RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 04/03/2018. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU Efeitos da superestimulação ovariana sobre a competência oocitária e embrionária em bovinos: possível participação dos exossomos presentes no fluido folicular FERNANDA FAGALI FRANCHI Orientador: Anthony César de Souza Castilho Botucatu – SP 2016 Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação do Instituto de Biociências de Botucatu, Universidade Estadual Paulista – UNESP, para a obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas, Farmacologia 3 Nome da Autora: Fernanda Fagali Franchi Título: Efeitos da superestimulação ovariana sobre a competência oocitária e embrionária em bovinos: possível participação dos exossomos presentes no fluido folicular Banca Examinadora Prof. Dr. Anthony César de Souza Castilho Presidente e Orientador Departamento de Pós-graduação em Ciência Animal Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE – Presidente Prudente – SP Profª. Drª. Gisele Zoccal Mingoti Membro Titular Departamento de Apoio, Produção e Saúde Animal – DAPSA Faculdade de Medicina Veterinária – FMV – UNESP – Araçatuba - SP Profª. Drª. Ester Siqueira Caixeta Membro Titular Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento Universidade Federal Alfenas – UNIFAL – Alfenas – MG Data da Defesa: 04/03/2016 Local da Defesa: Instituto de Biociências de Botucatu, UNESP, Botucatu – SP Dedico este trabalho aos meus pais, Mario e Eliana, e aos meus tios, Augusto e Regina, os quais contribuíram da maneira que puderam para que eu chegasse até aqui... AGRADECIMENTOS Ao meu orientador, Anthony César de Souza Castilho, por esses dois anos de aprendizado e crescimento tanto profissional quanto pessoal. Obrigada por me auxiliar nesse início de carreira e por estar sempre disposto a me atender quando precisei. Agradeço pela confiança, por acreditar no meu trabalho e por poder fazer parte da sua equipe. Obrigada, principalmente, pela sua humanidade, qualidade que faz de você mais do que um simples orientador, faz de você um amigo. Aos membros da banca pela disponibilidade e tempo dedicados para o enriquecimento deste trabalho e da minha formação acadêmica. Ao Prof. Dr. Luiz Cláudio Di Stasi, Prof. Dr. Marcelo Fábio Gouveia Nogueira e Prof. Dr. Ciro Moraes Barros por permitirem que toda execução desse projeto tenha sido realizada nas dependências do Laboratório Multiusuários Fitomedicamentos, Farmacologia e Biotecnologia. A Drª Raquel Zaneti Puelker por todo auxílio durante os experimentos, pelas dicas, pela disponibilidade e pelo tempo empregado nesse trabalho. Obrigada por dividir toda sua experiência conosco. Ao Dr. Juliano Coelho da Silveira pela ajuda e esclarecimentos sobre as vesículas extracelulares, que eram algo novíssimo para nós! Obrigada pelo tempo e paciência disponibilizados para realização desse trabalho Ao pessoal do Laboratório de Fitomedicamentos, Farmacologia e Biotecnologia pelos cafés da manhã sempre muito animados, regados a muitas conversas e risadas. Obrigada pela receptividade e pela ajuda oferecida quando precisei. Aos meus companheiros de trabalho Eduardo, Mariana, Patrícia, Priscila e Ramon por fazerem do ambiente de trabalho um local agradável e prazeroso de se trabalhar. Obrigada por me auxiliarem durante os experimentos e por estarem sempre dispostos a me ajudar no que fosse preciso. Obrigada por me aconselharem e por fazerem de mim uma pessoa melhor. Aos meus vizinhos de laboratório, Carol, Lorena e Rodrigo, pelos empréstimos e “socorros” prestados durante esse período! Obrigada pelo companheirismo e confiança. Ao meu namorado, Francisco, por me apoiar incondicionalmente no que diz respeito a minha carreira. Obrigada por ser meu amigo, companheiro e sempre estar ao meu lado. Obrigada pelos momentos