Francine Benetti 

 

 

TESE DE DOUTORADO 

 

 

Influência do peróxido de hidrogênio sobre a diferenciação 

celular e a mineralização do tecido pulpar após procedimento 

clareador. Estudo histológico e imunoistoquímico 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ARAÇATUBA, SP 

2018 

 



 

 
 

 

 

 

Francine Benetti 

 

 

Influência do peróxido de hidrogênio sobre a diferenciação 

celular e a mineralização do tecido pulpar após procedimento 

clareador. Estudo histológico e imunoistoquímico 

 
 
Tese de doutorado apresentada à Faculdade de 
Odontologia de Araçatuba, Universidade 
Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - 
UNESP como parte dos requisitos para 
obtenção do título de Doutor em Ciência 
Odontológica, área de concentração em 
Endodontia.  

 

Orientador: Prof. Adj. Luciano Tavares Angelo 
Cintra 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ARAÇATUBA, SP 

2018 

 

 



 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Catalogação na Publicação (CIP) 

Diretoria Técnica de Biblioteca e Documentação – FOA / UNESP 

 

 Benetti, Francine. 

B465i  Influência do peróxido de hidrogênio sobre a diferenciação 

 celular e a mineralização do tecido pulpar após procedimento 

 clareador. Estudo histológico e imunoistoquímico / Francine 

 Benetti. - Araçatuba, 2018 

  124 f. : il. ; tab. 

 

  Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista,  

 Faculdade de Odontologia de Araçatuba 

  Orientador: Prof. Luciano Tavares Angelo Cintra 

  Coorientador: Prof. André Luiz Fraga Briso 

 

  1. Clareamento dental 2. Estresse oxidativo 3. Peróxido de 

 hidrogênio 4. Pulpite 5. Dentinogênese 6. Células-tronco I. T. 

 

    Black D24 

    CDD 617.67 

 

Claudio Hideo Matsumoto – CRB-8/5550 

 



 

 
 

Dados curriculares - Francine Benetti 
  

Identificação  

Nascida em 16 de dezembro de 1990 em Catanduva, SP. 

Filiação: Joel de Freitas Benetti e Cacilda Apda. Porta Benetti 

 

2009 – 2013 - Curso de Graduação  

Concluiu o Curso de Graduação em Odontologia, na Faculdade de Odontologia do 

Campus de Araçatuba – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – 

UNESP, em dezembro de 2013. 

 

 2014 – 2015 - Curso de Mestrado 

Concluiu o Curso de Mestrado em Ciência Odontológica, área de concentração 

Endodontia, na Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba – Universidade 

Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, em setembro de 2015, sob 

orientação do professor Luciano Tavares Angelo Cintra, e coorientação do professor 

André Luiz Fraga Briso. 

 

 2016 – 2017 - Curso de Especialização  

Concluiu o curso de Especialização em Endodontia, na Faculdade de Odontologia 

do Campus de Araçatuba – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” 

– UNESP. 

 

 2015 – 2018 - Curso de Doutorado 

Concluiu o Doutorado em Ciência Odontológica, área de concentração Endodontia, 

na Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba – Universidade Estadual 

Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, sob orientação do professor Luciano 

Tavares Angelo Cintra, e coorientação do professor André Luiz Fraga Briso.



 

 
 

  

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
 
 

Dedicatória... 



Dedicatória 

 
 

 

Dedico este trabalho aos meus pais, Joel e 

Cacilda, meus maiores incentivadores. 
 

 

Obrigada por sempre 

confiarem em mim, e sempre estarem ao meu lado. 

Obrigada por tanto amor, tanto cuidado, tanta dedicação. 

  

Graças a você, pai, eu tenho 

ao meu lado a pessoa com o maior coração deste mundo. 

Aquele que daria tudo o que tem, mesmo que pouco, a 

quem estivesse precisando. Aquele que cuida mais do 

próximo, do que de si mesmo. Que possui uma fé que pode 

mover montanhas. A sua fé é o que tem de mais bonito, e é 

o maior exemplo que pode nos dar. Obrigada por tudo! 

 

Obrigada, mãe, por resgatar 

forças quando muitas vezes não tem de onde a tirar. Por 

ser guerreira, por me ajudar tanto, em tudo. Por colocar os 

filhos sempre em primeiro lugar. Por muitas vezes dedicar 

sua vida à minha e a de meus irmãos. Por me fazer saber que 

sempre terei ao meu lado alguém que eu posso confiar, de 

todo o meu coração! Que um dia eu possa lhe retribuir 

tudo o que faz por mim! 

 

Vocês são os responsáveis por 

este momento. Todas as minhas conquistas pertencem a 

vocês. Obrigada por tudo o que me ensinaram, pela base 

que me deram. É a vocês, com toda a certeza, que dedico 

este trabalho! Amo vocês!     



 

 
 

 
  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Agradecimentos... 



  Agradecimentos 
 

 
 

 
Agradeço a Deus 

 

 

Agradeço a Deus, meu Pai, 

por receber minhas orações, e por me guiar até o presente 

momento. Por me fazer entender que Seus planos são 

maiores que os meus, e que a maior vitória desta vida é ter o 

Senhor ao nosso lado.  

 
“O Teu manto de amor sinto estar sobre mim; Minha vida te entrego, Senhor; Viverei pela fé, protegido 
assim, Na presença de Deus, Criador. Meu destino de luz vejo ao longe, Senhor, E jamais olharei para 
trás; Minha crença em Ti guardarei, Redentor; Teu poder, virtuoso me faz.” 

. 

 

  
 

Agradeço a Jesus, o 

Caminho, a Verdade, e a Vida. O maior Professor, o maior 

Exemplo, o melhor Amigo. Nosso Intercessor fiel. 

 
“O Mestre que desceu dos céus, Jesus, o Redentor, Deixou exemplo aos santos Seus, Exemplo de 

amor: Curvado, lhes lavou os pés, E assim Se humilhou; Com essa obra que Ele fez, o amor nos 

ensinou. ‘Amai-vos’, disse o Redentor, Que teve morte atroz; Jesus, por seu divino amor, salvou a 
todos nós.” 
 
 
 
 
 
 
 
 



  Agradecimentos 
 

 
 

 

Aos meus irmãos, meus amigos, Giovana e Victor Benetti,  

 
  Vocês me dão alegria todas as vezes em que 

volto para “terrinha”.  

Nos ajudamos, nos interessamos pelos 

problemas/alegrias uns dos outros, vibramos juntos... 

longe ou perto, sempre estamos presentes.  Eu torço 

por vocês, como vocês torcem por mim. Agradeço 

muito por estarem sempre ao meu lado, e por me darem 

muito orgulho, a cada dia! 

Contem comigo, eternamente! 

 

Ao meu cunhado, Allison Chivetta,  

  
Obrigada pela paciência que tem com nossa família. 

Obrigada por ser como um irmão, por querer o bem, 

por fazer o bem. Você merece o melhor que a vida 

pode proporcionar. Obrigada por ser parceiro, 

sempre! 

 

Aos meus avôs, Chico Porta, Idalina, Clair e Orávio Benetti (in 
memorian), 

  
Obrigada pela alegria e amor incondicional que nos 

dão; por serem fonte de inocência, gratidão e amor. 

Quando estou ao lado de vocês, eu tenho paz! 

Obrigada por serem a base de nossa família!  

 

Eu amo vocês, minha família! 



  Agradecimentos 
 

 
 

 

Agradecimento especial... 

 

Ao meu orientador, Prof. Dr. Luciano Tavares Angelo Cintra, 
 
Obrigada, professor, por me orientar não apenas nos projetos, mas na vida. Era 

ao professor que eu procurava em minhas grandes decisões e, em muitas vezes, era a 

única opinião que me importava. Obrigada por me ensinar, na clínica, nas salas de aula, 

no laboratório, nas pesquisas, e de uma forma muito especial, nas conversas. A cada 

conversa com o professor, era como se eu subisse mais um degrau no aprendizado da 

vida. Me fazia refletir no mundo e nas pessoas ao meu redor, no que estaria por vir, em 

quem eu era, mas principalmente, no tipo de pessoa que eu queria ser; me acrescentou 

honestidade e simplicidade, e me fez crescer muito.  

Ter a chance de conhecer e aprender com o professor, é uma sorte, pois tem 

muito a ensinar, muito além do que cabe à um professor ou orientador... e por isso, te 

tenho como um “pai” dentro daquele departamento. O professor é meu exemplo de que 

trabalhar por amor, vale à pena. O gosto pelo o que faz te deixará eternizado no 

departamento de Endodontia da FOA, tenho certeza disso, pois o professor é 

espelho, aos alunos e aos demais professores, ainda que tão novo nesta caminhada.  

Eu te admiro muito, e tenho muito orgulho por ser, ou ter sido, sua orientada. 

Torço para o professor, como torço para um amigo muito querido, e desejo que tenha a 

ciência de que suas conquistas são provas de que está no caminho certo. 

Agradeço por ser paciente comigo, quando eu estava impaciente, e por tolerar 

minhas ansiedades. Deixo aqui meus sinceros e eternos agradecimentos ao professor, 

que me acolheu em 2011, na Iniciação Científica, me ensinou tudo o que sei, sempre me 

permitindo ter minha própria opinião; me ajudou, me orientou, me confiou projetos, 

acreditou em mim, e me incentivou, por pelo menos, até este momento. Minhas conquistas 

também são suas. Conte comigo sempre! Muito obrigada por tudo, mas principalmente, 

por ser minha maior inspiração. O professor estará sempre no meu coração! 

 
“Bons pais corrigem erros, pais brilhantes ensinam a pensar.” 

Augusto Cury 

 

 

 



  Agradecimentos 
 

 
 

 

À Faculdade de Odontologia de Araçatuba. 

Agradeço à Faculdade de Odontologia de Araçatuba - FOA, da Universidade 

Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, na pessoa seu Diretor Prof. Titular 

Wilson Roberto Poi e Vice-Diretor Prof. Titular João Eduardo Gomes Filho. Foi na FOA em 

que dei meus primeiros passos longe de casa.  Eu aprendi, eu cresci, eu lutei, eu me superei, 

eu me desafiei. À FOA eu confiei toda a minha formação. Me deu a base, proporcionando 

minha formação como Cirurgiã-Dentista; neste caminho, me permitiu a Iniciação 

Científica, minhas primeiras bolsas, meu ingresso no mestrado, a minha especialidade, e 

me acolheu até aqui, término do meu doutoramento. Obrigada, FOA, por me dar o orgulho 

de dizer, onde quer que eu esteja, que vim da Faculdade de Odontologia de Araçatuba, e 

que sempre carregarei o nome desta instituição comigo, principalmente no meu coração! 

 

Ao Departamento de Odontologia Restauradora. 

Agradeço a este departamento e a todos que convivem nele, pelo acolhimento desde 

o início de minha jornada. Agradeço em especial à disciplina e laboratório de Endodontia, 

pela permissão e todo o suporte para realizar “minhas” pesquisas, e hoje, me permitir viver 

este momento. Há tanto o que agradecer, há tantas pessoas, tantos momentos, tanto 

crescimento! Fiz amigos, fiz colegas, fiz parceiros, fiz irmãos... Agradeço por todo o 

aprendizado que tive, e que espero também ter repassado. Foi neste laboratório em que 

passei a maior parte da minha vida durante esses 4 anos de pós-graduação, e assim se 

tornou como uma segunda casa para mim. Hoje não há dúvidas de que a Endodontia é 

parte da minha vida. Obrigada, ao laboratório de Endodontia da FOA, de todo o meu 

coração!  

 



  Agradecimentos 
 

 
 

Agradeço à coordenação do Programa de Pós-graduação em Ciência Odontológica 

da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP, representada pelo coordenador 

Prof. Adj. Luciano Tavares Angelo Cintra, e vice-coordenador Prof. Ass. Juliano Pelim 

Pessan, pelo impecável trabalho que desenvolvem visando o crescimento do programa.    

