exercício progressivo em esteira (P1 e P2)........................ 40 5.2.1. Eritrograma e proteína plasmática total (PPT).............................. 40 5.2.2. Glutationa reduzida, superóxido dismutase, metahemoglobina e fragilidade osmótica eritrocitária .................................................. 52 5.2.3 Malondialdeído e vitamina E.......................................................... 60 5.2.4 Aspartato aminotransferase e creatinaquinase.............................. 64 5.2.5 Distância percorrida e velocidade máxima, lactato sangüíneo, freqüência cardíaca, potencial hidrogeniônico e hemogasometria........................................................................... 69 5.2.6 Freqüência respiratória e temperatura retal .................................. 76 5.2.7. Temperatura ambiente e umidade relativa do ar .......................... 78 5.3. Treinamento em esteira........................................................................ 79 5.3.1. Freqüência cardíaca, freqüência respiratória, temperatura retal, temperatura ambiente e umidade relativa do ar 79 6. CONCLUSÕES............................................................................................ 84 7. REFERÊNCIAS............................................................................................ 85 Introdução 15 1. INTRODUÇÃO A principal função dos eritrócitos é carrear a hemoglobina para o transporte de oxigênio (O2), sendo esta função dependente da manutenção da hemoglobina na forma reduzida e da integridade celular, que está relacionada às características de deformabilidade, transporte iônico e fluidez da membrana (WEED, 1970; JAIN, 1993). A eficiente distribuição e liberação do O2 para os músculos durante o exercício tem relação direta com a performance atlética máxima (SMITH et al., 1995). Contudo, o maior consumo de O2 no exercício induz uma produção excessiva de metabólitos altamente reativos denominadas espécies reativas de oxigênio (EROs) (McMENIMAN & HINTZ, 1991; MOFFARTS et al., 2005) que promovem lesões oxidativas nos eritrócitos (HEBBEL, 1986; HOKAMA et al., 1997). O exercício de curto período e alta intensidade provoca alterações pronunciadas em variáveis hematológicas, bioquímicas e hemogasométricas (BALOGH et al., 2001). O aumento da temperatura corporal, desidratação, hemoconcentração e trauma mecânico aliados a maior produção de EROs são eventos relacionados com a hemólise durante o exercício (SENTÜRK et al., 2001). As lesões oxidativas ocorrem quando há um excesso da produção de EROs e/ou quando os sistemas antioxidantes tornam-se ineficazes no seu controle e eliminação (BLAND, 1995; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2001). Nos eritrócitos manifesta-se pela oxidação e desnaturação dos lipídios e proteínas de membrana e da hemoglobina (HATHERILL et al., 1991). Ao contrário da maioria das células, os eritrócitos não têm capacidade de Introdução 16 sintetizar novos lipídios e proteínas para substituir os que foram oxidados e a manutenção de níveis adequados de antioxidantes é extremamente importante (CARRELL et al., 1975; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2001), principalmente a vitamina E por estar ligada na membrana como antioxidante natural (HEBBEL, 1986; DUTTA-ROY, 1994). Estes antioxidantes são elementos ou um conjunto de processos que diminuem ou cessam a oxidação pelas EROs. (HALLIWELL, 1994; THOMAS, 2000). A vitamina E age principalmente evitando a oxidação dos lipídios de membrana (lipoperoxidação) e o seu consumo aumenta durante o estresse oxidativo provocado pelo exercício (CHOW, 1991; CLAYCOMBE & MEYDANI, 2001). O malondialdeído (MDA) é um dos produtos finais da lipoperoxidaç ão e é utilizado como índice de intensidade da mesma (STOCKS & DORMANDY, 1971; CHIARADIA et al., 1998). O esforço físico constante, da forma leve à moderada induz modificações fisiológicas adaptativas benéficas ao organismo (BALOGH et al., 2001). O exercício de treinamento aumenta a atividade das enzimas antioxidantes, entretanto, o incremento dessas defesas pode não ser proporcional às necessidades criadas pelo aumento dos eventos pro-oxidantes e afetar o requerimento de antioxidantes na dieta (SACHECK & BLUMBERG, 2001; MOFFARTS et al., 2005). Este estudo pretendeu, pela utilização da esteira de alta velocidade, avaliar o efeito do exercício e da suplementação com vitamina E sobre o metabolismo oxidativo eritrocitário. Revisão de Literatura 17 2. REVISÃO DE LITERATURA Os eritrócitos possuem funções vitais de transporte de oxigênio (O2) e dióxido de carbono, e tamponamento de íons hidrogênio (H+) (WEED, 1970; STEINBERG & BENZ JR, 2000). Particularmente nos eqüinos, o baço armazena grande quantidade de eritrócitos que quando liberados para a circulação, por contração esplênica, aumentam a capacidade de transporte de O2 (BOUCHER, et al., 1981; JAIN, 1986; MASINI et al., 2000). Estas funções não requerem energia, porém, necessitam de energia para a manutenção de características importantes como deformabilidade, transporte iônico e fluidez de membrana, evitando também a oxidação da hemoglobina (WEED, 1970; JAIN, 1993). Na ausência de mitocôndrias os eritrócitos obtêm energia na forma de adenosina tri fosfato (ATP), nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida (NADH) e nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida (NADPH), por vias glicolíticas de menor eficiência. Em condições normais, 90% da glicose é metabolisada pela via glicolítica anaeróbica de Embden-Meyerhorf (EM), produzindo ATP e NADH, e 10% pela via aeróbica pentose fosfato, também denominada via das pentoses que produz NADPH (MURPHY, 1960; PRCHALL & GREGG, 2000). A interação de eritrócitos eqüinos com oxidantes aumenta a taxa de utilizaç ão da glicose pela via das pentoses (HARVEY & KANEKO, 1977). A integridade da membrana eritrocitária é dependente do aporte de ATP (HAMBITZER, 1987; STEINBERG & BENZ JR, 2000), desta forma, o sistema glicolítico é responsável por manter a célula circulando por meses em seu estado funcional perante a exposição a lesões mecânicas e/ou metabólicas (WEED, 1970; STEINBERG & BENZ JR, 2000). Revisão de Literatura 18 A eficiente distribuição e liberação do O2 para os músculos durante o exercício é indispensável para a performance atlética máxima (SMITH et al., 1995), contudo, o maior consumo de O2 implica em produção de metabólitos de alta reatividade (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2001; SCHNEIDER & OLIVEIRA, 2004). No metabolismo celular aeróbio, o O2 sofre redução tetravalente na mitocôndria, com conseqüente formação de água e produção de energia, nesse processo são formados intermediários reativos, como o peróxido de hidrogênio (H2O2) e os radicais livres superóxido (O2 -•), hidroperoxila (HO2 •) e hidroxila (OH•), coletivamente designados espécies reativas de oxigênio (EROs) (CARRELL et al., 1975; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2001). A contínua exposição ao oxigênio e a presença de ferro e lipídios insaturados tornam os eritrócitos particularmente susceptíveis à lesão oxidativa (HEBBEL, 1986; HATHERILL et al., 1991). Além disso, é relatada a produção de O2 -• pela auto-oxidação da hemoglobina (MISRA & FRIDOVICH, 1972; THOMAS, 2000). Os radicais livres são átomos ou moléculas que apresentam vida livre e número ímpar de elétrons na camada de valência que lhe conferem alta reatividade e instabilidade (HALLIWELL, 1994). Possuem meia-vida curta, podendo reagir com qualquer biomolécula, sendo necessário apenas que estas existam na proximidade do local de sua formação (THOMAS, 2000). Em condições fisiológicos, as EROs são conseqüência natural do metabolismo oxidativo e participam da regulação de vários eventos celulares, sendo produzidas em níveis compatíveis com a capacidade de defesa do sistema antioxidante (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2001; KINNUNEN, et al., 2005a). Ao redor de 5% do total de oxigênio é convertido em EROs (JI, 1995; AVELLINI et al., 1999), comparativamente, durante o exercício ocorre um aumento de 10 a 20 vezes Revisão de Literatura 19 no consumo de oxigênio, o que resulta em produção de EROs além da capacidade de defesa (SJÖDIN et al., 1990; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2001). Este desequilíbrio entre os eventos oxidantes e antioxidantes caracteriza a condição de estresse oxidativo (HALLIWELL, 1994; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2001). As lesões oxidativas eritrocitárias ocorrem como resultado da oxidação e desnaturação da hemoglobina e das alterações causadas pelas EROs aos lipídios e proteínas de membrana (HATHERILL et al., 1991). A oxidação dos lipídios, lipoperoxidação, tem importância particular por ser uma reação em cadeia devido à formação dos peróxidos lipídicos, com poder de oxidar outros lipídios e propagar a reação (BURTON & TRABER, 1990; HALLIWELL, 1994). O malondialdeído (MDA) é um dos produtos finais da lipoperoxidação e é utilizado como índice de intensidade da mesma (STOCKS & DORMANDY, 1971; CHIARADIA et al., 1998). Pesquisadores observaram aumento na concentração de MDA em eqüinos submetidos ao exercício (CHIARADIA et al., 1998; AVELLINI et al., 1999). Algumas alterações eritrocitárias atribuídas ao exercício são características de células velhas, como a diminuição do volume