agradáveis e pelo incentivo nos momentos de fraqueza. As minhas amigas Carol, Debora, Patrícia e Priscila por essa relação de amizade ter saído das paredes do laboratório e ter alcançado um lugar especial em minha vida. Obrigada pela força, pela dedicação, por me ouvirem, por estarem sempre ao meu lado, enfim, pela parceria sincera e desinteressada. Aos meus pais, Mario e Eliana, e aos meus irmãos, Renata e Raul, por me darem o apoio familiar necessário para suportar as situações mais adversas possíveis para que eu alcançasse meus objetivos. Obrigada por me incentivarem a nunca desistir dos meus sonhos. Aos meus tios, Augusto e Regina, por acreditarem no meu potencial e por me incentivarem a seguir a carreira acadêmica. Obrigada por me darem a oportunidade de estar onde estou e o suporte necessário para eu chegar até aqui. A seção de pós-graduação do Instituto de Biociências de Botucatu. Aos professores do Departamento de Farmacologia do Instituto de Biociências de Botucatu pelo tempo dedicado as disciplinas e por toda atenção disponibilizada. Aos funcionários do Departamento de Farmacologia Janete, Cristina, Luis, Paulo e Hélio por toda dedicação e atenção. A CAPES e a FAPESP pela concessão de bolsa de mestrado e a pelo suporte financeiro para realização deste trabalho. “O único lugar onde o sucesso vem antes do trabalho é no dicionário.” Albert Einstein RESUMO A superestimulação ovariana é uma das biotecnologias utilizadas com objetivo de aumentar o potencial reprodutivo de fêmeas com alto valor econômico através da obtenção de múltiplas ovulações e tem sido amplamente empregada na espécie bovina. O conhecimento da dinâmica folicular permitiu o desenvolvimento de diversos protocolos hormonais capazes de regular o desenvolvimento folicular, o momento e o número de ovulações produzidas. As duas gonadotrofinas mais utilizadas para induzir o crescimento de múltiplos folículos durante esses protocolos são o hormônio folículo- estimulante (FSH) e a gonadotrofina coriônica equina (eCG); e ambos têm se mostrado eficazes. Sabe-se que a utilização da superestimulação ovariana utilizando FSH provoca mudanças positivas nos complexos cumulus-oócito (CCOs) e que a utilização do eCG no final do tratamento superestimulatório aumenta a resposta ovulatória, a ocorrência de estro, as concentrações de progesterona e as taxas de prenhes em programas de inseminação artificial (IA). Deste modo, o uso desses protocolos parece alterar o microambiente folicular e consequentemente a competência dos CCOs que se desenvolvem nele. Dentre os vários fatores presentes nesse microambiente estão as vesículas extracelulares (VEs; incluindo os exossomos), que carregam diversas moléculas como mRNA e microRNAs (miRNAs). Diante disso, o presente estudo visou avaliar o efeito da superestimulação ovariana com FSH ou FSH combinado a eCG, sobre a expressão gênica de embriões produzidos a partir de CCOs recuperados de vacas superestimuladas. Adicionalmente, verificou-se se os exossomos presentes no fluido folicular dessas vacas, quando adicionadas durante a maturação in vitro (MIV) de CCOs, provenientes de folículos antrais (3-8mm), são capazes de alterar aspectos celulares e moleculares dos CCOs, bem como a produção de blastocistos in vitro. Em suma, os resultados demonstraram que a superestimulação ovariana altera a abundância de mRNAs, relacionados à competência embrionária, em blastocistos produzidos à partir dos CCOs recuperados das vacas superestimuladas. Adicionalmente, também parece modular o conteúdo das exossomos, uma vez que genes relacionados à competência oocitária foram positivamente regulados nos CCOs cultivados na presença dos exossomos, no entanto, sem alterar a competência do CCOs em produzir blastocistos. ABSTRACT Ovarian superestimulation is a biotecnology used to increase the