 

Agradeço à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – Fapesp, por 

me conceder bolsas de Iniciação Científica (projeto/renovação de bolsa num. 2011/13709-2, 

nos anos de 2011 a 2013), Mestrado (projeto num. 2013/25429-0, de março de 2014 a setembro 

de 2015) e Doutorado (projeto num. 2015/10825-2, de novembro de 2015 até este momento), 

e fornecer auxílio financeiro para a realização de nossos projetos. Agradeço ainda ao 

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq, pelo auxílio 

disponibilizado a meu orientador, que também financiou nossas pesquisas. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



  Agradecimentos 
 

 
 

Agradecimento aos demais queridos professores, que contribuíram para 

minha formação e para que este momento acontecesse. 

 

Agradeço a meu coorientador, professor André Luiz Fraga Briso. 

Professor, obrigada por acreditar tanto em mim! Obrigada por toda a força, e por 

ser um verdadeiro parceiro de nossas pesquisas! O professor é um dos responsáveis por 

termos formado esta equipe Endodontia e Dentística, e pela minha introdução nos 

trabalhos de clareação dentária e efeitos no tecido pulpar, e lhe sou eternamente grata por 

isso! Foi meu coorientador na Iniciação Científica, Mestrado e Doutorado, fazendo parte de 

toda minha formação. Obrigada por tudo o que me ensinou nesses anos, pela paciência, 

mas sobretudo, por todas as oportunidades que me concedeu. Tenho um enorme carinho 

pelo professor e uma grande admiração! Espero que nossa parceria, junto ao professor 

Luciano, seja eterna. O professor está no meu coração! 

 

Agradeço ao meu professor e tutor, Elói Dezan-Júnior. 

Professor, obrigada por todo incentivo, desde a minha graduação até os dias de hoje. 

Todas as palavras de carinho que o professor já se referiu a mim, ficam guardadas dentro 

do meu coração, eternamente. Obrigada pelo cuidado, pela atenção, por cada “empurrão” 

que me dá na vida, querendo que eu avance sempre mais degraus, principalmente na 

prática clínica. O professor me ensinou a lidar com os alunos da graduação e me permitiu 

dar as minhas primeiras aulas de verdade. Obrigada por se preocupar com minha saúde, 

por me chamar a atenção para me alimentar bem... rsrs. Obrigada por ser tão próximo, tão 

acessível às nossas incertezas, por esclarecer nossas dúvidas mais bobas, e por ser tão 

querido. Eu aprendi muito com o professor, e saiba que sempre terá um espaço guardado 

dentro do meu coração!    



  Agradecimentos 
 

 
 

Agradeço ao professor Edilson Ervolino. 

Professor, não tenho palavras para agradecer tudo o que me ajudou e me ensinou 

até este momento. Mesmo com tantos afazeres, o professor sempre propôs e aceitou nos 

auxiliar, sendo quase que como um coorientador nas “minhas” pesquisas de Iniciação 

Cientifica, Mestrado e Doutorado. Mas hoje agradeço em especial pela colaboração 

fundamental com este projeto de Doutorado, pelo auxílio na escolha dos marcadores, pelo 

auxílio durante as análises, até a obtenção dos resultados. Agradeço ainda por todas as 

vezes que me tranquilizou, quando eu procurava o professor com muitas dúvidas, mas 

sempre as solucionava rapidamente. Agradeço por me ensinar fazer as análises dos 

resultados, sempre com muita paciência, desenhando células em folhas de papel. O 

professor me proporcionou imenso aprendizado e segurança com meus trabalhos, e sou 

eternamente grata por isso. Obrigada mais uma vez por abrir as portas do departamento 

de Histologia para desenvolvermos os experimentos, e por toda confiança depositada em 

mim. Muito obrigada, de todo o meu coração!  

 

Agradeço ao professor João Eduardo Gomes-Filho. 

Muito obrigada, professor, por toda a paciência, apoio e pelas conversas atenciosas 

quando nos encontrávamos, seja no departamento ou na clínica de especialização. 

Obrigada por ser sempre tão gentil, calmo e educado. Uma simples conversa com o 

professor nos traz uma tranquilidade tamanha, tenha certeza disso. Obrigada por todas as 

dicas, pelos conselhos e pelas palavras firmes. E desejo de coração, que o professor nunca 

perca sua gentileza, pois é muito bonito de se ver.  

 

 

 



  Agradecimentos 
 

 
 

Agradeço ao professor Gustavo Sivieri de Araújo. 

Obrigada, professor, pela parceria no departamento. Por se interessar pelas minhas 

causas, por me dar apoio, por ser muito prestativo. Obrigada pela atenção e por todos os 

conselhos, sempre querendo o meu bem. O professor se tornou uma pessoa muito querida, 

e torço muito para o sucesso do professor. Espero que nunca desista de seus sonhos, assim 

como teve a coragem de batalhar pelos sonhos que já alcançou. E agradeço de uma forma 

especial, por nos emprestar o aparelho de Laser que possui, a qual sabemos que tem muita 

estima, e nos confiá-lo para realizar nossos trabalhos. Obrigada por tudo, sempre!  

 

Agradeço ao professor Rogério de Castilho Jacinto. 

Obrigada, professor, por compartilhar comigo o “vício” pelo café... rsrs Professor, lhe 

agradeço por ser sempre solícito. Por confiar em meu trabalho, por me permitir ajudar 

quando possível, e também pelas ajudas que o professor já me deu, em momentos 

específicos de minha vida. Agradeço por ser sempre gentil, paciente e compreensível. 

Agradeço por sempre dizer que tudo dará certo, que está sentindo. Que nosso “vício” pelo 

café continue nos proporcionando bons momentos de distração. 

 

Agradeço aos demais professores do departamento, em especial ao professor 

Ricardo Coelho Okida, pelas palavras de apoio, pelo interesse, pela força, por ser muito 

querido; à professora Ticiane Cestari Fagundes, pela paciência de sempre, por me permitir 

ajudar quando possível, e por confiar em meu trabalho; ao professor Paulo Henrique dos 

Santos, por ser sempre muito querido e educado; e ao professor Mauro Juvenal Nery, pelas 

boas lembranças que guardo do professor e pelas palavras de carinho e incentivo que 

sempre dirigiu a mim durante minha graduação e início do mestrado. Os professores são 

muito queridos! 



  Agradecimentos 
 

 
 

Agradeço ao professor Francisley Ávila Souza. 

Obrigada a meu amigo e professor, Francisley. Seu apoio e consideração são muito 

especiais para mim. Serei eternamente grata por toda confiança que depositou em mim 

durante a minha graduação, por tudo o que me ajudou, e me ajuda até hoje. Tenho um 

carinho enorme pelo professor, e espero que sempre continue com este grande coração, que 

ajuda a todos a seu redor. Obrigada por tudo o que me ensinou! O professor é um grande 

exemplo de batalhador! 

 

Agradeço aos demais professores que participaram da minha formação, seja na 

graduação ou na pós-graduação, pelo crescimento profissional e pessoal. 

  

 

 

 

 

 

 
 

“Aprender é a única coisa de que a mente nunca se cansa, nunca 

tem medo, e nunca se arrepende.” 

 
Leonardo da Vinci  

 
 

 

 



  Agradecimentos 
 

 
 

Agradecimento aos funcionários da FOA.  
 

Agradeço à técnica de departamento, amiga, “mãezona”, Nelci Vieira. Nelzinha, muito obrigada 

por tudo! Por todo carinho que me proporciona, por sempre cuidar de mim. Obrigada pela 

paciência, pelos altos papos, por toda a consideração. Obrigada por todos os lanchinhos que você 

leva especialmente a mim no departamento, esconde na geladeira, ou fala bem alto que é para 

mim, para que ninguém tome posse... rsrs. Obrigada pelas vezes que não se importou pela minha 

impaciência, e por puxar minha orelha quando necessário. Obrigada, Nelzinha, por fazer eu me 

sentir em casa, por ter me ensinado tanto, e por confiar em mim! Você está no meu coração para 

sempre, tenha certeza disso! 

  

Agradeço ao secretário do departamento, Peterson, por sempre me receber bem. Por perceber 

minhas ausências, por se importar, e ser sempre presente. Obrigada pela paciência, por tudo o 

que me ajuda, e pelas palavras de incentivo e força!  

   

Agradeço ao técnico do departamento e parceiro, João Rafael Amadeu. Rafa, obrigada por ter se 

tornado uma pessoa tão querida. Obrigada por todas as caronas, pela companhia, e por levar um 

pouquinho mais de alegria ao nosso departamento. Desejo que tenha um futuro brilhante! 

 

Agradeço às funcionárias da limpeza do departamento, Andressa e Grazi, pela simpatia comigo. 

Aos funcionários do biotério Central da FOA, Camilo e João, por toda paciência e compreensão. 

Aos porteiros da FOA, em especial, Márcio e Carlão, por se preocuparem, por me ajudarem, por 

torcerem por mim, e por compartilharem comigo momentos fora de hora na faculdade. Aos 

funcionários do Staepe, por serem extremamente prestativos, educados e atenciosos.  

 

Agradeço às meninas da seção de pós-graduação, Cristiane Lui Matos, Valéria de Queiroz M. 

Zagatto, e Lilian Sayuri Mada, por toda a atenção, paciência e dedicação! 

 



  Agradecimentos 
 

 
 

Agradecimento a meus eternos amigos e aos colegas de pós-graduação.  
 

Deixo meus agradecimentos àquelas que estiveram ao meu lado durante a graduação, e 

que continuam comigo até os dias de hoje. Rogéria Apda Agos Felipe e Bruna Barbieri Martins 

Borges, muito obrigada! Obrigada por serem pessoas as quais eu sei que posso confiar de olhos 

fechados. Por quererem o meu bem, por lutarem por mim, por me apoiarem, por me ouvirem, me 

darem conselhos. Vocês são verdadeiros anjos em minha vida! 

Obrigada, Ro, por toda sua amizade, compreensão, e por sempre me ouvir. Você sabe de 

todos os meus anseios, de todas as minhas angústias, de todas as minhas vitórias, assim como eu 

sei de todas as suas batalhas e todas suas conquistas. Sou eternamente grata por toda a paciência 

que tem comigo.  

Obrigada, Feia, por me acolher, me aconselhar, por ser tão simples e tão determinada. 

Por dividir comigo casos de Endodontia, pelas nossas sábias discussões, e por compartilhar 

comigo seus maiores momentos. Eu não tenho palavras para te agradecer tudo o que faz por 

mim!  

Vocês são verdadeiras irmãs, que sempre me ensinam, com gestos, com exemplos, e com 

palavras. Eu as admiro muito! Amo vocês!  

 

 Ao meu grande e querido amigo, Leopoldo Cosme Silva.  

Leozinho, eu nunca poderia imaginar que nossa amizade cresceria tanto. Você que 

chegou ao departamento movimentando a todos, ocupando grande parte do “meu tempo”, mas 

que aos poucos foi ocupando grande parte no meu coração, e no de cada um que convive com 

você. Obrigada, Leozinho, por ter se tornado tão importante na minha vida! Por ser aquele que 

me escuta, que me aconselha, que me alegra, que me faz rir... aquele que é parceiro para todas as 

horas, que se preocupa, que está SEMPRE ao meu lado, compartilhando várias “consultorias”! Eu 

não queria que você me fizesse falta nunca, porque queria você comigo sempre! Torço MUITO 

por você, por seus sonhos! Quero te ver crescer ainda mais do que já cresceu, quero ver você 



  Agradecimentos 
 

 
 

conquistar o mundo, porque você é capaz disso! Você é como um irmão para mim, e eu amo você! 

Conte comigo para tudo, sempre, eternamente!  

 

Às minhas grandes e eternas amigas do coração, Vanessa Abreu Sanches Marques e Letícia 

Citelli Conti . 

 Van, amiga, eu não tenho palavras para te agradecer por tudo! Eu não mereço ter ao meu 

lado alguém com coração tão bom e tão grande como o seu! Você é uma das pessoas mais 

verdadeiras que já conheci. Obrigada por me transmitir muita paz, harmonia, simplicidade e 

confiança extrema! Por ser alguém que eu sempre possa confiar, sem receios, sem medos. Por 

querer o bem de todos, e por nos ensinar sempre! Você nos ilumina! Obrigada por me permitir 

ser sua amiga! Eu amo você, migs!  

