RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 14/02/2022. PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA EDUARDO LUIZ ROSSINI ANÁLISES EM DISPOSITIVOS DE PAPEL: SÍNTESE DE CARBON DOT APLICADA À DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS DE INTERESSE CLÍNICO E PAPER-SPRAY IONIZATION PARA DETECÇÃO DIRETA DE DOPING ESPORTIVO Araraquara 2020 EDUARDO LUIZ ROSSINI ANÁLISES EM DISPOSITIVOS DE PAPEL: SÍNTESE DE CARBON DOT APLICADA À DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS DE INTERESSE CLÍNICO E PAPER-SPRAY IONIZATION PARA DETECÇÃO DIRETA DE DOPING ESPORTIVO Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Química Orientadora: Profa. Dra. Helena Redigolo Pezza Araraquara 2020 Bibliotecária Responsável: Ana Carolina Gonçalves Bet - CRB8/8315 FICHA CATALOGRÁFICA R835a Rossini, Eduardo Luiz Análises em dispositivos de papel: síntese de carbon dot aplicada à determinação de compostos de interesse clínico e paper-spray ionization para detecção direta de doping esportivo / Eduardo Luiz Rossini. – Araraquara : [s.n.], 2020 173 f. : il. Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química Orientador: Helena Redigolo Pezza 1. Microfluídica. 2. Fluorimetria. 3. Nanopartículas. 4. Espectrometria de massa. 5. Química clínica. I. Título. DADOS CURRICULARES 1. Dados pessoais Nome: Eduardo Luiz Rossini Nome em citações: Rossini, E. L.; Rossini, Eduardo Luiz; Rossini, Eduardo L. Data de nascimento: 11/04/1992 Naturalidade: Jaú – SP Nacionalidade: Brasileiro Estado Civil: Solteiro Filiação: Mãe – Vânia Elvira Arriello Rossini / Pai – Dorival Rossini Endereço Profissional: Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química de Araraquara, Departamento de Química Analítica, Rua Prof. Francisco Degni, 55, Bairro Quitandinha, Araraquara, 14800-060, SP - Brasil E-mail: elrossini.1@gmail.com 2. Formação acadêmica 2.1. Graduação: • Bacharel em Química pelo Instituto de Química – UNESP, Brasil, no período de 2010 a 2013. Trabalho de Conclusão de Curso orientado pela Profa. Dra. Helena Redigolo Pezza intitulado “Desenvolvimento de método analítico limpo para análise de corante amaranto por espectroscopia de reflectância difusa”. Bolsista do CNPq e FAPESP (Processo n. 2013/09701-1). 2.2. Pós-graduação • Mestrado em Química Analítica pelo Instituto de Química – UNESP – Araraquara, 2014 a 2015. Dissertação orientada pela Profa. Dra. Helena Redigolo Pezza intitulada “Determinação simultânea de biomarcadores de função renal em urina utilizando dispositivo analítico microfluídico em papel”. Bolsista do CNPq (Processo n. 132646/2014-5) e FAPESP (Processo n. 2014/17749-7). • Doutorado em Química Analítica pelo Instituto de Química – UNESP – Araraquara, 2016 a 2019. Tese orientada pela Profa. Dra. Helena Redigolo Pezza intitulada “Análises em dispositivos de papel: síntese de carbon dot aplicada à determinação de compostos de interesse clínico e paper-spray ionization para detecção direta de doping esportivo”. Bolsista do CNPq (Processo n. 140503/2016-1) e FAPESP (Processo n. 2016/20847-6). • Doutorado sanduíche na Ohio State University – Departamento de Química e Bioquímica – Columbus/OH, outubro/2018 a setembro/2019. Projeto orientado pelo Prof. Dr. Abraham K. Badu-Tawiah e pela Profa. Dra. Helena Redigolo Pezza intitulado “Paper-spray mass spectrometry as a tool for doping detection”. Bolsista da FAPESP (Processo n. 2018/05993-1). 3. Prêmios • Best Poster Award – European Chemistry Conference, Madridge, Roma, Itália, 2018. • Analyst Poster Prize - V Workshop em Microfluídica, Royal Society of Chemistry, Campinas, Brasil, 2015. • Prêmio Lavoisier, CRQ-IV, 2014. • Certificado de Honra ao Mérito ao melhor aluno da turma, Instituto de Química - UNESP/CAr, Araraquara, Brasil, 2014. 4. Artigos • ROSSINI, E. L.; KULYK, D. S.; ANSU, E.; SAHRAEIAN, T.; PEZZA, H. R.; BADU-TAWIAH, A. K. Direct analysis of doping agents in raw urine using hydrophobic paper spray mass spectrometry. Submetido para periódico especializado. • MILANI, M. I.; ROSSINI, E. L.; CATELANI, T. A.; PEZZA, L.; TOCI, A. T.; PEZZA, H. R. Authentication of roasted and ground coffee samples containing multiple adulterants using NMR and a chemometric approach. Food Control, v. 112, p. 107104, 2020. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2020.107104. • LIMA, L. S.; ROSSINI, E. L.; PEZZA, L.; PEZZA, H. R. Bioactive paper platform for detection of hydrogen peroxide in milk. Spectrochimica Acta Part A, v. 227, p. 117774, 2020. https://doi.org/10.1016/j.saa.2019.117774. • LUIZ, V. H. M.; LIMA, L. S.; ROSSINI, E. L.; PEZZA, L.; PEZZA, H. R. Paper platform for determination of bumetanide in human urine samples to detect doping in sports using digital image analysis. Microchemical Journal, v. 147, p. 43-48, 2019. https://doi.org/10.1016/j.microc.2019.03.006. • ROSSINI, E. L.; MILANI, M. I.; PEZZA, H. R. Green synthesis of fluorescent carbon dots for determination of glucose in biofluids using a paper platform. Talanta, v. 201, p. 503-510, 2019. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2019.04.045. • ROSSINI, E. L.; MILANI, M. I.; CARRILHO, E.; PEZZA, L.; PEZZA, H. R. Simultaneous determination of renal function biomarkers in urine using a validated paper-based microfluidic analytical device. Analytica Chimica Acta, v. 997, p. 16-23, 2018. https://doi.org/10.1016/j.aca.2017.10.018. • SILVESTRE, A. L. P.; MILANI, M. I.; ROSSINI, E. L.; PEZZA, L.; PEZZA, H. R. A paper platform for colorimetric determination of aluminum hydrochloride in antiperspirant samples. Spectrochimica Acta Part A, v. 204, p. 432-435, 2018. https://doi.org/10.1016/j.saa.2018.06.049. • MILANI, M. I.; ROSSINI, E. L.; CASTOLDI, K.; PEZZA, L.; PEZZA, H. R. Paper platform for reflectometric determination of furfural and hydroxymethylfurfural in sugarcane liquor. Microchemical Journal, v. 133, p. 286-292, 2017. https://doi.org/10.1016/j.microc.2017.03.046. • ROSSINI, E. L.; MILANI, M. I.; PEZZA, L.; PEZZA, H. R. New eco-friendly methodology for determination of amaranth dye in foodstuffs using diffuse reflectance spectroscopy. Analytical Methods, v. 8, p. 4086-4092, 2016. https://doi.org/10.1039/c5ay02723c. • KASTOLDI, K.; MILANI, M. I.; ROSSINI, E. L.; PEZZA, L.; PEZZA, H. R. Flow injection analysis of 5-(hydroxymethyl)-2-furaldehyde in honey by a modified winkler method. Analytical Sciences, v. 32, p. 413-417, 2016. https://doi.org/10.2116/analsci.32.413. • MILANI, M. I.; ROSSINI, E. L.; Pezza, L.; Pezza. H.R. Development of a new clean methodology with ultrasound-assisted extraction for analysis of sodium in pet foods. Analytical Methods, v. 7, p. 2433-2436, 2015. https://doi.org/10.1039/C4AY02892A. 5. Trabalhos apresentados em eventos científicos • European Chemistry Conference, Roma – Itália, 4 a 6 de julho de 2018. Trabalho: ROSSINI, E. L.; MILANI, M. I.; PEZZA, H. R. Novel carbon dot for glucose analysis using standard addition paper device. 2018. • 18º Encontro Nacional de Química Analítica, Florianópolis – Santa Catarina, 18 a 21 de setembro de 2016. Trabalho: ROSSINI, E. L.; MILANI, M. I.; PEZZA, L.; PEZZA, H. R. Construção de reflectômetro homemade e aplicação na análise de corantes. • 55º Congresso Brasileiro de Química, Goiânia – Goiás, 02 a 06 de novembro de 2015. Trabalho: ROSSINI, E. L.; MILANI, M. I.; PEZZA, L.; PEZZA, H. R., Determinação simultânea de biomarcadores de função renal em urina utilizando dispositivo analítico microfluídico em papel. • V Workshop em Microfluídica, Campinas – São Paulo, 23 e 24 de julho de 2015. Trabalho: ROSSINI, E. L.; MILANI, M. I.; PEZZA, L.; PEZZA, H. R., Determinação simultânea de ácido úrico e creatinina utilizando PAD com detecção por imagem digital. • 37ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Natal – Rio Grande do Norte, 26 a 29 de maio de 2013. Trabalho: ROSSINI, E. L.; MILANI, M. I.; PEZZA, L.; PEZZA, H. R., Metodologia alternativa ambientalmente amigável para análise de corante Bordeaux S utilizando spot-test associado à reflectância difusa. • XXV Congresso de Iniciação Científica da UNESP, Araraquara – São Paulo, 18 e 19 de setembro de 2013. Trabalho: ROSSINI, E. L.; MILANI, M. I.; PEZZA, L.; PEZZA, H. R., Desenvolvimento de método analítico para análise de aditivos em bebidas não alcoólicas aplicando princípios da química verde. • 36ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Águas de Lindóia – São Paulo, 25 a 28 de maio de 2013. Trabalho: ROSSINI, E. L.; MILANI, M. I.; PEZZA, L.; PEZZA, H. R., Desenvolvimento de método analítico limpo para análise de corante amaranto em groselhas por espectroscopia de reflectância difusa. 6. Participação em eventos • Central Ohio Mass Spec Discussion Group (COH-MSDG), 2019. • Escola de Verão em Química, Araraquara, 2018. • European Chemistry Conference, Roma, 2018. • XXXVII Escola de Verão em Química, São Carlos, 2017. • 18° Encontro Nacional de Química Analítica, Florianópolis, 2016. • VI Workshop em Microfluídica, Campinas, 2016. • 55° Congresso Brasileiro de Química, Goiânia, 2015. • V Workshop em Microfluídica, Campinas, 2015. • 37ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Natal, 2014. • XXV Congresso de Iniciação Científica da UNESP: 25 anos de discussão das atividades de Iniciação Científica, Araraquara, 2013. • 36ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Águas de São Pedro, 2013. 7. Supervisão de Iniciação Científica • Supervisão da aluna de graduação Amanda Letícia Polli Silvestre no projeto intitulado “Plataforma de papel para análise colorimétrica de sulfonamidas em amostras de medicamentos veterinários”, setembro/2016 a fevereiro/2017. Bolsista do PIBIC/CNPq. • Supervisão do aluno de graduação Felipe de la Rua Müzel no projeto intitulado “Plataforma de papel para spot-test e DLLME para detecção de furosemida em doping”, setembro/2017 a março/2018. Bolsista do PIBIC/CNPq. DEDICATÓRIA Dedico este trabalho aos meus pais, Vânia e Dorival, se não fosse por vocês eu não estaria aqui. Ao meu irmão, André, pelo apoio e companheirismo em todos os momentos. À Maria Izabel, minha melhor amiga, noiva e companheira de aventuras que é a maior incentivadora dos meus objetivos. Muito obrigado por estar sempre do meu lado cuidando de mim, me apoiando e tendo paciência. AGRADECIMENTOS Primeiramente agradeço a Deus por permitir que eu cumprisse mais essa etapa na minha vida. Ao meu pai, Dorival, e minha mãe, Vânia, que me formaram do jeito que sou hoje. Também, embora não seja esse o caminho que vocês gostariam que eu seguisse, espero que sintam orgulho do que me tornei. Ao meu irmão, André, pelo suporte e ajuda sempre que precisei. À minha noiva, melhor amiga e companheira, Maria Izabel, que sempre esteve ao meu lado em todos os momentos, me ajudando nas horas difíceis e compartilhando os bons momentos. Obrigado me apoiar por desde sempre e ser minha companheira de jornada, pois se estou onde estou, é por sua causa. Ao Henrique, Angela, Ana Julia e tia Edna, obrigado por terem me acolhido tão bem na sua casa e serem parte da minha vida. À professora Helena Redigolo Pezza pela orientação e confiança, pelas oportunidades, ensinamentos e pelo exemplo profissional que pretendo seguir. Ao professor Abraham K. Badu-Tawiah pela orientação e oportunidade de trabalhar e aprender no seu grupo de pesquisa. Aos amigos do GPFF e LATIG, em especial, Liliane, Aninha, Bruno, Richard, Laura, Geórgia, Felipe, Tiago e Dayana, obrigado pelo apoio e ajuda quando precisei e, principalmente, pelos bons momentos, pelos cafés e pelas risadas que descontraiam esse difícil caminho que decidimos seguir. Aos amigos do Badu’s research group, em especial, Devin, Sierra, Kavya, Ben, Suji, Dmytro e Taghi que me acolheram tão bem longe de casa e me ajudaram muito nessa nova etapa. À Karla e à Poliana que foram minha família em Columbus. A todos os amigos de Araraquara, em especial, Felipe, Marcelo e Patrick, obrigado pelo companheirismo e amizade durante esse período. Aos membros da banca, professores Ana Rita, Clóvis, Ivo e Paulo, pela disponibilidade, tempo dispensado e sugestões para melhorar esse texto. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (Processo nº 2016/20847-6 e 2018/05993-1) pelas bolsas concedidas e pelo auxílio financeiro. Ao CNPq (Processo n° 140503/2016-1) pelos recursos e pela bolsa concedida. Aos professores e funcionários do IQ e, também, a todos que contribuíram de maneira direta ou indireta para que mais essa etapa fosse concluída, muito obrigado. “Somewhere, something incredible is waiting to be known”. Carl Sagan “Quiet people have the loudest minds”. Stephen Hawking “A tarefa é não tanto para ver o que ninguém viu ainda, mas pensar o que ninguém ainda pensou, sobre o que todo mundo vê”. Erwin Schrödinger RESUMO A primeira parte deste trabalho foi desenvolvida no laboratório Fritz Feigl-UNESP/CAr, na qual foi descrito um novo carbon dot (CD) sintetizado a partir de ácido cítrico e tiramina usando uma rota em única etapa por meio de aquecimento por micro-ondas doméstico. O CD sintetizado apresenta emissão no azul quando irradiado com luz UV, que foi suprimida na presença de H2O2 e peroxidase. O CD foi utilizado para desenvolver metodologias para quantificar glicose em amostras biológicas utilizando plataforma de papel. O método desenvolvido foi aplicado em amostras de soro e urina certificadas, e não há diferenças estatisticamente significativas entre os resultados obtidos usando o dispositivo de papel com adição de padrão e as amostras certificadas. Também foram desenvolvidas metodologias utilizando 3D-µPAD com o reagente fluorescente e enzimas oxidase para quantificação de glicose e lactato em amostras de saliva. O preparo de amostra foi simples e rápido e o método foi validada utilizando adição de padrão e recuperação, além de ser aplicado em amostras de soro certificadas, não houve diferenças estatisticamente significativas entre os resultados obtidos e os valores de referência. A segunda parte deste trabalho foi desenvolvida no Badu’s research group na The Ohio State University durante o período sanduiche com bolsa da FAPESP, na qual foi desenvolvida a quantificação direta de agentes dopantes em amostras de urina sem tratamento da amostra por PS-MS. Paper-spray mass spectrometry é um método de ionização em condições ambientes que combina as vantagens das plataformas de papel com a confiabilidade das análises de espectrometria de massas, reduzindo o tempo de análise e o consumo de reagente e de solventes orgânicos. O uso de substâncias ilícitas para aumentar a desempenho de atletas em esportes é proibido e considerado doping. A superfície do papel foi tratada com triclorometilsilano utilizando reação em fase gasosa para aumentar a ionização dos compostos alvo. Essa abordagem foi aplicada para análise de dois agentes anabólicos (trembolona e clembuterol) e dois diuréticos (furosemida e hidroclorotiazida) em amostras de urina. Após a otimização das condições experimentais, os métodos desenvolvidos apresentaram repetibilidade satisfatória e boa correlação linear entre concentração e intensidade absoluta. Foram alcançados limites de detecção na faixa de sub-ng mL-1, abaixo dos níveis de desempenho mínimos requeridos pela WADA, utilizando o método de PS-MS com papel hidrofóbico sem nenhuma etapa de preparo ou clean-up da amostra. Os métodos propostos foram aplicados em amostras de urina fortificadas com os agentes dopantes e se mostraram rápidos, simples, sensíveis, exatos e precisos. Palavras-chave: Carbon dot. Glicose. Lactato. Saliva. µPAD. Imagem digital. Paper- spray. Espectrometria de massas. Doping. Agentes anabolizantes. Diuréticos. Urina. ABSTRACT The first part of this work was developed on the Fritz Feigl-UNESP/CAr laboratory, in which a novel carbon dot synthesized from citric acid and tyramine was described using a one-step microwave heating route. Under UV irradiation, the CD displayed blue emission that was quenched in the presence of H2O2 and peroxidase. This property was used to develop method to quantify glucose in biological samples using a paper platform. The method developed was applied in the analysis of certified serum and urine samples, and there were no statistically significant differences between the certified concentrations and the results obtained using the paper device with standard additions. In addition, it was developed method using 3D-µPAD, the CD fluorescence reagent and oxidase enzymes to quantify glucose and lactate in saliva samples. The sample preparation used was simple and fast. The method was validated in saliva samples utilizing standard addition and recovery, and applied in the analysis of certified serum samples, and there were no statistically significant differences between the certified concentrations and the results obtained using the 3D-µPAD. The second part of this work was developed at the Badu’s research group at The Ohio State University during the internship period funded by FAPESP, in which a direct quantification of doping agents in urine samples with no sample preparation by PS-MS was developed. Paper-spray mass spectrometry (PS-MS) is an ambient ionization method that combines the advantages of the paper platform with the reliability of MS analysis, reducing the consumption of time, reagent, and organic solvent. The use of illicit substances to improve enhance athletic performance in sport is forbidden and considered doping. The paper surface was treatment with trichloromethylsilane (TCMS) using a gas-phase reaction to increase the target compounds ionization. This approach was applied for the analysis of two anabolic agents (trenbolone and clenbuterol) and two diuretics (furosemide and hydrochlorothiazide) in urine samples. Under optimized conditions, the developed methods presented satisfactory repeatability and a good correlation between concentration and absolute intensity. Highly sensitive detections as low as sub-ng mL-1 which is below the minimum required performance levels (MRPL) proposed by the WADA has been reached using the hydrophobic PS-MS without any pre-concentration and clean-up step. The proposed methods were applied in fortified urine samples with doping agents and showed to be fast, simple, sensitive, accurate and precise. Keywords: Carbon dot. Glucose. Lactate. Saliva. µPAD. Digital image. Paper-spray. Mass spectrometry. Doping. Anabolic agents. Diuretics. Urine. LISTA DE FIGURAS Figura 1.1 – Comparação das dimensões de diferentes estruturas. .................................... 26 Figura 1.2 – Níveis de energia de um átomo até o bulk de um mesmo material. ................. 28 Figura 1.3 – Levantamento do número de publicações de trabalhos relativos à carbon dot em função do ano, no período de 2004 a 2019, feito utilizando a plataforma Scifinder® utilizando a palavra carbon dot..................................................................................... 31 Figura 1.4 – Estratégias top-down e bottom-up para síntese de nanopartículas. ................ 32 Figura 1.5 – Estados de spin dos elétrons das moléculas. Em (a) é representado o estado eletrônico fundamental singleto com os spins emparelhados. Em (b) e (c) são mostrados os estados eletrônicos excitados. Caso os spins estejam emparelhados no estado excitado, a molécula está no estado singleto (b). Se os spins estejam desemparelhados, a molécula está em um estado excitado tripleto (c). ....................... 36 Figura 1.6 – Diagrama de níveis de energia, ou diagrama de Jablonski, de uma molécula hipotética. .................................................................................................................... 37 Figura 1.7 – Levantamento do número de publicações de trabalhos relativos à μPAD em função do ano, no período de 2000 a 2019, feito utilizando a plataforma Scifinder® utilizando a palavra paper-based analytical device. ...................................................... 40 Figura 1.8 – Esquema dos diferentes modos para a confecção de barreiras hidrofóbicas. . 42 Figura 1.9 – (a) Detalhamento dos componentes de uma impressora com tinta à base de cera da marca Xerox®: 1) Display frontal, 2) Trajetória do papel, 3) Rolo de pressão para transferência, 4) Pré-aquecedor de papel, 5) Fusão da cera, 6) Reservatório de cera derretida, 7) Rolo de impressão, 8) Cabeça de impressão, 9) Kit de manutenção, 10) Reservatório de descarte, 11) Armazenamento de papel, 12) Armazenamento de cera sólida e 13) Conexões e saídas eletrônicas. (b) Esquema de como é feita a impressão utilizando a impressora com tinta à base de cera. ...................................... 43 Figura 1.10 – Confecção e utilização das plataformas de papel para determinação por adição de padrão. A. Layout dos spot-tests; B. Impressão dos spot-tests; C. Aquecimento para formação das barreiras hidrofóbicas; D. Spot-test pronto, E. Adição da mistura de GOx, Pox e CD; F. Adição da amostra e padrões de glicose; G. Iluminação UV para detecção por fluorimetria utilizando imagem digital; H. Tratamento das imagens por software gráfico. ................................................................................ 56 Figura 1.11 – Confecção e utilização do 3D-µPAD. A. Design dos 3D-µPADs; B. Impressão dos 3D-µPADs; C. Aquecimento para formação das barreiras hidrofóbicas; D. 3D-µPAD pronto; E. Dobradura do 3D-µPAD; F. 3D-µPAD no suporte metálico com imã para análise; G. Adição da amostra; H. Última camada retirada do 3D-µPAD; I. Câmara UV para detecção por fluorimetria utilizando imagem digital. ............................................. 57 Figura 1.12 – Gráfico de efeitos principais da matriz da Tabela 1.2. CH2O2 = 50 x 10-6 mol L-1, CPox = 30 U mL-1, pH = 6 e n = 3. .................................................................................. 61 Figura 1.13 – Variação da razão molar TIR/AC para a síntese dos CD. Tempo de síntese = 120 s, CH2O2 = 75 x 10-6 mol L-1, CPox = 30 U mL-1, pH=6 e n=3. ................................... 62 Figura 1.14 – Espectro de absorção e fotografia da cubeta da dispersão de CD diluída 5 vezes. .......................................................................................................................... 63 Figura 1.15 – Espectros de excitação e emissão de fluorescência para o CD. Fotografia da dispersão de CD sob luz UV (365 nm). pH=6. .............................................................. 64 Figura 1.16 – Espectros de emissão variando a comprimento de onda de excitação. pH = 6. ..................................................................................................................................... 65 Figura 1.17 – Variação do máximo de emissão com o aumento na concentração de CD no reagente utilizado. pH = 6. ........................................................................................... 66 Figura 1.18 – Variação na intensidade de fluorescência dos CD com o pH. ....................... 67 Figura 1.19 – Efeito da concentração de NaCl na fluorescência dos CD. pH=6 e n=3. ....... 68 Figura 1.20 – Espectro de FTIR e estrutura do ácido cítrico. ............................................... 69 Figura 1.21 – Espectro de FTIR e estrutura da tiramina. ..................................................... 70 Figura 1.22 – Espectro de FTIR do CD. .............................................................................. 71 Figura 1.23 – Reação de condensação entre o ácido cítrico e a tiramina. ........................... 72 Figura 1.24 – Espectro de ¹H-NMR presat da solução de ácido cítrico (600MHz, D2O). ...... 72 Figura 1.25 – Espectro de ¹H-NMR presat da solução de tiramina (600MHz, D2O). ............ 73 Figura 1.26 – Espectro de ¹H-NMR presat da dispersão de CD (600MHz, D2O). ................ 73 Figura 1.27 – Imagem de TEM do CD sintetizado. Distribuição do tamanho das nanopartículas. ............................................................................................................ 75 Figura 1.28 – Resposta dos CD frente aos compostos analisados. C = 100 x 10-6 mol L-1, CH2O2 = 50 x 10-6 mol L-1, CPox = 30 U mL-1 e n = 3. ...................................................... 