UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA INSTITUTO DE QUÍMICA CAMPUS DE ARARAQUARA GUILHERME JULIÃO ZOCOLO “Ocorrência de isoflavonas de soja no ambiente e correlação com atividade estrogênica: estudo de caso da região de Dourados (MS)” ARARAQUARA-SP 2010 Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 2 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA INSTITUTO DE QUÍMICA CAMPUS DE ARARAQUARA GUILHERME JULIÃO ZOCOLO “Ocorrência de isoflavonas de soja no ambiente e correlação com atividade estrogênica: estudo de caso da região de Dourados (MS)” Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho - UNESP, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Química. ORIENTADORA: PROFa. DRa. MARY ROSA RODRIGUES DE MARCHI ARARAQUARA-SP 2010 Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 3 FICHA CATALOGRÁFICA Zocolo, Guilherme Julião Z84o Ocorrência de isoflavonas de soja no ambiente e correlação com atividade estrogênica : estudo de caso da região de Dourados (MS) / Guilherme Julião Zocolo. – Araraquara : [s.n], 2010 185 f. : il. Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química Orientador: Mary Rosa Rodrigues De Marchi 1. Química analítica. 2. Química ambiental. 3. Fitoestrógenos. I. Título. Elaboração: Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação do Instituto de Química de Araraquara Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 4 Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 5 DADOS CURRICULARES DO AUTOR DADOS PESSOAIS Nome: Guilherme Julião Zocolo Filiação: Paulo Zanin Zocolo e Edelzia Julião Zocolo e-mail: gjzocolo@yahoo.com.br FORMAÇÃO ACADÊMICA/TITULAÇÃO 2006 - 2010 Doutorado em Química. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil. Bolsista da: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, FAPESP, Brasil. 2003 - 2006 Mestrado em Química. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil. Título: Determinação de Método para a Análise de substâncias sulfuradas em Petiveria alliacea L. Ano de obtenção: 2006. Orientador: Dr Alberto José Cavalheiro. Bolsista da: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES, Brasil. 1998 - 2003 Graduação em Química (Bacharelado e licenciatura). Universidade Federal de Viçosa, UFV, Minas Gerais, Brasil. Título: Análise de óxidos de ferro hematita e goethita por reflectância difusa na região do infravermelho. Orientador: Prof Dr. Antônio Augusto Neves. FORMAÇÃO COMPLEMENTAR 2008 – 2008 Curso Teórico e Prático Em LC – ESI - MS/MS. (Carga horária: 120h) Varian, VARIAN, São Paulo, Brasil. 2008 – 2008 Avaliação de Incerteza Em Química Analítica. (Carga horária: 24h) Rede Metrológica do Estado de São Paulo, REMESP, São Paulo, Brasil. 2002 – 2002 Extensão universitária em Química Forense. (Carga horária: 12h) Universidade Federal de Viçosa, UFV, Minas Gerais, Brasil. 2000 – 2000 Extensão universitária em RMN-Princípios e Aplicações. (Carga horária: 8h) Universidade Federal de Viçosa, UFV, Minas Gerais, Brasil. 1999 – 1999 Extensão universitária em Biofármacos e Fármacos. (Carga horária: 6h) Universidade Federal de Viçosa, UFV, Minas Gerais, Brasil. 1999 – 1999 Extensão universitária em Princípios de RMN. (Carga horária: 6h) Universidade Federal de Viçosa, UFV, Minas Gerais, Brasil. ATUAÇÃO PROFISSIONAL 2007 – 2007 Consultoria em Cromatografia Gasosa. (Carga horária: 40h) Centro Federal de Educação Tecnológica da Paraíba, CEFET/PB, Paraíba, Brasil. 2006-2007 Professor de Ciências Ciclo II inicial, ensino por 6 meses. 2003 – 2004 Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – UNESP. Vínculo institucional Vínculo: Outro, Enquadramento funcional: Representande dos alunos de Pós Graduação. Atividades 10/2003-10/2004 Conselhos, Comissões e Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 6 Consultoria. Cargos ou funções 1. Representante. 2003 – 2003 Colégio Anglo de Viçosa - CAV Vínculo institucional. Vínculo: Professor, Enquadramento funcional: Professor de química, Carga horária: 40. 2000 - 2001 Centro Acadêmico de Química – CA. Vínculo institucional: Coordenador Acadêmico, Carga horária: 10. 2000 – 2000 Análises Químicas Ambientais Rps Ltda – AQUA. Vínculo institucional: Estagiário, Carga horária: 60. PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA Artigos completos publicados em periódicos 1. ANDRADE, S. J.; CRISTALE, J.; SILVA, F. S.; ZOCOLO, G. J.; MARCHI, M. R. R. de. Contribution of sugar-cane harvesting season to atmospheric contamination by polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in Araraquara city, Southeast Brazil. Atmospheric Environment, v.44, p.2913-2919, 2010. 2. ZOCOLO, G. J.; SOUSA, A. C.; LOPES, M. N. T.; MARCHI, M. R. R. de. Determination of estrogens (estriol, �-estradiol, estrone and 17 �-ethynylestradiol) in river water from a rural area in Midwest Brazil. Toxicology Letters, v.196, p.S63- S63, 2010. 3. VILLANI, E. M. de A.; BARROS, N. F. de; NOVAIS, R. F.; MENDONÇA, E. de S.; ZOCOLO, G. J. Determinação de fósforo microbiano: comparação entre métodos e coberturas florestais. Revista Brasileira de Ciência do Solo (Impresso), v. 33, p.1061-1069, 2009. 4. RODRIGUES, Juliana; MICHELIN, Danielle Carvalho; RINALDO, Daniel; ZOCOLO, Guilherme Julião; DOS SANTOS, Lourdes Campaner; VILEGAS, Wagner; SALGADO, Hérida Regina Nunes. Antimicrobial Activity of Species (Melastomataceae). Journal of Medicinal Food, v.11, p.120-126, 2008. 5. SILVEIRA, Rodrigo D.; FARONI, Lêda R. A.; PIMENTEL, Marco A. G.; PETERNELLI, Luiz A.; ZOCOLO, Guilherme Julião. Eficácia biológica e persistência de bifentrina pulverizada em grãos de milho com diferentes temperaturas. Neotropical Entomology (Impresso), v.35, p.264-268, 2006. 6. SILVEIRA, Rodrigo Diniz; FARONI, Lêda Rita D'antonino; PIMENTEL, Marco Aurélio Guerra; ZOCOLO, Guilherme Julião. Influência da temperatura do milho, durante a pulverização, sobre a eficácia biológica da mistura de bifentrin e pirimifós metilico. Revista Brasileira de Armazenamento, 2005. Trabalhos completos em anais de eventos 1. ZOCOLO, Guilherme Julião, MARCHI, Mary Rosa Rodrigues de. ANÁLISE E SELEÇÃO DE BIOMARCADORES AMBIENTAIS (FITOESTRÓGENOS) EM PALHA DE SOJA USANDO LC-ESI-MS/MS In: XXXI CONGRESO INTERAMERICANO DE INGENIERÍA SANITARIA Y AMBIENTAL, 2008, Santiago. XXXI CONGRESO INTERAMERICANO DE INGENIERÍA SANITARIA Y AMBIENTAL. Santiago: 2008. Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 7 Resumos simples em anais de eventos 1. ZOCOLO, Guilherme Julião; MARCHI, Mary Rosa Rodrigues de DETERMINATION OF PHYTOESTROGENS (GENISTEIN AND DAIDZEIN) IN RIVER WATER FROM MIDWEST BRAZIL In: 1st Ibero-American Meeting on Toxicology and Environmental Health, 2009, Ribeirão Preto. 1st Ibero-American Meeting on Toxicology and Environmental Health. Ribeirão Preto: 2009. 2. PASCHOAL, F. M. M.; ZOCOLO, Guilherme Julião; MARCHI, Mary Rosa Rodrigues de; STRADIOTTO, N. R. Identificação e Quantificação dos Ácidos Graxos Presentes no Óleo de Tucumã. In: 17-Encontro da SBQ-Regional Interior Paulista Waldemar Saffiotti, 2009, Araraquara. 17-Encontro da SBQ-Regional Interior Paulista Waldemar Saffiotti , 2009. 3. ZOCOLO, Guilherme Julião; MARCHI, Mary Rosa Rodrigues de. Comparação de HPLC-UV e LC-MS/MS na análise de fitoestrógenos da soja In: 31° Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2008, Águas de Lindóia. 31° Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química. , 2008. 4. SPEROTO, J. S.; ZOCOLO, Guilherme Julião; MARCHI, Mary Rosa Rodrigues de; EVANGELISTA, R. C. Development and validation of HPLC methodology for analysis of isoflavones in crude extracts of soy (Glicine max (L) Merr.) In: XII COLACRO (Congresso Latino-Americano de Cromatografia e Técnicas Relacionadas), 2008, Florianópolis. XII COLACRO (Congresso Latino-Americano de Cromatografia e Técnicas Relacionadas). Florianópolis, 2008. 5. FRANCO, S.; ZOCOLO, Guilherme Julião; MARCHI, Mary Rosa Rodrigues de. OTIMIZAÇÃO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO PARA ANÁLISE DE DIURON E SEUS METABÓLITOS DE DEGRADAÇÃO POR HPLC-DAD. In: IV Encontro Nacional de Química Ambiental, Sergipe. IV Encontro Nacional de Química Ambiental. Sergipe, 2008. 6. ZOCOLO, Guilherme Julião; MARCHI, Mary Rosa Rodrigues de. Análise de Fitoestrógenos por HPLC-DAD: Limites de Detecção, Quantificação e Linearidade In: 14 Encontro Nacional de Química Analítica, 2007, João Pessoa. 14 Encontro Nacional de Química Analítica. João Pessoa, 2007. 7. ZOCOLO, Guilherme Julião; CAVALHEIRO, Alberto J.; BOLZANI, V. S.; MARCHI, Mary Rosa Rodrigues de; OLIVEIRA, J. E. Comparação da Análise Qualitativa de Substâncias Sulfuradas em Petiveria alliacea L In: II Congreso Iberoamericano Y IV Congreso Argentino de Química Analítica, 2007, Buenos Aires. II Congreso Iberoamericano Y IV Congreso Argentino de Química Analítica, 2007. 8. ZOCOLO, Guilherme Julião; BIZI, R. S.; GALVÃO, D.; SILVA, F. S., CRISTRALE, J.; MARCHI, Mary Rosa Rodrigues de. Desenvolvimento de Método em LC-ESI- MS/MS para a análise de Fitoestrógenos em Palha de Soja In: 2° Congresso Brasileiro de Espectrometria de Massas-BrMASS, 2007, Campinas. 2° Congresso Brasileiro de Espectrometria de Massas-BrMASS. Campinas, 2007. Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 8 9. SILVA, F. S.; CRISTRALE, J.; ZOCOLO, Guilherme Julião; MARCHI, Mary Rosa Rodrigues de. Determinação de Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (PAHs) por GC-MS/MS In: 2° Congresso Brasileiro de Espectrometria de Massas-BrMASS, 2007, Campinas. 2° Congresso Brasileiro de Espectrometria de Massas- BrMASS, 2007. 10. NASSER, A. L. M.; ZOCOLO, Guilherme Julião; SANTOS, L. C.; MARCHI, Mary Rosa Rodrigues de; VILEGAS, Wagner. Identification of the Triterpenes and Sterol Presents in Qualea Species by GC-MS In: 6° International Congress of Pharmeceutical Sciences, 2007, Ribeirão Preto. 6° International Congress of Pharmeceutical Sciences. Ribeirão Preto, 2007. 11. NAVICKIENE, H. D.; CARVALHO, L. R.; LAGO, J. H.; FURLAN, M.; CAVALHEIRO, Alberto J.; ALÉCIO, A. C.; ZOCOLO, Guilherme Julião, NUNES, J. M. C. TRITERPENIC COMPOUND CORROBORATES TAXONOMIC POSITION OF CHONDROPHYCUS FURCATUS (CERAMIALES, RHODOPHYTA) FROM BRAZIL In: XIX th International Seaweed Symposium, 2006, Kobe. XIX th International Seaweed Symposium, 2006. 12. ZOCOLO, Guilherme Julião; BANDEIRA, Karin F.; WANCZINSKI, Ana Elisa; TININIS, Aristeu G.; MARCHI, Mary Rosa Rodrigues de; CAVALHEIRO, Alberto J. Desenvolvimento de Método em CG-PFPD para Análise de Substâncias Sulfuradas em Petiveria alliacea L In: 13º Encontro Nacional de Química Analítica e 1ºCongresso Ibero -Americano de Química Analítica, 2005, Niterói. 13º Encontro Nacional de Química Analítica e 1ºCongresso Ibero -Americano de Química Analítica, 2005. 