 Lezinha, obrigada por ter sido minha verdadeira parceira. Nossa amizade começou 

lentamente, e hoje já tem um tamanho enorme! Você me ajudou tanto, em tudo que precisei. Você 

foi e sempre será a melhor vizinha que já tive! Obrigada por tudo o que compartilhamos nesses 

últimos anos. Nossos desabafos, nossas conquistas, nossas tristezas, alegrias, nossos cafés, e 

nossas comidas... rsrs. Você me ensinou muito, com sua extrema educação e preocupação com os 

que estão ao seu redor. Eu amo você!   

 Agradeço em especial por vocês acreditarem mais em mim, do que eu mesma! Vocês 

foram as que mais me apoiaram e me deram forças nesses últimos anos. Graças ao apoio de vocês 

eu venci vários desafios, e espero que um dia possa retribuir tudo o que fizeram por mim. Vocês 

são as amigas que a Endodontia me deu! 

 

Agradeço ao meu amigo e grande parceiro, Carlos Roberto Emerenciano Bueno. 

Bueno, obrigada pelo companheirismo. Você é meu irmãozinho de Mestrado, que me 

acompanhou até este momento. Você me salvou de diversas situações (diversas!), você me ajudou, 

me ouviu, pegou minhas dores... você torna tudo mais simples sempre, descomplica, me anima, 

me apoia. Eu te admiro muito, pelo seu amor pela Endodontia, por sua simpatia, por sua 



  Agradecimentos 
 

 
 

determinação. Obrigada por estar comigo desde o início, por ser meu parceiro de disciplinas, 

pelas nossas discussões construtivas no departamento, pelas trocas de experiência, e por me 

ensinar sempre! Você é um amigo que carrego no peito, e que levarei para sempre! 

 

Agradeço à minha parceira, irmã e amiga, Marjorie de Oliveira Gallinari. 

Obrigada, Jo! Iniciamos como amigas de experimento, e do nada, nossa amizade cresceu 

a um nível, que trato você como trato minha irmã (felizmente ou infelizmente... rsrs). Obrigada 

por me aturar, por dividir comigo nossos trabalhos, nossas pesquisas, nossos orientadores, e 

assim, as mesmas preocupações e as mesmas experiências. Obrigada por tudo o que me ensinou, 

me ajudou e me apoiou. Obrigada por permitir que nossa amizade fosse além do departamento, 

e que nos trouxesse ótimos momentos juntas. Torço muito para seu sucesso, e te admiro muito! 

Saiba que tem aqui uma amiga em que pode confiar e contar para toda a vida! Amo muito você! 

 

Agradeço aos demais amigos do departamento de Odontologia Restauradora... 

Amanda Caselato Andolfatto. Obrigada, Mandinha, por sua amizade! Obrigada por me 

transmitir alegria, sempre! Pelo seu alto astral, pelos seus abraços, e por tudo que 

compartilhamos no departamento. Você é extremamente querida para mim, e mora no meu 

coração! Amo você!    

 

Renan Dal Fabbro. Obrigada, Re, pela parceria e amizade! Por ser uma pessoa sempre plena e 

calma. Obrigada pelos nossos momentos na especialização e no departamento. Torço muito para 

que alcance seus sonhos e saiba que tenho um carinho muito grande por você! Conte comigo 

sempre! 

 

Morganna Borges de A. Souza. Obrigada, Morgs, pela sua amizade, sinceridade e 

companheirismo! Por sempre me ajudar quando precisei, e por ser alguém em quem eu possa 

confiar! Gosto muito de você! 



  Agradecimentos 
 

 
 

Vanessa Rahal. Obrigada, Van, pela sua amizade! Obrigada por tudo o que compartilhamos 

juntas, pelos experimentos na histologia, pela parceria, por sempre torcer pela gente. Você está 

em meu coração!   

 

Agradeço aos colegas e amigos Camila Ambrósio Dias, Gabriely Cristinne Rezende, Bruno 

Guandaline Cunha (Jarbas), Karina Sampaio Caiaffa, Ana Carolina, Úrsula Escalero Silva, e Caio 

Pavani, pelo ótimo convívio de sempre, por todas as experiências, e pelas parcerias. 

 

Agradeço àquelas que entraram posteriormente na pós-graduação, Marina Talomey Cury, Ana 

Maria Veiga Vasques, Marina Carminatti, Carolina de Barros M. Cardoso, Caroline Loureiro, e 

Flavia Alfredo Plazza. Torço para que cada uma atinja seus objetivos e alcance seus verdadeiros 

sonhos. Obrigada pela paciência de vocês comigo! Agradeço também ao Pedro Chaves de Oliveira, 

por me permitir ajudá-lo, por toda confiança depositada em mim, por todas as palavras de 

incentivo e carinho. Torço muito para que você seja feliz no caminho que escolheu. Conte comigo 

para o que precisar! 

 

Agradeço aos que estavam na pós-graduação, e que me receberam no departamento ainda como 

aluna de Iniciação Científica. Cristine Men, Annelise, Aguinaldo Facundo, Renata Oliveira, 

Mariane e Luciana Louzada. Agradeço em especial à Lu, que foi minha parceira durante meu 

Mestrado. Obrigada por tudo!   

 

Agradeço em especial às colegas Índia Olinta de Azevedo Queiroz e Loiane Massunari, pela 

parceria e por me ensinarem experimentos com cultura celular. Sou eternamente grata a vocês 

por isso, e por toda a paciência. Torço para que o futuro de vocês seja brilhante! 

 

Agradeço ao meu colega e amigo, Diego Valentim! Obrigada, “Inútil”, por tudo que me ajudou. 

Pelas vezes que em acolheu, me escutou, me aconselhou. Obrigada por tudo o que me ensinou, 



  Agradecimentos 
 

 
 

desde a graduação, na Endodontia, e depois da pós-graduação. Obrigada por me ajudar dentro 

e fora do departamento. Você é muito querido para mim! Conte comigo, sempre! 

 

Agradeço às minhas amigas do departamento de Odontopediatria da FOA, em especial, à Lais 

Salomão Arias. Obrigada, La, por ter sido sempre uma grande parceira, seja de espetinhos, seja 

de disciplinas, ou de representante discente da pós-graduação. Obrigada por ter sido minha 

amiga na maior viagem que já fiz (IADR – San Francisco), por ter me ajudado grandemente, e 

por ser companheira de desabafos. Eu não tenho palavras para te agradecer por tudo! Você é 

muito especial! 

 

Agradeço a minha amiga, parceira, e dupla de especialização, Marcela Ito Rey, pela sua amizade, 

paciência e compreensão. Te admiro muito pela sua força, garra e determinação! Torço muito por 

você e desejo que seja muito feliz! Conte comigo sempre, amiga! 

 

Agradeço aos meus amigos que se fazem sempre presente, Cleidiel Araújo Lemos, e Fernanda 

Bernardi. Vocês são especiais! Obrigada pela amizade sincera e pela torcida eterna! Cada um, de 

sua forma, é um grande exemplo para mim. Eu os admiro e os amo MUITO! Contem comigo 

eternamente!  

 

Agradeço às esposas de meus professores, Milena de Oliveira, e Vanessa Braga Dezan. Vocês são 

pessoas extremamente queridas! Obrigada, Mi, por sempre nos receber na sua casa com tanta 

paciência, pelo seu alto astral, por suas conversas sempre animadas! Obrigada, Van, por se 

preocupar, por todos bolinhos de padaria que me deu, e por todas as vezes que abriu as portas 

de sua casa. Vocês ajudam aumentar os laços dentro do departamento! Obrigada por tudo!  

 

Agradeço ao professor Carlos Alberto de Souza Costa, e à professora Diana Gabriela Soares, por 

terem aberto as portas do departamento de Patologia da Faculdade de Odontologia de 



  Agradecimentos 
 

 
 

Araraquara, para que eu pudesse aprender um pouco da metodologia que desenvolvem. 

Obrigada, professor Carlos, por ser extremamente receptivo e atencioso! Sempre tive enorme 

admiração pelo professor! Obrigada, professora Diana, por ser espelho a todos. Saiba que o meu 

grande exemplo de pós-graduanda sempre foi você! Obrigada pelas conversas, conselhos, e tudo 

o que me ensinou. Te admiro grandemente!  

 

E finalizo fazendo um agradecimento especial àquelas que tanto me ajudam, e que me dão o 

gostinho do que é ser “professor-orientador”, “minhas” alunas de Iniciação Científica, Juliana 

Maria de Araújo Lopes, Amanda Miyuki Terayama e Gabriela Aparecida Ramos. Obrigada por 

serem minhas amigas, minhas parceiras, e muitas vezes, minhas confidentes. Eu fico feliz a cada 

conquista de vocês e a cada crescimento que temos juntas! Vocês superam minhas expectativas, 

e fazem jus às bolsas de vocês, o que me deixa muito orgulhosa! Obrigada por fazerem sempre 

mais! Obrigada pelas palavras amigas, por torcerem por mim! Eu adoro vocês, e saibam que 

podem contar comigo eternamente!! Agradeço também àquelas que já finalizaram seus projetos, 

e que foram as “minhas” primeiras orientadas, Jéssica Galbiati, Lidiane Louzada, e Marina 

Carminatti. Meu aprendizado com vocês foi eterno. Deixo meus agradecimentos também aos 

alunos Pibic Júnior, Thalita, Leticia, Anna, Isabela, Renan e Suelen, que me trouxeram e trazem 

imensa alegria! 

Saibam que vocês moram no meu coração, e que estarei aqui para o que precisarem, sempre! 

 

 

 



   
 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

“Primeiro, lembre-se de olhar para as estrelas lá no 
alto, e não para os seus pés lá embaixo. 
Depois, nunca desista do seu trabalho.  

O trabalho lhe dá sentido e propósito, e a vida é 
vazia sem isso.” 

 
Stephen Hawking 

 



   
 

 
 

BENETTI, F. Influência do peróxido de hidrogênio sobre a diferenciação 

celular e a mineralização do tecido pulpar após procedimento clareador. 

Estudo histológico e imunoistoquímico. [Tese]. Faculdade de Odontologia, 

UNESP - Universidade Estadual Paulista. Araçatuba. 2018. 

 

Resumo 

Introdução Através de modelo experimental caracterizado por nosso grupo de 

pesquisa, e protocolo clareador adaptado, verificamos que o peróxido de hidrogênio 

(H2O2) contido no gel clareador pode gerar efeitos ao tecido pulpar, que ainda não 

estão completamente compreendidos. Outros estudos mostram uma indução à 

mineralização, levando à posterior calcificação de grande parte do tecido pulpar e 

à formação de nódulos.  

Objetivos Os objetivos deste trabalho foram divididos em duas etapas:  

1 – Verificar os efeitos do H2O2 na expressão de marcadores da mineralização no 

tecido pulpar, por meio da imunomarcação de osteocalcina (OCN) e osteopontina 

(OPN); e a presença de resposta celular específica ao estresse oxidativo, por meio 

de imunomarcação com anticorpo para espécies reativas de oxigênio (EROs);  

2 –  Determinar a capacidade de resposta ao estresse oxidativo gerado pelo H2O2 

no tecido pulpar, por meio da imunomarcação de Heme-oxigenase-1 (HO-1); 

investigar os efeitos do gel clareador sobre a diferenciação odontoblástica, por meio 

da imunomarcação do fator de transcrição Jun-D; e a influência do estresse 

oxidativo gerado pelo H2O2 na identificação de células-tronco mesenquimais 

(CTMs) do tecido pulpar, por meio da técnica de imunofluorescência, com 

identificação concomitante de positividade celular para CD90, CD73, CD105 e 

negatividade para CD45.  

Materiais e métodos Foram utilizados 60 ratos Wistar que tiveram os molares 

superiores direitos ou esquerdos clareados com 0,01 mL de H2O2 35%, em uma 

aplicação de 30 minutos, de forma randomizada. Os molares do lado não clareado 

serviram de controle. Após 0 horas, 2, 3, 7, 15 e 30 dias (n=10), os animais foram 

mortos e as maxilas processadas para avaliação histológica, imunoistoquímica 

(OCN, OPN, EROs, HO-1 e Jun-D) e de imunofluorescência (CD90, CD73, CD105, 

CD45). Os resultados foram submetidos a testes estatísticos específicos (p<0,05).  



