RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 28/02/2024. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP CENTRO DE AQUICULTURA DA UNESP Novas investigações sobre o desempenho reprodutivo de pacu (Piaractus mesopotamicus) envolvendo variações no uso de prostaglandina F2α exógena e no horário de indução hormonal Rafael Tomoda Sato Jaboticabal, São Paulo 2023 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP CENTRO DE AQUICULTURA DA UNESP Novas investigações sobre o desempenho reprodutivo de pacu (Piaractus mesopotamicus) envolvendo variações no uso de prostaglandina F2α exógena e no horário de indução hormonal Rafael Tomoda Sato Dr. Sergio Ricardo Batlouni Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Aquicultura do Centro de Aquicultura da UNESP - CAUNESP, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor. Jaboticabal, São Paulo 2023 Sato, Rafael Tomoda S253n Novas investigações sobre o desempenho reprodutivo de pacu (Piaractus mesopotamicus) envolvendo variações no uso de prostaglandina F2 exógena e no horário de indução hormonal / Rafael Tomoda Sato. – – Jaboticabal, 2023 iii, 80 p. : il. ; 29 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Centro de Aquicultura, 2023 Orientadora: Sergio Ricardo Batlouni Banca examinadora: Lucas Simon Torati, Rafael Yutaka Kuradomi, Rosicleire Verissimo Silveira, Renata Guimarães Moreira Whitton Bibliografia 1. Prostaglandinas. 2. Melatonina. 3. Peixe desova artificial. 4. Ovulação induzida. 5. Fotoperiodismo. I. Título. II. Jaboticabal-Centro de Aquicultura. CDU 639.3.03 Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP Campus de Jaboticabal/SP - Karina Gimenes Fernandes - CRB 8/7418 Doutorando Rafael Tomoda Sato Orientador – Dr. Sergio Ricardo Batlouni 4 AGRADECIMENTOS Primeiramente à Deus, por sempre estar do meu lado e por me mostrar o caminho correto a seguir nos momentos mais difíceis. Ao meu orientador Prof. Dr. Sergio Ricardo Batlouni, pela confiança, pelos conselhos e ensinamentos tanto na parte profissional quanto na parte pessoal. Aos membros da banca examinadora da minha defesa, Dr. Lucas Simon Torati, Dr. Rafael Yutaka Kuradomi, Dra. Renata Guimarães Moreira Whitton e Dra. Rosicleire Veríssimo Silveira, por aceitarem participar da minha banca e pela compreensão e paciência. Aos meus filhos Lucas e Arthur, que, com certeza, são as duas melhores coisas que aconteceram na minha vida. São, literalmente, as razões da minha vida. Sou uma pessoa muito melhor depois que vocês chegaram. À minha esposa Marina, por estar junto comigo nesta jornada, que diante de todos os nossos percalços e incertezas, seguimos firmes e fortes. Você é muito especial para mim, com certeza não teria conseguido sem você. Aos meus pais e irmão, pelo apoio, compreensão e carinho durante toda a minha vida e, principalmente, neste período que não foi fácil. Não seria nada sem vocês. À família da Marina, pela ajuda e pelo carinho em todos os momentos. A todos os amigos que passaram pelo grupo de reprodução de peixes nativos: Marina, Jack, Muringa, Xina, Mari, Laíza, Tex, Milene, Wisdeyvi, Thiago, Cristiane, Roosevelt, Felipe e Dorimê pela ajuda nos experimentos e análises. Ao meu amigo Jack, por todos os ensinamentos, mas principalmente pela amizade que perdura até hoje apesar da distância. Aos funcionários Valdecir, Márcio, Luís, Silvinha, David, Mayara, Elaine e Lúcia, pela grande ajuda durante todo esse período. A todas as pessoas que torceram para meu sucesso. Muito Obrigado! Doutorando Rafael Tomoda Sato Orientador – Dr. Sergio Ricardo Batlouni 5 APOIO FINANCEIRO O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (Capes) - Código de Financiamento 001. Doutorando Rafael Tomoda Sato Orientador – Dr. Sergio Ricardo Batlouni 6 RESUMO GERAL Ao longo da última década desenvolvemos um protocolo de hipofisação associado a prostaglandina F2α (PGF2α) que aumentou a previsibilidade na desova do pacu, mas ainda assim, falhas na ovulação persistem em algumas fêmeas tratadas. Por isso, esta tese teve como objetivo principal aprimorar este protocolo, investigando dois novos aspectos: a) a associação entre ovulação bem-sucedida com o momento de aplicação e a concentração de PGF2α sintética (manuscrito 1); e b) a associação entre ovulação bem-sucedida com o horário de aplicação da segunda dose hormonal, considerando especialmente os ritmos circadianos de melatonina (MTN) na espécie (manuscrito 2). Os manuscritos foram compostos por dois experimentos cada; e