13. TININIS, Aristeu Gomes; PERES, Carla Cristina; ASSONUMA, Murilo; BANDEIRA, Karin; ZOCOLO, Guilherme Julião; CAVALHEIRO, Alberto J. Desenvolvimento, otimização e utilização de metodologia analítica cromatográfica para a análise de casearinas. In: 13º Encontro Nacional de Química Analítica e 1ºCongresso Ibero -Americano de Química Analítica, 2005, Niterói. 14. ZOCOLO, Guilherme Julião; MANTOVANI, Simone M.; PASCOLI, Inara C.; BANDEIRA, Karin F.; CAVALHEIRO, Alberto J. Novo ácido olefínico policíclico de frutos de Cryptocaria moscata. In: Sociedade Brasileira de Química, 2005, Poços de Caldas. 28º Reunião anual da SBQ, 2005. 15. BANDEIRA, Karin F.; TELASCREA, Marcelo; TININIS, Aristeu G.; ZOCOLO, Guilherme Julião; ASSONUMA, Murilo; CAVALHEIRO, Alberto J. Otimização de Condição Cromatográfica para Análise Simultânea de Acalóides, Flvonóides e Estirilpironas. In: 13º Encontro Nacional de Química Analítica e 1ºCongresso Ibero -Americano de Química Analítica, 2005, Niterói, 2005. 16. ZOCOLO, Guilherme Julião; WANCZINSKI, Ana Elisa; MARCHI, Mary Rosa Rodrigues de; VILEGAS, Wagner; BRITO, Alba Regina Souza M. Avaliação de alguns parâmetros de validação para a determinação de SCFAS In: 10º Congresso Latino Americano de Cromatografia e Técnicas Afins, 2004, Campos do Jordão. 10º Congresso Latino Americano de Cromatografia e Técnicas Afins, 2004. Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 9 17. ZOCOLO, Guilherme Julião; DARDENGO, Raquel Pellanda; RIBEIRO, Robson; BADJI, César Auguste; QUEIROZ, Maria Eliana Lopes de; NEVES, Antônio Augusto; GUEDES, Raul Narciso Carvalho. Degradação do piretróide deltametrina em amostra de solo tropical In: XII SIMPÓSIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 2002, Viçosa. XII SIMPÓSIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 2002. 18. ZOCOLO, Guilherme Julião; FARIA, Anisio Márcio de; QUEIROZ, Maria Eliana Lopes Ribeiro de; JORDÃO, Cláudio Pereira. Determinação de metais em água por espectrometria de absorsão atômica de chama ,empregando extração por surfactante In: XII SIMPÓSIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 2002, VIÇOSA., 2002. 19. ZOCOLO, Guilherme Julião; PIMENTEL, Marco Aurélio Guerra; FARONI, Lêda Rita D'antonino; SILVEIRA, Rodrigo Diniz; CARDOSO, Flávio. Efeito da temperatura do grão de milho no momento da pulverização sobre a eficácia biológica de pirimifos- etilíco, bifenthrin e da mistura deles In: XII SIMPÓSIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 2002, Viçosa. XII SIMPÓSIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 2002. 20. ZOCOLO, Guilherme Julião; BADJI, César Auguste; QUEIROZ, Maria Eliana Lopes Ribeiro de; GUEDES, Raul Narciso Carvalho; NEVES, Antônio Augusto. Extração de deltametrina em amostra de solo In: XV Encontro Regional da Sociedade Brasileira de Química-MG, 2002, Viçosa. XV Encontro Regional da Sociedade Brasileira de Química-MG, 2002. 21. ZOCOLO, Guilherme Julião; PIMENTEL, Marco Aurélio; QUEIROZ, Maria Eliana Lopes Ribeiro de; NEVES, Antônio Augusto; FARONI, Lêda Rita. Extração de deltametrina em amostras de milho In: XII SIMPÓSIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 2002, Viçosa. XII SIMPÓSIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 2002. 22. ZOCOLO, Guilherme Julião; QUEIROZ, Maria Eliana Lopes Ribeiro de; DINIZ, Rodrigo; NEVES, Antônio Augusto; FARONI, Lêda Rita D'antonino. Otimização da extração do piretróide bifentrin em amostras de milho In: XI SIMPÓSIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 2002, Viçosa. XI SIMPÓSIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 2002. 23. ZOCOLO, Guilherme Julião; PIMENTEL, Marco Aurélio; FARONI, Lêda Rita D'antonino; QUEIROS, Maria Eliana Lopes Ribeiro de. Persistência do inseticida deltamrteina aplicado em grãos de milho sob diferentes temperaturas do ar ambiente In: XII SIMPÓSIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 2002, Viçosa. XII SIMPÓSIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 2002 ORIENTAÇÕES FRANCO, Stephane. Otimização e validação de método para determinação de Diuron e seus metabólitos DCA e DCPMU em urina. Início:2007. Dissertação (Mestrado em Química) - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior. (Co-orientador). MANTOVANI, Simone M. Perfil fitoquímico de frutos e de plântulas de Cryptocarya moschata germinadas em condições de luz e substrato controladas. Início:2004, fim 2004. Monografia (Química) - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. (Co-orientador). Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 10 ESTÁGIO NO EXTERIOR Realizado no Instituto de Química de Alimentos da Universidade de Münster – Alemanha sob orientação do Prof. Dr. Hans-Ulrich Humpf (trabalhando com ESI- MS/MS - orbitrap alta resolução e também com sistemas ESI-MS/MS de baixa resolução). Além dos métodos espectrométricos trabalhei também com o teste biológico Pig cecum model que descreve a metabolização intestinal de flavonóides e outros metabólitos secundários. (Período: de setembro a dezembro de 2009). Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 11 Dedico esse trabalho a minha mãe, Edelzia Julião Zocolo (in memorian), que enxergou esse momento antes de todos. Obrigado por acreditar em mim, por me mostrar os caminhos da vida pela educação e por estar ao meu lado durante todas as adversidades, mesmo estando tão distante. Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 12 AGRADECIMENTOS A Deus pela vida. À Profa. Dra. Mary Rosa Rodrigues de Marchi por ter me dado tantas oportunidades e por ter acreditado e investido nos meus sonhos, por todo o conhecimento que adquiri nesse período tão importante, por ter dado a mim a chance de ser um ser humano melhor. Meu profundo agradecimento pela orientação, amizade, confiança, respeito e todo o aprendizado e crescimento que me foi proporcionado durante o doutorado. Mesmo que a palavra obrigado signifique tanto, não expressará por inteiro o valor da sua contribuição para minha formação. Ao Prof. Dr. Norberto Peporine Lopes da USP de Ribeirão Preto, que mesmo sem me conhecer, sem saber quem eu era me abriu as portas para uma das grandes experiências de minha vida, que foi realizar um estágio na Alemanha. Minha gratidão eterna. Registro aqui minha sincera admiração e apreço por essa grande pessoa e profissional muito especial. Ao Prof. Dr. Alberto José Cavalheiro que também acreditou em mim, me aceitando como aluno de mestrado sem também ter nenhuma referência ao meu respeito e por estar sempre pronto a me ajudar com seus conhecimentos, meu muito obrigado. À Profa. Dra. Eliana Varanda da Faculdade de Ciência Farmacêuticas da UNESP, Campus Araraquara, e sua equipe, em especial, Flávia Resende pela atenção, competência e disponibilidade do laboratório para realização dos testes de estrogenicidade (RYA). À Profa. Dra. Mara Nilza Teodoro Lopes da UFGD, por toda dedicação, atenção e apoio durante a realização das coletas em Dourados (MS). Ao Prof. Dr. Jonas da Silva Mota da UEMS, grande amigo, que sempre me ajudou, e agora mais uma vez no doutorado. Obrigado pela sua grande colaboração me recebendo em Dourados e cedendo seu laboratório. À Profa. Dra. Cláudia Andrea Lima Cardoso da UEMS pela disponibilização do laboratório para realização do processamento das amostras, muitíssimo obrigado por tudo. Ao Prof. Msc. Abramo Loro Neto da UFGD que teve uma participação fundamental na etapa de coleta de amostras disponibilizando o barco e conhecimento da região que foram estratégicos para a determinação correta das áreas de coleta, meu muito obrigado. Ao Prof. Dr. Hans-Ulrich Humpf por ter me acolhido tão bem no período em que morei na Alemanha, por ter disponibilizado toda a infra-estrutura possível para que eu realizasse meu trabalho, meu muito obrigado. À Profa. Dra. Marisa Spirandeli Crespi e suas valiosas contribuições dadas na qualificação e durante a realização do trabalho. À Profa. Dra. Maria Lúcia Ribeiro (Bilu) também por toda a valiosa colaboração dada na qualificação, meu muito obrigado. À Prof. Dra. Maria Eliana Lopes Ribeiro de Queiros e ao Prof. Dr. Antônio Augusto das Neves do Laboratório de Química Analítica da UFV, por todos os ensinamentos e pela oportunidade de começar a aprender como fazer Ciência. Obrigado. À FAPESP, pela bolsa concedida e todo apóio necessário para o desenvolvimento deste trabalho, inclusive o custeio de meu estágio na Alemanha no Instituto de Química de Alimentos de Münster. Ao DAAD (Deutscher AKademicher Austauschdienst–Serviço Alemão de Intercâmbio Acadêmico) também pela bolsa e pela oportunidade de estudar e aprender mais sobre ciência e sobre a tão rica cultura alemã. À FACTE pelo apoio financeiro na execução deste projeto. Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 13 Ao Programa de Pós-graduação em Química, bem como, a todos do Instituto de Química da UNESP–Araraquara (professores, equipe administrativa, bibliotecárias) pelo apoio e organização – parabéns pela excelência e qualidade. Ao Grupo do Professor Dr. Joan O. Grimalt, Dra. Silvia Lacort e Dr. Benjamin Piña do Consejo Superior de Investigaciones Científicas – CSIC em Barcelona. A Varian instrumentos analíticos que me forneceu gratuitamente um excelente treinamento na área de LC-MS/MS por um período de três semanas, meu muito obrigado. A todos os amigos do GRESCO e, meu muito obrigado em especial a grande amiga Stephane Franco por toda a colaboração e profissionalismo característicos, você sempre esteve presente e sempre pude contar com você. Aos meus queridos amigos José Antonio de Moura, Dayana Moscati, Flávio Soares Silva e Joyce Cristale, ao João Batista Gomes de Souza e Laudicéia Giacometti Lopes. Ao Luciano e Mariele Baratto, Eduardo e Cristiane Martins, Thiago Gianeti, Marcos e Bráulio amigos de todas as horas. Também aos amigos, Eduardo Canaver, Jéssica. Ao Grupo do Professor Dr. Hans-Ulrich Humpf Instituto de Química de Alimentos de Münster pelo acolhimento e apoio durante meu estágio, onde parte desse trabalho foi desenvolvido. Agradeço em especial a Florian Hubner, Gordon van’ t Slot, Anna Engemann, Benedikt Cramer, Nina Blaas, Henning Harrer, Tanja Welsch, acima de tudo pela amizade de todos. A banca examinadora deste trabalho pela disponibilização e contribuições. A minha namorada Vanessa, pela compreensão e apoio. Você é fundamental para minha vida. Sei que não foi fácil suportar toda minha rabugice própria de final de tese, te amo. A todos da minha família (Meu pai Paulo Zanin Zocolo, meu irmão David Julião Zocolo, minha querida prima Maríllia Altoé e Mauro Altoé, tias Nenzinha, Amália, Helena) pelo apoio, carinho e compreensão. Ao meu sogro e sogra Antônio Carlos Antonini e Maria Aparecida Lara Antonini, e cunhados Verônica, Mariane, Daniel pelo apoio, incentivo e confiança que sempre me foi depositada. A Sra. Marilei por ter desempenhado o seu trabalho de técnica do nosso laboratório com tanto carinho, responsabilidade e grande competência. Ao Vinícius da UFGD por todo apoio e ajuda na realização de coletas e extração, mesmo quando estive ausente do país. Aos grandes amigos que conquistei nesse período: José Antônio, Magno, Adriana Pimentel, Janaina Conrado, Juliana Severi, Dayana, Diógenes, Sônia Almeida, Evaneide, Adreia, Felipe, e todos os demais que direta ou indiretamente contribuíram para realização desse trabalho. Aos amigos da família Boseja (Carlinhos, Tucho, Marcelo, Liliane, Dona Nilde que me acolheram e ajudaram na minha adaptação quando cheguei a Araraquara). Ao apoio da empresa de Tratamento de Água e Esgoto de Araraquara - DAAE, que muito gentilmente nos apoiaram fornecendo amostras para este estudo de validação analítica, sem essa valiosa contribuição esse estudo seria inviabilizado. Aos trabalhadores brasileiros e do grande Estado de São Paulo que através do seu suor contribuem para que haja recursos, que diretamente financiaram esse e que financiam outros importantes trabalhos. Meu muito obrigado, meu sincero respeito a todos vocês. Espero que meu trabalho esteja à altura do que vocês representam. A gratidão é uma forma singular de reconhecimento e o reconhecimento é uma forma sincera de gratidão. Muito obrigado a todos. Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 14 “Não é a terra que constitui a riqueza das nações, e ninguém se convence de que a educação não tem preço". Rui Barbosa Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 15 RESUMO Esta tese apresenta o desenvolvimento e a validação de um procedimento analítico, que permite a quantificação simultânea de sete fitoestrógenos (alteradores endócrinos - AEs) em água de rio e água sub-superficial em uma área rural com grande produção de soja. Os compostos selecionados para este estudo foram (genistina - GENIS, daidzina - DAID, equol - EQ, daidzeína - DAI, a genisteína - GEN, formononetina - FOR e biochanina - A - BIO). Este método consiste na pré- concentração de amostras de água (1 L) em cartuchos Strata X de 200 mg, seguido por análise de todos as AEs por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por ultra - violeta (CLAE-UV). Do ponto de vista analítico, estabeleceu-se um método simples e de confiabilidade conhecida (exatidão, precisão, seletividade e robustez) para análise de sete fitoestrógenos de soja em água de rio e subsuperficial. Os limites de detecção e quantificação do método validado foram de 3,5 ng L-1 e 10 ng L-1 respectivamente para todas as moléculas estudadas e em ambas as matrizes. O método foi aplicado a amostras de água da região de Dourados (MS). Foram coletadas 92 amostras de água de rio e 16 de água sub- superficial, em quatro campanhas de amostragem ao longo de 1 ano. GENIS e DAID não foram detectadas em nenhuma das amostras. GEN e FOR foram os fitoestrógenos mais detectados, estando presentes em 50 e 34% das amostras, respectivamente. As concentrações individuais de fitoestrógenos situaram-se entre 12 e 1957 ng L-1, sendo que as maiores concentrações foram obtidas para o EQ e GEN para amostras coletadas em meses chuvosos na região de estudo. Amostras de água do rio Dourados e de água sub-superficial foram testadas para o efeito de alteração endócrina com o ensaio de levedura recombinante (RYA). O ponto de coleta de água sub-superficial (afloramento do lençol freático) apresentou altos valores de estrogenicidade de 0,35 e 0,50 ng L-1 de equivalente de estradiol nos meses de abril e agosto de 2009, respectivamente. Métodos quimiométricos de análise demonstraram uma boa correlação entre as concentrações de equol com a atividade estrogênica na primeira coleta (abril de 2009). De maneira geral a atividade estrogênica pode ser explicada pela contaminação por EQ na primeira coleta (período de safra de soja) e de 17� – estradiol na segunda coleta (período de entre- safra da soja, onde prevalece à pecuária), tendo como fonte de contaminação a excreta do gado neste período do ano. Propõe - se que esses contaminantes podem ser os principais fatores responsáveis pelo efeito estrogênico observado pelo teste RYA. No entanto, não se pode descartar o impacto das altas concentrações medidas nos demais pontos de coleta, pois a literatura relata para essas concentrações efeitos como intersex em peixes. Em suma, os resultados obtidos indicam que a plantação de soja é fonte de isoflavonas para água de rio e sub-superficial, que a estrogenicidade (medida pelo teste RYA) é significativa e que na época da safra correlaciona-se com as isoflavonas de soja, enquanto que na entre-safra é melhor explicada pelos hormônios estrogênicos presentes na excreta de animais. Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 16 ABSTRACT This thesis presents the development and validation of an analytical procedure that allows the simultaneous measurement of seven phytoestrogens (endocrine disrupters - EDs) in river water and water sub-surface in a rural area with large soybean production. The compounds selected for this study were (genistin - GENIS, daidzin - DAID, equol - EQ, daidzein - DAI, genistein - GEN, formononetin - FOR and biochanin - A - BIO). This method consists of preconcentration of water samples (1 L) on Strata X cartridges of 200 mg, followed by analysis of all EDs by high performance liquid chromatography with detection by ultra - violet (HPLC-UV). From the analytical point of view, it was established a simple and known for reliability (accuracy, precision, selectivity and robustness) for consideration of seven phytoestrogens in soy and river water sub-surface. The limits of detection and quantification of the validated method were 3.5 ng L-1 and 10 ng L-1 respectively for all the molecules studied on both matrices. The method was applied to water samples from the region of Dourados (MS). We collected 92 samples of river water and 16 sub-surface water in four sampling campaigns over 1 year. GENIS and DAID were not detected in any sample. The phytoestrogens FOR and GEN were detected in most cases, present in 50 and 34% of samples respectively. Individual concentrations of phytoestrogens were between 12 and 1957 ng L-1, and the highest concentrations were obtained EQ and GEN for samples collected in the rainy months in the study area. Samples of river water Dourados and sub-surface water were tested for the presence of endocrine changes with recombinant yeast assay (RYA). The point of collecting subsurface water (groundwater upwelling) showed high estrogenicity values of 0.35 and 0.50 ng L-1 equivalent of estradiol in the months of April and August 2009 respectively. Chemometric methods of analysis showed a good correlation observed between the concentrations of equol with estrogenic activity in the first sampling (April 2009). In general, the estrogenic activity can be explained by contamination with EQ in the first collection (from soybean crop) and 17� - estradiol in the second collection (period between harvests of soybean, where prevailing livestock), and as a source of contamination from the excreta of cattle at this time of year, suggesting that these contaminants may be the main factors responsible for estrogenic effects observed by the RYA test. However, we can not dismiss the impact of high concentrations measured in the other collection sites, since the literature reports for these purposes as intersex concentrations in fish. In summary, the results indicate that the planting of soybean is a source of isoflavones for river water and sub- surface, that the estrogenicity (measured by test RYA) is significant and that during harvest time correlates with soy isoflavones while in no harvests season is better explained by estrogenic hormones present in the excreta of animals. Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 17 LISTA DE FIGURAS Figura 1: Alterações endócrinas: (a) resposta natural, (b) Efeito agonista e (c) Efeito antagonista. Adaptado de SUMPTER, 1998. 32 Figura 2: Estruturas de alguns alteradores endócrinos 35 Figura 3: Estruturas de alguns fitoestrógenos. 38 Figura 4: Estruturas químicas do 17�-estradiol (E2) e das três principais isoflavonas encontradas na soja. 39 Figura 5: Evolução da produção de soja nos principais estados produtores, no Brasil (EMBRAPA SOJA, 2003). 54 Figura 6: Abrangência da cultura de soja no Brasil (EMBRAPA SOJA, 2003). 55 Figura 7: Curvas de decomposição no solo dos principais constituintes orgânicos vegetais. Adaptado de MINDERMAN et al. (1960). 57 Figura 8: a) Principais Bacias Hidrograficas Brasileiras; b) Detalhamento da Bacia do Rio Tietê. 58 Figura 9: Microbacia do Rio Dourados. 59 Figura 10: Distribuição espacial da precipitação média anual na Bacia do Rio Dourados,considerando o período de 1973 a 2002 60 Figura 11: Precipitação média mensal na área de drenagem da Bacia do Rio Dourados, considerando o período de 1973 a 2002 (PEREIRA et al., 2007). 61 Figura 12: Vazão média mensal na área de drenagem da Bacia do Rio Dourados, considerando o período de 1973 a 2002. (PEREIRA et al., 2007). 62 Figura13: Sistema de plantio direto (a) e palha de soja em processo de decomposição (b). 65 Figura 14: Isoflavonas estudadas. Genisteína e daidzeína (agliconas) e os outros dois glicosídeos, genistina e daidzina. 68 Figura 15: Sistema de extração da palha da soja. Solvente. A: Hexano, US: Ultrassom, solvente. B: ACN:/H2O (1:1). Método baseado na proposta de NEHME, 2001. 71 Figura 16: Visão geral e ampliada de todos os sítios de amostragem. O ponto A é correspondente à fazenda da UFGD, ponto de afloramento do lençol freático, e o ponto B aos pontos de coleta no Rio Dourados. 76 Figura 17: Local da realização das coletas de amostras de água, nos pontos do Rio Dourados (ponto B). 77 Figura 18: Local da realização da coleta de amostras de água de afloramento do lençol freático na fazenda da UFGD (ponto A). 77 Figura 19: Fotos dos sítios de coleta de amostras. 78 Figura 20: Procedimento utilizado na extração das amostras de água de rio. 79 Figura 21: Suporte desenvolvido para a utilização completa do Manifold. 79 Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 18 Figura 22: Espectros de Massas em full-Scan para os padões de: (A) genistina, (B) genisteina, (C) daidzeina, (D) daidzina. 83 Figura 23: (A) cromatograma de íons totais (TIC) e cromatogramas dos íons extraídos do TIC, adquiridos com a técnica de MRM. Os valores indicados nos picos cromatográficos ilustram os tempos de retenção dos padrões (B- E). 84 Figura 24: (A) Cromatograma (TIC) do extrato aquoso da palha da soja; cromatogramas dos íons extraídos (MRM) para a: (B) daidzeína: 252>208; (C) genisteína: 269>133; e (D) genistina 431>269. 85 Figura 25: Cromatograma injeção direta: (A) TIC do extrato aquoso da palha da soja; (B) Espectro de massas obtido por injeção direta do extrato aquoso da palha da soja e adquirido em modo negativo e em full-scan. 86 Figura 26: Cromatograma LC/MS dos íons monitorados das substâncias desconhecidas presentes no extrato aquoso da palha da soja: (A) TIC do extrato aquoso da palha da soja; Scan-ES- dos íons monitorados: (B) 431, (C) 227, (D) 241. (E) 253, (F) 255, (G) 269. 