   
 

 
 

Resultados No tempo de 0 horas, houve necrose em toda a polpa coronária 

(p<0,05), e aos 2 e 3 dias, no terço oclusal (p<0,05); aos 7, 15 e 30 dias, não houve 

inflamação, assim como no controle (p>0,05). Dentina terciária estava presente aos 

7 dias, aumentando em 15 e 30 dias (p<0,05). Em relação aos marcadores de 

mineralização, OCN foi ausente imediatamente após procedimento clareador, 

aumentando ao longo dos períodos, se tornando significativa aos 15 e 30 dias 

(p<0,05); OPN apresentou maior imunomarcação aos 7 e 15 dias no grupo clareado 

(p<0,05). A imunomarcação de EROs foi significativa em todos os terços da polpa 

coronária no grupo clareado aos 7 e 15 dias, e no terço cervical aos 2 e 30 dias, 

comparada ao controle (p<0,05). HO-1 revelou maior imunomarcação no grupo 

clareado nos terços médio e cervical da polpa coronária aos 2 e 3 dias, em todos 

os terços aos 7 dias, e no terço oclusal aos 15 dias, quando comparado ao grupo 

controle (p<0,05). Imunomarcação nuclear para Jun-D foi significativa no grupo 

clareado no terço cervical da polpa coronária aos 2 e 3 dias, e nos terços oclusal e 

médio aos 7 dias, quando comparado ao grupo controle (p<0,05), reduzindo nos 

demais períodos (p>0,05). Poucas células CD90+/CD73+/CD105+/CD45- foram 

observadas no tecido pulpar do grupo controle e do grupo clareado em todos os 

períodos de análise (p>0,05).  

Conclusões Pode-se concluir que: 

1 – A redução da inflamação e o processo de reparo pulpar após procedimento 

clareador está associado com o aumento de OCN, e OPN participa durante o 

processo de reparo; EROs está presente no processo de defesa celular contra o 

estresse oxidativo decorrente do H2O2.  

2 – As células pulpares apresentam capacidade de resposta ao estresse oxidativo 

expressando HO-1 nos períodos onde há inflamação, até o início do reparo; Jun-D 

é presente no tecido pulpar durante a redução do processo inflamatório e início da 

produção de dentina terciária; a presença de estresse oxidativo não influencia o 

número de células CD90+/CD73+/CD105+/CD45- identificadas in vivo no tecido 

pulpar. 

 

Palavras-Chave Clareação dentária, estresse oxidativo, resposta pulpar, peróxido 

de hidrogênio, dentinogênese, células-tronco. 

 



   
 

 
 

BENETTI, F. Influence of hydrogen peroxide on cell differentiation and 

mineralization of pulp tissue after bleaching. Histological and 

immunohistochemical study. [Thesis, PhD]. School of Dentistry, UNESP - São 

Paulo State University. Araçatuba, SP, Brazil. 2018.   

 

Abstract 

Introduction Through an experimental model characterized by our research group, 

and adapted bleaching protocol, we verified that the hydrogen peroxide (H2O2) of 

bleaching gel can generate effects on the pulp tissue, which are not yet completely 

understood. Studies show an induction to mineralization, leading to subsequent 

calcification of a large part of the pulp tissue and to the formation of nodules. 

Objectives The objectives of this study were divided into two stages: 

1 – To verify the effects of H2O2 on the expression of mineralization markers in pulp 

tissue, through of immunolabelling of the osteocalcin (OCN) and osteopontin (OPN); 

and the presence of specific cellular response to oxidative stress, by 

immunolabeling with antibody to reactive oxygen species (ROS); 

2 – To determine the capacity of response to oxidative stress generated by H2O2 in 

pulp tissue, through of immunolabelling of Heme-oxigenase-1 (HO-1); to investigate 

the effects of the bleaching gel on the odontoblastic differentiation, through the 

immunolabelling of the transcription factor Jun-D; and the influence of the oxidative 

stress generated by H2O2 on the identification of mesenchymal stem cells (MSCs) 

of the pulp tissue by the immunofluorescence technique, with the concomitant 

identification of cellular positivity for CD90, CD73, CD105 and negativity for CD45. 

Materials and methods Sixty Wistar rats were used, and the right or left upper 

molars were bleached with 0.01 mL of 35% H2O2, in a direct application of 30 

minutes, randomly. The molars on the unbleached side served as controls. After 0 

hours, 2, 3, 7, 15 and 30 days (n=10), the animals were killed and the jaws 

processed for histological, immunohistochemical (OCN, OPN, ROS, HO-1 and Jun-

D) and immunofluorescence (CD90, CD73, CD105, CD45) analysis. The results 

were submitted to specific statistical tests (P<0.05).  

Results At 0 hours, there was necrosis throughout the coronary pulp (P<0.05), and 

at 2 and 3 days, in the occlusal third (P<0.05); at 7, 15 and 30 days, there was no 

inflammation, as well as in the control (P>0.05). Tertiary dentin was present at 7 



   
 

 
 

days, increasing in 15 and 30 days (P<0.05). In relation to mineralization markers, 

OCN was absent immediately after bleaching procedure, increasing over the 

periods, becoming significant at 15 and 30 days (P<0.05); OPN has higher 

immunolabelling at 7 and 15 days in the bleached group (P<0.05). Immunolabelling 

of ROS was significant in all thirds of the coronary pulp in the bleached group at 7 

and 15 days, and in the cervical third at 2 and 30 days, compared to the control 

group (P<0.05). HO-1 showed higher immunolabelling in the bleached group in the 

middle and cervical thirds of the coronary pulp at 2 and 3 days, in all thirds at 7 days, 

and in the occlusal third at 15 days, when compared to the control group (P<0.05). 

Nuclear immunolabelling for Jun-D was significant in the bleached group in the 

cervical third of the coronary pulp at 2 and 3 days, and in the occlusal and middle 

thirds at 7 days, when compared to the control group (P<0.05), reducing in the other 

periods (P>0.05). Low number of CD90+/CD73+/CD105+/CD45- cells were 

observed in the pulp tissue of the control group and the bleached group in all periods 

of analysis ( 

P>0.05).  

Conclusions It is concluded that: 

1 – The reduction of inflammation and the pulp repair process after bleaching is 

associated with increased of OCN, and OPN participates during the repair process; 

ROS are present in the cellular defence process against oxidative stress by H2O2. 

2 – The pulp cells had capacity to respond to oxidative stress expressing HO-1 in 

the periods where there is inflammation, until the beginning of the repair; Jun-D is 

present in the pulp tissue during the reduction of the inflammatory process and the 

beginning of the production of tertiary dentin; the presence of oxidative stress does 

not influence the number of CD90+/CD73+/CD105+/CD45- cells identified in vivo in 

the pulp tissue. 

 

Keywords dental bleaching, oxidative stress, pulp response, hydrogen peroxide, 

dentinogenesis, stem cells. 

 

  



   
 

 
 

S U M Á R I O 

  Páginas 

I. Introdução e justificativa..................................................... 1 

   

II. Objetivos............................................................................... 10 

   

III. ARTIGO 1 ............................................................................. 

Presence of osteocalcin, osteopontin, and reactive oxygen species-positive 

cells in pulp tissue after dental bleaching 

12 

   

IV. ARTIGO 2.............................................................................. 

In vivo analysis of the presence of heme oxygenase-1, transcription factor 

Jun-D, and CD90+/CD73+/CD105+/CD45- cells in the pulp of bleached teeth 

32 

   

V. Considerações finais............................................................. 58 

   

VI.  Referências........................................................................... 60 

   

VII. Anexo I.................................................................................. 

Guia para submissão dos artigos 

72 

   

VIII. Anexo II................................................................................. 

Certificado do Comitê de Ética no uso de animais 

93 

   

IX. Anexo III................................................................................ 

Carta de aceite referente ao Artigo 1 

95 

 



   
 

1 
 

 

 

 

 

 

 

I. Introdução e justificativa 

 

 
 



Introdução e justificativa 

Tese de Doutorado –  Francine Benetti  
2 

I. Introdução e justificativa 

A estética do sorriso tem atraído cada vez mais a atenção do público, 

levando a um aumento na busca pelo procedimento clareador dentário (Briso et al. 

2015, Calderini et al. 2016). Apesar de ser um tratamento considerado conservador 

quando comparado a outras formas de tratamento para se obter dentes mais claros, 

esse procedimento causa alterações no tecido pulpar que ainda não estão 

completamente compreendidas (Seale et al. 1981, Lee et al. 2006a, Min et al. 2008, 

Costa et al. 2010, Cintra et al. 2013). 

Estudos mostraram que o peróxido de hidrogênio (H2O2), componente ativo 

do gel clareador, pode causar alterações morfológicas na superfície dentária, como 

a redução da microdureza do esmalte e aumento da rugosidade (Chen et al. 2008, 

Briso et al. 2015). Ainda, espécies reativas de oxigênio (EROs), liberadas a partir 

do H2O2, possuem a capacidade de atravessar esmalte e dentina, levando a 

alterações no tecido pulpar, como inflamação, diminuição da celularidade e do 

metabolismo celular (Seale et al. 1981, Min et al. 2008, Cintra et al. 2013, Soares 

et al. 2014, Cintra et al. 2016a), além de desnaturação proteica (Caviedes-Bucheli 

et al. 2006, Camargo et al. 2007), e necrose tecidual (Costa et al. 2010, Cintra et 

al. 2013, Cintra et al. 2017, Benetti et al. 2018).  

Em um estudo inicial, observamos que após uma sessão clareadora com 

alta concentração de H2O2 (3 aplicações de 15 min cada, H2O2 35%) o tecido pulpar 

de molares de ratos apresentava inflamação severa e áreas de necrose. Estes 

danos se intensificaram a medida que o número de sessões clareadoras foi 

aumentado (Cintra et al. 2013). Posteriormente, notamos que mesmo após intensa 

agressão pulpar, o tecido se apresentou organizado aos 30 dias do procedimento 

clareador (Cintra et al. 2016b). Entretanto, grande área da câmara pulpar estava 

ocupada por dentina terciária, sendo diretamente proporcional ao aumento da 

concentração e do tempo de aplicação do H2O2 sobre o esmalte dentário (Cintra et 

al. 2016b). 

Observa-se que as células pulpares possuem a capacidade de promoverem 

a formação de tecido duro após o contato com o H2O2 (Hanks et al. 1993, Lee et al. 

2006b, Matsui et al. 2009). Acredita-se que em baixas doses, o H2O2 seja capaz de 

estimular as células a se proliferarem e executarem suas funções (Burdon et al. 

1989, Burdon et al. 1995, Wiese et al. 1995, Davies 1999), atuando como um agente 



Introdução e justificativa 

Tese de Doutorado –  Francine Benetti  
3 

de sinalização para a mitose celular (Davies 1999), com papel importante na 

transdução do sinal que modula o comportamento das células (Chang & Karin 2001, 

Forman & Torres 2001, Liu et al. 2002, Runchel et al. 2011, Wu et al. 2013).  

A imunomarcação do Antígeno Nuclear de Proliferação Celular (PCNA) 

revelou uma grande quantidade de células em proliferação no tecido pulpar de 

dentes clareados, principalmente nos terços mais profundos da polpa coronária 

(Benetti et al. 2017a). A presença de células apoptóticas no tecido pulpar também 

foi observada (Benetti et al. 2017a). A apoptose é crítica para o desenvolvimento 

dos tecidos e da recuperação destes após estímulos internos e externos (Vermelin 

et al. 1996, Mitsiadis & Rahiotis 2004, Mitsiadis et al. 2008). Assim, pode 

desempenhar papel na minimização da lesão à polpa dentária (Wu et al. 2013), e 

na formação de dentina terciária, durante um processo carioso, por exemplo, 

proporcionando espaço para a nova dentina e impedindo a ocorrência de necrose 

na tentativa de minimizar a inflamação (Mitsiadis et al. 2008). 

Ainda, observamos que as citocinas pró-inflamatórias Fator de Necrose 

Tumoral (TNF)-α, interleucina (IL)-6 e IL-17 (Ferreira et al. 2017, Benetti et al. 2018) 

participam do processo inflamatório ocorrido no tecido pulpar após clareação 

dentária, particularmente nos períodos iniciais. Em adição, uma quantidade 

significativa de células positivas para o receptor CD5, presente em todos os 

timócitos ou linfócitos T maduros (Lozano et al. 2000, Brown & Lacey 2010, de Wit 

et al. 2011), foi observada nos períodos iniciais após o procedimento clareador, 

permanecendo nos períodos mais tardios quando alta concentração de H2O2 foi 

utilizada (Benetti et al. 2018). Estes resultados nos permitem concluir que o tecido 

pulpar tem a capacidade de se recuperar mesmo após os danos severos gerados 

pelo H2O2, mas os mecanismos celulares que envolvem esse processo são pouco 

conhecidos, e pouco se sabe sobre as consequências a longo prazo que o H2O2 

pode ocasionar ao tecido pulpar.  