corpuscular médio (VCM) e aumento da densidade dos eritrócitos (SMITH et al., 1995), que podem ser devidas à liberação de células velhas pelo baço (BOUCHER, et al., 1981, MASINI, et al., 2000). Durante o envelhecimento os eritrócitos tornam-se mais densos, devido à redução do volume celular total e ao conseqüente aumento na concentração da hemoglobina, dentre outros fatores este processo está relacionado com a depleção de antioxidantes (CHRISTIAN, 2000). Weight et al., (1991), observaram menor vida média eritrocitária em indivíduos atletas comparados a um grupo de sedentários e segundo Christian (2000), quanto maior a taxa metabólica do animal, maior o estresse oxidativo acumulado e menor a vida média dos eritrócitos. Hanzawa & Revisão de Literatura 20 Watanabe (2000) concluíram que em eqüinos a maior destruição de eritrócitos pelo exercício não excede a taxa de produção e não compromete a performance atlética, ao contrário, pode ser vantajoso visto que as células jovens são mais eficientes no transporte de oxigênio. Vários estudos em eqüinos evidenciam o aumento da produção de EROs pelo exercício (AVELLINI et al., 1999; ONO, et al., 1990; BALOHG et al., 2001; WILLIAMS et al., 2004). Durante o exercício, inicialmente o músculo utiliza o metabolismo aeróbio e anaeróbio seguido da resposta fisiológica de aumento da demanda de oxigênio. Mudanças na concentração de oxigênio podem alterar o estado de redução da mitocôndria das fibras musculares favorecendo a conversão do oxigênio em EROs, principalmente O2 •- e H2O2 (PHUNG et al., 1994; THOMAS, 2000). A lesão tecidual provocada por exercícios extremos também contribui para a produção de EROS, devido a um aumento de enzimas envolvidas na formação de radicais livres (xantina oxigenase, lipoxigenase e cicloxigenase), ativação da fagocitose, liberação de ferro e cobre ou uma interrupção da cadeia transportadora de elétrons nos locais de lesão (ROCK et al., 1996). A presença de metais de transição, principalmente o ferro e o cobre, colaboram para o estresse oxidativo por catalisar a formação de radicais livres (CLEMENS & WALLER, 1987; HALLIWELL, 1994; HARVEY, 1997). O aumento da permeabilidade da membrana devido à lipoperoxidação libera enzimas musculares e a relação destas com biomarcadores de estresse oxidativo pode resultar em importante mecanismo de avaliação de lesão muscular induzida pelo exercício (KANTER et al., 1993). O exercício pode causar hemólise em eqüinos por vários mecanismos (BOUCHER et al., 1981; HANZAWA & WATANABE, 2000). Segundo Sentürk et al. Revisão de Literatura 21 (2001) a elevação da temperatura corporal, desidratação, hemoconcentração e trauma mecânico aliados a maior produção de EROs são eventos relacionados com a hemólise durante o exercício. A lesão oxidativa da membrana altera o equilíbrio osmótico intracelular e facilita a desidratação celular (SNYDER, et al., 1985). Alterações de temperatura e pH sanguíneos durante o exercício também influenciam a fragilidade osmótica eritrocitária (HANZAWA et al., 1999). A lesão oxidativa eritrocitária manifesta-se pela formação de corpúsculos de Heinz, metahemoglobina e hemólise (HARVEY & KANEKO, 1977; HARVEY, 1997). A atividade das enzimas glicolíticas eritrocitárias também é influenciada pela interação com oxidantes (TAVAZZI et al., 2000; OZTURK et al., 2003). A hemoglobina pode ser oxidada na porção heme, com oxidação do ferro e formação de metahemoglobina, incapaz de transportar oxigênio (CARRELL et al., 1975; PRCHALL & GREGG, 2000). Inevitavelmente 3% do total de hemoglobina são convertidos em metahemoglobina, porém, em condições normais ocorre redução pela enzima metahemoglobina redutase (CARRELL et al., 1975; HARVEY, 1997) com consumo de NADH, produzido pela via glicolíca EM (PRCHALL & GREGG, 2000). A oxidação da fração protéica, na porção cisteína da globina, induz à formação de pontes dissulfeto entre seus grupos sulfidrila (SH), desestruturando a molécula e podendo culminar com a formação de corpúsculos de Heinz que representam o estado final da degradação oxidativa da hemoglobina (BARRAVIERA & MACHADO, 1987). A remoção dos eritrócitos com Heinz ocorre por fagocitose no baço e fígado ou por hemólise intravascular nos sinusóides esplênicos (RIFKIND, 1965), estando relacionada com a menor deformabilidade destas células (LUBIN & DESFORGES, 1972). A característica de deformabilidade permite que os eritrócitos Revisão de Literatura 22 normais circulem por capilares de diâmetro inferiores ao seu, tendo relação direta com a vida média eritrocitária (WEED, 1970; HARVEY, 1997). Os lipídios e as proteínas que constituem a membrana eritrocitária podem sofrer degradação oxidativa por lipoperoxidação, oxidação de grupos SH das proteínas de membrana, formação de ligações ou aglomerados entre proteínas oxidadas, além de inibição de enzimas e sistemas de transporte de membrana (HARVEY, 1997). A membrana das células é uma bicamada lipídica na forma de um mosaico fluido com receptores e proteínas de transporte. A propriedade de fluidez da membrana está relacionada com ácidos graxos poliinsaturados e a viabilidade da célula com esta flexibilidade. A lipoperoxidação causa aumento da permeabilidade e perda da fluidez da membrana (SJÖDIN et al., 1990), diminuindo conseqüentemente a deformabilidade e aumentando a destruição dos eritrócitos (SNYDER et al., 1985; CHRISTIAN, 2000). Ao contrário da maioria das células os eritrócitos não têm capacidade de sintetizar novos lipídios e proteínas para substituir os que foram oxidados e a manutenção de níveis adequados de antioxidantes é extremamente importante (CARRELL et al., 1975; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2001). Estes antioxidantes são elementos ou um conjunto de processos que diminuem ou cessam a oxidação pelas EROs (THOMAS, 2000). Outras funções dos antioxidantes incluem o seqüestro de metais de transição e redução enzimática de peróxidos (HALLIWELL, 1994; THOMAS, 2000). Apesar do empenho do organismo na remoção das EROs a eficácia não é total e para atenuar as lesões inevitáveis os antioxidantes também atuam como mecanismos de reparo (HEBBEL, 1986; GUTTERIDGE, 1995). A glutationa reduzida (GSH), um tripeptídeo de ácido glutâmico, cisteína e glicina (SEN, 1997; KURATA et al., 2000) é sintetizada nos eritrócitos pelas enzimas Revisão de Literatura 23 γ-glutamilcisteína-sintetase e glutationa sintetase com consumo de ATP (HARVEY, 1997; SEN, 1997). Sua principal função é a manutenção dos grupos SH da célula na forma reduzida (COSTAGLIOLA et al., 1985). O radical SH da cisteína é a porção reativa da GSH e atua como aceptor de elétrons (HARVEY, 1997; HOKAMA, 1997). Diante da exposição a agentes oxidantes a GSH é oxidada mais rapidamente do que a hemoglobina e outros constituintes eritrocitários, protegendo-os da degradação oxidativa (JACOB & JANDL, 1966), o que resulta em depleção da GSH (SEN, 1997). A enzima glutationa peroxidase (GSH-Px) utiliza a GSH na transformação do H2O2 em água, desta reação resulta a glutationa oxidada (GSSG) (HALLIWELL, 1994; TELEN & KAUFMAN, 1999). O sistema glutationa é dependente de energia e influencia o metabolismo glicolítico eritrocitário, assim, a taxa de glicólise pela via das pentoses é regulada pela demanda de NADPH, produzido exclusivamente nesta via, e é inversamente proporcional à concentração de GSH (JACOB & JANDL, 1966). O NADPH, é utilizado pela glutationa redutase (GSHRed) na redução do GSSG para a forma reduzida (GSH) (SEN, 1997; PRCHALL & GREGG, 2000). Sob estresse oxidativo a via das pentoses é responsável por um consumo de glicose superior a 90% (TELEN & KAUFMAN, 1999). A superóxido dismutase (SOD) constitui uma classe de metaloenzimas que catalisa a dismutação do radical superóxido para O2 e H2O2 (HATHERILL et al., 1991; FALCONI et al., 2002). Sobre o peróxido de hidrogênio atua a enzima catalase que catalisa a redução deste à H2O e O2 (HARVEY, 1997; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2001). Nos eritrócitos, a SOD apresenta-se ligada a um átomo de cobre e um de zinco (CuZnSOD) constituindo sua porção ativa (OTERO et al., 1983, HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2001). Trata-se de uma enzima essencial para a Revisão de Literatura 24 sobrevivência dos eritrócitos, devido à produção de radical superóxido durante a auto-oxidação da hemoglobina (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2001) e à participação deste na formação de OH•, de maior potencial lesivo (FRIDOVICH, 1975; CHRISTIAN, 2000). Um potente antioxidante natural é a vitamina E, que abrange oito compostos: quatro tocoferóis e quatro tocotrienóis. O d-α-tocoferol representa a forma natural da vitamina E e o dl-α-tocoferol sua forma sintética (ROCK et al., 1996; BIANCHINI-PONTUSCHKA & PENTEADO, 2003). Sua principal função é interromper a propagação da reação de lipoperoxidação, por ser mais susceptível à oxidação que os lipídios de membrana e pela transformação dos peróxidos em formas menos reativas, durante a sua oxidação (BURTON & TRABER, 1990; HALLIWELL, 1994). A vitamina E oxidada é reduzida à sua forma ativa pela GSH (SEN, 1997; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2001) e pela vitamina C (CLEMENS & WALLER, 1987; HALLIWELL, 1994), um potente agente redutor (ROCK et al., 1996). Apesar do seu conhecido efeito antioxidante na presença