87 Figura 27: Cromatograma apresentando os canais dos íons extraídos (MRM) para as substâncias desconhecidas presentes no extrato aquoso da palha da soja. 88 Figura 28: (A) Espectros de Massas Full-Scan dos íons detectados no extrato aquoso da palha da soja: (B) m/z 286; (C) m/z 284; (D) m/z 282; (E) m/z 255; (F) m/z 242 Da. 88 Figura 29 A: Estrutura das isoflavonas utilizadas como padrões para análise do extrato aquoso da palha da soja por LC-MS/MS. 90 Figura 29 B: Proposta de estrutura das substâncias detectadas no extrato aquoso da palha da soja por LC-MS/MS. 90 Figura 30: Fragmentos propostos para a genistina MM 432 Da. Propostas de fragmentações baseadas em Wu et al., (2004). 93 Figura 31: Fragmentos propostos para a daidzeína MM 254 Da. Propostas de fragmentações baseadas em Wu et al., (2004). 94 Figura 32: Otimização da sensibilidade pelo ajuste da pressão do gás de nebulização da genisteína m/z –268,6 Da. 96 Figura 33: Otimização da sensibilidade pelo ajuste da pressão do gás de nebulização da genistina m/z – 431,2 Da 96 Figura 34: Otimização da sensibilidade pelo ajuste da pressão do gás de nebulização da daidzina m/z –415 Da 96 Figura 35: Otimização da sensibilidade pelo ajuste da pressão do gás de nebulização da daidzeína m/z – 252,4 Da 96 Figura 36: Teste de supressão iônica realizado com a injeção do extrato de palha de soja diluído em ACN/H2O (50:50). 97 Figura 37: Teste de supressão iônica realizado com a injeção do extrato de palha de soja enriquecida com padrões de isoflavonas a concentração de 1,0 μg mL- 1 em ACN/H2O (50:50). 97 Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 19 Figura 38: Daidzina m/z - 415 – energia de colisão 25,0 V. 98 Figura 39: Genistina m/z – 431,2 – energia de colisão 25 V. 98 Figura 40: Daidzeína m/z – 252,4 – energia de colisão 26,0 V. 98 Figura 41: Genisteína m/z – 268,6 – energia de colisão 27,0 V. 98 Figura 42: Cromatograma (LC-MS/MS) em sete concentrações diferentes dos fitoestrógenos estudados: genistina (tr= 4,650 min), daidzina (tr= 5,784 min), daidzeína (tr= 7,388 min) e genisteína (tr= 8,815 min). 99 Figura 43: Intervalo de linearidade da daidzina. 100 Figura 44: Curva analítica da daidzina. 100 Figura 45: Intervalo de linearidade da genistina. 101 Figura 46: Curva analítica da genistina. 101 Figura 47: Intervalo de linearidade da daidzeína. 101 Figura 48: Curva analítica da daidzeína. 102 Figura 49: Intervalo de linearidade da genisteína. 102 Figura 50: Curva de linearidade da genisteína. 102 Figura 51: Cromatogramas HPLC-UV/DAD para genisteína (20 μg mL-1) e daidzeína (15 μg mL-1) ambas a. Sistema de solvente ACN/H2O (10 a 65% ACN em 10 min). 104 Figura 52: Intervalo de linearidade da daidzeína 105 Figura 53: Curva analítica da daidzeína 105 Figura 54: Intervalo de linearidade da genisteína. 106 Figura 55: Curva analítica da genisteína. 106 Figura 56: Cromatograma (HPLC-UV) de padrões de daidzeína e genisteína injetados em concentrações iquais a 10 μg mL-1. 108 Figura 57: Gráfico de linearidade para genisteína no sistema LC920 Varian 109 Figura 58: Curva analítica para genisteína no sistema LC 920 Varian 109 Figura 59: Gráfico de linearidade para daidzeína no sistema LC 920 Varian 109 Figura 60: Curva analítica para daidzeína no sistema LC 920 Varian 110 Figura 61: Cromatogramas dos padrões (0,01 a 20 μg mL-1). Fitoestrógenos daidzina (tr= 5 min), genistina (tr= 6,8 min), daidzeína (tr= 10,64 min), equol (tr= 11,38 min), genisteína (tr= 12,38 min), formononetina (tr= 14,07 min) e biochanina A (tr= 15,36 min). 113 Figura 62: Intervalos de linearidade e curva de linearidade para as demais isoflavonas. 114 Figura 63: Estrutura química do sorvente Strata X 116 Figura 64: Cromatogramas que ilustram os melhores resultados de recuperação dos analitos. Testes realizados no sistema HPLC-UV-DAD. 118 Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 20 Figura 65: Comparação dos cromatogramas do branco, testemunha, padrão (1μg mL-1) e amostra enriquecida (350 ng L-1) . Análises efetuadas no sistema LC920, Varian. 119 Figura 66: Comparação dos cromatogramas do padrão (0,1 μg mL-1) e amostra enriquecida (35 ng L-1) com respectiva ampliação da região de interesse. Análises efetuadas no sistema LC920, Varian. 120 Figura 67: Comparação dos cromatogramas do padrão (0,05 μg mL-1) e amostra enriquecida (17,5 ng L-1) com respectiva ampliação da região de interesse. Análises efetuadas no sistema LC920, Varian. 121 Figura 68: Comparação dos cromatogramas do padrão (10 μg mL-1), branco, testemunha e amostras enriquecidas com os fitoestrogenos daidzina (tr= 5 min), genistina (tr= 6,8 min), daidzeína (tr= 10,64 min), equol (tr= 11,38 min), genisteína (tr= 12,38 min), formononetina (tr= 14,07 min) e biochanina A (tr= 15,36 min). 123 Figura 69: Nível de conservação para a daidzeína. 125 Figura 70: Nível de conservação para a genisteína. 126 Figura 71: Pontos de coleta de amostra nos anos de 2009 e 2010. 127 Figura 72: Sugestão para a distribuição ambiental das isoflavonas: os compartimentos na cor vermelha indicam o foco deste estudo. As linhas vermelhas pontilhadas: indicam onde a contaminação por isoflavonas provavelmente não ocorre. As linhas em verde e azul: não foram investigados principalmente porque se trata de um estudo em área rural (adaptado de HARTMANN et al, 2008). 128 Figura 73: Visão geral da contaminação por isoflavonas levando-se em consideração as concentrações das isoflavonas e os fatores sazonais envolvidos. 130 Figura 74: Taxas diárias de precipitação, evapotranspiração e temperaturas (Tmx =temperatura máxima,Tmn= temperatura mínima e Tmd= temperatura média) para o mês de abril de 2009 131 Figura 75: Taxas diárias de precipitação, evapotranspiração e temperaturas (Tmx =temperatura máxima, Tmn= temperatura mínima e Tmd= temperatura média) para o mês de agosto de 2009. 135 Figura 76: Taxas diárias de precipitação, evapotranspiração e temperaturas (Tmx =temperatura máxima, Tmn= temperatura mínima e Tmd= temperatura média) para o mês de dezembro de 2009 (MATO GROSSO DO SUL, 2009). 137 Figura 77: Taxas diárias de precipitação, evapotranspiração e temperaturas (Tmx =temperatura máxima, Tmn= temperatura mínima e Tmd= temperatura média) para o mês de abril de 2009 140 Figura 78: Dendograma da análise de cluster entre as amostras, ocorrendo o agrupamento das amostras coletadas em diferentes períodos. 143 Figura 79: Dendograma da análise de cluster entre as variáveis, ocorrendo o agrupamento das isoflavonas coletadas em diferentes períodos. 144 Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 21 Figura 80: Análise de componentes principais (PCA) entre as variáveis, análise da influência ambiental na disponibilização desses metabólitos no ambiente 145 Figura 81: Rotação varimax normalizada entre as variáveis, análise da influência ambiental na disponibilização desses metabólitos no ambiente. 147 Figura 82: Teste de estrogenicidade (RYA) para os quatro períodos de coleta. 148 Figura 83: Análise de componentes principais. As três PCs acumulam 73,43 % da variância explicada. 149 Figura 84: Rotação varimax normalizada extraída da análise de componentes principais (PCA) entre as variáveis, análise da influência ambiental na disponibilização desses metabólitos no ambiente. 151 Figura 85: Teste de estrogenicidade (RYA) para os quatro períodos de coleta. No eixo x log da concentração em ng L-1. 152 Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 22 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Atividades estrogênica/androgênica de fitoestrógenos em diferentes bioensaios (LIU, et al., 2009). 43 Tabela 2: Propriedades físico-químicas das principais isoflavonas (HOERGER et al., 2009) 48 Tabela 3: Fontes de contaminação por fitoestrógenos e respectivas concentrações 52 Tabela 4: Gradiente utilizado nas análises do extrato aquoso da palha da soja e dos padrões de isoflavonas 66 Tabela 5: Condições cromatográficas otimizadas 69 Tabela 6: Condições cromatográficas para os sistemas HPLC utilizados 72 Tabela 7: Condições de condicionamento e extração com a amostra acidificada 74 Tabela 8: Identificação dos pontos de coleta de amostras de água e sua correspondência nas Figuras 16 a 18 75 Tabela 9: LC-ESI-MS/MS: Transições monitoradas e condições utilizadas dos íons presentes nos padrões de isoflavonas e no extrato aquoso da palha da soja. 90 Tabela 10: ESI/MS/MS dos íons produtos da genistina e daidzeína 94 Tabela 11: Parâmetros de otimização de resposta no LC-MS/MS 95 Tabela 12: Limites de detecção, quantificação e coeficientes de correlação linear obtido a partir dos parâmetros das curvas analíticas para o sistema LC/MS- MS. 103 Tabela 13: Concentração de fitoestrógenos na palha de soja (n = 3). 103 Tabela 14: Limites de detecção, quantificação e coeficientes de correlação linear obtidos a partir dos parâmetros das curvas analíticas. Para o sistema HPLC- UV-DAD. 106 Tabela 15: Resposta dos sistemas analíticos (HPLC-UV e HPLC-UV-DAD). 111 Tabela 16: Resposta do sistema analítico (HPLC-UV). 115 Tabela 17: Valores de recuperação, precisão e exatidão (n= 3) obtidos para os dois sorventes, em ensaios com amostra de água superficial enriquecida. 117 Tabela 18: Recuperação média obtida a partir da análise de água de rio fortificada com os analitos (n=3). 122 Tabela 19: Comparação entre métodos descritos na literatura com método proposto para determinação de genisteína e daidzeína em água superficial. 125 Tabela 20: Rotação varimax normalizada. 146 Tabela 21: Rotação varimax normalizada. 