É possível investigar in vivo o momento em que as células pulpares 

apresentam capacidade de defesa frente ao estresse oxidativo gerado pelo H2O2, 

e indiretamente, o período de permanência do estresse oxidativo no tecido pulpar. 

Para isso, podem ser utilizadas imunomarcação para Heme-oxigenase-1 (HO-1) e 

EROs. A HO-1 é uma proteína celular induzida em resposta ao estresse oxidativo, 

e está presente em vários mecanismos celulares reguladores, tendo função 



Introdução e justificativa 

Tese de Doutorado –  Francine Benetti  
4 

importante na citoproteção e homeostase dos tecidos (Otterbein & Choi 2000, 

Cooper et al. 2007, Pae & Chung 2009). Tem capacidade de gerar monóxido de 

carbono (CO) para suprimir a sinalização inflamatória, e biliverdina e bilirrubina, que 

possuem ação antioxidante (Min et al. 2008, Pae & Chung 2009, Min et al. 2010).  

Foi demonstrado que monômeros de resina são capazes de estimular a 

expressão de HO-1 via produção de EROs em células pulpares (Schweikl et al. 

2004, Chang et al. 2005, Chang et al. 2009, Eckhardt et al. 2009), e que HO-1 

desempenha papel fundamental na adaptação das células da polpa dentária 

humana às condições de estresse (Min et al. 2006, Min et al. 2006a, Lee et al. 2007, 

Pi et al. 2007, Min et al. 2008, Kook et al. 2009, Lee et al. 2009).  

Outros estudos mostraram que HO-1 foi expressa em odontoblastos e 

células endoteliais após procedimento clareador em pré-molares humanos 

(Anderson et al. 1999). Segundo os autores, os odontoblastos da polpa coronária 

e células endoteliais subjacentes podem ter potencial de resposta ao estresse 

oxidativo aumentando a síntese de HO-1, representando uma resposta defensiva 

inicial, que antecedem vias inflamatórias clássicas. 

Assim, a expressão de HO-1 em células do tecido pulpar de dentes 

clareados, pode indicar que estas células estejam sofrendo estresse oxidativo, 

causado pela presença de EROs derivadas do gel clareador, tendo a capacidade 

de se adaptarem através de mecanismos para sua proteção. 

Ainda, a extensão de células atingidas pelas EROs liberadas pelo H2O2 

também pode ser  avaliada por meio de marcadores específicos de DNA de células 

danificadas pelas EROs, os anti-EROs. Há estudos na literatura que mostraram ser 

capaz a ação desses anticorpos em células atingidas pelo H2O2 (Ashok et al. 1997, 

Ashok et al. 1998, Mistry et al. 1999, Strollo et al. 2013), mas não encontramos 

estudos in vivo que avaliaram a extensão de células afetadas pelo H2O2 no tecido 

pulpar, após clareação dentária. Identificar estas marcações em cortes histológicos 

pode nos mostrar a real capacidade de penetração das EROs neste tecido e a 

extensão do tecido afetado após procedimento clareador.  

Estudos mostraram que os danos causados pelo H2O2 do gel clareador ao 

tecido pulpar são posteriormente reparados, com a formação de novas células 

odontoblastóides e extensa formação de dentina terciária (Cintra et al. 2016b, 

Benetti et al. 2018). Assim, pode-se supor que ocorra alterações na expressão de 



Introdução e justificativa 

Tese de Doutorado –  Francine Benetti  
5 

proteínas envolvidas no processo de dentinogênese, como osteocalcina (OCN) e 

osteopontina (OPN), e na expressão de fatores de transcrição envolvidos na 

diferenciação odontoblástica, como por exemplo, Jun-D. Ainda, células-tronco 

mesenquimais (CTMs) também podem atuar neste processo de reparo. No entanto, 

estudos são necessários para que se compreenda os mecanismos celulares 

envolvidos na reparação do tecido pulpar após clareação dentária. 

Ao sofrer uma injúria, como por exemplo uma injúria química (caso do H2O2 

do gel clareador), o tecido pulpar tem a reação defensiva de produzir dentina 

terciária (Torneck 1998). Quando o dano ocasionado ao tecido pulpar é leve, os 

próprios odontoblastos presentes no local são os responsáveis pela produção da 

dentina terciária, que recebe o nome de dentina reacional. Quando os danos 

ocorrem de forma severa, danificando os odontoblastos presentes, as células-

tronco do tecido pulpar são recrutadas para a produção de novas células 

odontoblastóides, que respondem à injúria produzindo a dentina reparadora, o 

segundo sub-tipo de dentina terciária (Fitzgerald et al. 1990, Tornec 1998, Lee et 

al. 2006, Yuan et al. 2012). Assim, as células diferenciadas e não diferenciadas da 

polpa dentária podem contribuir para o processo de produção de dentina terciária 

(Agata et al. 2008). 

Vários fatores de transcrição nucleares são considerados relevantes para a 

osteoblastogênese (Karsenty & Wagner 2002, Colucci et al. 2011). O gene Jun-D é 

conhecido por ter um papel chave no controle da diferenciação de osteoblastos 

(McCabe et al. 1995, Colucci et al. 2011), e foi demonstrado em osteoblastos 

completamente diferenciados (McCabe et al. 1996). Com base nas semelhanças 

morfológicas e funcionais entre osteoblastos e odontoblastos (TenCate 1998), 

muitos pesquisadores utilizam marcadores de diferenciação osteoblástica como 

marcadores terminais de odontoblastos (Hirata et al. 2005). 

A expressão de Jun-D e osteocalcina (OCN) foi analisada na fase inicial de 

formação de dentina reacionária em ratos após a realização de um preparo do 

dente (Hirata et al. 2005), e Jun-D foi temporariamente expresso nos núcleos dos 

odontoblastos, em um e dois dias após o preparo. Já a OCN foi sintetizada e 

segregada para a matriz de dentina reacionária três dias após o preparo. Assim, a 

expressão de OCN está relacionada com a formação de dentina reacionária, e Jun-

D está associado com a expressão de OCN em odontoblastos. Considera-se, 



Introdução e justificativa 

Tese de Doutorado –  Francine Benetti  
6 

portanto, que Jun-D atua tanto como um fator de transcrição que controla a 

expressão de OCN, como um marcador de diferenciação de odontoblastos (Owen 

et al. 1990, Ducy et al. 1997, Kern et al. 2001). 

A OCN, uma das diversas proteínas da linhagem dos osteoblastos, é 

expressa em odontoblastos envolvidos na formação da matriz de dentina 

reacionária (Hirata et al. 2005). Pode ser observada nos odontoblastos, em seus 

processos, e na matriz de dentina, mas não em pré-dentina (Matsui et al. 2009), o 

que indica que seja sintetizada dentro dos odontoblastos, transportada através de 

seus processos, e depositada na matriz de dentina (Bronckers et al. 1985, Okabe 

et al. 2006, Matsui et al. 2007, Wei et al. 2007, Matsui et al. 2008). Assim, a OCN é 

secretada por odontoblastos maduros e recém-formados, mas não está presente 

na pré-dentina (Matsui et al. 2009), o que nos leva a entender que a marcação de 

OCN antecede a mineralização da dentina (Yao et al. 1994). 

Outra proteína que também desempenha papel importante nos processos 

que conduzem à mineralização é a osteopontina (OPN) (Matsui et al. 2009), uma 

glicoproteína fosforilada multifuncional (Gericke et al. 2005) presente na 

diferenciação dos odontoblastos, no crescimento e na regeneração óssea (Sodek 

et al. 2000, Matsui et al. 2009). Acredita-se que a OPN regula eventos inicias de 

remodelação óssea, tais como a adesão celular, o funcionamento dos osteoclastos, 

e a mineralização da matriz (Sodek et al. 2000). Ainda, pode ligar-se a uma grande 

quantidade de cálcio (Sodek et al. 2000), e, junto com a OCN, formar os cristais de 

hidroxiapatita (Gericke et al. 2005). Assim, tem papel não apenas na fase inicial de 

formação, mas também durante a calcificação da dentinogênese reparativa 

(Kuratate et al. 2008). 

Assim, a dentina formada pelo tecido pulpar após procedimento clareador é 

constituída em parte, por dentina reparadora, formada por células odontoblastóides 

recém diferenciadas, e em parte, por dentina reacional, formada pelos 

odontoblastos presentes nos terços médio e cervical da polpa coronária, que 

produziram dentina como forma de defesa ao estresse oxidativo. Com a utilização 

de anti-OPN, acreditamos que esta proteína poderá ser expressa antes da 

expressão dos marcadores Jun-D e OCN, indicando a produção de dentina 

reacional, e expressa também após a marcação destes, indicando a formação de 

dentina reparadora. 



Introdução e justificativa 

Tese de Doutorado –  Francine Benetti  
7 

Mesmo com a expressão destes marcadores imunoistoquímicos, 

acreditamos que a identificação de CTMs seja necessária para auxiliar no 

esclarecimento dos mecanismos que envolvem a dentinogênese e a proliferação 

celular após estresse oxidativo ao tecido pulpar pelo procedimento clareador. 

Possivelmente, a menor concentração ou quantidade de H2O2 que atinge os 

terços médio e cervical da polpa coronária, seja capaz de ativar as células-tronco 

lá existentes, para que estas se diferenciem em novas células. Esta análise poderia 

nos levar ao entendimento de que o H2O2 do gel clareador possa ser capaz de 

ativar as células mesenquimais indiferenciadas em reposta ao estresse oxidativo 

gerado, o que levaria a um processo de reparo, mas também de envelhecimento 

precoce, levando a menor capacidade de reparo durante uma próxima injúria, uma 

vez que um grande número de CTMs, que seria utilizado durante toda a vida do 

elemento dentário, estaria sendo perdido (Basso et al. 2013, Soares et al. 2014). 

Quando odontoblastos são perdidos devido às agressões ao dente, estes 

podem ser substituídos por células odontoblastóides derivadas de células 

indiferenciadas mesenquimais, ou CTMs, que residem na polpa, e também podem 

ser consideradas como células-tronco da polpa dentária (DPSC) (Gronthos et al. 

2000, Gronthos et al. 2002), essenciais para a homeostasia do tecido pulpar. 

 As DPSC foram referidas como tendo uma grande capacidade de 

proliferação e de diferenciação (Nosrat et al. 2001, Tash et al. 2013), sendo 

capazes de gerar o complexo dentino-pulpar, o que conduz a sua utilização na 

regeneração deste complexo em aplicações clínicas durante um tratamento 

biológico para reparo do tecido pulpar danificado (Nakashima et al. 2004, 

Nakashima & Akamine 2005, Cordeiro et al. 2008, Huang 2009, Huang et al. 2009, 

Huang et al. 2009a). 

Vários estudos têm documentado o potencial osteogênico in vitro e in vivo 

das DPSC (Laino et al. 2005, Carinci et al. 2008, Mori et al. 2010, Liu et al. 2011, 

Atari et al. 2012). Outros estudos detectaram os marcadores de CTMs STRO-1, 

CD90, CD105 e CD146 em tecidos pulpares inflamados por meio da análise de 

imunoistoquímica (Alongi et al. 2010). Marcadores como CD73, CD90, CD105, 

também foram observados em células pulpares que entraram em contato com 

sistemas adesivos (Trubiani et al. 2010). Assim, nosso último objetivo é verificar se 



Introdução e justificativa 

Tese de Doutorado –  Francine Benetti  
8 

CTMs estão presentes em tecidos pulpares que sofrem estresse oxidativo após 

procedimento clareador. 

Diversas são as abordagens para caracterizar as CTMs, dificultando a 

comparação entre resultados de estudos distintos (Fernandez-Vallone et al. 2013). 