de metais de transição a vitamina C pode atuar como um agente oxidante (HALLIWELL, 1994). A vitamina E tem papel importante na prevenção da hemólise por manter a estabilidade das membranas (HATHERILL et al., 1991; MEYDANI, 1995), Dutta-Roy et al. (1994) caracterizaram uma proteína na membrana que se liga ao α-tocoferol para incorporá-lo na bicamada lipídica da membrana eritrocitária. Stowe (1968) determinou o requerimento diário de vitamina E em eqüinos, necessário para manter a estabilidade do eritrócito, sendo que este variou de 17 a 38 µg/Kg de peso por dia usando-se α-tocoferol injetável, e 120 a 330 µg/Kg quando foi administrado α- tocoferol oral. Segundo Craig et al., (1989) a concentração plasmática adequada de Revisão de Literatura 25 vitamina E compreende valores entre 1,5 a 2,0 µg/mL, os mesmos encontraram variações nas concentrações plasmáticas de vitamina E entre eqüinos jovens a adultos. A absorção dos tocoferóis é ineficiente, apenas 20 a 40% de todo o α- tocoferol ingerido é absorvido (ROCK et al., 1996; BIANCHINI-PONTUSCHKA & PENTEADO, 2003). A vitamina E é transportada por lipoproteínas de baixa densidade produzidas pelo fígado, sendo a principal responsável por manter as concentrações normais de vitamina E no plasma (TRABER & PARKER, 1995; ROCK et al., 1996). A deficiência da vitamina E está associada ao aumento da fragilidade das membranas lisossomais e à diminuição da fosforilação oxidativa no músculo esquelético, fígado e tecido adiposo (SEN, 2001). Estudos, em humanos, correlacionando a produção de MDA e protetores antioxidantes, verificaram que a lipoperoxidação foi significativamente reduzida com a suplementação de vitamina E por duas semanas (KASIE et al., 2000). Várias pesquisas foram desenvolvidas em eqüinos atletas objetivando diminuir o estresse oxidativo causado pelo exercício, envolvendo a suplementação de vitamina E exclusivam ente (JI et al., 1990; CHIARADIA et al., 1998) ou associada a outros antioxidantes (ONO et al., 1990; WHITE et al., 2001; MOFFARTS et al., 2005). A fadiga durante o exercício intenso em esteira de alta velocidade está associada ao aumento da concentração de hidrogênio conseqüente da dissociação do ácido lático em H+ e lactato. O acúmulo dos íons hidrogênio induz a acidose muscular, esta afeta a produção de energia e a contração muscular, reduzindo a força contráctil do músculo. Por isso, a redução do pH muscular é o principal fator limitante do desempenho durante o exercício de alta velocidade e curta duração (WILMORE & COSTILL, 2001). A queda do pH associado ao incremento de lactato e Revisão de Literatura 26 decréscimo das concentrações de bicarbonato após o exercício indicam acidose metabólica (AGUILERA-TEJERO et al., 2000). Durante o exercício leve e moderado, o ATP para a contração muscular é obtido pela oxidação do hidrogênio. O exercício intenso provoca hipóxia tecidual relativa e devido à deficiência de oxigênio a demanda de energia é atendida parcialmente pela glicólise anaeróbica, aumentando conseqüentemente a concentração de lactato (McARDLE et al., 1998). Quando a velocidade de remoção do lactato é inferior à velocidade de produção ocorre acúmulo e elevação de maneira exponencial (WILMORE & COSTILL, 2001). No eqüino a concentração de 4mmol/L de lactato sangüíneo indica o início do metabolismo anaeróbio (KAMERLING, 1993; WILMORE & COSTILL, 2001). Em cavalos da raça Árabe submetidos ao exercício progressivo em esteira este valor foi atingido à velocidade de 8m/s com 6% de inclinação (THOMASSIAN et al., 2005). O exercício anaeróbico diminui o pH sanguíneo e aumenta a fragilidade osmótica eritrocitária por lesão oxidativa da membrana, enquanto o aumento do pH promove maior resistência osmótica (HANZAWA & WATANABE, 2000). Em contrapartida, o lactato pode ser utilizado pelos eritrócitos na produção de NADH, tendo efeito benéfico na redução da metahemoglobina (HANZAWA & WATANABE, 2000). Diferente de outras raças, eqüinos da raça Árabe submetidos ao exercício progressivo possuem a habilidade de manter altos níveis de ventilação alveolar evitando a hipercapnia e acidose, induzidas pelo exercício (TAYLOR et al., 1998). A eficiente distribuição e liberação do O2 pelos eritrócitos para os músculos durante o Revisão de Literatura 27 exercício é um importante determinante da performance atlética máxima (SMITH et al., 1995). Um único episódio de exercício intenso aumenta a susceptibilidade dos eritrócitos ao estresse oxidativo e o treinamento de resistência regular confere efeito protetor (SMITH et al., 1995). Contrariamente, Moffarts e colaboradores (2005), observaram redução de alguns antioxidantes em eqüinos submetidos ao treinamento de três meses. Segundo Sacheck et al. (2001), o incremento das defesas antioxidantes no treinamento pode não ser proporcional às necessidades criadas pelos eventos pró-oxidantes e afetar o requerimento de antioxidantes na dieta, que depende da duração e da intensidade do exercício, do programa de treinamento, idade, dieta e estado de saúde do animal. Segundo Avellini e colaboradores (1995), os níveis de vitamina E muscular e hepático estão reduzidos durante o exercício, enquanto os níveis no plasma e eritrócitos estão significativamente elevados, provavelmente por mobilização (AVELLINI et al., 1995). Atualmente, há uma preocupação geral quanto à importância dos antioxidantes na prevenção do desenvolvimento de doenças. O conhecimento da interação entre mecanismos antioxidantes e o exercício é importante na avaliação da eficácia da suplementação da dieta com antioxidantes (JI, 1999). Objetivos 28 3. OBJETIVOS 3.1. Geral O presente trabalho teve como objetivos avaliar o metabolismo oxidativo eritrocitário em eqüinos da raça Árabe submetidos ao exercício progressivo em esteira de alta velocidade e o efeito da suplementação com vitamina E. 3.1. Específicos • Avaliar o eritrograma e o metabolismo oxidativo eritrocitário por meio da determinação de antioxidantes eritrocitários (glutationa reduzida e superóxido dismutase), metahemoglobina e fragilidade osmótica eritrocitária. • Avaliar o efeito do exercício e da suplementação com vitamina E sobre os níveis de malondialdeído e vitamina E séricos, atividade enzimática do aspartato aminotransferase e da creatinaquinase séricas, lactato sangüíneo e hemogasometria. Material e Métodos 29 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. Animais Foram utilizados oito eqüinos adultos, da raça Árabe, três machos castrados e cinco fêmeas, com idade variando de 3,5 a 9,5 anos e peso médio de 383kg, clinicamente sadios, selecionados pelo exame físico (SPEIRS, 1999), hemograma (KRAMER, 2000) e avaliação bioquímica (ROSE & HODGSON, 1994; KANEKO et al., 1997). Não tendo realizado nenhum tipo de exercício programado no período de um ano anterior ao experimento. Estes foram mantidos nos piquetes do Departamento de Cirurgia e Anestesiologia Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) da Universidade Estadual Paulista-UNESP/Campus de Botucatu, localizada a 48º52’ longitude oeste, 22º52’ latitude sul, a 756 metros acima do nível do mar. A medicação anti-helmíntica à base de ivermectina (Padock Plus, Vetbrands Saúde Animal, Brasil) foi administrada por via oral a cada três meses. O manejo nutricional consistiu de ração comercial para eqüinos (Proequi 13 – Guabi - Mogiana Alimentos AS, Brasil), feno de capim coast-cross (Cynodon dactylon), suplemento mineral (Sal Mineral Centauro 80 – Mogiana Alimentos AS, Brasil) conforme recomendações de Lewis (2000) e água ad libitum. 4.2. Delineamento experimental (Figura 1) 4.2.1. Grupos experimentais Os eqüinos foram aleatoriamente alocados em dois grupos de quatro animais. Grupo controle (GC) e grupo suplementado com vitamina E (GE). Material e Métodos 30 4.2.2. Momentos Os animais foram avaliados antes, durante e após o exercício, de acordo com cada variável (Figura 1 e Quadro1) nos seguintes momentos: • Antes do exercício: momento zero (M0) • Durante o exercício: trote (4m/s) e galope (média dos resultados à 8m/s, 9m/s e 10m/s). • Pós-exercício (PE): imediatamente após (PE1), 15min (PE2), 30min (PE3), 2h (PE4), 6h (PE5), 12h (PE6), 24h (PE7), 72h (PE8) e 120h (PE9) após o exercício. Figura 1. Delineamento experimental dos protocolos de exercício P1 e P2 e momentos de avaliação 10m/s PE4 2h M0 4m/s 9m/s Dia 0 =>início da suplementação GE Período de treinamento Primeira prova de exercício em esteira (P1) Protocolo de exercício de treinamento PE2 15min PE9 120h PE7 24h PE5 6h Antes do exercício Após o exercício em repouso (PE) Durante o exercício 8m/s PE1 PE6 12h PE8 72h Exercício progressivo PE3 30 min GE: 15 dias de suplementaçcão Trote Galope Momentos: PE8 72h Término da suplementação Segunda prova de exercício em esteira (P2) PE4 6h PE7 24h 10m/s 4m/s 8m/s PE1 Após o treinamento Exercício progressivo PE4 2h 9m/s PE9 120h PE6 12h M0 PE2 15min PE3 30 min Trote Galope Momentos: Material e Métodos 31 Quadro 1. Momentos de avaliação dos parâmetros laboratoriais, clínicos e ambientais realizados nas provas 1 e 2 de exercício, antes (M0), durante (trote e galope) e após o exercício (PE) Momentos Exercício Pós-exercício Trote Galope (média) PE2 PE3 PE4 PE5 PE6 PE7 PE8 PE9 Parâmetros M0 4m/s 8m/s 9m/s 10m/s PE1 15min 30min 2h 6h 12h 24h 72h 120h Eritrograma X X X X X X X X X X X X X X Proteína plasmática