testes - piloto não relatados. No experimento 1 (manuscrito 1), 24 fêmeas foram hipofisadas e receberam 2 mL/peixe de PGF2α sintética no momento da segunda dose (2D); ou cinco horas (5H) ou sete horas (7H) após a segunda dose da hipofisação. No experimento 2 (manuscrito 1), as fêmeas foram induzidas com cinco doses de PGF2α variando de 1,0 a 7,0 mL/kg aplicadas no momento da segunda dose da hipofisação. O manuscrito 2, sobre ritmos circadianos de MTN, teve o experimento 1 composto por três grupos: controle (sem indução); controle salino (indução com solução salina); e hipofisação. Neste experimento, os animais tiveram o sangue coletado a cada quatro horas, ao longo de 24 horas antes de ovulação (7h dia um até 7h dia 2), para quantificação dos níveis plasmáticos de MTN. No experimento 2 (manuscrito 2), com base nos níveis circadianos de MTN, o desempenho reprodutivo com indução hormonal iniciada às 19 horas (19H) e 0 horas (0H) foi comparado. Observamos no primeiro manuscrito, sobre variações no momento de aplicação da PGF2α exógena, uma taxa de desova de 66,7% nos grupos 2D e 5H e de 50% no grupo 7H. Além disso, apenas o grupo 2D não apresentou desovas ruins (fecundidade <35.000 ovócitos/kg peixe). No experimento 2, sobre doses de PGF2α exógena, as doses mais elevadas (5,5 e 7,0 mL/kg) foram as únicas que propiciaram 100% de desova, porém a viabilidade embrionária nestes grupos não foi satisfatória. No segundo manuscrito, sobre MTN, seus níveis foram similares ao longo de 24 horas entre os grupos controle e hipofisados. Quando analisados independentemente do tratamento, observamos que os níveis de MTN aumentam no início da noite às 19 horas do dia 1 e diminuem às 15 horas do dia 2. No experimento 2, as taxas de ovulação foram de 75% e 50% para os grupos 19H e 0H, respectivamente. O grupo 19H não apresentou desovas ruins. Além disso, o grupo (19H) obteve uma produção total de larvas (números absolutos) de 737.567, enquanto o grupo (0H) obteve 250.762. Portanto, nossas observações com o primeiro manuscrito não confirmam a especulação teórica que, aplicando PGF2α mais próximo da ovulação e/ou elevando sua dose, mitigariam as falhas de desova ainda recorrentes com o protocolo em uso (estabelecido por Criscuolo-Urbinati et al., (2012)). Porém, em ambos experimentos, as fortes correlações positivas entre níveis de PGF2α no momento da ovulação e fecundidade indicam que investigações neste sentido Doutorando Rafael Tomoda Sato Orientador – Dr. Sergio Ricardo Batlouni 7 devem ser continuadas. No segundo manuscrito, apesar do desempenho reprodutivo similar entre os grupos, a produção de larvas superior do grupo 19H indica que fêmeas submetidas a um maior período escuro pós-segunda dose possam apresentar maior sucesso na ovulação e na viabilidade embrionária. Portanto, este estudo consolida o uso da PGF2α exógena como ferramenta indutora da ovulação do pacu e traz fortes indícios iniciais, que precisam ser aprofundados, mostrando que a MTN tem associação importante com a ovulação da espécie e o início do período noturno é o mais adequado para indução hormonal, entre os períodos por nós testados. Palavras-chave: falhas na ovulação, fotoperíodo, hipofisação, peixes migradores, prostaglandina, ritmos circadianos. ABSTRACT Over the last decade we have developed a pituitary protocol associated with prostaglandin F2α (PGF2α) that increased the predictability of pacu spawning, but even so, failures in ovulation persist in some treated females. Therefore, this thesis had as main objective to improve this protocol, investigating two new aspects: a) the association between successful ovulation with the moment of application and the concentration of synthetic PGF2α (manuscript 1); and b) the association between successful ovulation and the time of application of the second hormonal dose, especially considering the melatonin circadian rhythms (MTN) in the species (manuscript 2). The manuscripts were composed of two experiments each; and tests - pilot not reported. In experiment 1 (manuscript 1), 24 females were hypophysed and received 2 mL/fish of synthetic PGF2α at the time of the second dose (2D); either five hours (5H) or seven hours (7H) after the resolving dose of hypophysation. In experiment 2 (manuscript 1), females were induced with five doses of PGF2α ranging from 1.0 to 7.0 mL/kg applied at the time of the resolving dose of hypophysation. Manuscript 2, about circadian rhythms of MTN, had experiment 1 composed of three