reproductive potential of females with high economic value by obtaining multiple ovulations and has been widely used in cattle. The follicular dynamics knowledge allows the development of numerous hormonal protocols able to regulate follicular development, the moment and the number of ovulations produced. Two most used gonadotrophins to induce the growth of multiple follicles during these protocols are follicle stimulating hormone (FSH) and chorionic gonadotropin equine (eCG) and both have proven effective. It is known that the ovarian superstimulation using FSH causes positives changes in cumulus-oocyte complexes (COCs) and the use of eCG at the end of superstimulatory treatment increases the ovulatory response, the oestrus occurrence, progesterone concentrations and pregnancy rates in artificial insemination (AI). Thus, these protocols seems to alter the follicular microenvironment and therefore the competence of COCs that development it. Among the several factors presents in this microenvironment are the extracellular vesicles (EVs; including the exosomes), that carry different molecules such mRNA and microRNA (miRNAs). Therefore, this study aimed to assess the effects of ovarian superstimulation with FSH or FSH combined with eCG on embryo gene expression produced from COCs recovered from superstimulated cows. Additionally, it was checked if the exosomes presents in follicular fluid from these cows, when added during in vitro maturation (IVM) of COCs from antral follicles (3- 8mm), are able to altering COCs cellular and molecular aspects and the in vitro blastocyst production. Briefly, the results showed the ovarian superstimulation change the mRNA abundance related to the embryo competence in blastocyst produced from COCs recovered from superstimulated cows. Furthermore, it also seems to modulate the exosome content, since the genes related to the oocyte competence are upregulated in COCs cultured in exosomes presence, however, without changing the COCs competence to produce blastocysts. LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO 2 Figure 1. Ovarian superstimulatory protocols in Nelore cows. Panel (A): control group, no superstimulated cows. Panel (B): P-36 protocol. Panel (C): P-36+eCG protocol. EB: Estradiol benzoate, D: day; PGF2α: prostaglandin F2 alpha.……………………….... 45 Figure. 2: Morphological characterization of exosomes pool isolated from bovine follicular fluid using ultracentrifugation by transmission electron microscopy………..57 Figure 3: Exosomes addition from superstimulated (FSH or FSH+eCG) cows or not during IVM on meiosis progression (A) and DNA fragmentation (B). The effects were testes by ANOVA. Differences were considered significant when P≤0.05. The results were obtained from 5 replicates to meiosis progression and to TUNEL assays analysis.………………………………………………………………………………...58 Figure. 4: Effects of addition of exosome from superstimulated (FSH or FSH+eCG) cows or not on the abundance of H2AFZ, PDE3, GDF9 and BMP15 mRNA on oocyte (A) and abundance of AREG, GREM1, COX2, EGFR, GDF9 and BMP15 mRNA on cumulus cells (B). The relative mRNA concentrations (target gene/PPIA by Pfaffl’s equation) were analyzed by ANOVA and the means were compared with an orthogonal contrast. The differences (a,b) were considered significant when P≤0.05. The results were obtained from 5 replicates………………………………………………………...59 LISTA DE TABELAS CAPÍTULO 2 Table 1. Names and functions for embryonic quality of candidate genes……………..49 Table 2. Information of specific primers used for amplification in real-time PCR. F: Forward primer; R: Reverse primer……………………………………………………54 Table 3. Gene expression of in vitro-produced blastocysts pools (5 embryos/pool) from cows submitted (FSH and FSH+eCG) or not (small follicles) to ovarian superstimulation. Number of pools analyzed were described in parenthesis. Data are presented by mean ± SEM. ND: undetectable expression..............................................56 SUMÁRIO PRÓLOGO .................................................................................................................... 