total X X X X X X X X X X X X X X Glutationa reduzida X X X X X X X X X X X Superóxido dismutase X X X X X X X X X X X Metahemoglobina X X X X X X X X X X X Fragilidade osmótica X X X X X X X X X X X Malondialdeído X X X X X X X X X X X Vitamina E X X X X X X X X X X X Aspartato aminotransferase X X X X X X X X X X X Creatinaquinase X X X X X X X X X X X Lactato X X X X X X X X pH e Hemogasometria X X X X Freqüência cardíaca X X X X X X X X Freqüência respiratória X X X X Temperatura retal X X X X Temperatura ambiente X X Umidade relativa do ar X X PE1= imediatamente após o exercíci o 4.3. Adaptação à esteira de alta velocidade Cada animal foi posicionado na esteira (Mustang 2200 AG, Kagra, Suíça) e acoplado ao corpo o cinto suspensor de segurança para iniciar a movimentação à velocidade de 0,8m/s. Após alguns passos a velocidade foi aumentada para 1,6m/s mantendo-se por 10 minutos. Nos dias posteriores a velocidade foi gradativamente elevada até que o animal pudesse realizar os andamentos ao passo, trote e galope. Este período de adaptação variou de 3 a 7 dias, dependendo da individualidade de cada animal, que foi considerado adaptado quando capaz de realizar o todos os três andamentos de forma cadenciada e uniforme. Material e Métodos 32 4.4. Exame videoendoscópico do aparelho respiratório anterior com o animal em repouso e laringoscopia com o animal em movimento Realizou-se a videoendoscopia do aparelho respiratório superior com o eqüino em tronco de contenção, utilizando aparelhagem de videoendoscopia (Olympus OTVF3) e reprodução de imagens. Foram avaliadas as seguintes estruturas: concha nasal, região do osso etmoidal, recesso faríngeo, óstios faríngeos das bolsas guturais e as estruturas da laringe visíveis ao exame. Posteriormente, realizou-se a laringoscopia com o animal em movimento para avaliar possíveis alterações dinâmicas do funcionamento da laringe durante o exercício. 4.5. Avaliação cinemática do aparelho locomotor Os eqüinos foram submetidos ao exercício na esteira de forma que procedesse todo o andamento: passo, trote, cânter e galope, sendo gravado em fita de videocassete por meio de uma câmera de vídeo (Sony). A finalidade deste exame foi verificar alguma disfunção músculo-esquelético que pudesse interferir no desempenho dos animais durante o exercício na esteira, ao longo do experimento. 4.6. Suplementação com Vitamina E A suplementação com vitamina E no grupo GE, iniciou-se 15 dias antes da primeira prova de exercício com a dose de 1.000 UI/animal/dia (CHIARADIA et al., 1998) de acetato de dl-α-tocoferol (E-Tabs-Sigma Pharma–EMS, Hortolândia, SP, Brasil). A administração foi realizada por via oral e manteve-se até o termino do experimento. Material e Métodos 33 4.7. Procedimentos pré-exercício Os animais foram escovados, casqueados e tricotomizados na região posterior à escápula esquerda e na região axial esquerda referente à área de auscultação cardíaca, fixou-se no animal uma cinta elástica acoplando-se à mesma o freqüencímetro digital (Polar Heart Rate Monitors – Canadá) e aplicou-se o gel condutor (para eletrocardiograma) na pele do animal. Estes procedimentos foram realizados nas provas de exercício (P1 e P2) e durante o período de treinamento. Antes das provas de exercício (P1 e P2) foi realizada a contenção do animal em tronco para a cateterização da veia jugular. Após a tricotomia e anti- sepsia local, introduziu-se um cateter 14G (Angiocath 14G - Becton Dickinson - BD, Franklin Lakes, NJ, USA) acoplado um tubo extensor adaptado a um equipo de aproximadamente 1,0m de comprimento e em sua extremidade acoplada uma torneira de três vias. Sendo o cateter e o extensor preenchidos com solução de NaCl 0,9% heparinizada com 4UI de heparina sódica/mL (Heparin – Cristália – Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda). 4.8. Primeira prova de exercício em esteira (P1) Após a adaptação à esteira de alta velocidade e o período de 15 dias de suplementação para os animais do GE, submeteu-se os eqüinos a uma prova de exercício em esteira de alta intensidade até a exaustão (Figura 1). 4.8.1. Protocolo de exercício O exercício, com a esteira inclinada a 7%, iniciou-se à velocidade de 1,8m/s por 5min, seguindo a 4,0m/s por 3min, 6,0m/s por 2min e posteriormente 8,0m/s, 9,0m/s, 10,0m/s, 11,0m/s e 12m/s por 1min em cada velocidade, ou até Material e Métodos 34 quando o animal não mais conseguisse manter-se em galope mesmo sendo estimulado. Após o término do exercício os animais foram mantidos sobre a manta da esteira por 30 minutos. 4.8.2. Exame clínico e condições ambientais A freqüência respiratória e a temperatura retal foram aferidas antes e após o exercício e a freqüência cardíaca, por frequenciômetro digital (Polar A1, Polar Electro Inc, Canadá) antes, durante e após (Quadro 1). Antes e após cada exercício foram aferidas a temperatura ambiente e a umidade relativa do ar por termohigrômetro digital (Minipa MT 241 - China). A utilização da esteira de alta velocidade, tanto para as provas de exercício (P1 e P2) como para o treinamento ocorreu entre 5:30h e 8:30h da manhã. 4.8.3. Colheita de amostras Foram colhidas amostras de sangue venoso antes, durante e após o exercício (Quadro 1) em tubos a vácuo (Vacutainer Labnew, Brasil) contendo ácido etilenodiaminotetracético potássico (EDTA) para realização do eritrograma, mensuração da proteína plasmática total e fragilidade osmótica; tubos com gel coagulante (Vaccum II, Labnew) para avaliações séricas incluindo a atividade enzimática da creat inaquinase (CK) e aspartato aminotransferase (AST), vitamina E e malondialdeído (MDA) sendo que, as amostras para dosagem de vitamina E foram protegidas da luz com papel alumínio. Tubos com heparina sódica (Vacutainer, Labnew) para a determinação da glutationa reduzida (GSH), superóxido dismutase (SOD) e metahemoglobina. As colheitas com o eqüino em repouso foram realizadas por venipunção Material e Métodos 35 jugular e durante o exercício, pelo circuito extensor. Antes de cada colheita o circuito foi esvaziado pela retirada de 15mL de solução heparinizada ejetada e 5mL de sangue. Imediatamente após as colheitas os circuitos foram preenchidos com solução heparinizada. As colheitas durante o exercício ocorreram no intervalo dos 15 segundos finais de cada momento. As amostras de sangue arterial foram colhidas em seringa de 3mL, contendo heparina de lítio (B.D. Preset – BD Vacuntainer Systems) por punção da artéria carótida antes e após o exercício (Quadro 1). 4.9. Treinamento em esteira Após realizarem à prova P1, todos os animais dos grupos GC e GE foram submetidos a um período de treinamento em esteira de alta velocidade, segundo o protocolo: 5min a 1,8m/s, 3min a 4,0m/s, 2min a 6,2m/s, 1min a 8,0m/s e 1min a 10,0m/s, seguidos de um período de desaquecimento a 3m/s por 2min e a 1,6m/s por 2min. Durante o período de treinamento, foram aferidas a freqüência respiratória, temperatura retal, temperatura ambiente e a umidade relativa do ar antes e após o exercício. A freqüência cardíaca foi registrada antes, durante (final de cada velocidade) e após o exercício. O protocolo de exercício estabelecido para o treinamento dos animais foi realizado uma vez ao dia, seis dias por semana até completar 20 dias de exercício. 4.10. Segunda prova de exercício em esteira (P2) Depois de treinados, os animais foram submetidos novamente à uma prova de exercício com o mesmo protocolo e momentos de colheita de amostras de Material e Métodos 36 P1, sendo denominada P2, (Figura 1) que foi realizada 48 horas após o último dia do treinamento. 4.11. Exames laboratoriais 4.11.1. Eritrograma O número de eritrócito (He), a concentração de hemoglobina (Hb), o volume corpuscular médio (VCM), e a distribuição do diâmetro dos eritrócitos (DDE) foram obtidos por meio do contador eletrônico de células (Cell-Dyn 3500 R, Abbott Diagnostic, Chicago, USA). O volume globular (VG) foi determinado pela técnica do microhematócrito segundo Jain (1986) e a partir deste foi calculada a concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM). 4.11.2. Proteína plasmática total A determinação da proteína plasmática total foi realizada por refratometria em refratômetro de bancada (ATAGO Co. Ltda, Japão), conforme Jain (1986). 4.11.3. Glutationa reduzida eritrocitária (GSH) Para mensuração da GSH, 300µL de sangue heparinizado foram hemolisados em 3mL de H2O deionizada, 2mL deste hemolisado foram processados segundo método de Beutler (1984) até a obtenção do sobrenadante ácido que foi estocado a -80ºC por no máximo oito semanas (MACHADO et al., 2005). No restante do hemolisado foi determinada a concentração de hemoglobina pelo método da cianometahemoglobina (JAIN, 1986). A mensuração da GSH no sobrenadante após descongelamento também seguiu a técnica de Beutler (1984). O resultado foi expresso em µmol/g de hemoglobina (µmol/gHb). Material e Métodos 37 4.11.4. Superóxido dismutase (SOD) Para mensuração da SOD 1mL de sangue heparinizado foi centrifugado a 3000rpm por 10 minutos. Removeu-se o plasma e os eritrócitos foram lavados quatro vezes com 3mL de solução de NaCl 0,9% gelada. Após a última lavagem foram reconstituídos em 4mL de H2O bidestilada, homogeneizados e incubados a +4ºC por 15 minutos. O hemolisado obtido após este processo foi estocado à -80ºC. No momento da dosagem, determinou-se a concentração de hemoglobina no hemolisado, pelo método da cianometahemoglobina (JAIN, 1986), o qual foi diluído 1:100 em tampão fosfato 0,1M pH 7,0, mensurando-se a SOD por kit comercial (Ransod – Randox, Reino Unido) em analisador automático (Cobas Miras – Roche Rotkreuz, Suiça) sendo o resultado expresso em UI/g de hemoglobina. 