76 Figura 1.29 – Proposta de mecanismo para a supressão da fluorescência do CD em presença de H2O2 e Pox. ............................................................................................. 77 Figura 1.30 – Intensidade de fluorescência das componentes RGB em função da velocidade do obturador da câmera fotográfica. (t = 1, 0,8, 0,6, 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/8, 1/10 e 1/13 s). n = 5. ............................................................................................................... 78 Figura 1.31 – Curva analítica de concentração de quinino em função da intensidade das componentes RGB. ...................................................................................................... 79 Figura 1.32 – Spot-test utilizado na calibração da fluorescência. Concentrações de sulfato de quinino em meio de H2SO4 0,1 mol L-1 iguais a 2,50, 5,00, 7,50, 10,0 15,0, 20,0 e 25,0 x 10-6 mol L-1. ....................................................................................................... 79 Figura 1.33 – Supressão da fluorescência com o aumento da concentração de CD no reagente. CH2O2 = 10 x 10-6 mol L-1, CPox = 30 U mL-1. .................................................. 81 Figura 1.34 – Reação de oxidação da glicose utilizando a enzima glicose oxidase em meio contendo oxigênio formando ácido glucônico e peróxido de hidrogênio. ...................... 82 Figura 1.35 – Curva de adição de padrão e a obtenção da concentração de glicose na amostra. n = 3. ............................................................................................................. 83 Figura 1.36 – Diferentes volumes de solução de corante amaranto adicionados ao µPAD. Da esquerda para a direita os volumes utilizados foram de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 e 50 µL de solução de corante amaranto. ............................................................... 85 Figura 1.37 – Diferentes volumes de água deionizada adicionados ao µPAD. Da esquerda para a direita os volumes utilizados foram de 0, 35, 40, 45, 55, 65, 75 e 80 µL de água deionizada. .................................................................................................................. 86 Figura 1.38 – Resposta dos CD frente aos compostos analisados na presença de GOX e Pox. C = 50,0 x 10-6 mol L-1, CGOx = 120 U mL-1 e CPox = 30 U mL-1. ............................. 87 Figura 1.39 – Curva analítica de supressão em função da concentração de glicose. CGLI = 5,00 a 50,0 x 10-6 mol L-1, CGOx = 120 U mL-1 e CPox = 30 U mL-1. Componente de cor = azul (B). ....................................................................................................................... 87 Figura 1.40 – Reação de oxidação do lactato utilizando a enzima lactato oxidase em meio contendo oxigênio formando piruvato e peróxido de hidrogênio. .................................. 90 Figura 1.41 – Resposta dos CD frente aos compostos analisados. C = 20,0 x 10-6 mol L-1, CLOx = 50 U mL-1 e CPox = 30 U mL-1. ............................................................................ 90 Figura 1.42 – Curva analítica de supressão em função da concentração de lactato. CLAC = 2,50 a 20,0 x 10-6 mol L-1, CLOx = 50 U mL-1 e CPox = 30 U mL-1. Componente de cor utilizada = azul (B). ................................................................................................. 91 Figura 2.1 – Os componentes básicos de um espectrômetro de massas. ......................... 107 Figura 2.2 – Representação esquemática do processo de ionização por electrospray. ..... 109 Figura 2.3 – Ilustração de um sistema de PS-MS. ............................................................ 111 Figura 2.4 – Levantamento do número de publicações de trabalhos relativos ao uso de PS-MS em função do ano, no período de 2010 a 2019, feito utilizando a plataforma Scifinder® utilizando as palavras paper-spray mass spectrometry. ............................ 113 Figura 2.5 – Esquema da parte interna de um espectrômetro de massas Finnigan LTQ Linear Ion Trap, Thermo Scientific ®. ......................................................................... 114 Figura 2.6 – Ilustração do funcionamento da ejeção de íons pelo LQT de acordo com a razão m/z do íon. ....................................................................................................... 115 Figura 2.7 – Estruturas dos agentes anabólicos (a) trembolona e (b) clembuterol. ........... 119 Figura 2.8 – Estruturas dos diuréticos (a) furosemida e (b) hidroclorotiazida. ................... 121 Figura 2.9 – Esquema da configuração utilizada na silanização em fase de vapor. 1. Dessecador; 2. Válvula; 3. Sistema de bomba de vácuo; 4. Disco de plástico do dessecador; 5. Triângulos de papel; 6. Organosilano. ................................................ 127 Figura 2.10 – Configuração do espectrômetro de massas utilizado para realização dos experimentos com PSI. .............................................................................................. 128 Figura 2.11 – Representação esquemática da configuração utilizada na análise de compostos em urina utilizando PS-MS. ...................................................................... 129 Figura 2.12 – Modificação do papel através da silanização dos grupos hidroxil presente na superfície do papel utilizando vapor de triclorosilano para criação uma camada hidrofóbica. ................................................................................................................ 132 Figura 2.13 – Espectro de massas obtido por meio de PS-MS em modo íon positivo para solução de trembolona (MM 270) preparada em MeOH:H2O (1:1) utilizando papel hidrofóbico tratado com TCTFPS por 120 min. Espectro de CID-MS2 para o íon protonado da trembolona está inserido na figura. Energia de colisão = 23 eV. CTREM = 1000 ng mL-1. ............................................................................................................. 132 Figura 2.14 – Proposta de padrão de fragmentação via CID-MS2 proposto do íon trembolona protonado (m/z 271) no modo íon positivo. A fragmentação apresenta os principais íons fragmentos em m/z 253, 227 e 199. ........................................................................... 133 Figura 2.15 – Espectro de massas obtido por meio de PS-MS em modo íon positivo para solução de clembuterol (MM 277) preparada em MeOH:H2O (1:1) utilizando papel hidrofóbico tratado com TCTFPS por 120 min. Espectro de CID-MS2 para o íon protonado do clembuterol está inserido na figura. Energia de colisão = 15 eV. CCLEM = 1000 ng mL-1. ............................................................................................................. 134 Figura 2.16 – Proposta de padrão de fragmentação via CID-MS2 proposto do íon clembuterol protonado (m/z 277) no modo íon positivo. A fragmentação apresenta os principais íons fragmentos em m/z 277, 259 e 203. ................................................... 135 Figura 2.17 – Espectro de massas no modo íon negativo registrado para furosemida (MM 331) preparado em MeOH:H2O (1:1) utilizando papel hidrofóbico tratado com TCTFPS por 120 min. Espectro de CID-MS2 para o íon desprotonado da furosemida está inserido na figura. Energia de colisão = 16 eV. CFUR = 25 μg mL-1. ............................ 136 Figura 2.18 – Proposta de padrão de fragmentação via CID-MS2 proposto do íon furosemida desprotonado (m/z 329) no modo íon negativo. A fragmentação apresenta os principais íons fragmentos em m/z 285, 249 e 205. ................................................................... 137 Figura 2.19 – Espectro de massas no modo íon negativo registrado para hidroclorotiazida (MM 298) preparado em MeOH:H2O (1:1) utilizando papel hidrofóbico tratado com TCTFPS por 120 min. Espectro de CID-MS2 para o íon desprotonado da hidroclorotiazida está inserido na figura. Energia de colisão = 20 eV. CHCT = 25 μg mL-1. ................................................................................................................................... 138 Figura 2.20 – Proposta de padrão de fragmentação via CID-MS2 proposto do íon hidroclorotiazida desprotonado (m/z 296) no modo íon negativo. A fragmentação apresenta os principais íons fragmentos em m/z 269, 232 e 205. .............................. 139 Figura 2.21 – Curva de nível da superfície de resposta do planejamento composto central obtido para a intensidade absoluta (IA) em função da voltagem do tube lens e da temperatura do capilar para o íon molecular desprotonado da furosemida ([M-H]- em m/z 329), utilizando PS-MS em modo íon negativo. ................................................... 141 Figura 2.22 – Curva de nível da superfície de resposta do planejamento composto central obtido para a intensidade absoluta (IA) em função da voltagem do tube lens e da temperatura do capilar para o íon produto da fragmentação na fonte da furosemida ([M- CO2-H]- em m/z 285), utilizando PS-MS em modo íon negativo. ................................ 142 Figura 2.23 – Curva de nível da superfície de resposta do planejamento composto central obtido para a intensidade absoluta (IA) em função da voltagem do tube lens e da temperatura do capilar para o íon molecular desprotonado da hidroclorotiazida ([M-H]- em m/z 296), utilizando PS-MS em modo íon negativo. ............................................. 142 Figura 2.24 – Curva de nível da superfície de resposta do planejamento composto central obtido para a intensidade absoluta (IA) em função da voltagem do tube lens e da temperatura do capilar para o aduto formado entre a hidroclorotiazida e o íon cloreto ([M+Cl]- em m/z 332), utilizando PS-MS em modo íon negativo. ................................ 143 Figura 2.25 – Curva de nível da superfície de resposta do planejamento composto central obtido para a intensidade absoluta (IA) em função da voltagem do tube lens e da temperatura do capilar para o íon produto via CID-MS2 da trembolona (m/z 271 → 253), utilizando PS-MS em modo íon positivo. .................................................................... 145 Figura 2.26 – Curva de nível da superfície de resposta do planejamento composto central obtido para a intensidade absoluta (IA) em função da voltagem do tube lens e da temperatura do capilar para o íon produto via CID-MS2 do clembuterol (m/z 277 → 259), utilizando PS-MS em modo íon positivo. .................................................................... 145 Figura 2.27 – Otimização do solvente do spray utilizado durante o PS-MS. Intensidade absoluta de soluções de 12,5 µg mL-1 de furosemida (cinza claro) e 1000 ng mL-1 de trembolona (vermelho). Fragmentos característicos da trembolona protonada (m/z 271 → 253) e da furosemida desprotonada (m/z 329 → 285) foram utilizadas para a análise. ................................................................................................................................... 147 Figura 2.28 – Efeito da voltagem da fonte na intensidade do sinal. Trembolona (círculos pretos – 500 ng mL-1) foi monitorado através de experimentos CID-MS2 utilizando o íon produto mais abundante, m/z 253, no modo íon positivo, e a furosemida (círculos brancos – 12,5 µg mL-1) foi monitorado através de experimentos CID-MS2 utilizando o íon produto mais abundante, m/z 285, no modo íon negativo. As barras de erro representam o desvio padrão de três réplicas dos analitos realizadas em triângulos de papeis independentes. ............................................................................................... 149 Figura 2.29 – Modificação do papel através da silanização dos grupos hidroxil da sua superfície utilizando vapor de triclorosilano para criar uma camada hidrofóbica no papel. ................................................................................................................................... 150 Figura 2.30 – Otimização do reagente e tempo de tratamento do papel. Intensidade absoluta de soluções de (a) 500 ng mL-1 de trembolona e (b) 12,5 µg mL-1 furosemida. Fragmentos característicos da trembolona protonada (m/z 271 → 253) e furosemida desprotonada (m/z 329 → 285) foram utilizadas na análise. Os triângulos de papel foram tratados com TCMS (cinza claro) e TCTFPS (vermelho) por 15, 30, 60, 120 e 240 min. ............................................................................................................................ 