15 INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 18 CAPÍTULO 1 ................................................................................................................ 21 1. ESTADO DA ARTE ............................................................................................... 22 1.1 Aspectos gerais da foliculogênese e o papel do microambiente folicular ovariano na competência oocitária......................................................................... 22 1.2 Vesículas extracelulares: exossomos ................................................................ 24 1.3 Superestimulação ovariana na espécie bovina ................................................. 28 2. HIPÓTESE .............................................................................................................. 31 3. OBJETIVOS............................................................................................................ 31 4. REFERÊNCIAS BIBLIOFRÁFICAS..................................................................... 31 CAPÍTULO 2 ................................................................................................................ 40 ABSTRACT ................................................................................................................... 41 INTRODUCTION .......................................................................................................... 42 MATERIAL AND METHODS...................................................................................... 44 Experiment 1: Effects of superstimulated treatment on embryo gene expression ... 44 Experiment 2: Effects of exosomes from bovine follicular fluid on oocyte competence and embryo production ....................................................................... 50 RESULTS ....................................................................................................................... 55 DISCUSSION ................................................................................................................. 60 REFERENCES ............................................................................................................... 65 CONSIDERAÇÕES FINAIS ....................................................................................... 76 15 PRÓLOGO Participação em eventos 2015 - XXIX Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Tecnologia de Embriões; Agosto/2015, Gramado – SP. 2015 - 1° Encontro de Epigenética e Reprogramação Nuclear, Abril, 2015 – USP – Pirassununga – SP. 2015 - XIV Workshop da Pós Graduação; Junho – UNESP – Botucatu-SP. 2015 - XV Workshop de genética; Abril, 2015 – UNESP – Botucatu-SP. 2014 - XIII Workshop da Pós Graduação; Junho, 2014 – Unesp – Botucatu-SP. 2014 - Análise Genômica- Presente e Futuro; Instituto de Biociências, UNESP – Botucatu – SP Resumos em congressos 2015 - FERNANDA FAGALI FRANCHI, PATRÍCIA KUBO FONTES, PRISCILA HELENA DOS SANTOS, JULIANO COELHO DA SILVEIRA, MARCELO FÁBIO GOUVEIA NOGUEIRA, CIRO MORAES BARROS, ANTHONY CÉSAR DE SOUZA CASTILHO. Efeitos moleculares e celulares de exossomos do fluido folicular de vacas Nelore submetidas à superestimulação ovariana. Em: XXIX Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Tecnologia de Embriões, Agosto 2015, Gramado – RS. 2015 - RODRIGO GARCIA BARROS, DEBORA JARDINA SARTOR, PAULA FERNANDA DE LIMA, LORENA SANCHES, ANA CAROLINE SILVA SOARES, CAMILA PAULA FREITAS-DELL ‘AQUA, FERNANDA FAGALI FRANCHI, FERNANDA CRUZ LANDIM ALVARENGA, CHRISTOPHER PRICE, JOSE