Assim, em 2006, a Sociedade Internacional de Terapia Celular (ISCT) propôs 

critérios mínimos para definir CTMs humanas. Dentre estes critérios, estabeleceu-

se que CTMs devem apresentar expressão para CD105, CD73 e CD90, e não 

expressão para, dentre outras, CD45 (Kawashima 2012, Fernandez-Vallone et al. 

2013). 

A CD90 (Thy-1) é uma glicoproteína expressa principalmente nos leucócitos 

e está envolvida em interações célula-célula e célula-matriz (Rege & Hagood 2006). 

Vários investigadores relataram a expressão de CD90 nas DPSCs (Huang et al. 

2009a, Huang et al. 2009b, Balic et al. 2010, Karaoz et al. 2010, Pivoriuunas et al. 

2010). A CD73 atua como uma molécula de adesão celular e intercede a ligação 

de linfócitos às células endoteliais (Airas et al. 1995, Fernandez-Vallone et al. 

2013). Ainda, por ser uma molécula de adesão, age como um ativador de 

transdução de sinal durante a interação das CTMs com os demais componentes do 

microambiente do estroma, favorecendo os processos de proliferação e 

diferenciação (Barry et al. 2001). Vários estudos relataram sua expressão em 

DPSCs (Alongi et al. 2010, Pivoriuunas et al. 2010, Yamada et al. 2010). Já a 

CD105, conhecida como endoglina, está associada com o endotélio vascular 

humano (Rius et al. 1998), também sendo referida como expressa nas DPSCs em 

alta atividade de proliferação e migração (Huang et al. 2009b, Waddington et al. 

2009, Alongi et al. 2010, Lee et al. 2010, Pivoriuunas et al. 2010). 

Para a identificação de um marcador negativo para CTMs, podemos lançar 

mão da marcação de CD45, que é uma glicoproteína de superfície celular 

encontrada em todas as células da linhagem hematopoiética, exceto eritrócitos e 

plaquetas (Streuli et al. 1988, Rutz et al. 2007). Um estudo mostrou que polpas de 

incisivos murinos não erupcionados continham pouca marcação CD45+, e uma alta 

marcação CD90+/CD45-, sendo que este tecido exibiu uma rápida mineralização in 

vitro (Balic & Mina 2010). Essas características também foram observadas em 

molares humanos inclusos (Balic et al. 2010). Após erupção dos dentes, o perfil de 

marcação imunoistoquímica apresentou-se com maior quantidade de células 



Introdução e justificativa 

Tese de Doutorado –  Francine Benetti  
9 

CD45+, e menor marcação para CD90+ (Balic & Mina 2010). Isso nos sugere que 

ambos, dentes de ratos e de humanos, apresentam maior marcação para células 

estaminais no momento do desenvolvimento dentário. Acreditamos que estas 

células voltem a se proliferar após o procedimento de clareação dentária.  Assim, 

utilizaremos estes marcadores (CD90, CD105, CD73 e CD45) para a observação 

da resposta das CTMs em tecidos pulpares de dentes clareados. 

Depreende-se dos estudos consultados na literatura que, até o momento, os 

mecanismos que envolvem as células após o contato com o H2O2 não estão 

completamente elucidados, principalmente no que diz respeito à dentinogênese 

reparadora. Vários estudos foram realizados para compreender os efeitos do H2O2 

sobre o tecido pulpar, entretanto, muitos destes estudos se baseiam em culturas 

de células manipuladas ex vivo, o que leva a limitações significativas com relação 

à interação celular. Uma limitação deste modelo experimental é o fato dessas 

células não serem analisadas junto a um tecido organizado, restringindo a análise 

apenas à linhagem celular utilizada. A falta de estudos in vivo, que forneça 

informações detalhadas a respeito dos eventos celulares e moleculares que 

ocorrem após o procedimento clareador, é clara.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

10 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

II. Objetivos 

 

 



Objetivos 

Tese de Doutorado –  Francine Benetti  
11 

 

II. Objetivos  

Os objetivos deste trabalho são: 

 

1 – Verificar in vivo os efeitos do H2O2 do gel clareador na expressão de 

marcadores da mineralização no tecido pulpar, por meio da imunomarcação de 

osteocalcina (OCN) e osteopontina (OPN); e a presença de resposta celular 

específica ao estresse oxidativo, por meio de imunomarcação com anticorpo para 

espécies reativas de oxigênio (EROs); 

 

2 – Determinar a capacidade de resposta ao estresse oxidativo gerado pelo 

H2O2 no tecido pulpar, por meio da imunomarcação de Heme-oxigenase-1 (HO-1); 

investigar os efeitos do gel clareador sobre a diferenciação odontoblástica, por meio 

da imunomarcação do fator de transcrição Jun-D; e a influência do estresse 

oxidativo gerado pelo H2O2 na identificação de células-tronco mesenquimais 

(CTMs) do tecido pulpar, por meio da técnica de imunofluorescência, com 

identificação concomitante de positividade celular para CD90, CD73, CD105 e 

negatividade para CD45. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

12 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

III. Artigo 1 

International Endodontic Journal 



Artigo 1. Benetti et al.  

Tese de Doutorado –  Francine Benetti  
13 

 

Presence of osteocalcin, osteopontin, and reactive oxygen species-positive cells in pulp 

tissue after dental bleaching 

 

Abstract 

Aim Apoptosis and lymphocyte-like cells are observed after tissue reorganisation and 

tertiary dentine formation in dental pulp previously damaged by hydrogen peroxide (H2O2). 

However, our understanding of the long-term effects of H2O2 is limited. This study analysed 

the influence of H2O2 on pulp repair through osteocalcin and osteopontin immunolabelling, 

and in cellular defence by using the anti-reactive oxygen species (ROS) antibody. 

Methodology The maxillary molars of rats were treated with 35% H2O2 (Ble group) or 

placebo gel (control). At 0 h and 2, 7, 15, and 30 days (n=10 hemimaxillae), the rats were 

killed; pulp tissue was evaluated using inflammation and immunolabelling scores 

(osteocalcin/osteopontin); ROS-positive cells were counted. Friedman and Dunn tests or 

repeated-measures ANOVA was used (P<0.05).  

Results The Ble group had necrosis in the coronary pulp at 0 h, and in the occlusal third of 

the coronary pulp at 2 days; at 7, 15, and 30 days, no inflammation was noted similar to the 

controls (P>0.05). Osteocalcin was absent in the Ble at 0 h, moderate at 2 days, and increased 

thereafter, differing from the controls at 15 and 30 days (P<0.05). Osteopontin was higher 

at 7 and 15 days in Ble group compared to controls (P<0.05). The Ble group had more ROS-

positive cells in pulp at 7 and 15 days (P<0.05). Tertiary dentine was observed at 7 days, 

increasing thereafter (P<0.05).  

Conclusions Post-bleaching pulp repair is associated with increased osteocalcin over time. 

Osteopontin also participates in this process, and anti-ROS is involved in cellular defence 

against H2O2. 

 

Keywords Dental pulp, hydrogen peroxide, osteocalcin, osteopontin, reactive oxygen 

species, tertiary dentine. 

 

 

 

 

 

 



Artigo 1. Benetti et al.  

Tese de Doutorado –  Francine Benetti  
14 

 

Introduction 

Hydrogen peroxide (H2O2) is widely used in dentistry as an active component of bleaching 

gels, because it is an excellent auxiliary material in dental aesthetic procedures (Briso et al. 

2016, Cintra et al. 2016a, Benetti et al. 2017b). However, H2O2 is known to promote tooth 

sensitivity, even in intact teeth (Resende et al. 2016), and can have adverse effects on pulp 

tissue. 

Several studies (Benetti et al. 2004, Soares et al. 2014, Cintra et al. 2016a) have 

showed that H2O2 releases reactive oxygen species (ROS), which can penetrate mineralised 

dental tissues and reach the pulp tissue (Costa et al. 2010, Cintra et al. 2013, Roderjan et al. 

2015, Cintra et al. 2016b; 2017, Ferreira et al. 2018). The effects of this action range from 

inflammation, which may be minimal depending on the thickness of enamel and dentine 

(Kina et al. 2010, Benetti et al. 2017b), to pulp necrosis in teeth with less thick mineralised 

tissues (Costa et al. 2010, Cintra et al. 2013). 

Previous studies have considered the necrosis generated after bleaching as an 

irreversible process (Costa et al. 2010, Roderjan et al. 2015). However, recent studies have 

shown that areas of necrosis observed in the bleached molars of rats were later replaced by 

tertiary dentine, and that pulp tissue recovered its cellular organisation (Cintra et al. 2016b, 

Benetti et al. 2017a; 2018). These results were observed even in diabetic rats (Cintra et al. 

2017, Ferreira et al. 2018). A study on dogs also showed initial changes in the pulp which 

were reversible over time (Seale et al. 1981).  

In vitro studies have shown that pulp cells can promote the formation of hard tissue 

after contact with H2O2 (Lee et al. 2006, Matsui et al. 2009). At low doses, H2O2 has been 

demonstrated to stimulate cell proliferation (Burdon & Rice-Evans 1989, Burdon 1995, 

Davies 1999, Benetti et al. 2017a), signal cell mitosis, and have an important action in cell 

signal transduction (Davies 1999, Chang & Karin 2001, Liu et al. 2002, Wu et al. 2013). 

In a previous in vivo animal study, H2O2 induced cell proliferation in the pulp tissue, 

mainly in the third of the coronary pulp which was exposed to a lower concentration of H2O2 

(Benetti et al. 2017a). On the other hand, studies have verified the presence of CD5-positive 

cells (Benetti et al. 2018), which may indicate the proliferation of thymocyte-like or mature 

T-lymphocyte cells and B cells (Lozano et al. 2000, Brown & Lacey 2010, de Wit et al. 

2011). These cells were present in the pulp even 30 days after the bleaching procedure 

(Benetti et al. 2018). Presence of apoptotic cells in the pulp tissue of rat molars was also 



Artigo 1. Benetti et al.  

Tese de Doutorado –  Francine Benetti  
15 

 

observed after the use of higher concentrations of H2O2 in the later periods, where pulp tissue 

was already organised (Benetti et al. 2017a). 

These results show that pulp tissue has the capacity to recover even after damage 

generated by H2O2, but the cellular mechanisms involved in this process are not fully 

understood. Thus, the objective of this study was to verify the effect of H2O2 in a bleaching 

gel on the repair process of pulp tissue over time, through the analysis of dentinogenesis 

markers, namely, osteocalcin and osteopontin. In addition, the study aimed to verify the 

period in which the cell became capable of responding to the effects of H2O2, as well as the 

duration of this effect, by using a specific antibody, the anti-reactive oxygen species (anti-

ROS) antibody. Our hypothesis was that the effects of H2O2 contact with pulp tissue may be 

long lasting and may influence pulp tissue mineralisation over time, even after tissue 

organisation. 

  

Materials and Methods 

Fifty 2-month-old male Wistar albino rats (weighing approximately 280 g) were used. The 

sample size was established on the basis of the findings of previous studies (Cintra et al. 

2013; 2016b, Benetti et al. 2017a; 2018). The animals were housed in a temperature-

controlled environment (22°C ± 1°C, 70% humidity, and a 12-h light–dark cycle) and 

received water and food ad libitum. All animal procedures were performed in accordance 

with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the National Institutes of 

Health (Bethesda, MD, USA). The experimental protocol (CEUA-01053-2015) was 

approved by the local Ethics Committee. 

 

Dental bleaching 

The animals were anaesthetised by intramuscular injections of ketamine (80 mg/kg, 

Ketamina Agener 10%; União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, São 

Paulo, Brazil) and xylazine (10 mg/kg, Xilazin; Syntec do Brasil LTDA, Cotia, São Paulo, 

Brazil). After the application and photo-activation of the resinous gingival barrier (Top Dam; 

FGM Dental Products, Joinville, SC, Brazil), the right or left maxillary molars of the rats 

were randomly treated with either bleaching gel (0.01 mL; 1 application of 30 min of the 

35% H2O2; Whiteness HP Maxx; FGM Dental Products, Joinville, SC, Brazil) or placebo 



Artigo 1. Benetti et al.  

Tese de Doutorado –  Francine Benetti  
16 

 

gel (0.01 mL; 1 application of 30 min of the thickener of the bleaching gel) (Cintra et al. 

2016b). 