4.11.5. Metahemoglobina A determinação da metahemoglobina foi realizada no sangue total heparinizado segundo o método de Evelyn & Malloy (1938), modificado por Beutler, (1990), e expressa em porcentagem de hemoglobina. 4.11.6. Fragilidade osmótica (FO) A prova de avaliação da fragilidade osmótica eritrocitária foi determinada em concentrações crescentes de cloreto de sódio (NaCl), pH 7,4, determinando-se a porcentagem de hemólise em cada concentração segundo Jain (1986). O resultado deste teste expressa a concentração de NaCl correspondente a 50% de hemólise (H50), calculado a partir da curva dos percentuais de hemólise nas concentrações, ajustada por um modelo linear generalizado para as proporções com função de ligação probit (McCULLOCH & SEARLE, 2001). Material e Métodos 38 4.11.7. Malondialdeído (MDA) As amostras de soro destinadas à determinação do MDA foram armazenadas a -80ºC, a dosagem foi realizada em aparelho de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) (Shimadzu - Tokyo, Japão), por fluoroscopia, de acordo com a metodologia descrita por Karatas et al. (2002). 4.11.8. Vitamina E As amostra de soro destinada a dosagens de Vitamina E protegidas da luz com papel alumínio e armazenadas a -80ºC, para posterior dosagem por cromatografia líquida de alta performance (HPLC) (Shimadzu), em fluoroscopia de acordo com a metodologia descrita por Arnaud et al. (1991). 4.11.9. Aspartato aminotransferase (AST) e creatinaquinase (CK) As alíquotas de soro foram estocadas em freezer à temperatura de -80ºC. Posteriormente, foram processadas por kits comerciais para determinação da CK (CK-NAC – Wiener lab, Rosário, Argentina) e do AST (AST - Celm - Cia. Equipadora de Laboratórios Modernos, São Paulo, Brasil) com leitura em espectrofotômetro semi-automático (CelmSB -190 - Celm). 4.11.10. Lactato sangüíneo A dosagem de lactato sangüíneo foi realizada em sangue venoso sem anticoagulante, imediatamente após a colheita em uma alíquota de 20µL aplicada à uma fita reagente e a leitura realizada no lactímetro portátil (Accutrend - Roche). Material e Métodos 39 4.11.11. Potencial hidrogeniônico (pH) sangüineo e hemogasometria As amostras de sangue arterial foram acondicionadas em recipiente térmico com gelo e processadas em analisador automático (Rapidlab 348 - Chiron Diagnostics Ltda, Essex) com a correção da temperatura. Foram avaliados o potencial hidrogeniônico (pH), pressão parcial de oxigênio (PaO2), pressão parcial de dióxido de carbono (PaCO2), saturação da hemoglobina por O2 (SaO2), concentração total de CO2 (ctCO2), íon bicarbonato ([HCO- 3]) e déficit de base (EB). 4.12. Análise estatística Para variáveis avaliadas nos dois grupos, cuja tendência central foi representada pela mediana, foi efetuado o teste não paramétrico de Mann-Whitney para comparação dos dois grupos, em cada momento e prova. Para comparar os momentos dentro de cada grupo foi aplicado o teste não paramétrico de Friedman (CURI, 1998). Em todas as análises, as estatísticas foram consideradas significativas quando p<0,05. Para as variáveis do período de treinamento foi realizada apenas a estatística descritiva, os resultados foram apresentados na forma de média e desvio padrão. Resultados e Discussão 40 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1. Avaliação videoendoscópica do aparelho respiratório anterior, laringoscopia e avaliação cinemática da locomoção As avaliações da integridade do aparelho respiratório anterior, funcionalidade da laringe e da cinemática da locomoção objetivaram a exclusão de animais com alterações que pudessem interferir na realização do exercício. Os eqüinos utilizados no experimento não apresentaram alterações do trato respiratório anterior ou da movimentação fisiológica da laringe pelos exames videoendoscópicos. Na avaliação da movimentação à esteira não foram observadas alterações que pudessem interferir com o desempenho atlético. 5.2. Provas de exercício progressivo em esteira (P1 e P2) Todos os animais foram submetidos a duas provas de exercício progressivo, sendo a primeira prova (P1) realizada antes do período de treinamento e a segunda (P2), após o treinamento dos animais. Para melhor elucidação os resultados de ambos os grupos, controle (GC) e suplementado com vitamina E (GE), nas duas provas estão apresentados em conjunto para cada variável. 5.2.1. Eritrograma e proteína plasmática total Em ambos os grupos e nas duas provas observou-se aumento do número de eritrócito (Tabela 1, Figura 2), da concentração de hemoglobina (Tabela 2, Figura 3), do volume globular (VG) (Tabela 3, Figura 4), da distribuição do diâmetro dos eritrócitos (DDE) (Tabela 6, Figura 7) e da concentração da proteína plasmática total (PPT) (Tabela 7, Figura 8) durante o exercício. Atingindo valores máximos Resultados e Discussão 41 imediatamente após o exercício (PE1). Não se observaram alterações do volume corpuscular médio (VCM) (Tabela 4, Figura 5) e da concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM) (Tabela 5, Figura 6) durante o exercício. Em todos os momentos os valores de mediana estiveram dentro dos valores de normalidade citados por KRAMER (2000), para eqüinos de sangue quente. Em eqüinos é sabido que o exercício promove mobilização de eritrócito do baço (BOUCHER et al., 1981; JAIN, 1986; MASINI et al., 2000), a contração esplênica causada pela liberação de epinefrina introduz na circulação periférica grande quantidade de eritrócitos, que podem aumentar em 40% o volume globular (VG) (KRAMER, 2000). Durante o exercício, a diminuição do volume plasmático também tem relação com a elevação do VG (Jain, 1986; ARAUJO et al., 2004). O exercício promove redução do volume plasmático devido às perdas pelo suor e respiração aliado ao movimento de líquidos para o espaço extravascular, causado por aumento da pressão arterial, compressão de capilares pela contração muscular e maior pressão oncótica tecidual, pelo acúmulo de metabólitos como o lactato (ARAUJO et al., 2004). Comparando-se os valores de mediana do número de eritrócitos e do VG antes do exercício (M0) e logo após o exercício (PE1) constata-se uma elevação superior a 40% em ambos os grupos e provas, porém estatisticamente não significativa. Os resultados no PE1 foram diferentes (p<0,05) dos obtidos 6 horas após o exercício (PE5), exceto no GE na P2, e os valores do PE5 foram inferiores, mas não diferiram do M0. A apreensão e a excitação, na entrada dos eqüinos no salão de exercícios, podem ter induzido a liberação de epinefrina e promovido contração Resultados e Discussão 42 esplênica, justificando o maior número de eritrócitos no M0 em relação ao PE5 (JAIN, 1986; KRAMER, 2000). Apesar de não ser significativo, ocorreu um aumento de 20% na PPT do M0 para o PE1 em todas as provas nos dois grupos, relacionado à hemoconcentração por diminuição do volume plasmático (JAIN, 1986). Segundo Rose & Hodson (1994) o exercício promove movimentação de líquidos do espaço extracelular para o intracelular. Analisando-se o VCM, não houve alteração no diâmetro médio dos eritrócitos durante o exercício, contudo a DDE, que avalia a heterogeneidade dos volumes eritrocitários na população, aumentou significativamente (p<0,05). Este achado pode ser explicado pela tumefação dos eritrócitos, que implica em aumento de volume, aliado à liberação de células velhas pelo baço, de tamanho menor, ambos eventos citados em eqüinos durante o exercício (HANZAWA & WATANABE, 2000; MASINI et al., 2000). Nesta situação o volume médio não se altera porque os eventos se sobrepõem, no entanto a DDE aumenta. A utilização de analisadores automáticos tem contribuído com o estudo do eritrograma fornecendo novos parâmetros, como a DDE que é mais precisa para a avaliação do grau de anisocitose do que o VCM ou a avaliação do tamanho dos eritrócitos em esfregaço sangüíneo corado (Jain, 1993). Vários mecanismos estão relacionados com a maior entrada de água nos eritrócitos, principalmente o aumento H+ e potássio (K+) (SPEAKE et al., 1997). O exercício induz queda do pH e os eritrócitos desempenham função tampão por vários mecanismos, principalmente captando H+ e K+, estes eventos são benéficos à performance, porém, o aumento da concentração eritrocitária de íons promove Resultados e Discussão 43 entrada de água e conseqüentemente tumefação celular com aumento do VCM (WEISS & EVANSON, 1997; MASINI et al., 2000). O VCM aumentou após PE1, atingindo valores máximos 15 minutos após o exercício (PE2) em todos os grupos e provas, sendo significativo (p<0,05) na P1 apenas no GE e na P2 em ambos os grupos. Em contrapartida, embora não significativo, a DDE apresentou redução entre o PE1 e o PE2. Estes resultados indicam que os mecanismos de tumefação ainda estão presentes após o exercício e são compatíveis com os resultados do pH sangüíneo, que permanece em acidose até 30 minutos após o exercício (Tabela 18). No presente estudo ocorreu queda significativa (p<0,05) do pH após o exercício (Tabela 18), o potássio plasmático não foi mensurado, porém, considera-se