152 Figura 2.31 – Fotografia mostrando a interação da solução aquosa de corante com o papel hidrofóbico tratado (esquerda) e com o papel hidrofílico não tratado (direita). ........... 153 Figura 2.32 – Curva analítica para (a) trembolona (5 – 1000 ng mL-1), (b) clembuterol (1 – 1000 ng mL-1), (c) furosemida (50 - 25 x 103 ng mL-1) e hidroclorotiazida (50 - 25 x 103 ng mL-1). Quantificação do analito foi realizada pela análise do íon produto via tandem MS-CID: trembolona (m/z 271 → 227), clembuterol (m/z 277 → 203), furosemida (m/z 329 → 285) e hidroclorotiazida (m/z 296 → 269). A barra de erro representa o desvio padrão das análises de três réplicas em triângulos de papeis independentes. ........... 155 Figura 2.33 – Estabilidade da trembolona (1000 ng mL-1) em amostra de urina depositada sobre o papel hidrofóbico tratado com TCMS (linhas azul e vermelha) e papel hidrofílico não-tratado (linhas azul escuro e laranja) estocados por 25 dias a temperatura ambiente (linhas vermelha e laranja) e a 4°C (linhas azul e azul escuro). A barra de erro representa o desvio padrão das análises de três réplicas em triângulos de papeis independentes. .......................................................................................................... 158 Figura 2.34 – Estabilidade da clembuterol (1000 ng mL-1) em amostra de urina depositada sobre o papel hidrofóbico tratado com TCMS (linhas azul e vermelha) e papel hidrofílico não-tratado (linhas azul escuro e laranja) estocados por 25 dias a temperatura ambiente (linhas vermelha e laranja) e a 4°C (linhas azul e azul escuro). A barra de erro representa o desvio padrão das análises de três réplicas em triângulos de papeis independentes. .......................................................................................................... 158 Figura 2.35 – Estabilidade da furosemida (25 μg mL-1) em amostra de urina depositada sobre o papel hidrofóbico tratado com TCMS (linhas azul e vermelha) e papel hidrofílico não-tratado (linhas azul escuro e laranja) estocados por 25 dias a temperatura ambiente (linhas vermelha e laranja) e a 4°C (linhas azul e azul escuro). A barra de erro representa o desvio padrão das análises de três réplicas em triângulos de papeis independentes. .......................................................................................................... 159 Figura 2.36 – Estabilidade da hidroclorotiazida (25 μg mL-1) em amostra de urina depositada sobre o papel hidrofóbico tratado com TCMS (linhas azul e vermelha) e papel hidrofílico não-tratado (linhas azul escuro e laranja) estocados por 25 dias a temperatura ambiente (linhas vermelha e laranja) e a 4°C (linhas azul e azul escuro). A barra de erro representa o desvio padrão das análises de três réplicas em triângulos de papeis independentes. .......................................................................................................... 159 LISTA DE TABELAS Tabela 1.1 – Massa dos precursores tiramina e ácido cítrico monoidratado utilizados na otimização experimental da síntese dos CD................................................................. 52 Tabela 1.2 – Matriz do planejamento fatorial completo 2² e os resultados obtidos para cada experimento. CH2O2 = 50 x 10-6 mol L-1, CPox= 30 U mL-1, pH=6 e n=3. ......................... 60 Tabela 1.3 – Atribuição das bandas de absorção do FTIR para o ácido cítrico. ................... 69 Tabela 1.4 – Atribuição das bandas de absorção do FTIR para a tiramina. ......................... 70 Tabela 1.5 – Atribuição das bandas de absorção do FTIR para o CD. ................................ 71 Tabela 1.6 – Imagem da fluorescência do papel em função do tempo de abertura do obturador. .................................................................................................................... 78 Tabela 1.7 – Variação dos componentes de cor para o branco da reação e para uma amostra. CH2O2 = 10 x 10-6 mol L-1, Cperoxidase = 30 U mL-1. ............................................ 80 Tabela 1.8 – Determinação de glicose em amostras certificadas. ....................................... 83 Tabela 1.9 – Aplicação do método proposto em amostras de saliva. .................................. 89 Tabela 1.10 – Determinação de glicose em amostras certificadas. ..................................... 89 Tabela 1.11 – Aplicação do método proposto em amostras de saliva. ................................ 92 Tabela 1.12 – Determinação de lactato em amostras certificadas. ...................................... 93 Tabela 1.13 – Comparação de parâmetros do método proposto com metodologias descritas na literatura para a determinação de glicose. ............................................................... 94 Tabela 1.14 – Comparação de parâmetros do método proposto com metodologias descritas na literatura para a determinação de lactato. ............................................................... 95 Tabela 2.1 – Tensão superficial de diferentes solventes e misturas de acetotinitrila e água com diferentes frações molares. ................................................................................ 130 Tabela 2.2 – Matrizes dos planejamentos composto central para a furosemida e hidroclorotizida. Os níveis codificados dos fatores estão em frente aos valores reais utilizados para o planejamento. .................................................................................. 140 Tabela 2.3 – Matriz do planejamento composto central para a trembolona e clembuterol. Os níveis codificados dos fatores estão em frente aos valores reais utilizados para o planejamento. ............................................................................................................ 144 Tabela 2.4 – Propriedades físico-químicas dos solventes. ................................................ 148 Tabela 2.5 – Estimativa da energia de superfície dos papeis tratados por tempos diferentes utilizando TCMS e TCTFPS pelo método de bracketing. ........................................... 154 Tabela 2.6 – Faixa linear, transição, equação da regressão linear e coeficiente de determinação para as curvas analíticas de TREM, CLEM, FUR e HCT. .................... 155 Tabela 2.7 – Valores de LD, LQ, precisão inter-dia e recuperação para TREM, CLEM, FUR e HCT. ....................................................................................................................... 156 Tabela 2.8 – LD e LQ para TREM, CLEM, FUR e HCT em amostras de urina utilizando papel hidrofóbico tratado e papel hidrofílico não-tratado. ........................................... 157 Tabela 2.9 – Comparação de parâmetros do presente método com metodologias descritas na literatura para a determinação de trembolona. ...................................................... 161 Tabela 2.10 – Comparação de parâmetros do presente método com metodologias descritas na literatura para a determinação de clembuterol. ..................................................... 161 Tabela 2.11 – Comparação de parâmetros do presente método com metodologias descritas na literatura para a determinação de furosemida. ...................................................... 162 Tabela 2.12 – Comparação de parâmetros do presente método com metodologias descritas na literatura para a determinação de hidroclorotiazida. .............................................. 162 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS ε Absortividade molar; ∫ Integral do espectro de emissão; η Índice de refração; Φ Rendimento quântico; µPAD Dispositivo analítico microfluídico em papel, do inglês microfluidic paper- based analytical device; σ Deslocamento químico; λ Comprimento de onda; A Absorbância; AC Ácido cítrico; ACN Acetonitrila; AI Ionização ambiente, do inglês ambient ionization; Am Amostra; APCI Ionização química a pressão atmosférica, do inglês atmospheric pressure chemical ionization; ASAP Atmospheric pressure solid analysis probe; AuNP Nanopartículas de ouro; b Caminho ótico B Componente de cor azul; B0 Campo magnético externo; C Concentração; CBS Coated blade spray; CD Ponto quântico de carbono, do inglês carbon dot; CI Ionização química, do inglês chemical ionization; CID Dissociação induzida por colisão, do inglês collision induced dissociation; CLEM Clembuterol; d Dubleto; DAPPI Desorption atmospheric pressure photoionization; DART Direct analysis in real-time; DC Corrente contínua, do inglês direct current; DESI Desorption electrospray ionization; EASI Easy ambient sonic-spray ionization; EI Ionização por elétrons, do inglês eléctron ionization; ESI Ionização por electrospray, do inglês electrospray ionization; F/F0 Razão entre a intensidade de fluorescência da amostra e do branco (supressão); FI Força iônica; FUR Furosemida; FTIR Infravermelho com transformada de Fourier, do inglês Fourier transform infrared; G Componente de cor verde; GC Cromatografia gasosa, do inglês gas chromatography; GOx Glicose oxidase; HCT Hidroclorotiazida; I Intensidade da amostra; I0 Intensidade do branco; IA Intensidade absoluta; IEM Modelo da evaporação do íon, do inglês ion evaporation model; IR Infravermelho, do inglês, infrared; IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry; LASER Light amplification by stimulated emission of radiation; LC Cromatografia líquida, do inglês liquid chromatography; LD Limite de detecção; LIT Linear ion trap; LLE Extração líquido-líquido, do inglês liquid-liquid extraction; LOx Lactato oxidase; LTP Low temperature plasma; LTQ Linear quadrupole ion trap; LQ Limite de Quantificação; MALDI Matrix-assisted laser desorption-ionization; MCP Placa de microcanais, do inglês microchannel plate; MIP Polímero molecularmente impresso, do inglês molecular imprinted polymer; MMIPs-d Superparamagnetic molecularly imprinted polymers; MOF Estrutura metalorgânicas, do inglês metal-organic framework; MRPL Nível mínimo de desempenho exigido, do inglês minimum required performance levels; MS Espectrometria de massas, do inglês mass spectrometry; MSn Espectrometria de massas de múltiplos estágios; m/z Razão massa-carga; nanoDESI Nanospray desorption electrospray ionization; nESI Nano electrospray ionization; NMR Ressonância magnética nuclear, do inglês nuclear magnetic resonance; NP Nanopartícula; OPP-API Open port probe-ambient pressure ionization; PNQC Programa Nacional de Controle de Qualidade; Pox Peroxidase; PS Paper-spray; PTFE Politetrafluoroetileno; PVC Policloreto de vinila; PVDF Fluoreto de polivinilideno; QD Ponto quântico, do inglês, quantum dot; R Componente de cor vermelho; RSD Desvio padrão relativo, do inglês relative standard deviation; S0 Estado eletrônico fundamental; Sn Estado eletrônico excitado singleto; SPE Extração em fase sólido, do inglês solid phase extraction; SPME Microextração em fase sólida, do inglês solid phase microextraction; t Tripleto; TI Ionização térmica, do inglês termal ionization; Tn Estado eletrônico excitado tripleto; TC Temperatura do capilar; TCMS Triclorometilsilano TCTFPS Tricloro(3, 3, 3-trifluoropropil)silano; TEM Microscopia eletrônica de transmissão, do inglês transmission electron microscopy; TIR Tiramina; TOF Time-of-flight; TREM Trembolona; SBAC Sociedade Brasileira de Análises Clínicas; SD Desvio padrão, do inglês standard deviation; UV-Vis Ultravioleta-visível; VSSA Área de superfície específica do volume, do inglês volume specific surface área; VTL Voltagem do tube lens; WADA Agência Mundial Anit-doping, do inglês World Anti-doping Agency; WHO Organização Mundial da Saúde, do inglês World Health Organization; x̅ Valor médio SUMÁRIO PREFÁCIO ....................................................................................................... 24 Capítulo 1......................................................................................................... 