150 Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 23 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AAE – afastado da margem AAQ – próximo à margem ACN – acetonitrila AEs – Alteradores endócrinos ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária APE – Alquilfenóis etoxilados AR – receptor androgênio ARCEM – “Austrian Research Cooperation on Endocrine Modulators BFP – bisfenol A BIO – biochanina – A C18 – Octadecil silano CG/MS – Cromatógrafo a gás acoplado a espectrômetro de massas CID – dissociação por colisão induzida COM – Community Strategy for Endocrine Disrupters COMPREHEND – Community Programme of Research on Endocrine CSTEE – Committee on Toxicity, Ecotoxicity and the Environment CV – coeficiente de variação Da – Dalton DAD – Detector por Arranjo de Diodos DAE – afastado da margem DAI – daidzeína DAID – daidzina DAQ – próximo à margem DDT – Dichloro Diphenyltrichloroethane - dicloro-difenil-tricloroetano DES – dietilestilbestrol E1 – Estrona E2 – Estradiol EC50 – Concentração de substância que causa efeito negativo mensurável em 50% da população teste EDs ou EDCs – Endocrine Disruptors - Alteradores Endócrinos EDSP – Environmental Disruptor Screening Program EDSTAC – Endocrine Disrupter Screening and Testing Advisory Committee EDTA – Endocrine Disrupter Testing and Assessment Task Force EE2 – Etinilestradiol EEQ – Equivalente grama de estradiol EEQ – equivalentes de estradiol EPA – environmental protection agency EQ – equol ESI – electrospray ETA – Estação de tratamento de água – WTP – water treatment plant ETE – Estação de tratamento de esgoto - WWTP – wastewater treatment plant FOR – formononetina. GEN – genisteína GENIS – genistina Glc – glicose GRESCO – Grupo de Estudo em Saúde e Contaminantes Orgânicos hAR – receptor humano de androgênio HCA – análise hierárquica por cluser Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 24 hER – receptor humano de estrogênio HPLC/FLU – Cromatografo líquido com detector de fluorescência HPLC – High Performance Liquid Chromatography INMETRO – Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial Kow – constante de partição octanol/água LC-MS/MS – Liquid chromatography-tandem mass spectrometry LD – limite de detecção Leu – leucina LQ – limite de quantificação m/z – relação carga massa MeOH – metanol MM – massa molecular MP – material particulado MRM – Multiple Reaction Monitoring MuGal – 4-metilumbeliferona b-D-galactopiranosídeo n.d – não detectado N.L – não ligante NITE – National Institute of Technology and Evaluation, Japan nm – nanômetros NP – nonilfenol NPE – Nonilfenol etoxilado PAE – afastado da margem PAQ – próximo à margem PCA – análise de componentes principais PCBs – bifenilaspolicloradas pKa – constante de dissociação ácida POP – Poluentes Orgânicos Persistentes rAR – receptor de androgênio do rato RBA – afinidade relativa de ligação RE – Receptores estrogênicos RGA – ensaio de gene RYA – Recombinant yeast assay - ensaio de levedura recombinante SD – desvio padrão SIM – Monitoramento de íon seletivo SPE – Solid-phase extraction - extração em fase sólida TBT – Tributilestanho Te – Testosterona TGEA – ensaio de expressão de gene transiente TGEA – ensaio de expressão do gene transiente TIC - cromatograma de íons totais Tmd – temperatura média Tmn – temperatura mínima Tmx – temperatura máxima TQ – Triplo quadrupolo tr – tempo de retenção UFGD – Universidade Federal da Grande Dourados Ura – uracila US – Ultrassom UV – detector de ultravioleta X – valor inicialmente encontrado da variável para cada amostra Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 25 Xm – valor médio da variável Z - valor padronizado da variável � - desvio padrão da variável na amostra. Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 26 SUMÁRIO 1 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 28 1.1 Alteradores endócrinos 29 1.1.2 O sistema endócrino 31 1.1.3 Alteradores endócrinos no ambiente 33 1.2 Estrógenos naturais e sintéticos 34 1.3 Fitoestrógenos e seus efeitos biológicos 36 1.4 Teste de estrogenicidade: RYA - Ensaio com levedura recombinante 44 1.5 Ocorrência e dispersão ambiental de fitoestrógenos 46 1.6 Produção de soja no Brasil (compilado de EMBRAPA SOJA, 2003; 2004). 52 1.6.1 A palha da soja e o plantio direto 55 1.7 A microbacia do Rio Dourados (MS) 57 2 Objetivos 63 3 Parte Experimental 64 3.1 Análise qualitativa do extrato aquoso da palha da soja 65 3.1.1 Preparo do extrato 65 3.1.2 Condições cromatográficas para o sistema LC-MS/MS 66 3.2 Análise quantitativa dos fitoestrógenos na palha de soja 67 3.2.1 Preparo das soluções padrão 68 3.2.2 Condições cromatográficas 68 3.2.3 Avaliação do desempenho de cada sistema cromatográfico 69 3.2.4 Preparo do extrato 70 3.3 Otimização e validação de método para análise das isoflavonas em água de rio e sub-superficial 71 3.3.1 Preparo das soluções padrão 71 3.3.2 Condições cromatográficas para o sistema HPLC-UV Varian LC 920 72 3.3.3 Estudo de recuperação – água superficial enriquecida com os padrões 72 3.3.4 Estudo da estabilidade da amostra 74 3.4. Estudo ambiental 75 3.4.1 Pontos de amostragem 75 3.4.2 Preparo das amostras ambientais 78 3.5 Testes de estrogenicidade - RYA (Recombinant Yeast Assay) 80 3.6 Avaliação estatística dos dados 81 4 Resultados e discussão 83 4.1 Estudo do perfil químico da palha da soja 83 4.2 Análise quantitativa dos fitoestrogenos da palha de soja 95 4.2.1 Otimização dos parâmetros para análise por LC/MS-MS 95 4.2.2 Avaliação do desempenho do sistema LC/MS-MS 99 4.2.3 Análise por LC - MS/MS de fitoestrógenos na palha de soja 103 4.3 Otimização e validação de método para análise das isoflavonas em água de rio e sub-superficial 104 4.3.1 Avaliação do desempenho do sistema HPLC-UV (LC-920, Varian) seleção do comprimento de onda para as análises por HPLC-UV-DAD 104 4.3.2 Avaliação do desempenho do sistema HPLC-UV-DAD 105 4.3.3 Resultados da avaliação do desempenho sistema HPLC-UV (LC-920, Varian) 107 Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 27 4.3.4 Avaliação do desempenho do novo sistema HPLC-UV para as demais isoflavonas. 112 4.3.5 Estudo de recuperação – água superficial enriquecida com os padrões 115 4.3.6 Estudo de conservação da amostra 125 4.4 Estudo ambiental: análises químicas e testes biológicos - Análise das amostras ambientais 126 4.4.1 Primeira coleta 130 4.4.2 Segunda coleta 134 4.4.3 Terceira coleta 137 4.4.4 Quarta coleta 139 4.5 Análises Multivariadas - Análise hierárquica por cluster 142 4.5.1 Análise de componentes principais 144 4.5.2 Testes de estrogenicidade (RYA) 147 4.5.3 Relevância ecotoxicologica 151 5 Conclusões 155 Referências 157 Apêndices 175 Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 28 1 Revisão bibliográfica Atualmente, as maiores preocupações relacionadas com a exposição dos ecossistemas aos alteradores endócrinos podem ser resumidas nas seguintes dúvidas: - se essas substâncias podem produzir efeitos tóxicos em baixas concentrações; - quais substâncias estão associadas aos efeitos tóxicos e se essas substâncias estão presentes em concentrações ambientalmente relevantes, para que possam ser uma ameaça à saúde de seres humanos e animais; - se existe uma concentração limiar abaixo da qual essas substâncias químicas podem ser consideradas como seguras; - se os novos tipos de ensaios, usados para prever os efeitos causados em organismos expostos, podem realmente fornecer ferramentas para o entendimento do mecanismo de ação dessas substâncias e, por fim, - se esses ensaios podem ser facilmente usados em larga escala para monitorar seus efeitos no meio ambiente. Várias são as substâncias que possuem a capacidade de afetar o sistema endócrino, tais como, as sintéticas (alquilfenóis, agrotóxicos, ftalatos, bifenilaspolicloradas (BFP), bisfenol A, substâncias farmacêuticas, dentre outras) e substâncias naturais (estrógenos e fitoestrógenos). O comportamento dos alteradores endócrinos nas estações de tratamento de esgoto (ETE), solo e sedimentos marinhos tem sido investigado, bem como, seu transporte e destino no meio ambiente (CLARA et al., 2004; COLUCCI; TOPP, 2001, COLUCCI et al., 2001). Constata-se que o conhecimento do destino e dos processos de transporte desses poluentes no meio ambiente é essencial para avaliar seus impactos potenciais no solo e nas águas naturais. Muitos grupos foram criados ao redor do mundo com o objetivo de avaliar a complexa situação dos alteradores endócrinos e são exemplos da crescente Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 29 preocupação mundial com essas substâncias. Diversos assuntos são abordados e investigados, tais como o monitoramento de substâncias estrogênicas em amostras de águas naturais (ARCEM – “Austrian Research Cooperation on Endocrine Modulators”); a validação dos métodos de ensaios que determinam as substâncias com potencial de alteração endócrina (EDSTAC – “Endocrine Disruptor Screening and Testing Advisory Committee”, EDTA – “Endocrine Disrupter Testing and Assessment Task Force”); a identificação e caracterização de todos os efeitos relatados (EDSP – “Environmental Disruptor Screening Program”; Programa COMPREHEND – “Community Programme of Research on Endocrine Disrupters and Environmental Hormones”; CSTEE – “Committee on Toxicity, Ecotoxicity and the Environment”); organização do conhecimento científico disponível sobre os alteradores endócrinos (SPEED’98/JEA – “Exogenous Endocrine Disrupting Chemical Task Force” e COM – “Community Strategy for Endocrine Disrupters”), dentre outros (BILA; DEZOTTI, 2007). 1.1 Alteradores endócrinos Animais e plantas possuem um sistema de controle do organismo baseados em mensageiros químicos, que regulam algumas funções, tais como: reprodução, crescimento e manutenção. Nos animais estes sistemas utilizam várias glândulas que produzem tais mensageiros químicos (hormônios), os quais são transportados pelo organismo. Embora existam similaridades entre as espécies (na utilização de hormônios), diferentes rotas evolutivas podem produzir complexas variações, resultando num sistema regulatório multifacetado. Sabe-se que certas moléculas podem interferir em rotas do sistema endócrino produzindo uma resposta indesejada, também chamada de alteração, a qual pode afetar a saúde, o crescimento e a reprodução de um grande número de organismos. Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 30 Essas substâncias são coletivamente conhecidas como alteradores endócrinos (AEs). A ocorrência e ação dos alteradores endócrinos (AEs) têm sido evidenciada desde o início do Século XX (DODDS et al.,1938), mas apenas recentemente, esse fenômeno tem emergido como um problema ambiental maior quanto aos efeitos sobre a saúde humana, gerando uma grande mobilização da comunidade científica do mundo todo e considerável interesse por parte da mídia. Durante as décadas de 1950 e 1960, o pesticida DDT foi usado amplamente em todo o mundo em vasta quantidade, apesar do fato de que já havia sido demonstrado o efeito estrogênico desse inseticida no sistema reprodutivo de mamíferos e pássaros (BURLINGTON; LINDEMAN.,1950; BITMAN et al.,1968). Esses compostos são altamente persistentes no meio ambiente e mesmo assim são usados até hoje em algumas partes do mundo. Essas descobertas foram publicadas em 1962, no livro de Rachel Carlson (1962) “Primavera Silenciosa”, que expôs ao mundo os problemas de saúde que estavam ocorrendo em animais (tais como: deformidades, declínio populacional, etc), os quais foram relacionados à exposição dos animais a agrotóxicos e outras substâncias químicas sintéticas. Pesquisas têm indicado que a exposição precoce a hormônios pode produzir graves efeitos à saúde, tais como câncer em populações de jovens e adultos (DUNN; GREEN., 1963; TAKASUGI; BERN., 1964; FORESBERG., 1969). Um exemplo das conseqüências devastadoras da exposição aos alteradores endócrinos foi o uso de uma potente droga: o dietilestilbestrol (DES), um estrógeno sintético. Antes de ser banido no início da década de 1970, médicos prescreveram DES para mais de cinco milhões de gestantes com o objetivo de conter abortos espontâneos. O DES foi prescrito com base na crença equivocada de que este evitaria o aborto e contribuiria para o crescimento fetal. As crianças que resistiram Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 31 aos efeitos abortivos do DES vieram a sofrer suas conseqüências na puberdade, quando muitas delas foram diagnosticadas com problemas de desenvolvimento do sistema reprodutivo, causando principalmente, câncer vaginal (HERBST et al., 1971, HERBST et al., 1975; GILL et al., 1976). Essas descobertas foram reforçadas por estudos em laboratório, os quais confirmaram que o DES provocava um desenvolvimento anormal em culturas de células do sistema reprodutivo de machos e fêmeas (McLACHLAN et al., 1975, 1980). As conseqüências da exposição ao DES são bem conhecidas (MELNICK et al., 1987). Kaufman et al. (2000) mostraram que as mães expostas ao DES possuíam maiores chances de terem problemas relacionados a nascimentos prematuros, abortos espontâneos e uma longa lista de efeitos deletérios no sistema reprodutivo. 