que ele aumentou baseado nos achados de Watanabe (2004), em eqüinos da raça Árabe submetidos a um protocolo de exercício similar (6% de inclinação), no qual observou-se redução do pH associada à elevação significativa de K+ durante o exercício, que retornou aos valores basais três minutos após o exercício. Segundo Lindinger & Grudzien (2003) em condições associadas a exercício de alta intensidade os eritrócitos são capazes de regular a concentração plasmática de K+. A tumefação celular, conseqüente ao aumento do K+ intraeritrocitário, causa redução transitória da deformabilidade (WEISS & EVANSON, 1997). A lipoperoxidação pode agravar este processo porque causa aumento da permeabilidade e perda da fluidez da membrana (SJÖDIN et al., 1990). Não houve diferença estatística do VCM entre grupos, contudo, observam- se valores de VCM menores no GE, em todos os momentos e provas. O CHCM foi superior no GE na maioria dos momentos, sendo significativo (p<0,05) no PE4 e PE8 da prova P1. O maior VCM e menor CHCM do grupo controle pode ser atribuído Resultados e Discussão 44 a uma taxa remoção e reposição de eritrócitos mais elevada, visto que as células jovens são maiores e possuem menos hemoglobina (JAIN, 1986). O efeito cumulativo da lesão oxidativa é responsável pelo processo normal de envelhecimento e remoção dos eritrócitos (HARVEY, 1997). Segundo Christian (2000), quanto maior o estresse oxidativo acumulado, menor a vida média eritrocitária. Baseado nestes conceitos, a menor lipoperoxidação observada no grupo suplementado pela concentração de malondialdeído (MDA) inferior ao grupo controle (Tabela 12), indicando menor estresse oxidativo e pode ter inferido menor taxa de remoção dos eritrócitos neste grupo. Evidenciando o efeito protetor da vitamina E na manutenção da estabilidade das membranas (MEYDANI, 1995). Antes do treinamento os momentos 24h (PE7) e 72h (PE8) do grupo controle e 120h (PE9) do grupo suplementado apresentaram queda do número de eritrócitos, concentração de hemoglobina e volume globular, atingindo o limite inferior de normalidade (KRAMER, 2000), apesar de não diferirem estatisticamente do M0. Nestes mesmos momentos ocorreram as menores concentrações da PPT. Estes resultados são compatíveis com a “anemia do esporte” caracterizada como uma pseudoanemia devido à diluição dos eritrócitos pelo aumento do volume plasmático (DRESSENDORFER et al., 1981; ARAUJO et al., 2004). Ao repetir-se o exercício após o treinamento (P2) esta queda foi menos acentuada, indicando efeito adaptativo durante o treinamento. Em humanos Gillen e colaboradores (1991), relatam que um único episódio de exercício intenso provoca elevação de 10% no volume plasmático 24h pós-exercício. Este evento é uma resposta adaptativa fisiológica à hemoconcentração provocada pelo exercício (ARAUJO et al., 2004). Resultados e Discussão 45 Tabela 1. Medianas e percentis (P25;P75) do número de eritrócitos (x106/µL), em eqüinos da raça Árabe, nas provas P1 (pré-treinamento) e P2 (pós-treinamento) de exercício progressivo em esteira, nos grupos controle (GC) e suplementado com vitamina E (GE), mensuradas antes (M0), durante (trote e galope) e após o exercício (PE) P1 P2 Momentos GC GE GC GE M0 8,14 ( 7,8 ; 8,4 ) abcd 7,95 ( 7,6 ; 8,2 ) abcd 7,85 ( 7,6 ; 8,2 ) abc 7,81 ( 7,3 ; 8,2 ) abc Trote 9,87 ( 9,7 ; 10,1 ) abc 10,25 ( 9,9 ; 10,7 ) abc 9,96 ( 9,8 ; 10,1 ) abc 9,94 ( 9,6 ; 10,3 ) abc Galope 10,95 ( 10,6 ; 11,4 ) ab 10,95 ( 10,7 ; 11,5 ) ab 11,18 (11,0 ; 11,4 ) ab 11,17 ( 10,7 ; 11,7 ) ab PE1 11,20 ( 11,1 ; 11,5 ) a 11,15 ( 11,0 ; 11,6 ) ab 11,50 (11,5 ; 11,7 ) a 11,60 ( 11,2 ; 12,1 ) a PE2(15min) 8,98 ( 8,9 ; 9,1 ) abcd 9,60 ( 9,4 ; 10,0 ) abc 9,64 ( 9,4 ; 9,9 ) abc 9,97 ( 9,6 ; 10,5 ) abc PE3(30min) 8,18 ( 7,9 ; 8,4 )abcd 8,66 ( 8,4 ; 9,0 )abcd 8,81 ( 8,5 ; 9,0 )abc 8,96 ( 8,6 ; 9,4 )abc PE4(2h) 7,46 ( 7,3 ; 7,6 ) abcd 8,07 ( 7,8 ; 8,4 ) abcd 7,79 ( 7,5 ; 8,1 ) abc 8,10 ( 7,7 ; 8,3 ) abc PE5(6h) 6,97 ( 6,9 ; 7,4 ) bcd 7,77 ( 7,5 ; 7,9 ) bcd 7,44 ( 7,4 ; 7,6 ) c 7,42 ( 7,2 ; 7,7 ) c PE6(12h) 8,04 ( 7,8 ; 8,4 ) abcd 8,39 ( 8,2 ; 8,5 ) abcd 8,16 ( 7,8 ; 8,4 ) abc 8,03 ( 7,6 ; 8,5 ) abc PE7(24h) 6,89 ( 6,8 ; 6,9 ) d 7,36 ( 7,3 ; 7,4 ) cd * 8,15 ( 7,6 ; 8,6 ) abc 8,04 ( 7,8 ; 8,2 ) bc PE8(72h) 6,95 ( 6,7 ; 7,2 ) cd 7,39 ( 7,1 ; 7,8 ) abcd 7,40 ( 7,3 ; 7,5 ) c 7,33 ( 6,5 ; 8,4 ) bc PE9(120h) 7,46 ( 7,4 ; 7,7 ) abcd 6,78 ( 6,7 ; 6,9 )d* 7,50 ( 6,7 ; 8,5 ) bc 7,38 ( 7,1 ; 7,9 ) bc Valores na mesma coluna seguidos de letras iguais não diferem estatisticamente (p>0,05) * Difere significativamente do grupo controle (p<0,05), no mesmo momento e prova PE1 = imediatamente após o exercício 6 7 8 9 10 11 12 M0 Trote Galope PE1 PE2 PE3 PE4 PE5 PE6 PE7 PE8 PE9 E rit ró ci to s (x 10 6 / µµ L) GC P1 GE P1 GC P2 GE P2 Figura 2. Medianas do número de eritrócito em eqüinos da raça Árabe, nas provas P1 (pré-treinamento) e P2 (pós-treinamento) de exercício progressivo em esteira, nos grupos controle (GC) e suplementado com vitamina E (GE), mensurados antes (M0), durante (trote e galope), imediatamente após o exercício (PE1) e 15min (PE2), 30min (PE3), 2h (PE4), 6h (PE5), 12h (PE6), 24h (PE7), 72h (PE8) e 120h (PE9) após o exercício Resultados e Discussão 46 Tabela 2. Medianas e percentis (P25;P75) da concentração de hemoglobina (g/dL), em eqüinos da raça Árabe, nas provas P1 (pré-treinamento) e P2 (pós-treinamento) de exercício progressivo em esteira, nos grupos controle (GC) e suplementado com vitamina E (GE), mensuradas antes (M0), durante (trote e galope) e após o exercício (PE) P1 P2 Momentos GC GE GC GE M0 13,5 ( 13,1 ; 13,7 ) abcd 12,7 ( 12,3 ; 12,9 ) abc 13,1( 12,4 ; 13,8 ) bc 12,3( 12,0 ; 12,6 ) abc Trote 16,1 ( 15,6 ; 16,5 ) abc 16,3 ( 15,1 ; 17,4 ) ab 16,5( 16,1 ; 16,6 ) abc 16,0( 15,2 ; 16,6 ) abc Galope 17,8 ( 17,7 ; 17,8 ) ab 17,4 ( 16,9 ; 18,1 ) a 18,3( 17,7 ; 18,9 ) ab 17,2( 17,1 ; 17,5 ) ab PE1 18,1 ( 18,1 ; 18,2 ) a 17,7 ( 17,3 ; 18,1 ) a 19,2( 18,7 ; 19,4 ) a 17,7( 17,7 ; 18,1 ) a PE2(15min) 14,7 ( 14,3 ; 15,2 ) abcd 15,7 ( 15,0 ; 16,3 ) ab 15,8( 15,5 ; 16,1 ) abc 15,6( 15,4 ; 16,2 ) abc PE3(30min) 13,5 ( 13,0 ; 13,9 ) abcd 14,2 ( 13,3 ; 14,9 ) abc 14,2( 14,0 ; 14,5 ) abc 14,0( 13,9 ; 14,4 ) abc PE4(2h) 12,5 ( 12,3 ; 12,5 ) abcd 12,8 ( 12,7 ; 13,2 ) abc * 12,7( 12,2 ; 13,3 ) abc 12,6( 12,3 ; 12,8 ) abc PE5(6h) 12,0 ( 11,6 ; 12,4 ) bcd 12,1 ( 11,8 ; 12,5 ) abc 12,5( 12,3 ; 12,8 ) c 12,0( 11,6 ; 12,3 ) c PE6(12h) 13,0 ( 12,6 ; 13,8 ) abcd 13,2 ( 12,9 ; 13,5 ) abc 13,7( 13,2 ; 14,1 ) abc 12,8( 11,6 ; 13,9 ) abc PE7(24h) 11,5 ( 11,2 ; 11,7 ) d 11,9 ( 11,6 ; 12,2 ) bc 13,5( 13,0 ; 13,7 ) abc 12,5( 12,2 ; 12,8 ) bc PE8(72h) 11,1 ( 11,0 ; 11,6 ) cd 12,2 ( 11,5 ; 12,6 ) abc 12,2( 11,4 ; 13,2 ) c 11,7( 11,0 ; 12,8 ) bc PE9(120h) 12,2 ( 11,6 ; 13,3 ) abcd 10,9 ( 10,8 ; 11,1 ) c * 12,5( 11,8 ; 13,4 ) bc 12,0( 11,4 ; 12,6 ) bc Valores na mesma coluna seguidos de letras iguais não diferem estatisticamente (p>0,05) * Difere significativamente do grupo controle (p<0,05), no mesmo momento e prova PE1 = imediatamente após o exercício 10 12 14 16 18 20 M0 Trote Galope PE1 PE2 PE3 PE4 PE5 PE6 PE7 PE8 PE9 H em og lo bi na (g /d L) GC P1 GE P1 GC P2 GE P2 Figura 3. Medianas da concentração de hemoglobina em eqüinos da raça Árabe, nas provas P1 (pré- treinamento) e P2 (pós-treinamento) de exercício progressivo em esteira, nos grupos controle (GC) e suplementado com vitamina E (GE), mensurados antes (M0), durante (trote e galope), imediatamente após o exercício (PE1) e 15min (PE2), 30min (PE3), 2h (PE4), 6h (PE5), 12h (PE6), 24h (PE7), 72h (PE8) e 120h (PE9) após o exercício Resultados e Discussão 47 Tabela 3. Medianas e percentis (P25;P75) do volume globular (VG) (%), em eqüinos da raça Árabe, nas provas P1 (pré-treinamento) e P2 (pós -treinamento) de exercício progressivo em esteira, nos grupos controle (GC) e suplementado com vitamina E (GE), mensuradas antes (M0), durante (trote e galope) e após o exercício (PE) P1 P2 Momentos GC GE GC GE M0 39,5( 37,5 ; 41,0 ) abcd 37,0( 35,5 ; 38,0 ) abcd 38,0 ( 35,5 ; 40,5 ) abc 35,5( 35,0 ; 36,5 ) ab Trote 47,5( 46,5 ; 48,3 ) abc 48,0( 44,5 ; 51,5 ) abc 48,5 ( 47,0 ; 49,3 ) abc 46,5( 44,5 ; 48,0 ) ab Galope 52,8( 52,3 ; 53,4 ) ab 52,3( 48,8 ; 56,1 ) ab 53,0 ( 50,8 ; 55,4 ) ab 50,3( 50,0 ; 51,3 ) ab PE1 55,0( 53,8 ; 56,0 ) a 52,0( 50,8 ; 54,0 ) a 56,0 ( 53,8 ; 58,3 ) a 53,5( 52,8 ; 54,3 ) a PE2(15min) 44,0( 42,8 ; 45,8 ) abcd 47,5( 44,8 ; 49,8 ) abc 47,0 ( 46,3 ; 47,8 ) abc 47,0( 47,0 ; 49,3 ) ab PE3(30min) 39,5( 37,3 ; 42,8 ) abcd 41,5( 38,0 ; 45,0 ) abcd 42,0 ( 41,5 ; 43,0 ) abc 42,0( 41,8 ; 43,3 ) ab PE4(2h) 37,5( 36,5 ; 38,0 ) abcd 36,5( 36,0 ; 38,0 ) abcd 37,0 ( 35,5 ; 39,8 ) abc 36,5( 35,5 ; 37,5 ) ab PE5(6h) 35,5( 34,0 ; 37,0 ) bcd 35,0( 34,8 ; 35,8 ) bcd 36,5 ( 34,8 ; 38,0 ) bc 35,0( 34,3 ; 35,5 ) b PE6(12h) 39,0( 37,3 ; 41,8 ) abcd 38,0( 37,5 ; 39,0 ) abcd 39,0 ( 38,8 ; 39,8 ) abc 37,0( 33,8 ; 40,3 ) ab PE7(24h) 33,5( 32,8 ; 34,3 ) dc 33,5( 32,8 ; 34,3 ) cd 38,5 ( 37,0 ; 39,5 ) bc 35,5( 34,5 ; 36,8 ) b PE8(72h) 32,5( 32,0 ; 34,5 ) cd 34,0( 32,3 ; 35,8 ) bcd 35,5 ( 33,0 ; 38,3 ) c 34,0( 32,0 ; 37,0 ) b PE9(120h) 35,5( 33,8 ; 38,5 ) abcd 31,5( 30,8 ; 32,5 ) d 36,5 ( 35,0 ; 38,5 ) bc 35,0( 33,3 ; 36,8 ) b Valores na mesma coluna seguidos de letras iguais não diferem estatisticamente (p>0,05) Não houve diferença estatística (p>0,05) entre grupos, para o mesmo momento