BURATINI. O fator de crescimento dos fibrosblastos 10 (FGF10) e a proteína morfogenética óssea 15 (BMP15) inibem a apoptose nas células do cumulus de complexos cumulus-oócito bovinos submetidos a maturação in vitro. Em: XXIX Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Tecnologia de Embriões, Agosto 2015, Gramado – RS. 16 2015 - FONTES, P. K.; FRANCHI, F. F.; MILANEZI, R.; SANTOS, P. H.; NOGUEIRA, M. F. G.; BARROS, C. M.; CASTILHO, A. C. S. Effects of ovarian superstimulation on luteinizing hormone receptor (LHR) mRNA-binding protein (LRBP) mRNA and mir-222 expression in granulosa cells from Nelore cows. In: 48th Annual Meeting of the Society for the Study of Reproduction; Junho 2015, San Juan, Puerto Rico, USA. 2014 - JARDINA SARTOR, D.T.; FRANCHI, F. F.; LIMA, P. F.; PRICE, C.; BURATINI JUNIOR, J. Bone morphogenetic protein 15 and fibroblast growth factor 10 cooperate to inhibit apoptosis in bovine cumulus-oocyte complexes submitted to in vitro maturation. In: 9th Symposium of ruminants, Agosto 2014, Obihiro, Hokkaido, Japão. Atividades didáticas 2015 - Aula prática ministrada aos alunos de Biomedicina da UNIP de Bauru durante a visita Técnica ao laboratório de Fitomedicamentos, Farmacologia e Biotecnologia – UNESP, Botucatu-SP Tema: “Noções de produção in vitro de embriões bovino” 2015 - Palestra ministrada aos alunos de Pós-graduação em Ciências animal, durante a disciplina de Endocrinologia Molecular da Reprodução - UNOESTE, Presidente Prudente-SP Tema: “Vesículas extracelulares: Importância e perspectivas na comunicação intracelular ovariana“ Participação em outros projetos 2015 - Expressão de miRNAs reguladores do LHR ao redor do desvio folicular e durante a diferenciação de células da granulosa de fêmeas Nelore cultivadas in vitro. 2015 - Efeito da adição de vesículas extracelulares intrafoliculares de vacas holandesas submetidas ao estresse térmico em meio de maturação oocitária in vitro 17 2015 - Efeitos da adição da proteína sérica A associada à prenhêz (PAPPA) sobre aspectos celulares e moleculares da maturação in vitro de oócitos bovinos. 2015 - Efeito da adição da proteína sérica A associada à prenhêz (PAPPA) durante a maturação in vitro sobre a produção de embriões bovinos. 18 INTRODUÇÃO A produção in vitro de embriões (PIVE) bovinos tem crescido significativamente nos últimos anos. Em 2011, foram produzidos 350.762 embriões no Brasil, dos quais 90,7% foram produzidos in vitro. O aumento da utilização da fecundação in vitro (FIV) ocorreu devido aos seus efeitos positivos na redução de custos e na criação de novas possibilidades de aplicação na produção animal (Viana 2012) Na pecuária brasileira, há a predominância da sub-espécie Bos taurus indicus, cujas fêmeas apresentam em seus ovários maior abundância de folículos antrais passíveis de utilização na PIVE, o que determinou forte expansão comercial desta biotecnologia (Pontes et al. 2009). A maturação in vitro (MIV) é uma das etapas determinantes para o sucesso da técnica de PIVE e resultados insatisfatórios nesta fase alteram drasticamente o desenvolvimento, sobrevivência e implantação embrionária (Eppig 2001; Rizos et al. 2002; Gilchrist et al. 2004; McNatty et al. 2004; Gilchrist 2011). Apesar dos avanços no processo de PIVE em bovinos, os resultados da MIV são inferiores quando comparados à maturação in vivo (Rizos et al. 2002), sugerindo que a baixa competência de oócitos maturados in vitro seja decorrente, principalmente, da remoção do CCOs do ambiente intrafolicular. Isto porque, tal procedimento compromete a comunicação entre o oócito e as células somáticas (células do cumulus), além de impossibilitar a ação de diversos fatores reguladores da maturação nuclear e citoplasmática, presentes no microambiente folicular (Lonergan et al. 1994; Coticchio et al. 2004; Krisher 