1.1.2 O sistema endócrino Organismos multicelulares necessitam de sistemas que regulem e integrem o funcionamento de diferentes células. Os dois sistemas responsáveis por essas funções são: o sistema nervoso e o sistema endócrino. Sendo o último crucial para plantas e animais por ser responsável pelo crescimento, reprodução, manutenção, homeostase e metabolismo (ENVIRONMENTAL..., 1997). O sistema endócrino é constituído de muitas glândulas em diferentes áreas do organismo que produzem hormônios com diferentes funções (GRIFFIN; OJEDA, 1996). As glândulas do sistema endócrino são o hipotálamo, a pituitária, a tireóide, a paratireóide, as glândulas adrenais e as gônadas. Os hormônios sintetizados por essas glândulas são transportados pela corrente sangüínea e seus alvos no organismo são os locais onde exista a necessidade de uma resposta natural. Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 32 Essas células contêm sítios de ligação (receptores) e sítios ativos (COLBORN et al., 1993). Quando os hormônios atacam o receptor, o sítio ativo é alterado produzindo a resposta desejada. Algumas moléculas hormonais “livres” nunca alcançarão os receptores e são inativadas a priori por excreção, realizada pelos rins num processo chamado de “limpeza metabólica”. Esse processo varia com o tipo de hormônio, mas o “tempo de vida” efetivo dos hormônios no corpo varia entre minutos e horas. Portanto, se a taxa de limpeza é baixa, o hormônio permanecerá no corpo por um longo período e poderá interagir com mais receptores, resultando em uma resposta mais intensa. Além disso, quando os AEs estão presentes, os mecanismos de limpeza metabólica podem não ser realizados, levando a persistência e a bioacumulação dessas moléculas no corpo. A maior parte dos AEs são pequenas moléculas que mimetizam ou antagonizam hormônios (Figura 1) como esteróides ou hormônios da tireóide (SUMPTER, 1998). Eles podem perturbar a ação de hormônios naturais responsáveis pelos processos de regulação homeostática e do desenvolvimento reprodutivo (SADIK; WITT, 1999). Figura 1: Alterações endócrinas: (a) resposta natural, (b) Efeito agonista e (c) Efeito antagonista. Adaptado de SUMPTER, 1998. Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 33 1.1.3 Alteradores endócrinos no ambiente Talvez um dos exemplos mais representativos da atuação dos alteradores endócrinos na vida selvagem seja o uso do tributilestanho (TBT), como um componente antiincrustante presente na tinta que é usada nos cascos de embarcações (HERBST et al., 1975; MORA, 1996). Foi comprovado que esse composto possui propriedades androgênicas resultando na masculinização de fêmeas de moluscos (GIBBS; BRYAN, 1996), erradicando quase toda a população de algumas espécies dessa classe de organismos no Mediterrâneo. Os efeitos nas populações de ostras nas águas francesas também foram severos, levando o governo francês a criar uma legislação específica em 1982, restringindo a aplicação das formulações em embarcações maiores que 25 metros (ALZEIU, 1991). Em 1987, essa regulamentação foi seguida pelos Estados Unidos, pelo Reino Unido e outros países da União Européia. Desde então a presença de organoestânicos no meio ambiente (DOWSON; BUBB; LESTER, 1992; DOWSON et al., 1992) vem sendo extensivamente estudada. Alternativamente, outros compostos antiincrustantes como os organocúpricos têm melhorado a eficácia na ação como antiincrustantes, exercendo um menor impacto ambiental, por serem usados em pequena escala (VOULVOULIS et al., 1999). Outro elucidativo estudo de alteradores endócrinos relacionados à vida selvagem foi realizado na Inglaterra e demonstrou o impacto de esteróides e substâncias estrogênicas (particularmente alquilfenóis) em peixes. Essas pesquisas apontaram para um grande número de estações de tratamento de esgoto cujos efluentes mostraram-se estrogênicos para peixes (PURDOM et al., 1994; SUMPTER; JOBLING, 1995; SHEAHAN et al., 2002). Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 34 Na literatura também se encontram relatos de alta prevalência de hermafroditismo em peixes e outros organismos que foram expostos a efluentes de estações de tratamento de esgoto (JOBLING et al., 1998). Existem, ainda, alguns estudos que indicam uma possível correlação de efeitos sobre o poder reprodutivo humano com a exposição aos AEs. Os efeitos estudados em seres humanos incluem principalmente, redução na qualidade e quantidade de esperma, bem como, o aumento no número de casos de câncer de testículos (HANDELSMAN, 2001; CARLSEN et al., 1992; SHARPE; SKAKKEBAEK, 1993; TOPPARI; SKAKKEBAEK, 2000). Existem ainda estudos que traçam um paralelo entre os efeitos estrogênicos sobre o sistema reprodutivo de animais selvagens desencadeados por poluentes tais como: agrotóxicos, estrógenos e surfactantes (FRY, 1995; MURK et al., 1996; GUILLETTE, et al., 1994; GUILLETTE, et al., 1996; JOBLING et al., 1998), com efeitos similares sobre os humanos (MATTHIESSEN, 2000). Uma publicação considerada marco da preocupação com os alteradores endócrinos ambientais é o livro “O Futuro Roubado” (COLBORN et al., 1996), o qual apresenta um grande conjunto de dados de alterações na vida selvagem e indica a possibilidade de que, tais alterações estivessem correlacionadas com a exposição a diversas classes de substâncias químicas, alertando para a possibilidade de esses mesmos efeitos atingirem o homem. 1.2 Estrógenos naturais e sintéticos Estrógenos, como todos os esteróides, possuem estrutura similar à do colesterol e seus derivados Figura 2. Os estrógenos esteróidais são caracterizados por seu anel fenólico-A, contendo uma hidroxila na posição 3, que é essencial para a atividade biológica. Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 35 Figura 2: Estruturas de alguns alteradores endócrinos O núcleo lipofílico do ciclopentanofenantreno representado na Figura 2 é constituído de grupos hidroxila e carbonila no caso de moléculas naturais, enquanto que nos esteróides sintéticos são geralmente adicionados grupos etinila em sua estrutura, como é o caso do 17 α–etinilestradiol, um dos princípios ativos mais utilizados em pílula anticoncepcional (MAKIN; HEFTMANN., 1988). Os grupos substituintes citados podem ser encontrados nas posições � e � sendo que a primeira configuração situa o grupo substituinte acima do plano e a segunda abaixo do plano. Os estrógenos ambientais, também chamados xenoestrógenos, consistem num grupo diversificado de substâncias que não necessariamente possuem relações estruturais com os estrógenos naturais tal como o 17 � – estradiol, porém grande parte deles apresenta mecanismo de ação similar (JORDAN et al., 1985). Os estudos referentes às relações de estrutura-atividade (SAR) (DAUX; GRIFFIN., 1987) sugerem que quando o estradiol (E2) é ligado ao receptor estrogênico (RE) existe, preferencialmente, um reconhecimento do receptor ao anel 13 149 810 17 12 11 15 16 75 6 18 1 4 2 3 H H H H OH OH H H H OH OH OH H H H O OH H H H OH OH H H H H O O H H H O OH OH Anel ciclopentanofenantreno 17β Estradiol (E2) Estriol (E3) Estrone (E1) 17α Etinilestradiol (EE2) Progesterona Testosterona Dietilestilbestrol (DES) A B C α α' Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 36 – A do esteróide. Os mais potentes antagonistas possuem anéis fenólicos capazes, na maioria das vezes, de mimetizar o efeito do anel – A de E2. DAUX; GRIFFIN (1987) relataram que o potente estrógeno sintético DES possui atividade como alterador por se assemelhar estruturalmente a parte do anel – A do E2. Tal fato fortaleceu a hipótese de que a resposta de uma substância depende principalmente de sua configuração molecular que, neste caso, demonstrou ser a planaridade (caráter sp2) condição fundamental. Portanto, os anéis de � e �´ do DES cumpriram esse papel mimetizando a ação dos hormônios sintéticos e naturais. 1.3 Fitoestrógenos e seus efeitos biológicos Fitoestrógenos são definidos como qualquer tipo de substância de origem vegetal, semelhantes estrutural e/ou funcionalmente aos estrógenos placentários do ovário e seus metabólitos ativos (WHITTEN; PATISAUL, 2001). Nas plantas, os fitoestrógenos são metabólitos secundários que podem agir como fungicidas, reguladores hormonais e protetores contra radiação UV. Diversos tipos de plantas produzem essas substâncias que podem mimetizar ou interagir com estrógenos hormonais em animais. Existe uma lista de 20 fitoestrógenos que foram identificados em 300 plantas, de 16 diferentes famílias (COLBORN et al., 1996). Esses fitocompostos possuem menor poder estrogênico que os estrógenos endógenos e sintéticos e estão presentes em concentrações elevadas em ervas, grãos, vegetais e frutas (LIGGINS et al., 2000). Alguns desses alimentos são comercializados mundialmente, especialmente a soja que é consumida em níveis elevados de forma direta ou indireta (ADLERCREUTZ et al., 1991). Embora, as pesquisas sobre os fitoestrógenos, em Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 37 sua maioria, afirmem que esses produzem efeitos positivos sobre saúde humana (SETCHELL; CASSIDY, 1999; LISSIN; COOKE, 2000; KRIS-ETHERTON et al., 2002), algumas pesquisas têm mostrado o efeito dessas substâncias como alteradores endócrinos, o que poderia causar intersex em organismos aquáticos (KIPARISSIS et al., 2003). Cientistas têm focado sua atenção em dois principais grupos de fitoestrógenos: as isoflavonas e as lignanas. As isoflavonas são encontradas em soja (Glycine Max (L.) Merrill) e outros vegetais, enquanto as lignanas são produzidas por ação microbiana sobre grãos, fibras e estão presentes em diversas frutas e vegetais. Os fitoestrógenos têm uma estrutura básica derivada do 2-fenilnaftaleno, a qual assemelha-se, no modo de ação, aos estrógenos endógenos. Eles têm sido encontrados ligados a receptores estrogênicos e pesquisas têm sugerido que podem atuar como agonistas