25 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 26 1.1. Nanotecnologia e nanomaterial ............................................................ 26 1.1.1. Nanopartículas e pontos quânticos .................................................. 29 1.1.2. Métodos para síntese de nanopartículas ......................................... 31 1.2. Caracterização das nanopartículas ...................................................... 34 1.2.1. Espectroscopia de absorção no UV-Vis ........................................... 34 1.2.2. Espectroscopia de fluorescência ..................................................... 35 1.2.3. Espectroscopia de absorção no infravermelho ................................ 38 1.2.4. Espectroscopia de ressonância magnética nuclear ......................... 38 1.2.5. Microscopia eletrônica de transmissão ............................................ 39 1.3. Microfluídica em papel ......................................................................... 39 1.4. Detecção via imagem digital ................................................................ 43 1.4.1. Métodos de calibração ..................................................................... 44 1.5. Análise de compostos de interesse clínico ........................................... 45 1.5.1. Glicose ............................................................................................. 46 1.5.2. Lactato ............................................................................................. 46 2. OBJETIVOS ................................................................................................. 48 3. PARTE EXPERIMENTAL ............................................................................. 49 3.1. Equipamentos ...................................................................................... 49 3.2. Reagentes ............................................................................................ 50 3.3. Soluções .............................................................................................. 51 3.3.1. Soluções gerais ............................................................................... 51 3.3.2. Soluções estoque dos analitos ........................................................ 51 3.3.3. Soluções para síntese dos CD ......................................................... 51 3.3.4. Dispersão estoque de CD ................................................................ 52 3.3.5. Soluções para a otimização da concentração do reagente.............. 52 3.3.6. Reagente fluorescente para dispositivo de adição de padrão .......... 52 3.3.7. Reagente fluorescente para dispositivo 3D-μPAD ........................... 53 3.3.8. Amostras certificadas ....................................................................... 53 4. METODOLOGIAS ........................................................................................ 54 4.1. Síntese dos CD .................................................................................... 54 4.2. Otimização da síntese de CD ............................................................... 54 4.3. Calibração da potência do forno de micro-ondas ................................. 54 4.4. Caracterização do CD .......................................................................... 55 4.5. Spot-test para adição de padrão .......................................................... 55 4.6. Dispositivo analítico microfluídico 3D em papel (3D-µPAD) ................. 56 4.7. Detecção por imagens digitais ............................................................. 58 4.8. Coleta e filtragem de amostra de saliva ............................................... 58 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................... 60 5.1. Planejamento fatorial para as condições da síntese ............................ 60 5.2. Otimização da síntese dos CD ............................................................. 61 5.3. Caracterização do CD .......................................................................... 62 5.3.1. Espectro de absorção ...................................................................... 62 5.3.2. Espectro de emissão e excitação .................................................... 63 5.3.3. Rendimento quântico ....................................................................... 66 5.3.4. Efeito da variação de pH .................................................................. 67 5.3.5. Variação da força iônica do meio ..................................................... 67 5.3.6. Espectroscopia de absorção no infravermelho ................................ 68 5.3.7. Espectroscopia de ressonância magnética de 1H ............................ 72 5.3.8. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) ................................. 75 5.3.9. Supressores ..................................................................................... 75 5.4. Calibração da detecção de fluorescência por imagem digital .............. 77 5.4.1. Fluorescência do papel .................................................................... 77 5.4.2. Detecção por imagem digital em fluorimetria ................................... 78 5.5. Detecção por imagem digital – sensibilidade dos canais ..................... 80 5.6. Otimização da concentração da dispersão de trabalho de CD ............ 80 5.7. Curvas de adição de padrão ................................................................ 82 5.7.1. Construção das curvas de adição de padrão ................................... 82 5.7.2. Validação do método ....................................................................... 83 5.8. Dispositivo analítico microfluídico 3D em papel (3D-µPAD) ................. 84 5.8.1. Volume utilizado no 3D-µPAD .......................................................... 84 5.9. Determinação de glicose ...................................................................... 86 5.9.1. Especificidade da reação ................................................................. 86 5.9.2. Curva analítica ................................................................................. 87 5.9.3. Aplicação em amostra de saliva ...................................................... 88 5.9.4. Adição de padrão e recuperação ..................................................... 89 5.9.5. Aplicação em amostras certificadas de soro .................................... 89 5.10. Determinação de lactato ...................................................................... 90 5.10.1. Especificidade da reação ................................................................. 90 5.10.2. Curva analítica ................................................................................. 91 5.10.3. Aplicação em amostra de saliva ...................................................... 92 5.10.4. Adição de padrão e recuperação ..................................................... 92 5.10.5. Aplicação em amostras certificadas de soro .................................... 92 5.11. Comparação de metodologias ............................................................. 93 6. CONCLUSÕES ............................................................................................ 97 7. PERSPECTIVAS FUTURAS ........................................................................ 98 REFERÊNCIAS ................................................................................................ 99 Capítulo 2....................................................................................................... 106 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................... 107 1.1. Espectrometria de massas ................................................................. 107 1.2. Métodos de ionização para espectrometria de massas ..................... 108 1.2.1. Ionização ambiente em espectroscopia de massas ....................... 110 1.2.2. Paper-spray mass spectrometry .................................................... 110 1.3. Analisador de massas linear ion trap ................................................. 113 1.4. Doping esportivo ................................................................................ 115 1.4.1. A lista proibida ............................................................................... 116 1.4.2. Agentes anabólicos ........................................................................ 118 1.4.2.1. Trembolona .................................................................................. 118 1.4.2.2. Clembuterol.................................................................................. 119 1.4.3. Diuréticos e agentes mascarantes ................................................. 120 1.4.3.1. Furosemida .................................................................................. 121 1.4.3.2. Hidroclorotiazida .......................................................................... 121 1.4.4. A detecção do doping .................................................................... 122 2. OBJETIVOS ............................................................................................... 124 3. PARTE EXPERIMENTAL ........................................................................... 125 3.1. Equipamentos .................................................................................... 125 3.2. Reagentes .......................................................................................... 125 3.3. Solução .............................................................................................. 126 3.3.1. Solução padrão estoque de trembolona ........................................ 126 3.3.2. Amostras de urina .......................................................................... 126 3.3.3. Soluções para as curvas analíticas ................................................ 126 4. METODOLOGIAS ...................................................................................... 127 4.1. Produção dos triângulos de papel ...................................................... 127 4.2. Silanização do papel .......................................................................... 127 4.3. Espectrometria de massas ................................................................. 127 4.4. Experimento utilizando paper-spray ionization mass spectrometry .... 129 4.5. Estimativa da energia de superfície utilizando método de bracketing 129 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................. 131 5.1. Silanização do papel .......................................................................... 131 5.2. Análise via PS-MS e caracterização estrutural dos analitos alvo ....... 132 5.2.1. Trembolona utilizando PS-MS no modo íon positivo ..................... 132 5.2.2. Clembuterol utilizando PS-MS no modo íon positivo ..................... 133 5.2.3. Furosemida utilizando PS-MS no modo íon negativo .................... 135 5.2.4. Hidroclorotiazida utilizando PS-MS no modo íon negativo............. 137 5.3. Otimização das variáveis ................................................................... 139 5.3.1. Voltagem do tube lens e temperatura do capilar ............................ 139 5.3.2. Solvente do spray .......................................................................... 146 5.3.3. Voltagem da fonte .......................................................................... 149 5.3.4. Tratamento do papel hidrofóbico ................................................... 149 5.4. Análise direta de substâncias dopantes em amostras de urina ......... 154 5.5. Estabilidade utilizando plataformas de papel ..................................... 157 5.6. Comparação de metodologias ........................................................... 160 6. CONCLUSÕES .......................................................................................... 164 7. PERSPECTIVAS FUTURAS ...................................................................... 165 REFERÊNCIA ................................................................................................. 