 

Histological and immunohistochemical analysis 

The rats were killed immediately (0 h) and at 2, 7, 15, and 30 days (Hirata et al. 2005, 

Kina et al. 2010, Cintra et al. 2013, Cintra et al. 2016b) after dental bleaching, with an 

overdose of an anaesthetic solution (Thiopentax; Cristália—Produtos Químicos 

Farmacêuticos LTDA, Itapira, São Paulo, Brazil), resulting in n=10 hemimaxillae per 

bleaching group and 10 hemimaxillae per control group, in each period. The right and left 

hemimaxillae were separated, dissected, and fixed in a solution of 4% buffered 

formaldehyde for 24 h. The specimens were decalcified in a 10% ethylenediaminetetraacetic 

acid solution for 3 months and then dehydrated, clarified, and embedded in paraffin.  

Serial histological sections of each specimen were selected from the point where the 

mesial root of the first molar was seen in all its longitudinal extension. Five-micron sections 

were cut in the vestibular–lingual plane and stained with haematoxylin–eosin (H.E.) or 

submitted to immunohistochemical analysis by using an indirect immunoperoxidase 

technique (Benetti et al. 2018, Ferreira et al. 2018) for osteocalcin, osteopontin, and ROS. 

The first blade obtained was selected for H.E. staining, and the next two for 

immunohistochemical analysis. This sequence was repeated, thus obtaining three blades for 

each staining. 

For immunohistochemical reactions, the histological sections were deparaffinised in 

xylene and hydrated in a decreasing ethanol series. Antigen retrieval was achieved by 

immersing the histological slides in citrate buffer solution (Antigen Retrieval Buffer; Spring 

Bioscience, Pleasanton, CA, USA) in a pressurised chamber (Decloaking Chamber; Biocare 

Medical, Concord, CA, USA) at 95°C for 10 min. The slides were rinsed with phosphate-

buffered saline at the end of each stage of the immunohistochemical reaction. The 

histological sections were immersed in 3% H2O2 solution for 1 h and 20 min and in 1% 

bovine serum albumin for 12 h to block the endogenous peroxidase activity and nonspecific 

sites, respectively. The histological slides were divided and incubated with one of the 

following primary antibodies: anti-osteocalcin (primary antibody goat, SC-18319; Santa 

Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA), anti-osteopontin (primary antibody goat, SC-

10593; Santa Cruz Biotechnology), or anti-ROS (primary antibody rabbit, orb13678; 



Artigo 1. Benetti et al.  

Tese de Doutorado –  Francine Benetti  
17 

 

Biorbyt Ltd., Cambridge, Cambridgeshire, UK). The primary antibodies were diluted 

(Antibody Diluent with Background Reducing Components; Dako Laboratories, 

Carpinteria, CA, USA) and placed in a moist chamber for 24 h. The histological sections 

were incubated with a biotinylated secondary antibody for 1 h and 30 min and were 

subsequently treated with streptavidin–horseradish peroxidase conjugate for 1 h and 30 min 

(Universal Dako Labelled Streptavidin-Biotin kit; Dako Laboratories). The slides were 

rinsed with phosphate-buffered saline, and the reaction was developed using the chromogen 

3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen kit; Dako Laboratories) and 

was counterstained with Harris’s haematoxylin or Fast Green. The negative controls 

consisted of specimens submitted to the procedures previously mentioned but without the 

primary antibodies. 

The analyses were performed by a single calibrated operator in a blinded manner 

under light microscopy (×400 magnification; DM4000 B; Leica, Wetzlar, Germany). The 

pulp chamber was divided into the occlusal, middle, and cervical thirds (Cintra et al. 2013, 

Benetti et al. 2017a), and inflammation was scored in each third as follows: 0, inflammatory 

cells absent or negligible in number; 1, mild inflammatory infiltrate (<25 cells per field); 2, 

moderate inflammatory infiltrate (between 25 and 125 cells per field); 3, severe 

inflammatory infiltrate (>125 cells per field); and 4, tissue necrosis (Benetti et al. 2017a; 

2018). 

The immunolabelling of osteocalcin and osteopontin was defined as the presence of 

a brownish colour in the cytoplasm of the cells and extracellular matrix. Because 

immunolabelling of both the cells and the extracellular matrix is of great importance for 

study, we performed semi-quantitative analysis, which provides information on the numbers 

of immunolabeled cells and immunolabelling intensity of the extracellular matrix (Ferreira 

et al. 2018). The scores were assigned as follows (Benetti et al. 2018, Ferreira et al. 2018): 

0, immunolabelling missing; 1, low standard of immunolabelling; 2, moderate standard of 

immunolabelling; 3, severe standard of immunolabelling; and 4, very severe standard of 

immunolabelling. To analyse ROS, cells that had a brown nucleus were counted in each third 

of the pulp chamber of each specimen, and were analysed as the number of cells per mm2 

(Benetti et al. 2017a; 2018). The mean values of each third of each specimen were used for 

statistical analysis.  



Artigo 1. Benetti et al.  

Tese de Doutorado –  Francine Benetti  
18 

 

The mean of the central area of the pulp chamber and of each third of the pulp 

chamber was measured using an image processing software (Leica QWin V3, Leica 

Microsystems, Wetzlar, Germany) (Cintra et al. 2016b, Benetti et al. 2017a). By taking into 

account the obtained values, it was possible to calculate the reduction percentage in the 

central area of the pulp chamber in the treated groups considering the central area of the 

control group. 

 

Statistical analysis 

One-way repeated-measures ANOVA was used for parametrical data and Friedman 

repeated-measures statistical test was used for non-parametrical data. Significance was set 

at the level of 5% (P<0.05). 

 

Results 

Inflammatory infiltrate analysis 

The representative images of the inflammatory response are shown in Figure 1 (a-f). 

The pulp tissue of the control group had normal conditions, with intact coronary pulp tissue, 

continuous odontoblast layer around the entire pulp, and absence of inflammatory cells. 

Immediately after bleaching, a large area of necrosis was observed in the coronary pulp. At 

2 days, the area of necrosis was present in the occlusal third of the coronary pulp, and 

extended to the middle third in some specimens. Severe inflammatory infiltrate underlying 

the area of necrosis was observed. At 7 days, the pulp tissue showed no inflammation, and 

odontoblastoid cells appeared around the entire coronary pulp. At 15 and 30 days, the pulp 

tissue was organised, and the odontoblastoid cell layer had formed. 

Table 1 shows the inflammatory infiltrate scores for the groups in each analysis 

period. The pulp tissue of the specimens analysed immediately and at 2 days after dental 

bleaching was different from that of the control specimens and the specimens of the bleached 

group analysed at 7, 15, and 30 days (P<0.05). 

 

Immunohistochemical analysis 

Immunolabelling of osteocalcin and osteopontin was observed in the extracellular 

matrix and cytoplasm of fibroblasts and odontoblast-like cells. Representative images are 



Artigo 1. Benetti et al.  

Tese de Doutorado –  Francine Benetti  
19 

 

shown in Figure 1 (osteocalcin, a1-f1; osteopontin, a2-f2). Table 1 shows the scores for the 

immunolabelling standard. 

Low immunolabelling of osteocalcin was observed in the control group. In the Ble 

group, no immunolabelling of osteocalcin was observed immediately after bleaching. After 

2 days, the immunolabelling was moderate; thereafter, it increased at 7, 15, and 30 days, 

ranging from moderate at 7 days, to severe at 15 days, and to very severe at 30 days. A 

significant difference was observed between the control and Ble groups at 15 and 30 days 

after bleaching (P<0.05). 

Low standard of immunolabelling was observed for osteopontin in the control group. 

Immediately after bleaching, no immunolabelling was observed in the Ble group, and at 2 

days, only moderate immunolabelling was observed. Immunolabelling of osteopontin 

increased at 7 days, where it was very severe. However, the immunolabelling reduced at 15 

and 30 days after bleaching, but there was no difference compared to the immunolabelling 

at 7 days (P>0.05). A significant difference in relation to the control group was observed at 

7 and 15 days after bleaching in the Ble group (P<0.05). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Artigo 1. Benetti et al.  

Tese de Doutorado –  Francine Benetti  
20 

 

 

Table 1 Scores for inflammatory infiltrate and for immunohistochemical labeling of OCN 

and OPN, and central area of the pulp chamber (μm2) in each period of analysis 

Analysis  Scores 

Groups 

P 
Cont 

Bleached 

Oh 2d 7d 15d 30d 

H.E. 

Occlusal 

0 10/10 0/10 0/10 9/10 10/10 10/10 

<0.001 

1 0/10 0/10 0/10 1/10 0/10 0/10 

2 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 

3 0/10 0/10 4/10 0/10 0/10 0/10 

4 0/10 10/10 6/10 0/10 0/10 0/10 

Median*  0a 4b 4b 0a 0a 0a 

Middle 

0 10/10 0/10 0/10 10/10 10/10 10/10 

<0.001 

1 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 

2 0/10 0/10 4/10 0/10 0/10 0/10 

3 0/10 0/10 5/10 0/10 0/10 0/10 

4 0/10 10/10 1/10 0/10 0/10 0/10 

Median*  0a 4b 3b 0a 0a 0a 

Cervical 

0 10/10 0/10 0/10 10/10 10/10 10/10 

<0.001 

1 0/10 0/10 3/10 0/10 0/10 0/10 

2 0/10 0/10 6/10 0/10 0/10 0/10 

3 0/10 2/10 1/10 0/10 0/10 0/10 

4 0/10 8/10 0/10 0/10 0/10 0/10 

Median*  0a 4b 2b 0a 0a 0a 

OCN 0 0/10 6/10 0/10 0/10 0/10 0/10 

<0.001 

1 10/10 4/10 0/10 0/10 0/10 0/10 

2 0/10 0/10 9/10 5/10 2/10 2/10 

3 0/10 0/10 1/10 5/10 4/10 3/10 

4 0/10 0/10 0/10 0/10 4/10 5/10 

Median*  1ab 0a 2abc 2bc 3c 4c 

OPN 0 4/10 8/10 0/10 0/10 0/10 0/10 

<0.001 

1 6/10 2/10 3/10 0/10 0/10 2/10 

2 0/10 0/10 5/10 1/10 1/10 3/10 

3 0/10 0/10 2/10 2/10 8/10 5/10 

4 0/10 0/10 0/10 7/10 1/10 0/10 

Median*  1a 0a 2ab 4b 3b 3ab 

Pulp chamber                  

area (105) 
Mean* 

(±SD) 

21.89 

(±1.18)a 

21.78 

(±2.64)a 

23.79 

(±4.19)a 

14.18 

(±9.90)b 

12.30 

(±5.25)b 

6.65 

(±2.47)c 
<0.001 

*Different letters in the same line indicate statistically significant differences between groups. 

 

 

 



Artigo 1. Benetti et al.  

Tese de Doutorado –  Francine Benetti  
21 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figure 1 Representative images of histological and immunohistochemical analyses of 

osteocalcin and osteopontin. Control: panoramic microscopic aspect showing normal pulp 

tissue, (a) cervical third of the coronary pulp with organised pulp tissue, and low 

immunolabelling of (a1) osteocalcin and (a2) osteopontin. 0 h: panoramic microscopic 

aspect of the bleached group immediately after dental bleaching, showing an extensive area 

of necrosis and (b) absence of cellularity and immunolabelling of (b1) osteocalcin and (b2) 

osteopontin. 2 days: microscopic aspect of the bleached group at 2 days with regions of 

necrosis and pulp disorganisation, (c) evident tissue disorganisation, and moderate 

immunolabelling of (c1) osteocalcin and (c2) osteopontin. 7 days: microscopic aspect of the 

bleached group at 7 days showing organised pulp tissue and areas of tertiary dentine, (d) 

cervical third of the coronary pulp with the formation of odontoblastic-like cells, (d1) 

moderate immunolabelling of osteocalcin, and (d2) very severe immunolabelling of 

osteopontin. 15 days: microscopic aspect of the bleached group at 15 days with intact pulp 

tissue and presence of tertiary dentine, (e) higher magnification showing pulp organisation, 

and severe immunolabelling of (e1) osteocalcin and (e2) osteopontin. 30 days: microscopic 

aspect of the bleached group at 30 days with cellular and tissue organisation, (f) absence of 

inflammation and deposition of tertiary dentine, (f1) very severe immunolabelling of 

osteocalcin, and (f2) severe immunolabelling of osteopontin (100×, 1000×: haematoxylin–

eosin [H.E.]; 1000×: immunohistochemical analysis of osteocalcin and osteopontin). 