ou antagonistas do sistema endócrino (THAM et al., 1998). Os flavonóides, mais especificamente as isoflavonas, possuem uma atividade estrogênica relativamente alta quando comparadas às lignanas (WHITTEN; PATISAUL, 2001). As estruturas de algumas destas substâncias estão apresentadas na Figura 3. As isoflavonas possuem uma estrutura difenólica que se assemelha à estrutura de potentes estrógenos sintéticos, como o dietilestilbestrol (DES). A daidzeína e a genisteína são dois isoflavonóides mais comumente encontrados na soja, enquanto que a formononetina e biochanina – A são majoritárias no trevo vermelho. A estrutura básica das lignanas provém do 2,3-dibenzilbutano e seus precursores essenciais são encontrados e produzidos pelas paredes celulares de plantas. No que tange as lignanas as fontes vegetais principais são as sementes, (linho, Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 38 abóbora, girassol e papoula), grãos inteiros (trigo e centeio), frutas (particularmente as cerejas e vegetais folhosos) (THAM et al., 1998). O OOH OH OH O OOH OH O O O OH OH O O O OH OH O OH OH OH OH O O OH OH Genisteína Biochanina - A Daidzeína ISOFLAVONAS LIGNANAS Matairesinol Enterodiol Enterolactona O O OH O Formononetina Figura 3: Estruturas de alguns fitoestrógenos. As três isoflavonas mais abundantes na soja são a genisteína, daidzeína e gliciteína. Esses compostos são normalmente encontrados na soja na proporção de aproximadamente 1.3:1 (LC LABORATORIES, 2004). Isoflavonas são estruturalmente semelhantes ao estrógeno E2 (Figura 4) e são conhecidas por apresentarem interações com receptores estrogênicos (RE) das enzimas que em geral desencadeiam efeitos biológicos em animais. Por exemplo, ratas alimentadas com dietas contendo uma relação 2:1 de genisteína/daidzeína revelaram inúmeros efeitos estrogênicos incluindo o alargamento do útero e queratinização do epitélio vaginal. Por outro lado, os machos apresentaram redução Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 39 plasmática das concentrações de testosterona e atrofia das glândulas sexuais (CLINE et al., 2004). H OH OH H H H O OOH OH OH O O OH OH O O OH O 17B - Estradiol (E2) Genisteína Daidzeína Gliciteína Figura 4: Estruturas químicas do 17�-estradiol (E2) e das três principais isoflavonas encontradas na soja. Alguns trabalhos científicos relatam que a genisteína pode exercer efeito estrogênico em peixes. Por exemplo, KO et al. (1999) reportaram que a genisteína induz a produção de vitelogenina, com efeito semelhante ao do 17 �-estradiol (MALISON et al., 1985; MALISON et al., 1988). Dietas a base de genisteína e daidzeína, também aumentaram as concentrações plasmáticas de vitelogenina em diferentes espécies de peixes tanto em machos quanto em fêmeas da espécie truta arco-íris (PELISSERO et al., 2001), esturjão siberiano (Acipenser baeri) (PELISSERO; LE MENN; KAUSHIK, 1991; PELISSERO et al., 1991), e Morone saxatilis (POLLACK et al., 2003). Um dado importante refere-se ao fato de que o efeito biológico da gliciteína, relacionado à atividade estrogênica, não é detectado em peixes, embora a gliciteína seja estruturalmente semelhante à genisteína e, portanto, passível de ser estrogênica (YULIANA et al., 2006). Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 40 A genisteína exerce seus efeitos estrogênicos via mecanismo de ação por mimetização, ligando-se a receptores estrogênicos (RE), agindo como agonista, competindo com o hormônio E2 por tais sítios ativos das enzimas do sistema endócrino, sendo assim é razoável afirmar que tal mecanismo de ação que é válido para os mamíferos pode também se aplicar a outras espécies (KUIPER et al., 1997; KUIPER et al., 1998) tais como peixes (TOLLEFSON et al., 2002; LATONNELLE et al., 2002) mostrando que genisteína age ligando-se a RE. Entretanto, estudos demonstraram que a genisteína liga-se de maneira mais fraca aos RE, se comparada com o hormônio E2, principalmente em espécies de peixes tais como a truta arco-íris, salmão do Atlântico e esturjão siberiano os quais apresentaram ligações com intensidades de 100 a 200 vezes menores que as realizadas pelo E2 (TOLLEFSON et al., 2002; LATONNELLE et al., 2002). Assim, é possível afirmar que pelo menos alguns dos potentes efeitos estrogênicos dos fitoestrógenos seriam vinculados e mediados por outros mecanismos além do relacionado à RE. Dados da literatura indicam que mamíferos e peixes possuem um mecanismo alternativo, pelo qual esses compostos estrogênicos provocam a inibição da atividade de E2 no metabolismo periférico das enzimas. Especificamente, vários xenobióticos hidroxilados são associados a esse tipo de mecanismo tendo as hidroxilas papel fundamental, atuando como inibidores competitivos de conjugação de reações que normalmente inativam o E2. Em seres humanos, por exemplo, inúmeros xenoestrógenos hidroxilados, incluindo as formas hidroxiladas de bifenilaspolicloradas (PCBs), dibenzo-p-dioxinas e dibenzofuranos podem agir como potentes inibidores do estrógeno sulfotransferase resultando em atividade Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 41 estrogênica em concentrações subnanomolares (KESTER et al., 2000; KESTER et al., 2002). Yuliana et al. (2006) pesquisaram os efeitos da genisteína sobre o metabolismo do E2 de três espécies de salmonícolas: truta arco-íris (Oncorhyncus mykiss), salmão do Atlântico (Salmo salar) e truta lacustres (Salvelinus namaycush). Demonstrou-se neste estudo que a genisteína, que possui três grupos hidroxila, e que é estruturalmente semelhante a E2 (Figura 3), é a responsável pela inibição da formação de metabólitos conjugados E2, porém ainda assim não existem dados suficientes que esclareçam completamente o papel das hidroxilas nesse mecanismo de ação alternativo. Percebe-se que o comportamento dessa molécula apresenta similaridades aos xenoestrógenos hidroxilados. Nos últimos anos, a comunidade científica tem demonstrado interesse nos fitoestrógenos, como a genisteína e a daidzeína, principalmente devido aos seus possíveis efeitos benéficos. Entretanto, existem resultados conflitantes quanto a estes benefícios. Por exemplo, em estudos sobre o efeito da exposição de ratas em período pré-natal a genisteína, há o relato que esta exposição preveniu o câncer em glândulas mamárias (PHILLIPS et al., 1999; HERTZ, 1985), enquanto outro estudo demonstra o aumento deste mesmo tipo de câncer (UKEA, 2000). Hughes (1996) demonstrou um aumento nas taxas de síntese de colesterol em crianças que consumiam produtos derivados da soja. Enquanto que outros estudos demonstraram que a exposição á genisteína no período neonatal induziram a formação de adenocarcinoma uterino em ratos (OSPAR, 1998), similarmente à exposição ao DES. Pesquisas adicionais sugerem efeitos adversos de genisteína em mulheres grávidas que consumiram produtos à base de soja, sendo que fora relatado um Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 42 aumento de incidência de hipospádia (má formação, de origem congênita, da uretra) em bebês (varões) nascidos destas mulheres (JAPAN ENVIRONMENT AGENCY, 1998). Corroborando com estes dados, outros estudos sugerem que os efeitos estrogênicos mais pronunciados das isoflavonas é sentido durante o desenvolvimento embrionário (COLBORN et al., 1993; SUMPTER, 1998). Estudos epidemiológicos relacionaram o alto consumo de produtos derivados da soja na infância ao aumento de problemas ligados a alergias em homens e mulheres, prolongado ciclo menstrual e um maior desconforto durante a menstruação (WWF, 2006; COMISSION..., 2001). Existem muitos dados disponíveis, utilizando diferentes bioensaios, que relacionam os fitoestrógenos às atividades estrogênicas e androgênicas. Na Tabela 1 estão sumarizados alguns destes dados. Nestes bioensaios, a substância padrão para o teste de estrogenicidade é o 17 �-estradiol (E2) e para o teste de androgenia é a testosterona (Te) ou a metiltrienolona (R1881). Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 43 Tabela 1: Atividades estrogênica/androgênica de fitoestrógenos em diferentes bioensaios (LIU et al., 2009). Fitoestrógeno RBA (ER) RBA (AR) Potencial Estrogênico (EP) TGEAb hER(�)ef hER(�)b hAR(�)a rAR(�)c RGAa (ER(�)) YESd (ER(�)) ER(�) ER(�) Daidzeína 1,8e-3; 1e-3 5e-3 N.L – 6,67e-5 3e-6 0,97 0,8 Formononetina 2,65e-4; <1e-4 <1e-4 – – 2,94e-5 – 0,06 0,02 Genisteína 1,2e-3; 4e-2 0,87 N.L 3.6e-5 4,17e-4 3e-3 1,98 1,82 Biochanina-A 1,26e-5; <1e-4 <1e-4 – – 9,09e-6 <3e-6 0,36 0,53 Gliciteína 2,8e-4i – – – – <3e-7 – – Equol 8,6e-3f 0,02f – 4.1e-5 6,1e-4f 3e-5 – – * RBA, afinidade relativa de ligação, receptor estrogênico (ER)/receptor androgênio (AR) ensaio de competição por ligação; hER - receptor humano de estrogênio; hAR, receptor humano de androgênio; rAR - receptor de androgênio do rato; RGA,ensaio de gene; TGEA - ensaio de expressão de gene transiente; –, N.L., não ligante. a National Institute of Technology and Evaluation, Japan (NITE,2008). b Kuiper et al., 1998. c Fang et al., 2003. d Nishihara et al., 2000. e Song et al., 1999. f Matthews et al., 2000 Analisando a Tabela 1 nota-se que os valores de estrogenicidade para os fitoestrógenos são relativamente baixos, exceto no ensaio de expressão do gene transiente (TGEA), no qual o potencial estrogênico de alguns fitoestrógenos apresenta-se no mesmo nível, ou maiores, que os encontrados para E2. Comparados com substâncias de origem industrial tais como o bisfenol-A (BPA) ou o nonilfenol (NP), a maior parte dos fitoestrógenos possui potencial estrogênico da mesma ordem de magnitude. As concentrações na faixa de μg L-1, tanto para os fitoestrógenos quanto para BPA e NP provocam altos níveis de atividades estrogênicas, dessa forma, a presença dessas substâncias não pode ser Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 44 negligenciada, principalmente quando encontradas em altas concentrações em amostras ambientais. Por outro lado, poucos fitoestrógenos possuem atividade androgênica (Tabela 1). Para monitorar a atividade estrogênica dos fitoestrógenos em ambientes aquáticos, que em geral são de grande complexidade, é muito importante ter a estimativa das concentrações existentes nesses ambientes. Ainda, em relação aos efeitos biológicos dos fitoestrógenos, cabe salientar que plantas produtoras de fitoestrógenos também podem causar impacto sobre outras espécies vegetais e à microbiota do solo. Isoflavonas extraídas de raízes de soja foram pesquisadas com foco na relação planta-microrganismo e foi constatado que essas substâncias causam a inibição do crescimento de microrganismos demonstrando assim o caráter alelopático dessas substâncias (PARK et al., 2001), sendo também relatada a atividade nematicida para estas substâncias (AKHTAR; MAHMOD, 1994). Têm sido relatado na literatura os efeitos adversos das isoflavonas que causam impacto por exercerem forte competição com outras espécies de plantas, sendo conhecidas como substâncias de alto efeito alelopático (BAIS et al., 2004; SINGER et al., 2004) e até mesmo sendo classificadas como tóxicas (WITTSTOCK; GERSCHENZON, 2002). 