166 24 PREFÁCIO Esta tese foi dividida em dois capítulos. O capítulo 1 aborda a síntese de carbon dots para a análise de compostos de interesse clínico utilizando dispositivos analíticos microfluídicos em papel e detecção fluorimétrica por imagem digital. O capítulo 2 abrange a modificação de plataformas de papel para a detecção direta de substâncias dopantes através da ionização por paper-spray e detecção por espectrometria de massas. 25 Capítulo 1 DESENVOLVIMENTO DE DISPOSITIVO ANALÍTICO MICROFLUÍDICO EM PAPEL PARA ANÁLISES DE INTERESSE CLÍNICO COM DETECÇÃO POR FLUORESCÊNCIA 26 1. INTRODUÇÃO 1.1. Nanotecnologia e nanomaterial O conceito de nanotecnologia foi utilizado pela primeira vez em 1959 pelo físico americano Dr. Richard Feynman na palestra “There's Plenty of Room at the Bottom”, proferida na conferência da American Physical Society at the California Institute of Technology em Pasadena, California (FEYNMAN, 1992), embora o termo nanotecnologia só tenha sido empregado pela primeira vez apenas em 1974 pelo Dr. Norio Taniguchi (CORBETT et al., 2000). Atualmente sua definição mais utilizada é: ciência multidisciplinar que engloba atividades científicas e tecnológicas na escala nanométrica, ou seja, inclui materiais de comprimento entre 1 e 100 nm em pelo menos uma dimensão (NAGARAJAN, 2008). A Figura 1.1 ilustra a comparação entre diferentes estruturas a fim de facilitar a comparação entre suas dimensões. Figura 1.1 – Comparação das dimensões de diferentes estruturas. Fonte: Disponível em https://nanomateriais.wordpress.com/nanomateriais/. A Comissão Europeia define nanomaterial como material natural, acidental ou fabricado que contém partículas, em um estado não ligado, como um agregado ou como um aglomerado e em que, para 50% ou mais das partículas na distribuição de tamanho, uma ou mais dimensões externas está na faixa de tamanhos de 1 nm – 27 100 nm (EUROPEAN COMMISSION, 2011). Kreyling e coautores propuseram uma nova definição para nanomateriais: um material particulado é um nanomaterial se tiver uma área de superfície específica do volume (VSSA) igual ou superior a 60 m2 cm-3 de volume do material (KREYLING; SEMMLER-BEHNKE; CHAUDHRY, 2010). Há divergências no significado do que é um nanomaterial pois a definição não é direta, não há um embasamento científico sólido em uma dimensão de corte para a classificação de um material como nano ou não (KREYLING; SEMMLER-BEHNKE; CHAUDHRY, 2010; “Nanomaterials definition matters”, 2019). Essa dificuldade ocorre pois um nanomaterial é muito mais do que somente diminuir o tamanho de um material, para cada composto suas propriedades que distinguem uma amostra em nanoescala de seu correspondente não-nanométricos ocorrem em tamanhos diferentes; a transição raramente é abrupta e as propriedades evoluem do bulk para nanoescala de maneira contínua (“Nanomaterials definition matters”, 2019). Devido ao seu tamanho reduzido, os nanomateriais apresentam características físico-químicas próprias, com propriedades eletrônicas, óticas, químicas e mecânicas diferentes dos materiais em bulk (LOPEZ-SERRANO et al., 2014). Com isso, abre-se a possibilidade de criar novos materiais, com novas propriedades e possibilidade de aplicação que podem ser sintetizados por meio do controle do tamanho e da forma das partículas desses materiais (ZARBIN, 2007). As novas propriedades físico-químicas dos materiais nanométricos estão associadas aos efeitos de superfície e efeitos quânticos. Com a diminuição do tamanho de um material a fração de átomos que ficam na superfície do material aumenta, ou seja, a razão área superficial/volume aumenta. Esses átomos da superfície apresentam menos vizinhos do que átomos do bulk, por isso seus números de coordenação e ligações são menores, levando a uma menor estabilidade e diferentes propriedades quando comparados aos componentes do bulk. Em nanomateriais, como é o caso das nanopartículas, o número de átomos presentes na superfície é comparável com o número de átomos no bulk, tornando as propriedades da superfícies dominantes e alterando as propriedades do material (HENRY, 2007; RODUNER, 2006; ZARBIN, 2007) As bases do confinamento quântico podem ser explicadas pelo modelo quântico da partícula na caixa. Esse efeito é observado quando o tamanho da partícula é pequeno o suficiente e comparável com o comprimento de onda de De Boglie. 28 Assim, os elétrons ou éxcitons (par elétron-buraco) são tratados quanticamente como partículas na caixa, onde o tamanho da caixa é dado pelas dimensões da partícula. Como consequência, para os nanomateriais seus níveis de energia vão ser estruturados em níveis discretos de energia, com o band gap crescendo de maneira proporcional ao decréscimo do tamanho da partícula, como ilustra a Figura 1.2. Os níveis eletrônicos de energia de um átomo são discretos e bem definidos, ao contrário dos níveis eletrônicos de um sólido cristalino que são bandas difusas de energia. Com a diminuição das dimensões dos sólidos, por exemplo, em um semicondutor, há um aumento entre os níveis de energia, sendo que para nanocristais, a densidade dos níveis eletrônicos de energia varia entre os estados atômico e de bulk (ALIVISATOS, 1997; RODUNER, 2006). Figura 1.2 – Níveis de energia de um átomo até o bulk de um mesmo material. Fonte: Adaptado de Alivisatos (ALIVISATOS, 1997). Nesses pouco mais de meio século de estudo, a nanotecnologia tem crescido rapidamente, apresentando diversos avanços em diferentes áreas da ciência e da tecnologia. É um dos setores da tecnologia com maior crescimento e com elevado impacto econômico, visto que já está sendo utilizada em artigos esportivos, pneus, roupas resistentes a manchas, cosméticos, protetores solares (NEL et al., 2006), tintas, eletrônicos e revestimentos (LOPEZ-SERRANO et al., 2014). Outros produtos também estão em desenvolvimento para utilização em catálise (BELACHEW; MESHESHA; BASAVAIAH, 2019), sensores (TOKUYAMA; KITAMURA; SEIDA, 2020), células de combustível (KIRUBAHARAN et al., 2019), medicina (NGUYEN et al., 2019), drug delivery (IMPERIALE et al., 2019), e em análises clínicas (CAO et al., 2019) de alimentos (DONG, B. et al., 2019) e ambientais (MING et al., 2019). E Átomo Molécula Nanocristal Bulk p s sp 3 σ σ* Egap 29 1.1.1. Nanopartículas e pontos quânticos As nanopartículas (NPs) são um importante componente da nanotecnologia e dos nanomateriais podendo ser classificadas em materiais à base de carbono (fulereno, nanotubo de carbono e grafeno), compostos inorgânicos (óxidos de zinco, ferro, cério, titânio, entre outros), metais (ouro, prata e ferro) e pontos quânticos inorgânicos (seleneto de cádmio e telureto de cádmio) e de carbono (CAYUELA et al., 2016; JU-NAM; LEAD, 2008). Os pontos quânticos, QD, do inglês quantum dots, também conhecidos como semicondutores nanocristalinos, são aglomerados cristalinos monodispersos capazes de emitir radiação na região do visível quando excitados com radiação eletromagnética de maior energia que a emitida, e apresentam dimensões físicas menores do que o raio de Bohr do bulk-éxciton, ou seja, a distância de um par elétron- buraco (FRIGERIO et al., 2012). O termo quantum dot foi utilizado pela primeira vez em 1988 por Mark Reed e coautores para se referir à NP de semicondutores. Sua luminescência é causada pela excitação de um elétron com auxílio da radiação eletromagnética, formando um par elétron-buraco, ou éxciton, que é fortemente confinado devido ao diminuto tamanho do QD (MACHADO et al., 2015). As aplicações de QD vão desde células solares (XING et al., 2020) a aplicações em medicina (YU, G. et al., 2019) e análises ambientais (ZHANG et al., 2019). Métodos luminescentes são utilizados para determinações quantitativas de espécies orgânicas e inorgânicas e são interessantes devido à sua detectabilidade, que frequentemente apresentam limites de detecção até três ordens de grandeza menores que obtidos por espectroscopia de absorção molecular. Ao mesmo tempo, medidas de luminescência são seletivas e apresentam grande faixa linear de concentração Por exemplo, detectores que utilizam a espectroscopia de absorção molecular podem apresentar limites de detecção de 10 pg e faixas lineares entre 3 e 4 décadas, enquanto que detectores por luminescência podem apresentar limites de detecção de 10 fg e faixas lineares de até 5 décadas (HOLLER; SKOOG; CROUCH, 2009). Dessa forma, plataformas fluorescentes vêm ganhando importância devido a sua fácil utilização, alta seletividade e alta detectabilidade (LI, P. et al., 2014). Os quantum dots mais comuns são sintetizados com compostos das famílias 12 e 16 (CdSe), 13 e 15 (InP) ou 14 e 16 (PbSe) (FRIGERIO et al., 2012). Porém, os 30 compostos com maior desempenho apresentam metais potencialmente tóxicos, como cádmio, em sua composição (DONG, Y. et al., 2012), o que limita suas aplicações principalmente para análises in vivo (FOWLEY et al., 2012), podendo conferir risco ao usuário, ao operador e ao meio ambiente, não estando de acordo com os princípios da Química Verde (ANASTAS, P. T.; WARNER, 1998). Dessa forma, a descoberta de nanopartículas fluorescentes derivadas de nanotubos de carbono por Xu e coautores em 2004 (Xu et al., (2004), apresentou uma nova classe de QDs, conhecida como pontos quânticos de carbono, ou do inglês carbon dots (CD) (MACHADO et al., 2015). Os CDs apresentam características semelhantes aos QDs inorgânicos tradicionais, tais como luminescência dependente do tamanho, resistência a fotodegradação e facilidade de bioconjugação, com a vantagem de não apresentarem toxicidade intrínseca de seus constituintes e não necessitarem de etapas de síntese laboriosas, tediosas, caras ou ineficientes (BAKER; BAKER, 2010). Também, devido aos grupos polares na superfície, como carboxila e hidroxila, por exemplo, possuem boa solubilidade em solventes polares (MIRTCHEV et al., 2012), o que torna os CDs aplicáveis em bioanálises. Essas vantagens dos CDs frente aos QDs fizeram com que um aumento no interesse nessa tecnologia ocorresse nos últimos anos. Um levantamento bibliográfico foi realizado dos dados sobre o uso de CDs em inúmeras aplicações para a produção de trabalhos científicos em revistas de maior circulação. A Figura 1.3 apresenta o número de trabalhos publicados com CDs em função do ano, considerando o período de 2004 a 2019. 31 Figura 1.3 – Levantamento do número de publicações de trabalhos relativos à carbon dot em função do ano, no período de 2004 a 2019, feito utilizando a plataforma Scifinder® utilizando a palavra carbon dot. Fonte: Elaborada pelo autor. 1.1.2. Métodos para síntese de nanopartículas Existem diversos métodos para a síntese de nanopartículas, porém essas rotas sintéticas podem ser agrupadas em duas grandes abordagens: top-down e bottom-up (Figura 1.4). O método top-down baseia-se na produção de NPs a partir de compostos maiores em bulk por meio de métodos físicos ou químicos, tais como fotolitografia (GAO, 2004; JU-NAM; LEAD, 2008), descarga de arco voltaico, tratamento por plasma, ablação a laser, síntese hidrotérmica, oxidação química e síntese eletroquímica (LIU, M. L.; CHEN; LI, 2019; WU; LIU; HUAN, 2017) . Os materiais de partida mais comuns para a síntese de CD via métodos top-down são carbono em pó, nanotubos ou fibras de carbono, grafeno e colunas de carbono, ou seja, compostos maiores de carbono (WU; LIU; HUAN, 2017). 