2004) Dentre os vários fatores presentes no microambiente folicular, encontram-se as vesículas extracelulares (VEs: exossomos e microvesículas). Sua presença tem sido observada em diversos tipos celulares, tais como, reticulócitos, plaquetas, linfócitos T 19 citotóxicos, linfócitos B, células dendríticas, células epiteliais de glândulas salivares, células acinares do pâncreas e células tumorais (Beaudoin et al. 1987; Escola et al. 1998; Théry et al. 2001; Kapsogeorgou et al. 2005; Bhatnagar et al. 2007; Iero et al. 2008). Adicionalmente, estudos mostraram a presença de exossomos e microvesículas em diversos fluidos biológicos como saliva, plasma, urina (Pisitkun et al. 2004; Caby et al. 2005; Gonzalez-Begne et al. 2009; Berckmans et al. 2011), bem como no líquido folicular de éguas (da Silveira et al. 2012) e fêmeas bovinas (Sohel et al. 2013). Uma característica importante nessas vesículas é que seus componentes e conteúdos podem ser modificados pelas condições de cultivo (Parolini et al. 2009; de Jong et al. 2012; Kucharzewska and Belting 2013) e essa capacidade de modificação, pode ser o mecanismo pelo qual as células controlam diversos processos fisiológicos. Recentes estudos demonstraram que a superestimulação ovariana afeta positivamente a abundância relativa de genes correlacionados com a capacidade ovulatória e competência de CCOs recuperados de vacas da raça Nelore submetidas à superestimulação ovariana (Barros et al. 2013), bem como regula a composição de fosfolipídios presentes no fluido folicular (dados não publicados). Logo, o uso da superestimulação ovariana, visando otimizar a produção de embriões através da produção de múltiplas ovulações de fêmeas com alto potencial genético (Barros and Nogueira 2001; Gouveia Nogueira et al. 2002; Baruselli et al. 2006; Barros et al. 2010), parece alterar o microambiente folicular no ovário bovino, e porque não, o perfil e conteúdo dos exossomos presentes no fluido folicular de fêmeas bovinas. Sabe-se que o microambiente folicular fornece ao oócito as condições propícias para o desenvolvimento da competência oocitária, definida como o potencial de um oócito em maturar, ser fecundado, desenvolver-se até o estágio de blastocisto e consequentemente manter a gestação (Sirard et al. 2006). Assim, o presente estudo 20 visou maximizar o entendimento das modificações causadas pela superestimulação ovariana com FSH ou FSH combinado com eCG, sobre a produção e perfil gênico relacionado à competência embrionária em vacas da raça Nelore. Adicionalmente, sabendo-se da presença dos exossomos no fluido folicular, pretende-se explorar possíveis efeitos da comunicação celular desempenhada por essas vesículas, sobre importantes processos, como a MIV e a PIVE em bovinos, em resposta às gonadotrofinas. 65 REFERENCES Acampora, D., Di Giovannantonio, L.G., and Simeone, A. (2013) Otx2 is an intrinsic determinant of the embryonic stem cell state and is required for transition to a stable epiblast stem cell condition. Development 140(1), 43-55 Adams, G.P., Matteri, R.L., Kastelic, J.P., Ko, J.C., and Ginther, O.J. (1992) Association between surges of follicle-stimulating hormone and the emergence of follicular waves in heifers. J Reprod Fertil 94(1), 177-88 Adams, G.P., Nasser, L.F., Bo, G.A., Garcia, A., Del Campo, M.R., and Mapletoft, R.J. (1994) Superovulatory response of ovarian follicles of Wave 1 versus Wave 2 in heifers. Theriogenology 42(7), 1103-13 Al-Gubory, K.H., Arianmanesh, M., Garrel, C., and Fowler, P.A. (2015) The conceptus regulates tryptophanyl-tRNA synthetase and superoxide dismutase 2 in the sheep caruncular endometrium during early pregnancy. Int J Biochem Cell Biol 60, 112-8 Al-Gubory, K.H., and Garrel, C. (2012) Antioxidative signalling pathways regulate the level of reactive oxygen species at the