e prova PE1 = imediatamente após o exercício 30 35 40 45 50 55 60 M0 Trote Galope PE1 PE2 PE3 PE4 PE5 PE6 PE7 PE8 PE9 VG (% ) GC P1 GE P1 GC P2 GE P2 Figura 4. Medianas do volume globular (VG) em eqüinos da raça Árabe, nas provas P1 (pré-treinamento) e P2 (pós-treinamento) de exercício progressivo em esteira, nos grupos controle (GC) e suplementado com vitamina E (GE), mensurados antes (M0), durante (trote e galope), imediatamente após o exercício (PE1) e 15min (PE2), 30min (PE3), 2h (PE4), 6h (PE5), 12h (PE6), 24h (PE7), 72h (PE8) e 120h (PE9) após o exercício Resultados e Discussão 48 Tabela 4. Mediana e percentis (P25;P75) do volume corpuscular médio (VCM) (fL), em eqüinos da raça Árabe, nas provas P1 (pré-treinamento) e P2 (pós -treinamento) de exercício progressivo em esteira, nos grupos controle (GC) e suplementado com vitamina E (GE), mensuradas antes (M0), durante (trote e galope) e após o exercício (PE) P1 P2 Momentos GC GE GC GE M0 48,7 ( 46,3 ; 51,1 ) a 46,5( 45,1 ; 48,4 ) abc 48,4 ( 45,8 ; 50,8 ) b 46,7 ( 45,9 ; 48,1 ) ab Trote 48,5 ( 46,3 ; 50,8 ) a 46,5( 44,8 ; 48,5 ) abc 48,5 ( 46,0 ; 50,6 ) b 46,1 ( 45,3 ; 47,8 ) ab Galope 48,9 ( 46,6 ; 51,1 ) a 46,5( 45,0 ; 48,8 ) abc 49,2 ( 46,6 ; 51,5 ) ab 46,8 ( 46,0 ; 48,3 ) ab PE1 49,3 ( 46,7 ; 51,8 ) a 47,5( 46,0 ; 49,7 ) ab 49,3 ( 46,6 ; 51,4 ) ab 47,7 ( 46,8 ; 49,6 ) ab PE2(15min) 49,5 ( 47,1 ; 51,8 ) a 47,9( 45,9 ; 50,5 ) a 49,6 ( 47,4 ; 51,8 ) a 48,7 ( 47,7 ; 50,4 ) a PE3(30min) 49,3 ( 46,7 ; 51,8 )a 47,3( 45,6 ; 49,8 ) abc 49,3 ( 46,9 ; 51,4 ) ab 47,7 ( 46,9 ; 49,2 ) ab PE4(2h) 49,2 ( 46,6 ; 51,5 ) a 46,0( 45,1 ; 47,3 ) abc 48,4 ( 45,7 ; 50,8 ) b 45,8 ( 45,3 ; 47,1 )ab PE5(6h) 48,8 ( 46,6 ; 50,8 ) a 46,0( 44,5 ; 47,9 ) c 48,8 ( 45,9 ; 51,0 ) b 45,8 ( 45,3 ; 47,0 ) b PE6(12h) 48,5 ( 46,2 ; 50,9 ) a 45,9( 44,6 ; 47,7 ) abc 49,2 ( 46,3 ; 51,5 ) ab 45,7 ( 45,0 ; 47,2 ) b PE7(24h) 48,7 ( 46,5 ; 51,0 ) a 46,0( 44,8 ; 47,7 ) abc 48,4 ( 45,5 ; 51,1 ) b 45,7 ( 45,2 ; 47,1 ) ab PE8(72h) 48,6 ( 46,4 ; 50,8 ) a 46,1( 44,6 ; 47,6 ) bc 49,1 ( 46,3 ; 51,3 ) ab 45,6 ( 44,5 ; 47,2 ) ab PE9(120h) 48,4 ( 46,3 ; 50,7 ) a 45,6( 44,9 ; 47,1 ) abc 48,6 ( 46,2 ; 50,8 ) ab 46,1 ( 45,1 ; 47,6 ) b Valores na mesma coluna seguidos de letras iguais não diferem estatisticamente (p>0,05) Não houve diferença estatística (p>0,05) entre grupos, para o mesmo momento e prova PE1 = imediatamente após o exercício 44 46 48 50 M0 Trote Galope PE1 PE2 PE3 PE4 PE5 PE6 PE7 PE8 PE9 V C M (f L) GC P1 GE P1 GC P2 GE P2 Figura 5. Médianas do volume corpuscular médio (VCM), em eqüinos da raça Árabe, nas provas P1 (pré- treinamento) e P2 (pós-treinamento) de exercício progressivo em esteira, nos grupos controle (GC) e suplementado com vitamina E (GE), mensurados antes (M0), durante (trote e galope), imediatamente após o exercício (PE1) e 15min (PE2), 30min (PE3), 2h (PE4), 6h (PE5), 12h (PE6), 24h (PE7), 72h (PE8) e 120h (PE9) após o exercício Resultados e Discussão 49 Tabela 5. Medianas e percentis (P25;P75) da concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM) (%), em eqüinos da raça Árabe, nas provas P1 (pré-treinamento) e P2 (pós- treinamento) de exercício progressivo em esteira, nos grupos controle (GC) e suplementado com vitamina E (GE), mensuradas antes (M0), durante (trote e galope) e após o exercício (PE) P1 P2 Momentos GC GE GC GE M0 33,4( 33,1 ; 34,0 ) a 34,2( 34,1 ; 34,3 ) ab 34,4 ( 34,0 ; 35,0 ) a 34,1( 33,9 ; 34,4 ) ab Trote 33,5( 33,0 ; 34,1 ) a 33,8( 33,7 ; 34,0 ) ab 34,1 ( 33,9 ; 34,3 ) a 34,3( 34,2 ; 34,5 ) ab Galope 33,4( 32,8 ; 33,8 ) a 34,3( 33,3 ; 34,5 ) ab 34,5 ( 34,2 ; 34,7 ) a 34,3( 34,1 ; 34,4 ) ab PE1 33,1( 32,3 ; 33,6 ) a 33,6( 33,5 ; 33,8 ) ab 33,7 ( 33,3 ; 34,2 ) a 33,6( 33,2 ; 34,1 ) ab PE2(15min) 33,3( 33,0 ; 33,4 ) a 33,2( 33,0 ; 33,4 ) b 33,5 ( 33,1 ; 34,0 ) a 32,8( 32,3 ; 33,0 ) b PE3(30min) 33,6( 33,1 ; 34,3 ) a 33,7( 33,1 ; 34,5 ) ab 33,8 ( 33,4 ; 34,1 )a 33,4( 33,3 ; 33,5 ) b PE4(2h) 33,5( 33,3 ; 33,6 ) a 34,7( 34,3 ; 35,2 ) ab * 34,2 ( 33,6 ; 34,4 ) a 34,4( 34,2 ; 34,5 ) ab PE5(6h) 33,7( 33,6 ; 33,9 ) a 34,7( 34,5 ; 34,8 ) ab 34,3 ( 33,8 ; 35,0 ) a 34,6( 34,4 ; 34,6 ) ab PE6(12h) 34,1( 33,2 ; 34,9 ) a 34,6( 34,3 ; 34,7 ) ab 34,0 ( 33,8 ; 34,6 ) a 34,5( 34,5 ; 34,6 ) ab PE7(24h) 34,2( 34,0 ; 34,3 ) a 35,8( 35,0 ; 36,4 ) a 34,5 ( 34,2 ; 35,0 ) a 35,1( 34,9 ; 35,2 ) a PE8(72h) 34,2( 33,9 ; 34,5 ) a 35,2( 34,9 ; 35,6 ) a * 34,4 ( 34,0 ; 34,9 ) a 34,7( 34,5 ; 34,8 ) ab PE9(120h) 34,1( 34,1 ; 34,4 ) a 34,4( 34,2 ; 34,9 ) ab 34,2 ( 33,6 ; 34,9 ) a 34,4( 34,2 ; 34,8 ) ab Valores na mesma coluna seguidos de letras iguais não diferem estatisticamente (p>0,05) * Difere significativamente do grupo controle (p<0,05), no mesmo momento e prova PE1 = imediatamente após o exercício 32 33 34 35 36 M0 Trote Galope PE1 PE2 PE3 PE4 PE5 PE6 PE7 PE8 PE9 C H C M (% ) GC P1 GE P1 GC P2 GE P2 Figura 6. Médianas da concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM), em eqüinos da raça Árabe, nas provas P1 (pré-treinamento) e P2 (pós-treinamento) de exercício progressivo em esteira, nos grupos controle (GC) e suplementado com vitamina E (GE), mensurados antes (M0), durante (trote e galope), imediatamente após o exercício (PE1) e 15min (PE2), 30min (PE3), 2h (PE4), 6h (PE5), 12h (PE6), 24h (PE7), 72h (PE8) e 120h (PE9) após o exercício Resultados e Discussão 50 Tabela 6. Medianas e percentis (P25;P75) da distribuição do diâmetro dos eritrócitos (DDE) (%), em eqüinos da raça Árabe, nas provas P1 (pré-treinamento) e P2 (pós -treinamento) de exercício progressivo em esteira, nos grupos controle (GC) e suplementado com vitamina E (GE), mensuradas antes (M0), durante (trote e galope) e após o exercício (PE) P1 P2 Momentos GC GE GC GE M0 26,1 ( 25,5 ; 26,2 ) ab 26,0 ( 25,8 ; 26,2 ) ab 24,8 ( 23,2 ; 26,5 ) ab 25,3( 25,1 ; 26,1 ) ab Trote 26,2 ( 25,7 ; 26,8 ) ab 26,4 ( 26,2 ; 27,1 ) ab 27,4 ( 27,0 ; 28,0 ) a 28,1( 26,2 ; 29,7 ) ab Galope 27,3 ( 26,3 ; 28,4 ) a 26,7 ( 26,2 ; 27,5 ) ab 28,3 ( 27,7 ; 28,7 ) a 28,0( 27,2 ; 29,0 ) ab PE1 27,9 ( 26,5 ; 29,3 ) a 28,6 ( 27,6 ; 29,7 ) a 27,9 ( 26,6 ; 29,2 ) a 28,4( 27,5 ; 29,3 ) a PE2(15min) 26,4 ( 25,7 ; 26,8 ) ab 27,6 ( 26,1 ; 29,7 ) ab 26,4 ( 25,9 ; 27,0 ) ab 27,1( 26,6 ; 28,0 ) ab PE3(30min) 26,3 ( 25,5 ; 26,8 ) ab 26,8 ( 26,5 ; 27,2 ) ab 25,4 ( 25,0 ; 26,1 ) ab 26,0( 25,4 ; 26,8 ) ab PE4(2h) 24,2 ( 23,8 ; 24,7 ) b 24,2 ( 23,3 ; 24,9 ) b 25,8 ( 25,2 ; 26,6 ) ab 24,7( 24,3 ; 25,2 ) b PE5(6h) 25,3 ( 25,0 ; 25,3 ) ab 23,9 ( 23,7 ; 24,3 ) b 25,5 ( 24,6 ; 26,4 ) ab 25,5( 25,0 ; 25,7 ) ab PE6(12h) 25,2 ( 24,6 ; 25,9 ) ab 25,8 ( 25,3 ; 26,4 ) ab 25,6 ( 24,8 ; 26,7 ) ab 25,9( 25,5 ; 26,2 ) ab PE7(24h) 24,5 ( 24,2 ; 25,0 ) ab 25,1 ( 24,3 ; 26,1 ) ab 26,4 ( 25,2 ; 26,8 ) ab 26,4( 26,0 ; 26,8 ) ab PE8(72h) 24,9 ( 24,4 ; 25,3 ) ab 25,2 ( 24,3 ; 26,1 ) ab 24,4 ( 23,3 ; 25,7 ) b 26,1( 25,6 ; 26,5 ) ab PE9(120h) 24,8 ( 24,5 ; 25,1 ) ab 25,0 ( 24,1 ; 25,8 ) b 24,1 ( 23,8 ; 25,3 ) ab 26,4( 25,8 ; 26,8 ) ab Valores na mesma coluna seguidos de letras iguais não diferem estatisticamente (p>0,05) Não houve diferença estatística (p>0,05) entre grupos, para o mesmo momento e prova PE1 = imediatamente após o exercício 22 24 26 28 30 M0 Trote Galope PE1 PE2 PE3 PE4 PE5 PE6 PE7 PE8 PE9 D D E (% ) GC P1 GE P1 GC P2 GE P2 Figura 7. Medianas da distribuição do diâmetro dos eritrócitos (DDE), em eqüinos da raça Árabe, nas provas P1 (pré-treinamento) e P2 (pós-treinamento) de exercício progressivo em esteira, nos grupos controle (GC) e suplementado com vitamina E (GE), mensurados antes (M0), durante (trote e galope), imediatamente após o exercício (PE1) e 15min (PE2), 30min (PE3), 2h (PE4), 6h (PE5), 12h (PE6), 24h (PE7), 72h (PE8) e 120h (PE9) após o exercício Resultados e Discussão 51 Tabela 7. Medianas e percentis (P25;P75) da concentração da proteína plasmática total (g/dL) em eqüinos da raça Árabe, nas provas P1 (pré-treinamento) e P2 (pós -treinamento) de exercício progressivo em esteira, nos grupos controle (GC) e suplementado com vitamina E (GE), mensuradas antes (M0), durante (trote e galope) e após o exercício (PE) P1 P2 Momentos GC GE GC GE M0 6,3 ( 6,2 ; 6,5 ) abc 6,6 ( 6,5 ; 6,6 ) abc 6,4 ( 6,2 ; 6,5 ) abc 6,4( 6,1 ; 6,7 ) abc Trote 7,2 ( 6,9 ; 7,4 ) abc 7,1 ( 6,9 ; 7,4 ) abc 6,9 ( 6,8 ; 7,1 ) abc 6,9( 6,6 ; 7,2 ) abc Galope 7,4 ( 7,1 ; 7,7 ) ab 7,6 ( 7,2 ; 8,0 ) ab 7,3 ( 7,1 ; 7,5 ) ab 7,4( 7,3 ; 7,6 ) a PE1 7,6 ( 7,5 ; 7,7 ) a 7,9 ( 7,6 ; 8,1 ) a 7,7 ( 7,4 ; 7,8 ) a 7,9( 7,8 ; 8,1 ) a PE2(15min) 6,9 ( 6,8 ; 7,0 ) abc 7,5 ( 7,2 ; 7,8 ) abc 7,1 ( 7,0 ; 7,1 ) abc 7,3( 7,1 ; 7,4 ) ab PE3(30min) 6,6 ( 6,4 ; 6,6 ) abc 7,0 ( 6,8 ; 7,2 ) abc 6,6 ( 6,6 ; 6,6 ) abc 6,9( 6,7 ; 6,9 ) abc PE4(2h) 6,6 ( 6,2 ; 6,9 )abc 6,9 ( 6,8 ; 6,9 )abc 6,7 ( 6,3 ; 7,1 ) abc 6,6( 6,3 ; 6,9 ) abc PE5(6h) 6,4 ( 6,2 ; 6,7 ) abc 6,8 ( 6,5 ; 6,9 ) abc 6,3 ( 6,2 ; 6,3 ) bc 6,2( 6,0 ; 6,5 ) bc PE6(12h) 6,8 ( 6,5 ; 7,0 ) abc 6,8 ( 6,6 ; 6,9 ) abc 6,6 ( 6,4 ; 6,7 ) abc 6,5( 6,4 ; 6,6 ) abc PE7(24h) 6,2 ( 6,1 ; 6,3 ) c 6,4 ( 6,4 ; 6,6 ) bc 6,4 ( 6,1 ; 6,7 ) abc 6,4( 6,4 ; 6,5 ) abc PE8(72h) 6,1 ( 6,0 ; 6,3 ) c 6,4 ( 6,2 ; 6,5 ) bc 6,0 ( 6,0 ; 6,2 ) c 6,0( 5,9 ; 6,1 ) c PE9(120h) 6,3 ( 6,1 ; 6,5 ) bc 6,4 ( 6,2 ; 6,5 ) c 6,5 ( 6,3 ; 6,5 ) abc 6,3( 6,2 ; 6,5 ) abc Valores na mesma coluna seguidos de letras iguais não diferem estatisticamente (p>0,05) Não houve diferença estatística (p>0,05) entre grupos, para o mesmo momento e prova PE1 = imediatamente após o exercício 5,4 5,8 6,2 6,6 7,0 7,4 7,8 8,2 M0 Trote Galope PE1 PE2 PE3 PE4 PE5 PE6 PE7 PE8 PE9 P P T (g /d L) GC P1 GE P1 GC P2 GE P2 Figura 8. Medianas da concentração da proteína plasmática total (PPT) em eqüinos da raça Árabe, nas provas P1 (pré-treinamento) e P2 (pós-treinamento) de exercício progressivo em esteira, nos grupos controle (GC) e suplementado com vitamina E (GE), mensurados antes (M0), durante (trote e galope), imediatamente após o exercício (PE1) e 15min (PE2), 30min (PE3), 2h (PE4), 6h (PE5), 12h (PE6), 24h (PE7), 72h (PE8) e 120h (PE9) após o exercício Resultados e Discussão 52 5.2.2. Glutationa reduzida eritrocitária, superóxido dismutase, metahemoglobina e fragilidade osmótica eritrocitária Os resultados em medianas e percentis (P25; P75), da concentração da glutationa reduzida eritrocitária (GSH), superóxido dismutase (SOD), porcentagem de metahemoglobina e fragilidade osmótica eritrocitária (FO) estão discriminados nas tabelas 8, 9, 10 e 11 e figuras 9,10, 11 e 12, respectivamente. A concentração da GSH foi considerada adequada em ambos os grupos e provas comparando-se aos valores (8,13±1,81 µmol/gHb) relatados por Medeiros et al., (1984). Analisando-se cada grupo isoladamente, o exercício não induziu alterações significativas, exceto nos momentos 24h (PE7) e 72h (PE8) do grupo controle na P2 que foram maiores (p<0,05) do que os observados imediatamente após o exercício. No grupo controle a glutationa apresentou uma tendência a elevar-se entre 2h (PE3) e 72h (PE8) e queda em 120h (PE9) pós-exercício, no grupo suplementado observa-se queda no PE7 e PE9, todos não significativos. Marlin et al. (2002) observaram diminuição da GSH em cavalos da raça Árabe, imediatamente e 16 horas após uma prova de enduro de 140Km. Porém, estudos com exercício em esteira não constataram efeito do exercício sobre a GSH até 24h pós-exercício (MILLS et al., 1996; DEATON et al., 2004). Segundo Kinunnen et al., (2005a) a recuperação da homeostasia celular se estende por várias horas após o exercício e neste período as alterações dos marcadores de estresse oxidativo e de proteção antioxidante são mais evidentes. Analisando-se o efeito do tratamento, a queda da GSH no grupo suplementado a partir de 24 horas (PE4) foi significativa (p<0,05) em relação ao controle no PE7 da P1 e PE8 da P2. Além disso, no galope da P1 e no PE7 e PE9 Resultados e Discussão 53 da P2 observam -se resultados visivelmente inferiores para o grupo suplementado, apesar de não significativos (p=0,057). Deaton et al. (2004) acompanharam eqüinos submetidos ao exercício em esteira até 24 horas após e não verificaram efeito da suplementação com antioxidantes ou do treinamento sobre os níveis de GSH. No presente estudo ocorreu redução dos níveis da GSH posterior ao exercício, a qual foi mais evidente no grupo suplementado com vitamina E. Esta maior queda no GE pode estar relacionada a um maior consumo neste grupo, visto que a GSH é utilizada durante a reciclagem da vitamina E oxidada (SEN, 1997; JI, 1999). Os antioxidantes atuam de maneira integrada, principalmente as vitaminas E e C e a glutationa (SEN, 1997). A vitamina E impede a propagação da lipoperoxidação e nesta reação ela é oxidada formando o radical α-tocoferila (αT•), que posteriormente é reciclado pela vitamina C, reação da qual resulta o radical ascorbil (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2001). A GSH atua na reciclagem dos radicais formados pela oxidação das vitaminas E e C reduzindo-os para sua forma ativa (SEN, 1997; JI, 1999). O que justifica o consumo mais acentuado da GSH nos eqüinos que receberam vitamina E, a maior quantidade de vitamina E estaria impedindo a propagação da lipoperoxidação, porém, conseqüentemente obtem-se mais vitamina E oxidada. Resultados também obtidos pelo estudo de Moffarts et al. (2005), no qual eqüinos treinados em período de corridas apresentaram redução significativa da GSH nos grupos controle e suplementado com antioxidantes contendo vitamina E, no mesmo estudo, observam-se resultados inferiores no grupo suplementado em todos os momentos avaliados, embora não significativos. Resultados e Discussão 54 Os valores das medianas da superóxido dismutase foram maiores no grupo suplementado em quase todos os momentos nas duas provas, porém, não se constatou diferença significativa entre grupos ou momentos. Outros estudos com eqüinos também não observaram efeito do exercício (ONO et al., 1990; BALOGH et al., 2001) ou da suplementação com vitamina E na concentração de SOD (ONO et al., 1990; JI et al., 1990). Os valores obtidos no repouso foram inferiores aos observados por Ono et al. (1989) (2,5 a 3,6 x103 UI/gHb) e semelhantes aos citados por Moffats et al. (2005) (1,38±0,4 x103 UI/gHb). Não houve diferença significativa entre grupos e entre momentos em ambas as provas, para a porcentagem de metahemoglobina. Em todos os momentos os resultados de mediana foram inferiores a 0,4% e do percentil 75 inferiores a 0,8%, sendo não detectáveis em vários momentos, principalmente no grupo suplementado com vitamina E na prova pós-treinamento. Os resultados obtidos estão de acordo com os valores de referência, sendo que porcentagens de metahemoglobina inferiores a 1% do total de hemoglobina são consideradas normais (HARVEY et al., 2003). Observa-se uma tendência da fragilidade osmótica (FO) de elevar-se durante e logo após o exercício, porém, não ocorreu diferença significativa entre grupos ou momentos em ambas as provas. Os resultados da literatura são conflitantes, Boucher et al. (1981) sugerem que após o exercício os eritrócitos têm volume reduzido, alterações de forma, menor deformabilidade e maior fragilidade osmótica devido à liberação de eritrócitos pelo baço. Resultados refutados por Smith et al. (1989), que reportam presença de eritrócitos de tamanho maior, sem alterações de forma ou deformabilidade e de maior resistência osmótica. Porém, as provas de exercício estudadas foram muito Resultados e Discussão 55 diferentes, Boucher et al. (1981) avaliaram eqüinos em uma corrida de enduro de 160 Km, enquanto Smith et al. (1989), realizaram uma prova curta de exercício em esteira (2m /s por 2min, 10m/s por 2min com 3% de inclinação). Posteriormente, outros estudos concluíram que o influxo de eritrócitos do baço não é o principal determinante das alterações da FO no exercício, tendo importância o tipo de exercício, o estresse físico provocado pelo aumento do fluxo sanguíneo e hemoconcentração, a temperatura, o pH e o aumento das espécies reativas de oxigênio, que promovem alterações de membrana e aumentam a fragilidade osmótica. Segundo Hanzawa & Watanabe (2000), o exercício anaeróbico induz aumento da FO devido à queda do pH e conseqüente tumefação dos eritrócitos, ambos eventos verificados no presente trabalho e que somados indicam que este protocolo de exercício pode ter induzido hemólise. A presença de hemólise em decorrência do exercício é citada em eqüinos (BOUCHER et al., 1981; HANZAWA & WATANABE, 2000). Segundo Hanzawa & Watanabe (2000) em eqüinos este aumento da destruição dos eritrócitos não excede a taxa de produção e seria uma resposta benéfica, pelo maior estímulo para liberação de células jovens que são mais eficientes no transporte de oxigênio. Contudo, a interpretação da hemólise no exercício ainda necessita de mais estudos principalmente quanto ao efeito desta hemólise em longo prazo. Resultados e Discussão 56 Tabela 8. Medianas e percentis (P25;P75) da concentração de glutationa reduzida eritrocitária (GSH) (µmol/gHb), em eqüinos da raça Árabe, nas provas P1 (pré-treinamento) e P2 (pós - treinamento) de exercício progressivo em esteira, nos grupos controle (GC) e suplementado com vitamina E (GE), mensuradas antes (M0), durante (trote e galope) e após o exercício (PE) P1 P2 Momentos GC GE GC GE M0 8,39( 8,00 ; 8,65 ) a 7,92( 7,83 ; 8,10 ) a 7,86( 7,83 ; 7,96 ) ab 8,12( 8,06 ; 8,33 ) a Trote 8,18( 8,03 ; 8,45 ) a 8,00( 7,66 ; 8,42 ) a 7,76( 7,59 ; 8,06 ) ab 8,79( 8,42 ; 9,14 ) a Galope 8,18( 8,06 ; 8,45 ) a 7,74( 7,55 ; 7,83 ) aφ 7,81( 7,59 ; 8,07 ) ab 8,26( 7,66 ; 9,04 ) a PE1 8,37( 8,22 ; 8,41 ) a 7,69( 7,51 ; 7,91 ) a 7,63( 7,49 ; 7,81 ) b 7,96( 7,48 ; 8,53 ) a PE3(30min) 8,18( 7,87 ; 8,24 ) a 7,51( 7,19 ; 7,87 ) a 7,74( 7,61 ; 7,87 ) ab 7,97( 7,79 ; 8,43 ) a PE4(2h) 9,35( 8,81 ; 9,41 )a 7,93( 7,64 ; 8,41 )a 8,32( 8,12 ; 8,46 ) ab 8,16( 7,62 ; 8,93 ) a PE5(6h) 8,61( 8,31 ; 8,79 ) a 7,85( 7,61 ; 8,08 ) a 8,43( 8,27 ; 8,72 ) ab 7,69( 7,58 ; 7,83 ) a PE7(24h) 8,37( 8,26 ; 8,40 ) a 7,33( 7,20 ; 7,51 ) a* 8,38( 8,16 ; 8,62 ) a 7,06( 6,74 ; 7,55 ) aφ PE8(72h) 8,49( 8,00 ; 8,65 ) a 8,17( 7,79 ; 8,35 ) a 8,68( 8,54 ; 8,73 ) a 7,51( 7,37 ; 7,67 ) a* PE9(120h) 7,75( 7,39 ; 7,92 ) a 6,93( 6,71 ; 7,34 ) a 8,22( 8,06 ; 8,59 ) ab 7,41( 7,04 ; 7,71 ) aφ Valores na mesma coluna seguidos de letras iguais não diferem estatisticamente (p>0,05) * Difere significativamente (p<0,05) do grupo controle, no mesmo momento e prova φ p=0, 057, em relação ao grupo controle no mesmo momento e prova PE1 = imediatamente após o exercício 6 7 8 9 10 M0 Trote Galope PE1 PE3 PE4 PE5 PE7 PE8 PE9 G S H ( µµ m ol /g H b) GC P1 GE P1 GC P2 GE P2 Figura 9. Medianas da concentração da glutationa reduzida eritrocitária (GSH) em eqüinos da raça Árabe, nas provas P1 (pré-treinamento ) e P2 (pós-treinament