2 0 0 4 2 0 0 5 2 0 0 6 2 0 0 7 2 0 0 8 2 0 0 9 2 0 1 0 2 0 1 1 2 0 1 2 2 0 1 3 2 0 1 4 2 0 1 5 2 0 1 6 2 0 1 7 2 0 1 8 2 0 1 9 0 250 500 750 1000 1250 N ú m e ro d e p u b li c a ç õ e s Ano (1) (1) (2) (0) (0) 32 Figura 1.4 – Estratégias top-down e bottom-up para síntese de nanopartículas. Fonte: Adaptada de Ju-Nam (JU-NAM; LEAD, 2008). Para a síntese bottom-up compostos moleculares são utilizados como materiais de partida. Nesse caso, os precursores agem como “sementes” para que a formação dos CDs sob condições específicas, através da nucleação e crescimento (JU-NAM; LEAD, 2008; LIU, M. L.; CHEN; LI, 2019; WU; LIU; HUAN, 2017). Para que esses precursores moleculares formem os CDs é necessário fornecer energia para o sistema por meio de combustão, aquecimento hidrotérmico, pirólise térmica ou micro-ondas (WU; LIU; HUAN, 2017). A síntese de CDs utilizando os métodos bottom-up pode utilizar as mais diversas fontes de carbono, tais como substância orgânicas na sua forma pura, como ácido cítrico, sacarose, glicose, frutose e glicerina (COSTAS-MORA et al., 2015), e outras como folhas de bambu (LIU, Y.; ZHAO; ZHANG, 2014) e alho (CHEN, Y. et al., 2016). Além dos diferentes precursores, frequentemente são utilizados dopantes, tais como compostos que contenham nitrogênio e enxofre em sua composição, modificando as propriedades dos CDs, tornando as características mais interessantes e aumentando a emissão de radiação das nanopartículas (RECKMEIER et al., 2016). A rota sintética top-down envolve um processo não seletivo que não permite controle preciso sobre o tamanho e a distribuição morfológica das nanopartículas. Porém, oferece uma oportunidade para a exploração da fotoluminescência dos CDs devido à diversificação de tamanho e estado da superfície (WU; LIU; HUAN, 2017) e formam CDs com excelentes propriedades fotofísicas (CHOI et al., 2018). Contudo, essas rotas envolvem maior gasto de energia, geram mais resíduos do que o método bottom-up, podem utilizar materiais de partida caros e frequentemente necessitam de uma etapa de passivação da superfície da NP para aumentar sua luminescência (CAYUELA et al., 2016). As técnicas de bottom-up são de mais simples implementação e utilização, pois empregam condições mais brandas de síntese 0,1 nm 1 nm 10 nm 100 nm 1 mμ 10 mμ 100 mμ 1 mm Síntese top-down Síntese bottom-up 33 (CHOI et al., 2018), apresentam altos rendimentos e custos menores, evitam rotas complicadas e longas, formam diretamente CDs luminescentes devido a presença de grupos superficiais de emissão ativos (CAYUELA et al., 2016), são métodos de síntese ambientalmente mais amigáveis (LIU, M. L.; CHEN; LI, 2019) e uma larga gama de precursores estão disponíveis para serem utilizados (CHOI et al., 2018). O desenvolvimento dos nanomateriais trouxe inúmeros benefícios para a área da ciência e da engenharia. Com a descoberta de novas tecnologias foi possível criar novos produtos e aprimorar ou criar novos procedimentos (LIU, M. L.; CHEN; LI, 2019). As rotas tradicionais de síntese de NPs, tais como os CDs, geralmente necessitam de rotas laboriosas com diversas etapas, consumindo grandes quantidades de energia, empregando altas temperaturas, consumindo muito tempo e utilizando reagentes químicos e solventes tóxicos, os quais além de aumentar o custo da produção, produzem grandes quantidades de resíduos que podem ser perigosos para o ambiente e ao operador (ANASTAS, P. T.; WARNER, 1998; ANASTAS, Paul T.; KIRCHHOFF, 2002; LIU, M. L.; CHEN; LI, 2019; SANGAM et al., 2018). Atualmente, rotas ambientalmente mais amigáveis que utilizam precursores seguros e renováveis estão ganhando a atenção dos pesquisadores (SANGAM et al., 2018). Com isso as rotas sintéticas bottom-up ganharam maior importância, pois podem utilizar precursores mais baratos e renováveis. Além disso, empregam condições reacionais mais brandas e ambientalmente mais amigáveis quando comparadas com as rotas top-down (CAYUELA et al., 2016; CHOI et al., 2018; LIU, M. L.; CHEN; LI, 2019), tais como reações auto-exotérmica (CHEN, B. Bin et al., 2017), catálise básica (LIU, M. L. et al., 2017), métodos redutores (LINEHAN; DOYLE, 2014) e aquecimento por micro-ondas (WANG, Hai-jiao et al., 2019). Métodos de síntese bottom-up utilizando aquecimento por micro-ondas apresentam simultaneamente aquecimento eficiente e homogêneo, menor número de etapas, permitem altas taxas de reação e reduzem drasticamente o tempo de síntese para apenas alguns minutos, o que reduz reações secundárias e formação de subprodutos (DE MEDEIROS et al., 2019). Dessa maneira, é considerado a abordagem mais simples e rápida dentre todas as utilizadas para a síntese de CD e, portanto, tem sido amplamente empregadas para a preparação de CDs (LIU, M. L.; CHEN; LI, 2019). 34 1.2. Caracterização das nanopartículas A seguir são descritas as técnicas utilizadas para a caracterização das nanopartículas de carbono sintetizadas no presente trabalho. 1.2.1. Espectroscopia de absorção no UV-Vis A espectroscopia de absorção é uma técnica utilizada na química analítica para identificar ou quantificar substâncias por meio da interação da radiação eletromagnética na região do UV-Visível com a matéria. Ao incidir uma radiação UV- Vis em uma solução de determinada molécula, por exemplo, essa radiação fornece energia suficiente para que os elétrons mais externos dessa molécula sejam excitados de um nível eletrônico de mais baixa energia para níveis eletrônicos excitados de maior energia, essas transições ocorrem em comprimentos de onda da radiação com energia igual a diferença entre os níveis eletrônicos; além de transições eletrônicas, os elétrons podem apresentar transições vibracionais e rotacionais que formam o espectro de absorção (SKOOG; HOLLER; WEST, 2006). Quando uma radiação na região do UV-Vis incide em uma determinada molécula que é capaz de absorver algumas frequências, há um decréscimo na intensidade da radiação incidente que pode ser descrito pela razão das potências da radiação transmitida e incidente, ou a transmitância da luz. Assim, a absorbância de determinada substância é relacionada com a concentração e as propriedades dessa substância por meio da Lei de Lambert-Beer (SKOOG; HOLLER; WEST, 2006), na qual A é a absorbância, ε a absortividade molar da substância, b o caminho ótico e C a concentração da solução: A = εbC Equação 1.1 Um espectrofotômetro básico para medidas no UV-Vis é constituído de uma fonte para fornecer a radiação incidente, monocromadores para selecionar comprimentos de onda de interesse, o compartimento de amostra e o detector para medir a radiação transmitida. A geometria utilizada em espectrofotômetros é linear, ou seja, entre a fonte, amostra e detector forma-se um ângulo de 180° (CHRISTIAN; DASGUPTA; SCHUG, 2014b). 35 1.2.2. Espectroscopia de fluorescência Luminescência é o fenômeno ótico que ocorre quando determinada substância (sólida, líquida ou gasosa) é excitada eletronicamente e no seu retorno para o estado fundamental libera energia na forma de fótons, emitindo radiação em determinado comprimento de onda (SKOOG; HOLLER; WEST, 2006). Quando essa excitação do elétron ocorre devido à absorção de energia proveniente de uma radiação eletromagnética, esse fenômeno é conhecido como fotoluminescência. Fotoluminescência é tradicionalmente dividida em duas categorias: a fluorescência e a fosforescência, diferindo na natureza do estados eletrônicos excitado (LAKOWICZ, 2006). Para melhor compreender a fotoluminescência é preciso entender dois fenômenos físicos distintos: a absorção de energia pela matéria e a consequente relaxação. A molécula absorve energia através da radiação eletromagnética e é transformada de um estado fundamental (S0) para um estado excitado (Sn ou Tn). Essa energia absorvida é quantizada e corresponde à diferença de energia entre esses dois estados, ou seja, a promoção do elétron não ocorre se a energia da radiação eletromagnética excitante for menor que a energia entre as diferenças dos estados eletrônicos fundamental e excitado. Também, podem ocorrer transições vibracionais dentro dos estados eletrônicos como resultado da absorção de energia (SZABO, 2000). No estado fundamental os elétrons se encontram emparelhados (estado fundamental singleto, S0, Figura 1.5a), de acordo com o princípio da exclusão de Pauli, que diz que dois elétrons não podem apresentar os mesmos quatro números quânticos, ou seja, somente dois elétrons podem ocupar um orbital e devem ter spins contrários. Se no estado excitado o spin do elétron promovido ainda estiver pareado com o estado fundamental, mantendo sua orientação inicial, tem-se o estado excitado singleto, Sn (Figura 1.5b). Caso contrário, se a orientação do elétron que foi promovido ao estado excitado for invertida, tem-se o estado excitado tripleto, Tn (Figura 1.5c) (HOLLER; SKOOG; CROUCH, 2009). 36 Figura 1.5 – Estados de spin dos elétrons das moléculas. Em (a) é representado o estado eletrônico fundamental singleto com os spins emparelhados. Em (b) e (c) são mostrados os estados eletrônicos excitados. Caso os spins estejam emparelhados no estado excitado, a molécula está no estado singleto (b). Se os spins estejam desemparelhados, a molécula está em um estado excitado tripleto (c). Fonte: Adaptada de Skoog (SKOOG; HOLLER; WEST, 2006). Uma molécula no estado excitado tende a relaxar para o estado fundamental que é configuração de menor energia e mais estável. A trajetória favorecida para o estado fundamental é aquela que minimiza o tempo de vida do estado excitado. Se o processo luminescente é mais rápido que os processos não radiativos, tal emissão será observada. Caso contrário, se a etapa não radiativa é mais rápida, a emissão será muito fraca ou não será observada. A Figura 1.6 representa o diagrama parcial de níveis para uma molécula hipotética e permite compreender quais são os processos relacionados à relaxação que ocorrem após a absorção de energia. A fluorescência ocorre quando a relaxação do sistema excitado singleto (S1) relaxa de modo radioativo diretamente para o estado fundamental (S0). A fosforescência acontece quando há o cruzamento de um sistema excitado singleto (S1) para um sistema excitado tripleto (T1) e a relaxação ocorre a partir desse sistema, esse cruzamento é conhecido como cruzamento intersistemas. O tempo de relaxação da fosforescência é maior que o tempo de relaxação da fluorescência, pois envolve uma mudança de spin para que haja o retorno ao estado fundamental. (a) (b) (c) 37 Figura 1.6 – Diagrama de níveis de energia, ou diagrama de Jablonski, de uma molécula hipotética. Fonte: Adaptada de Christian (CHRISTIAN; DASGUPTA; SCHUG, 2014a) Ao ser excitado do nível fundamental, o elétron pode ocupar qualquer nível vibracional de diferentes estados eletrônicos excitados (S1 e S2, por exemplo), porém, de acordo com a lei de Kasha, a emissão de fluorescência mais intensa é esperada que ocorra a partir do estado eletrônico excitado mais baixo (S1). Esse processo de relaxação até o nível de energia mais baixo, S1, ocorre por meio de relaxação vibracional e conversão interna (Figura 1.6). Devido aos processos de relaxamento não-radioativos, como o relaxamento vibracional, conversão interna e cruzamento intersistemas, a energia emitida no processo de relaxamento radioativo, seja ele fluorescência ou fosforescência, é sempre menor que a energia absorvida no processo de excitação dos elétrons. Isso implica que a radiação eletromagnética emitida apresenta sempre comprimento de onda maior, ou menor energia, do que a radiação de excitação (MONDAL; DIASPRO, 2014). Ao contrário do que ocorre com a espectroscopia de absorção, na espectroscopia de fluorescência as medidas são realizadas com um ângulo de 90° entre a fonte, o porta-amostra e o detector. Isso é necessário para que a radiação de excitação da fonte não interfira na detecção da radiação emitida. Isso é possível pois na fluorescência a radiação é emitida em todas as direções (CHRISTIAN; DASGUPTA; SCHUG, 2014a). 38 1.2.3. Espectroscopia de absorção no infravermelho Ao contrário da espectroscopia de absorção no UV-Vis e de fluorescência, na espectroscopia de absorção no infravermelho (IR) a energia envolvida não é suficientemente energética para promover a transição eletrônica, contudo, apresenta energia suficiente para promover transições vibracionais e rotacionais das ligações dos átomos de uma determinada molécula (SKOOG; HOLLER; WEST, 2006). Para a química, a região de interesse vai de 2,5 a 25 μm, ou 4000 a 400 cm-1, que representa a região vibracional do infravermelho (PAVIA et al., 2010b). Ao absorver a energia da radiação no infravermelho, a molécula é excitada para um estado vibracional de maior energia, aumentando a amplitude dos movimentos das ligações na molécula. No entanto apenas as ligações com momento de dipolo que altera em função do tempo são capazes de absorver radiação no infravermelho, dessa maneira, ligações simétricas não absorvem radiação na região do infravermelho (PAVIA et al., 2010b). Como o processo de absorção é quantizado, as moléculas absorvem apenas as energias com frequências específicas equivalentes às frequências vibracionais naturais da molécula. Como essas energias são específicas para cada tipo de ligação, a espectroscopia no infravermelho é utilizada para obter informações estruturais das ligações presentes em uma determinada molécula (PAVIA et al., 2010b). 