endometrial-extraembryonic membranes interface during early pregnancy. Int J Biochem Cell Biol 44(9), 1511-8 Barcelos, A.C.Z., Gouvêa, L.M., Meneghel, M., Barcelos, D.S., Barcelos, L.N., Trinca, L.A., and Barros, C.M. (2007) Efeito benéfico da substituição das duas últimas doses de pFSH por eCG no protocolo superestimulatório P-36 em vacas Nelore. Acta Scientiae Veterinariae 35(3), 1260 [Abstract] Barcelos, A.C.Z., Satrapa, R.A., Nogueira, M.F.G., Barros, and C.M (2006) Protocolo superestimulatório P-36 na raça Bonsmara:uso de eCG e atraso na indução da ovulação com LH. Acta Scientiae Veterinariae 34(Suppl. 1), 514 [Abstract] Barile, L., Lionetti, V., Cervio, E., Matteucci, M., Gherghiceanu, M., Popescu, L.M., Torre, T., Siclari, F., Moccetti, T., and Vassalli, G. (2014) Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction. Cardiovasc Res 103(4), 530-41 Barros, C.M., Ereno, R.L., Simões, R.A., Fernandes, P., Buratini, J., and Nogueira, M.F. (2010) Use of knowledge regarding LH receptors to improve superstimulatory treatments in cattle. Reprod Fertil Dev 22(1), 132-7 66 Barros, C.M., and Nogueira, M.F. (2001) Embryo transfer in Bos indicus cattle. Theriogenology 56(9), 1483-96 Barros, C.M., and Nogueira, M.F.G. (2005) Superovulation in Zebu cattle: Protocol P- 36 Embryo Transfer Newsletter 23 Barros, C.M., Satrapa, R.A., Castilho, A.C., Fontes, P.K., Razza, E.M., Ereno, R.L., and Nogueira, M.F. (2013) Effect of superstimulatory treatments on the expression of genes related to ovulatory capacity, oocyte competence and embryo development in cattle. Reprod Fertil Dev 25(1), 17-25 Baruselli, P.S., de Sá Filho, M.F., Martins, C.M., Nasser, L.F., Nogueira, M.F., Barros, C.M., and Bó, G.A. (2006) Superovulation and embryo transfer in Bos indicus cattle. Theriogenology 65(1), 77-88 Beaudoin, A.R., Piotte, M., Jolicoeur, C., Grenier, G., Grondin, G., Routhier, N., Gaudreau, J., and St-Jean, P. (1987) Lipid analysis of a novel type of cell secretion in the exocrine pancreas: the pancreasomes. Biochim Biophys Acta 922(1), 62-6 Bellow, R.A., B., S.R., M., W.J., A., P.D., and Darling, A. (1991) Use of bovine FSH for superovulation and embryo production in beef heifers. Theriogenology 35(6) Berckmans, R.J., Sturk, A., van Tienen, L.M., Schaap, M.C., and Nieuwland, R. (2011) Cell- derived vesicles exposing coagulant tissue factor in saliva. 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Deste modo, em primeiro plano, esperávamos que os embriões produzidos a partir dos CCOs recuperados de vacas submetidas ao tratamento superestimulatório apresentassem maior expressão de marcadores envolvidos com a melhoria da sua qualidade. De fato, o perfil gênico encontrado nesses embriões, fornecem indicativos dessa melhoria e corroboram com nosso pensamento inicial. Somando-se aos indícios de que os tratamentos superestimulatórios modificam o microambiente folicular e sabendo-se da presença de VEs no fluido folicular bovino e o seu papel na comunicação celular, resolvemos investigar se os exossomos estavam envolvidos nessa modulação gênica anteriormente reportada e se, a adição dessas vesículas na MIV, aumentaria a taxa de blastocistos produzida. No entanto, a adição desses exossomos durante a MIV não alterou a taxa de blastocistos produzidos in vitro. Ainda não sabemos, se os embriões produzidos nos grupos onde houve adição dos exossomos de vacas superestimuladas são de qualidade superior. Para termos pelo menos um indicativo disso, serão realizadas análises da expressão gênica desses embriões. Além disso, prospectamos analisar o conteúdo desses exossomos, investigando a presença de mRNA e miRNAs que estejam envolvidos no controle dos genes relacionados com a competência oocitária (BMP15 e GDF9), criando, assim, um rede biológica entre essas alterações e o conteúdo dos exossomos.