 



Artigo 1. Benetti et al.  

Tese de Doutorado –  Francine Benetti  
22 

 

Figure 2 (a, a1, a2-f, f1, f2) shows representative images of the groups in relation to 

the immunolabelling of ROS, as well as the number of ROS-positive cells per mm2 in each 

third of the coronary pulp. ROS-positive cells were absent in the control group and in the 

Ble group immediately after bleaching. At 2 days, the Ble group had a certain amount of 

immunoreactive cells, and compared to the control, their numbers were significant in the 

cervical third (P<0.05). However, greater immunolabelling was observed at 7 and 15 days, 

which was different from that in the control group in all thirds of the pulp chamber (P<0.05). 

At 30 days, despite the difference in relation to the control group in the cervical third 

(P<0.05), a small number of ROS-positive cells was observed in the Ble group. 

 

Tertiary dentine analysis 

Compared to the control group, the Ble group had a significant presence of tertiary 

dentine at 7 and 15 days after bleaching (P<0.05). This tertiary dentine gradually increased 

in thickness at 30 days after bleaching (P<0.05); at this time point, the pulp tissue of all the 

specimens was organised and showed no inflammation. Table 1 shows data on the reduction 

of the central area of the pulp chamber in each analysis period. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Artigo 1. Benetti et al.  

Tese de Doutorado –  Francine Benetti  
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Figure 2 Representative images of immunohistochemical labelling of reactive oxygen 

species (ROS)-positive cells. Representative photomicrographs of the thirds of the coronary 

pulp of (a, a1, a2). Control without ROS-positive cells. (b, b1, b2) Bleaching groups at 0 h 

with no immunolabelled cells; (c, c1, c2) at 2 days with more ROS-positive cells in the 

cervical third; (d, d1, d2) at 7 days and (e, e1, e2) at 15 days with greater immunolabelling; 

and (f, f1, f2) at 30 days with lesser immunolabelling (immunolabelling of ROS: 1000×). 

The graph (g) shows the counts of ROS-positive cells, expressed as the number of cells per 

mm2, and statistical analysis. Different superscript lowercase letters indicate statistically 

significant differences between groups at each third of the coronal pulp (P<0.05). 



Artigo 1. Benetti et al.  

Tese de Doutorado –  Francine Benetti  
24 

 

Discussion 

This study evaluated in vivo the influence of H2O2 on the mineralisation and response 

capacity of pulp tissue of Wistar rats over time, and found that H2O2 induces the expression 

of osteocalcin and osteopontin in pulp tissue. The study also showed that the number of 

ROS-positive cells increased when these markers began to appear more intensely, as well as 

when the formation of tertiary dentine became significant. Thus, the hypothesis of the study 

was confirmed. 

Some in vitro studies have previously shown the effects of H2O2 on the mineralisation 

and differentiation of different cell lines. The MDPC-23 odontoblast-like cell line treated 

with 0.2 and 0.3 mmol/L H2O2 for 14 days showed a significant increase in extracellular 

matrix mineralisation, number of calcification nodules, and alkaline phosphatase activity, 

indicating an alteration in the initial stage of odontoblast differentiation (Lee et al. 2006). 

The authors suggest a favourable H2O2 effect on odontoblasts to increase the capacity of 

dentine production (Lee et al. 2006). These effects were contrary to those on MC3TC-E1 

pre-osteoblastic cells in which cell differentiation was inhibited (Lee et al. 2006). 

Human dental pulp cells had initial reduction in the expression of odontoblastic 

markers and deposition of mineralised nodules after the application of H2O2 in artificial pulp 

chambers; however, the groups with a lower application time of H2O2 showed similar 

mineralisation to the control group during the 21-day period (Soares et al. 2015). These 

results agree with those of the present study regarding the immunolabelling of osteocalcin 

and osteopontin, whose expressions were inhibited after the initial contact with H2O2, but 

were expressed later. This fact shows that the dental pulp can recover and respond with an 

increase in these markers, which accelerate the process of dentinogenesis. 

However, osteocalcin expression increased over time, whereas osteopontin 

expression was greater at 7 and 15 days and reduced over time. A previous study showed 

that a higher amount of osteocalcin was also expressed later than that of osteopontin in cell 

cultures after contact with minimal concentrations of H2O2 (Matsui et al. 2009). A significant 

importance of in vitro studies is their ability to demonstrate response of specific cell types 

to a material. However, in vivo studies allow the analysis of simultaneous reactions in an 

organised tissue with different cell types acting together in the response of that tissue to the 

aggressor agent (Cintra et al. 2016b). In our study, we could observe that significant levels 



Artigo 1. Benetti et al.  

Tese de Doutorado –  Francine Benetti  
25 

 

of osteocalcin and osteopontin expression were associated with the period in which the 

deposition of tertiary dentine was also observed. 

Osteocalcin is a protein of the osteoblast lineage that is observed in odontoblasts 

involved in the formation of reactionary dentine (Hirata et al. 2005). Osteocalcin can also 

be observed in extensions of odontoblasts (Matsui et al. 2009), indicating that it is 

synthesised within the odontoblasts, transported through their processes, and deposited in 

the dentine matrix (Bronckers et al. 1985, Matsui et al. 2007, Wei et al. 2007, Matsui et al. 

2008). However, this protein was not observed in pre-dentine (Matsui et al. 2009). In the 

present study, osteocalcin was present in the cytoplasm of fibroblasts and odontoblasts 

mainly in the period between 15 and 30 days. In contrast, immunolabelling of osteocalcin 

was negligible in the cytoplasm of odontoblast-like cells during differentiation at 7 days. 

In a previous study, osteocalcin was observed in the initial phase of reactionary 

dentine formation in rats after tooth preparation (Hirata et al. 2005) and was synthesised and 

secreted to the reactionary dentine matrix 3 days after preparation. As greater osteocalcin 

expression was observed at 30 days in the present study, we believe that the production of 

dentine is still active in the later periods and is related to the presence of newly differentiated 

mature odontoblast-like cells, which produce the dentine matrix. Although Matsui et al. 

(2009) have shown a decrease in osteocalcin after its greater expression, we must consider 

that seeded cells tend to die after a certain period, which could have influenced their results. 

Thus, in vivo studies analysing the pulp at later periods than the present study may clarify 

the period in which the expression of osteocalcin still remains in the pulp tissue after 

bleaching. 

Another important protein in the processes that lead to tissue mineralisation is 

osteopontin (Matsui et al. 2009), a multifunctional phosphorylated glycoprotein expressed 

by a wide variety of tissues and cells (Gericke et al. 2005), and present in the differentiation 

of odontoblasts, growth, and bone regeneration (Sodek et al. 2000, Matsui et al. 2009). 

Osteopontin has been shown to regulate early bone remodelling events, such as cell 

adhesion, osteoclast functioning, and matrix mineralisation (Sodek et al. 2000). Moreover, 

osteopontin can interact with a large amount of calcium (Sodek et al. 2000) and with 

osteocalcin, forming crystals of hydroxyapatite (Gericke et al. 2005). Thus, it plays a role 

not only in the initial formation phase, but also during the calcification of reparative 

dentinogenesis (Kuratate et al. 2008). 



Artigo 1. Benetti et al.  

Tese de Doutorado –  Francine Benetti  
26 

 

In this study, greater osteopontin immunolabelling occurred at 7 days after bleaching, 

at which time osteocalcin has not yet been expressed significantly compared to that in the 

control group. Thus, the greater expression of osteopontin before osteocalcin may suggest 

the presence of reactionary dentine, formed by odontoblasts, that resisted the effects of 

bleaching. The subsequent production of osteocalcin may suggest the formation of reparative 

dentine produced by newly differentiated mature odontoblast-like cells.  

Studies have shown that pulp cells under oxidative stress, resulting from contact with 

H2O2 from the bleaching gel, were able to proliferate significantly over time, recovering their 

viability around 3-4 times, 3 days after bleaching (Soares et al. 2014). Benetti et al. (2017a) 

demonstrated in vivo cell proliferation in the pulp after bleaching, which was higher in the 

presence of lower H2O2 concentrations. In the present study, we evaluated cell reactivity 

against oxidative stress by using a specific marker, anti-ROS. Previous studies have shown 

the action of these antibodies on H2O2-affected cells (Ashok et al. 1997; 1998, Strollo et al. 

2013), but no in vivo studies have evaluated the moment when the cells of the pulp tissue 

affected by H2O2 are able to react after dental bleaching. 

We can observe that in the immediate period after contact with H2O2, the cells do not 

present reactivity to ROS, which occurs significantly in the cervical third of the coronary 

pulp at 2 days, in the other thirds at 7 and 15 days, and thereafter reducing by 30 days. This 

shows that the cellular reactivity to oxidative stress occurs during the initial period of repair 

of the pulp tissue, when the inflammation decreases. 

Excessive production of ROS is considered an important factor in the formation of 

various disease-causing substances (Matsui et al. 2009). However, authors have suggested 

that small amounts of ROS have biodefense roles, in addition to enhancing the proliferative 

effect and differentiation of cells (Ueda et al. 1996, Schmitt et al. 2006, Matsui et al. 2007). 

Although ROS have been reported to cause tissue damage, such as apoptosis (Han et al. 

2008, Benetti et al. 2017a), necrosis (Costa et al. 2010, Cintra et al. 2013), inflammation 

(Seale et al. 1981, Costa et al. 2010, Cintra et al. 2013, Ferreira et al. 2018, Benetti et al. 

2018), or tissue aging (Cintra et al. 2017), they have also been found to have a more complex 

role in cell physiology (Scandalios 2005, Lee et al. 2006, Matsui et al. 2007, Matsui et al. 

2009). The responsiveness of pulp tissue to oxidative stress and cell proliferation (Soares et 

al. 2014, Benetti et al. 2017a) and induction to the formation of hard tissue corroborates with 

these findings. However, high concentrations of H2O2 used during bleaching can cause 



Artigo 1. Benetti et al.  

Tese de Doutorado –  Francine Benetti  
27 

 

extreme damage to the pulp tissue; therefore, it is important that the healthy pulp is not 

affected by H2O2, since its aging can be accelerated. 

In addition, cytokines such as interleukin-6 and interleukin-17 (Soares et al. 2015, 

Benetti et al. 2018, Ferreira et al. 2018) and tumour necrosis factor-α (Soares et al. 2015, 

Ferreira et al. 2018) are involved in the response of the pulp to the bleaching gel and decrease 

over time; however, CD5-positive cells, associated with a chronic inflammatory process, are 

observed for even long periods after dental bleaching with high concentrations of H2O2 

(Benetti et al. 2018). In Europe, the minimum concentrations of H2O2 for use in dental 

bleaching have been determined (The Council of The European Union 2011). 

The findings of this study suggest that although the necrosis caused by high 

concentrations of H2O2 may be reversible, pulp tissue suffers consequences that may extend 

in the long term, such as increased hard-tissue production, which may suggest a process of 

calcification of the pulp over time. Results observed in rat teeth cannot be extrapolated 

directly to the clinical setting (Cintra et al. 2016b). However, animal studies are very 

important in understanding the mechanism of repair of pulp tissue. Longitudinal studies in 

humans would be required to verify possible accelerated calcification over time. 

Nevertheless, these results reinforce that dental bleaching should be performed with caution, 

as it may result in adverse sequelae in the pulp tissue. Future studies, such as those analysing 

stem cell markers, for example, may help in understanding the effects of H2O2 on the pulpal 

response of bleached teeth. 

 

Conclusion 

The repair process of the pulp tissue after bleaching is associated with the increase of 

osteocalcin over time. Osteopontin also participates in this process, and ROS is involved in 

the cellular defence process against oxidative stress induced by H2O2. 

 

Conflict of Interest 

The authors have stated explicitly that there are no conflicts of interest in connection with 

this article. 

 

 

 



Artigo 1. Benetti et al.  

Tese de Doutorado –  Francine Benetti  
28 

 

Acknowledgement 

This research was supported by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - 

FAPESP (n. 2015/10825-2) and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e 

Tecnológico – CNPq (n. 455943/2014-1). 

 

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