1.2.4. Espectroscopia de ressonância magnética nuclear Na espectroscopia de absorção no infravermelho são obtidas informações quanto os tipos de grupos funcionais que estão presentes em determinada molécula, já a NMR fornece informações acerca do número de átomos magneticamente distintos do isótopo estudado (PAVIA et al., 2010a). A técnica de NMR utiliza as propriedades magnéticas dos núcleos dos átomos. Os núcleos atômicos apresentam uma propriedade chamada de spin e se possuírem número atômico ou massa atômica ímpar, o momento angular de spin e o momento magnético desses núcleos é diferente de zero, se alinhando na presença de um campo magnético externo (B0). O fenômeno de ressonância magnética nuclear ocorre quando os núcleos alinhados por B0 são induzidos a absorver energia e mudar a 39 orientação do spin em relação ao campo magnético aplicado. A energia absorvida é quantizada e corresponde à diferença de energia entre os dois estados de spin envolvidos. Núcleos ativos (¹H, ³¹P, 15N e ¹³C) absorvem radiação eletromagnética em uma frequência característica de cada isótopo. A frequência de ressonância, a energia da absorção e a intensidade do sinal são proporcionais à força do campo magnético. 1.2.5. Microscopia eletrônica de transmissão Microscópios eletrônicos são capazes de gerar imagens de materiais com resoluções e ampliações muito maiores do que microscópios óticos. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) é uma técnica muito útil para caracterização de materiais, revelando detalhes de morfologia, formato e dimensões. O arranjo ótico dos microscópios eletrônicos é similar ao dos microscópios óticos, porém, sua alta resolução é devido ao pequeno comprimento de onda dos elétrons utilizados como fonte de radiação, podendo alcançar resoluções de até 0,1 nm (LENG, 2013). Para formar uma imagem por TEM, os elétrons emitidos pela fonte são focados por lentes formando um feixe de elétrons antes de atingirem a amostra. Dependendo da densidade da área a ser varrida, alguns elétrons podem ser espalhados, enquanto outros são transmitidos através da amostra. Apenas elétrons transmitidos ou minimamente espalhados chegam ao detector. Regiões escuras nas imagens são formadas pois menos elétrons chegam ao detector devido a espessura e densidade da amostra ou da área analisada. A imagem é então formada como uma função da voltagem de aceleração, espessura da amostra e do material estudado (REGE; MEDINTZ, 2009). 1.3. Microfluídica em papel A utilização de papel na química não é nenhuma novidade. Além da filtração, o uso do papel na química iniciou-se com o papel de tornassol; datando do século XVIII, foi uma das primeiras formas de se utilizar o papel como uma plataforma para a realização de experimentos (DAVY, 1812). O primeiro teste popular empregando papel como plataforma originou-se na Inglaterra em 1883 para a análise de açúcar e albumina (VOSWINCKEL, 1994). A impregnação de papel com cera para a criação de 40 barreiras que impedissem reações cruzadas entre duas zonas foi proposto por Dieterich em 1902 (DIETERICH, 1902). Na década de 1920, o papel se difundiu como uma plataforma sólida utilizada por Fritz Feigl para a realização de reações de spot- test em determinações de substâncias orgânicas. Posteriormente, a primeira técnica de fabricação para a impregnação de parafina no papel com o propósito de criar zonas confinadas para reações de spot-test foi publicada em 1937 por Yagoda (YAGODA, 1937). Os indícios dos primeiros dispositivos microfluídicos em papel capazes de controlar o transporte de solução através de canais confinados apareceram em 1949 com o trabalho de Müller e co-autores em cromatografia de papel (MÜLLER; CLEGG, 1949). Ao mesmo tempo que ocorreram esses avanços, as tiras reagentes começaram a ser desenvolvidas na década de 1930, tornando-se comercialmente disponíveis em 1956 com o lançamento do Clinistix pela Ames Company, hoje Bayer Diagnostics (VOSWINCKEL, 1994). Apesar de todo o histórico do papel no campo da química, o surgimento e o crescimento do dispositivo analítico microfluídico em papel ocorreu em 2007 com o trabalho de Whitesides e colaboradores (MARTINEZ et al., 2007), como ilustra o levantamento bibliográfico realizado dos dados sobre o uso de μPAD em inúmeras aplicações para a produção de trabalhos científicos em revistas de maior circulação. A Figura 1.3 apresenta o número de trabalhos publicados com μPAD em função do ano, considerando o período de 2000 a 2019. Figura 1.7 – Levantamento do número de publicações de trabalhos relativos à μPAD em função do ano, no período de 2000 a 2019, feito utilizando a plataforma Scifinder® utilizando a palavra paper-based analytical device. Fonte: Elaborada pelo autor. 2 0 0 0 2 0 0 1 2 0 0 2 2 0 0 3 2 0 0 4 2 0 0 5 2 0 0 6 2 0 0 7 2 0 0 8 2 0 0 9 2 0 1 0 2 0 1 1 2 0 1 2 2 0 1 3 2 0 1 4 2 0 1 5 2 0 1 6 2 0 1 7 2 0 1 8 2 0 1 9 0 50 100 150 200 250 300 N ú m e ro d e p u b li c a ç õ e s Ano 41 Microfluídica é a parte da ciência e da tecnologia de sistemas que manipula e processa volumes reduzidos de fluidos utilizando canais com dimensões entre 10 e 100 μm. A microfluídica se originou e teve sua primeira aplicação no desenvolvimento de métodos microanalíticos devido a características como: baixo custo, separações e detecções com alta resolução e sensibilidade, utilização de pequenas quantidades de amostra e reagentes, e curtos tempos de análise (WHITESIDES, 2006). Quando um dispositivo microfluídico é confeccionado utilizando papel, conhecido como μPAD, combina-se a versatilidade da microfluídica com a simplicidade do papel (MARTINEZ et al., 2010). Resumidamente, o μPAD consiste na criação de barreiras hidrofóbicas que formam canais capazes de confinar os fluidos e controlar seu transporte para zonas desejadas. O μPAD apresenta baixo custo, compatibilidade com matrizes biológicas, baixo consumo de reagentes, é de fácil utilização, possibilita a integração de diferentes análises em um mesmo dispositivo e pode ser facilmente descartado por incineração, diminuindo o risco de contaminação biológico (YAMADA et al., 2017) (CATE et al., 2015). Além disso, o transporte de fluidos é controlado por capilaridade e evaporação e não necessita de uma fonte de energia externa (MARTINEZ et al., 2010). Na literatura estão descritos diversos métodos para a fabricação de barreiras hidrofóbicas. Na Figura 1.8 estão descritos 12 modos para a confecção de μPAD, na qual os itens de A à C representam a fabricação manual por (A) desenho com cera, (B) desenho ou estampagem com polímero e (C) estampagem com cera; nos itens D à F utilizam-se máscaras para proteger a região hidrofílica e formar as barreiras hidrofóbicas, sendo utilizada (D) imersão em cera, (E) fotolitografia e (F) serigrafia com cera; nos itens G à J utilizam-se impressoras que adicionam tinta usando a impressão com (G) tinta sólida à base de cera, (H) gravação com jato de cera e (I) impressão com jato de tinta. Outro modo de fabricação é o corte ou modelagem, representado em L e K, na qual são formados canais com o auxílio de (L) cortadores manuais ou (K) cortador a laser (CATE et al., 2015). 42 Figura 1.8 – Esquema dos diferentes modos para a confecção de barreiras hidrofóbicas. Fonte: Adaptada de Cate (CATE et al., 2015). A impressão com tinta sólida a base de cera (Figura 1.8 G) envolve duas etapas principais: primeiro o desenho desejado para o μPAD é impresso sobre a superfície do papel utilizando uma impressora com tinta à base de cera e, posteriormente, esse papel com cera depositada é aquecido para que haja o derretimento e permeação da cera pelas fibras do papel para formar as barreiras hidrofóbicas. Esse método apresenta uma série de vantagens em relação às outras metodologias de fabricação, tais como produção em larga escala, não necessita de tratamento do papel, o canal hidrofílico não é exposto a polímeros ou solventes, não são necessárias várias máscaras e pode-se criar canais abertos, semiabertos e fechados. Porém, também apresenta desvantagens como: o custo elevado da impressora e dos cartuchos de cera, a necessidade de uma etapa extra de aquecimento e perda de resolução das barreiras após o aquecimento (CARRILHO; MARTINEZ; WHITESIDES, 2009; CATE et al., 2015; LU et al., 2009). A Figura 1.9 ilustra os componentes da impressora com tinta sólida a base de cera da marca Xerox® e o modo como uma folha é impressa. 43 Figura 1.9 – (a) Detalhamento dos componentes de uma impressora com tinta à base de cera da marca Xerox®: 1) Display frontal, 2) Trajetória do papel, 3) Rolo de pressão para transferência, 4) Pré-aquecedor de papel, 5) Fusão da cera, 6) Reservatório de cera derretida, 7) Rolo de impressão, 8) Cabeça de impressão, 9) Kit de manutenção, 10) Reservatório de descarte, 11) Armazenamento de papel, 12) Armazenamento de cera sólida e 13) Conexões e saídas eletrônicas. (b) Esquema de como é feita a impressão utilizando a impressora com tinta à base de cera. Fonte: Adaptada de Jaeger (JAEGER, 2000). O processo de impressão de um desenho do computador usando cera pode ser resumido em três etapas: (i) O rolo do kit de manutenção limpa e aplica uma fina camada de silicone no rolo de impressão de alumínio anodizado, (ii) a cabeça de impressão aquecida (135°C) pulveriza gotas microscópicas de cera derretida no rolo de impressão rotativo com muita precisão. O rolo de impressão é mantido a uma temperatura intermediária (65°C) para manter a cera em um estado semissólido maleável. (iii) O papel a ser impresso é aquecido e passa sob pressão entre o rolo de pressão para transferência e o rolo de impressão. Sob calor e pressão, a imagem é transferida do rolo de impressão para o papel em uma única passagem. Quando o papel sai da impressora, a tinta está totalmente seca e a impressão está pronta para uso (JAEGER, 2000). 1.4. Detecção via imagem digital Ser capaz de quantificar e/ou identificar o analito de interesse é uma das etapas mais importantes da análise (CATE et al., 2015). A imagem digital é amplamente utilizada para a detecção qualitativa, semi-quantitativa e quantitativa em μPAD devido a sua simplicidade e baixo custo (MORBIOLI; MAZZU-NASCIMENTO; STOCKTON; et al., 2017). Ainda, com o desenvolvimento de novas tecnologias foi possível obter 44 equipamentos óticos digitais cada vez melhores com menor custo e integradas à internet como os smartphones, possibilitando a rápida troca de informações e dados mesmo que o paciente esteja a centenas de quilômetros de distância do médico ou do dentro de diagnóstico, por exemplo (BYRNE et al., 2000; MARTINEZ et al., 2008) A primeira descrição na literatura da utilização de imagem digital para detecção de analito foi realizada por Momeni em 1999 (MOMENI et al., 1999), na qual foi desenvolvido um sistema para detecção quimiluminescente da proteína ligada ao retinol. Porém, uma descrição mais aprofundada da utilização da imagem digital como detecção foi feita por Byrne em 2000 ((BYRNE et al., 2000). A detecção por imagem digital é baseada no tratamento gráfico usando softwares como Photoshop®, ImageJ® ou Gimp®. Esses programas transformam a informação física das cores do papel em linguagem binária que é interpretada pelo software e, como resultado, fornecem intensidades das cores que é relacionada com concentração da substância de interesse para determinações analíticas (MARTINEZ et al., 2008; PACIORNIK et al., 2006). 1.4.1. Métodos de calibração Em determinações quantitativas em plataformas de papel, seja ela utilizando técnicas colorimétricas, eletroquímicas ou fluorescentes, a calibração com padrão externo é o método de calibração