groups: control (without induction); saline control (induction with saline solution); and hypophysation. In this experiment, the animals had their blood collected every four hours, over the 24 hours before ovulation (7h day one to 7h day 2), to quantify the plasma levels of MTN. In experiment 2 (manuscript 2), based on circadian levels of MTN, reproductive performance with hormone induction starting at 7 pm (19H) and midnight (0H) was compared. In the first manuscript, on variations in the moment of application of exogenous PGF2α, a spawning rate of 66.7% in the 2D and 5H groups and of 50% in the 7H group. Furthermore, only the 2D group did not have poor spawning (fecundity <35,000 oocytes/kg fish). In experiment 2, on exogenous PGF2α doses, the highest doses (5.5 and 7.0 mL/kg) were the only ones that provided 100% spawning, but embryonic viability in these groups was Doutorando Rafael Tomoda Sato Orientador – Dr. Sergio Ricardo Batlouni 8 not satisfactory. In the second manuscript, on MTN, its levels were similar over 24 hours between the control and pituitary groups. When analyzed independently of treatment, we observed that MTN levels increase in the early evening at 7 pm on day 1 and decrease at 3 pm on day 2. In experiment 2, ovulation rates were 75% and 50% for groups 19H and 0H, respectively. The 19H group did not present bad spawns. Furthermore, the group (19H) obtained a total production of larvae (absolute numbers) of 737,567, while the group (0H) obtained 250,762. Therefore, our observations with the first manuscript do not confirm the theoretical speculation that, applying PGF2α closer to ovulation and/or increasing its dose, would mitigate the still recurrent spawning failures with the protocol in use (established by Criscuolo-Urbinati et al., (2012)). However, in both experiments, the strong positive correlations between PGF2α levels at the time of ovulation and fertility indicate that investigations in this direction should be continued. In the second manuscript, despite the similar reproductive performance between the groups, the higher larval production of the 19H group indicates that females subjected to a longer post-resolving dose dark period may be more successful in ovulation and embryonic viability. Therefore, this study consolidates the use of exogenous PGF2α as a tool to induce pacu ovulation and provides strong initial evidence, which needs to be deepened, showing that MTN has an important association with the ovulation of the species and the beginning of the nocturnal period is the most appropriate for hormonal induction, between the periods we tested. Keywords: ovulation failures, photoperiod, hypophysation, migratory fish, prostaglandin, circadian rhythms. INTRODUÇÃO GERAL 1. Características gerais da espécie-alvo O pacu (Piaractus mesopotamicus) é um caracídeo neotropical onívoro, nativo das bacias dos rios Paraná, Paraguai e Uruguai. Esta espécie possui características zootécnicas favoráveis como resistência a doenças e baixas temperaturas, boa aceitação pelo consumidor e rápido crescimento em várias condições de cultivo (Jomori et al., 2003; Souza et al., 2003; Gelman et al., 2004; Moro et al., 2013; Kuradomi et al., 2017; Mourad et al., 2018; Urbinati e Takahashi, 2020), e por essas razões, possui destacada importância comercial no continente americano, e mais recentemente, no mundo (Gelman et al., 2004; Valladão et al., 2018). No Brasil, existem mais de 14.500 estabelecimentos que cultivam o pacu, distribuídos principalmente nas regiões Sul, Sudeste e Centro- Doutorando Rafael Tomoda Sato Orientador – Dr. Sergio Ricardo Batlouni Oeste, geralmente cultivados em viveiros escavados ou em tanques-rede (Moro et al., 2013; Peixe BR, 2020). Vários aspectos da produção de pacu já foram estabelecidos, como as exigências nutricionais (Abimorad & Carneiro, 2007; Abimorad et al., 2008; Honorato et al., 2016), manejo da larvicultura (Jomori et al., 2003, 2008; Leitão et al., 2011; Portella et al., 2014) e fisiologia (Biller- Takahashi et al., 2015; Takahashi et al., 2017; Marinho de Mello et al., 2019; Zanuzzo et al., 2019). O abate geralmente ocorre com um ano de idade, quando os animais têm cerca de 1 kg (Silva et al., 1997; Souza et al., 2003; Reis Neto et al., 2012; Mourad et al., 2018). Esta espécie pertence a um grupo de peixes comercialmente conhecido como 'peixes redondos' (pacu; tambaqui (Colossoma macropomum); e pirapitinga, (Piaractus brachypomus)), bem como seus híbridos interespecíficos (tambacu, tambaqui x pacu; patinga, pacu x pirapitinga; e tambatinga, tambaqui x pirapitinga), que formam o segundo grupo de peixes mais produzidos no Brasil, representando aproximadamente 27% da produção aquícola brasileira em 2021 (IBGE, 2022). Neste mesmo ano, a produção brasileira atingiu 841 mil toneladas (Peixe BR, 2022). Além disso, as exportações deste grupo de peixes subiram expressivamente de 2019 para 2020, crescendo aproximadamente 650% para o tambaqui e 410% para o pacu (Peixe BR, 2021). Como normalmente ocorre em peixes reofílicos (migração no período de reprodução), o ciclo reprodutivo do pacu é sazonal e a desova é do tipo total (Schorer et al., 2016; Urbinati e Takahashi, 2020). A diferenciação de suas gônadas em ovários se inicia aos 150 dias (Barbosa et al., 2022). A primeira maturação é atingida com aproximadamente 3 anos e 34 cm de comprimento total (Ferraz de Lima et al., 1984), se mantendo apta a reprodução pelo menos até os 10 anos (Schorer et al., 2016). Sua época de reprodução vai de outubro a março na América do Sul (Schorer et al., 2016; Urbinati e Takahashi, 2020). Doutorando Rafael Tomoda Sato Orientador – Dr. Sergio Ricardo Batlouni 72 CAUNESP CONCLUSÕES GERAIS As modificações propostas no protocolo de hipofisação associado a PGF2α não propiciaram um melhor desempenho reprodutivo se comparado ao protocolo já estabelecido por Criscuolo-Urbinati et al. (2012). A aplicação de PGF2α exógena para além da segunda dose de hipofisação e mais próximo do período de ovulação não trouxe ganhos no desempenho, mas pelo contrário esteve associada a ocorrência de “desovas ruins”, caracterizadas por baixa fecundidade. A outra variável modificada, o aumento da dose de PGF2α exógena, propiciou sim estabilidade na ovulação com taxas de 100% de ovulação e ausência de desovas ruins, contudo, taxas de fertilidade e eclosão não foram satisfatórias. Não observamos associação entre a aplicação de PGF2α mais próximo da ovulação e o aumento de sua dose com níveis plasmáticos superiores de PGF2α no momento da ovulação. Entretanto, as correlações positivas fortes encontradas entre níveis de PGF2α no momento da ovulação e fecundidade, indicam que, apesar de não ser necessariamente relacionados ao sucesso da ovulação, elevados níveis PGF2α no momento da ovulação estão associados ao maior número de ovos liberados pelas fêmeas. As concentrações plasmáticas de MTN não apresentaram variações entre animais controle e hipofisados. Quando analisados conjuntamente, observamos que os níveis de MTN se elevam no início da noite (19 horas) do dia 1, se mantêm semelhantes até às 11 horas e reduzem às 15 horas do dia 2. Durante a indução hormonal, níveis plasmáticos de MTN, PGF e DHP foram similares entre as fêmeas hipofisadas as 19 horas e 0 horas. Da mesma forma, o desempenho reprodutivo foi similar entre os dois grupos. Porém, o grupo 19H com o mesmo número de fêmeas, apresentou uma produção total (números absolutos) de 737.567 larvas, contra 250.762 do grupo 0H. Além disso, os níveis plasmáticos de MTN no momento da ovulação apresentaram correlação positiva com fecundidade, taxa de fertilidade, taxa de eclosão e larvas/kg peixe. Estes resultados indicam que, apesar de não apresentarem diferenças significativas entre os grupos (níveis hormonais e desempenho reprodutivo), fêmeas submetidas a um maior período escuro pós-segunda dose podem apresentar maior sucesso na ovulação e maior produção de larvas. Este aspecto necessita de explorações mais aprofundadas que envolvem a expressão de receptores das Doutorando Rafael Tomoda Sato Orientador – Dr. Sergio Ricardo Batlouni 73 CAUNESP substancias envolvidas, entre outras variáveis e conhecimentos, tais como estudos sobre o horário de desova natural da espécie. Por fim, este estudo, que testou doses e momentos aplicação de PGF2α, não confirmou as vantagens teóricas das alterações propostas em relação ao protocolo vigente, porém consolida a PGF2α exógena como excelente ferramenta para indução a ovulação por suas fortes correlações positivas com fecundidade. Com relação a MTN, apresentamos de forma pioneira o ritmo circadiano desta substancia no pacu e mostramos que, apesar de serem necessários mais investigações, a indução no início do período de escuro pode auxiliar no sucesso reprodutivo da espécie em cativeiro. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abimorad, E. G., & Carneiro, D. J. (2007). 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