1.4 Teste de estrogenicidade: RYA - Ensaio com levedura recombinante O ensaio com levedura recombinante (RYA) é um dos mais adequados para avaliação de alteração endócrina (AE) de uma substância ou amostra ambiental. Neste ensaio é usada uma levedura recombinante que contém dois elementos genéticos, um deles atuando como um sensor e o outro como repórter. O elemento Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 45 sensor consiste de um receptor de vertebrado (receptor de estrógeno humano-ER) ao qual o AE se liga com média a alta afinidade. O gene repórter codifica um produto que pode ser facilmente quantificado (em nosso caso codificando a enzima beta- galactosidase de E.coli.) e a expressão do qual é feita de modo dependente da ativação do ER pela presença de estrógenos (GARCÍA-REYERO et al., 2001). Nesse sistema, um estrógeno ou composto similar a estrógeno presente no meio de cultura da levedura poderia desencadear a seguinte cascata de eventos: a) Ligação aos receptores de estrógenos (ER) das células leveduriformes, b) o complexo resultante poderia promover a expressão do gene da betagalactosidase, c) a enzima correspondente seria fabricada pelos moldes de uma célula leveduriforme, d) a enzima produzida poderia tornar-se um substrato cromogênico (GARCÍA-REYERO et al., 2001). O sistema não fornece a medida direta da concentração molar (ou massa) dos agentes estrogênicos, mas a sua atividade. Para simplificar, os resultados são fornecidos em "estradiol equivalente", definido como a quantidade de estradiol presente na amostra responsável pela resposta observada. Esses equivalentes são calculados a partir da mais baixa diluição em que a atividade da betagalactosidase é similar a do controle negativo. A atividade estrogênica na diluição mais baixa é considerada o limite de detecção para o estradiol nessas condições, o que é similar ao limite de detecção do RYA (GARCÍA-REYERO et al., 2001). O gene repórter foi construído de maneira que essa enzima pudesse ser somente expressada na presença do complexo estrógeno-ER, regulados de uma maneira similar a muitos genes femininos em vertebrados (GREEN; CHAMBON, 1991; GARCÍA-REYERO et al., 2001). A similaridade de todos os eucariotos Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 46 assegura que o mecanismo funciona da mesma maneira em vertebrados e em levedura. O ensaio com leveduras recombinantes emprega células leveduriformes geneticamente modificadas para reproduzir a via natural do controle genético de dois estrógenos em vertebrados (COLDHAM et al., 1997; GARCÍA-REYERO et al., 2001). Este ensaio tem a vantagem de ser simples, sensível e com boa reprodutibilidade (KORNER et al.,1999; QUIROS et al., 2005; TASHIRO et al., 2004; CESPEDES et al., 2005). 1.5 Ocorrência e dispersão ambiental de fitoestrógenos Como mencionado anteriormente, as isoflavonas ocorrem naturalmente em plantas como a soja (Glycine Max (L.) Merrill) e trevo vermelho (Trifolium ssp.), tais plantas contêm concentrações elevadas dessa substância, na ordem de g/kg. O trevo vermelho é comumente usado na Europa como pastagem e como adubo orgânico nas plantações de milho e é conhecido por conter grandes quantidades de formononetina (FOR) e biochanina A (BIO). (BOLLER, 1996; SIVESIND; SEGUIN, 2005). Por outro lado, a soja possui como metabólitos principais a daidzeína (DAI) e a genisteína (GEN) (FLETCHER., 2003; MORRISON et al., 2008). A DAI é facilmente reduzida a equol que, por sua vez, não é produzido pela planta e sim por um processo metabólico que ocorre no intestino de mamíferos. O equol também é formado pelo processo de degradação da DAI por microrganismos presentes nos solos e água (LUNDH, 1995; HEINONEN et al., 2004). A presença de isoflavonas em águas residuais e efluentes de estações de tratamento de esgoto (ETE), bem como água de rio e água tratada foi investigada Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 47 por vários autores (BESTER et al., 2009; TERNES et al., 2001; PAWLOWSKI et al., 2004; LAGANÀ et al., 2004; BALCONI et al., 2005; KANG et al., 2006; FARRÉ et al., 2008). Esses estudos reportam a presença de GEN, DAI e BIO que foram encontradas em concentrações da ordem de centenas de ng L-1, além de indicarem a remoção de 50 a 100% dessas isoflavonas. Apesar de existirem diversos trabalhos investigando a presença de isoflavonas em ambientes urbanos (ETAs, ETEs, corpos d’água que sofrem influência de cidades, etc), poucos são os estudos enfocando a presença destas substância em ambiente rural. Burnison et al. (2003) examinaram esterco de porco encontrando concentrações de equol na ordem de mg Kg-1. Em outro estudo, porcos que foram alimentados com 20% de trevo vermelho (Trifolium ssp.) na ração, excretaram após 8 horas, 55% do total de isoflavonas ingeridas na forma de FOR e DAI (LUNDH et al., 1995). Em um trabalho desenvolvido na Suiça (SCHUBIGER et al., 1998) estimou-se que o consumo de isoflavonas por vacas varia de 50 - 100 g por dia. Assumindo que 25 g de isoflavonas estão presentes em cerca de 50 – 60 L de estrume excretado por vaca ao dia. Considerando-se que a aplicação destes dejetos como melhoradores de solo é feita na proporção de 50-100 m3 ha-1 ano-1, então se pode inferir que cerca de 20 – 50 kg ha-1 ano-1 de isoflavonas são incorporados a solos agrícolas, naquele país. Sendo as isoflavonas solúveis em água (Tabela 2), pode-se inferir que o risco de que sejam lixiviadas pelas chuvas para corpos hídricos naturais é bastante alto e não deve ser negligenciado. Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 48 Tabela 2: Propriedades físico-químicas das principais isoflavonas (HOERGER et al., 2009). Formononetina (FOR) Daidzeína (DAI) Equol Biochanina A (BIO) Genisteína (GEN) Estrutura O O OH O CH3 O O OH OH OOH OH O OOH OH O CH3 O OOH OH OH Massa molecular (g/mol) 268,3 254,2 242,3 284,3 270,2 log Kow 3,11 (estimado)a 2,55 (estimado)a 2,51 (experimental pH 7,4)b 3,60 (estimado)a 3,20 (experimental pH 7,4)b 3,41 (estimado)a 2,84 (estimado)a 3,04 (experimental, pH 7,4)b pKa 7±1c 7±1, 13±1c 7±1, 10±1c 7±1, 13±1c 7,2, 10, 13,2c Tempo de meia-vida (dias) em águas naturaisd 4 36 29 26 32 a Meylan; Howard. 1995. bRothwell et al., 2005. c Zielonka et al., 2003. d Erbs et al., 2007. Os valores do coeficiente de partição octanol/água log Kow aumentam com o aumento da lipofilicidade que é inversamente proporcional a solubilidade em água. Altos valores de log Kow são característicos de grandes moléculas e de moléculas hidrofóbicas que tendem a associar-se com a matéria orgânica sólida possuindo assim menor potencial de lixiviação, enquanto moléculas menores, hidrofílicas, possuem baixos valores de log Kow. Este coeficiente também é considerado um excelente parâmetro para inferir o fator de bioconcentração de uma determinada substância química, que representa neste caso uma indicação mais precisa da extensão da adsorção das substâncias por microrganismos, sendo que substâncias com altos valores de log Kow possuem alto potencial de bioacumulação em Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 49 organismos devido ao maior potencial de permeabilidade na bicamada lipoprotéica dos organismos (BELL; TSEZOS,1987). Quanto ao significado para o ambiente dos valores de log Kow, pode-se agrupá-los em faixas. Valores de log Kow > 4 são representativos de substâncias lipofílicas (apolares), nessa faixa as substâncias demonstram tendência de adsorção em partículas (solo ou material particulado em suspensão na coluna d’água) e bioacumulação. O intervalo de 1,5 < log Kow < 4 inclui substâncias moderadamente hidrofílicas que tendem a sofrer processos de lixiviação. A última faixa abrange os valores de log Kow < 1,5 que representa as substâncias de caráter hidrofílico (polares) e que possuem alto potencial de lixiviação. Outro fator que influencia a dispersão de contaminantes é o pH do meio. Água e solo possuem pH entre 5 e 8, substâncias com pKa >10 tendem a ficar retidas no solo ou em partículas da coluna d’água, enquanto que substâncias que apresentam pKa entre 3 e 9 tendem a sofrer maior efeito de lixiviação contaminando com maior frequência os corpos d’ água, pois tornam-se mais solúveis em água, por estarem desprotonadas, o que contribui para uma maior solubilidade destas em água (ROGERS, 1996; BURGESS et al.,1999). De acordo com os dados de meia-vida apresentados na Tabela 2 (p. 48) nota- se que o tempo de meia-vida das isoflavonas no ambiente aquático situa-se entre 26 e 41 dias, porém de acordo com Minderman (1960) a persistência de substâncias fenólicas no solo é alta e possui valor de meia-vida de aproximadamente sete anos. Desta maneira, as isoflavonas presentes no solo podem significar uma fonte de aporte constante destas substâncias para os recursos hídricos. A contribuição das plantações para o aporte de substâncias, tais como as isoflavonas da soja, são muito pouco estudadas. Alguns dados iniciais foram Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 50 publicados por Erbs et al. (2007) que relataram concentrações de isoflavonas entre 4 e 157 ng L-1 em águas de drenagem de campos de pastagem de trevo vermelho (Trifolium pratense), uma leguminosa forrageira de inverno, originária da Europa e Ásia. Na Suíça os bovinos são alimentados basicamente com este tipo de forragem e seu estrume é colocado diretamente nas pastagens com a finalidade de fechar o ciclo dos nutrientes necessários para a manutenção da fertilidade do solo. Concomitantemente, as áreas de pastagens e a produção de gado em uma determinada bacia hidrográfica são duas coisas que estão fortemente correlacionadas. Portanto, os autores concluem que é difícil distinguir se a fonte de emissão de isoflavonas é proveniente da planta, ou seja, após o seu corte inicia-se um processo de decomposição do material vegetal ou, se essa emissão está ligada diretamente à aplicação de estrume nas pastagens ou ainda, se há a contribuição de ambas as fontes. Na literatura existem diversos trabalhos nos quais são apresentados dados para a ocorrência de fitoestrógenos, principalmente daidzeína e genisteína, em água, efluentes de ETE e solo, muitas vezes associando esta ocorrência à excreta humana ou animal. A presença de isoflavonas em mananciais hídricos também pode ser atribuída a liberação, por lixiviação pela chuva ou irrigação, a partir de material vegetal degradado (LAGANÀ et al., 2004). Estes compostos também têm sido detectados na enxurrada de áreas agrícolas tratadas com resíduos vegetais utilizados como adubo orgânico (BURNISON et al., 2003). Os fitoesteróis estrogenicamente ativos (inclui-se aqui também os fitoestrógenos), tais como o β-sitosterol e a genisteína, são encontrados em plantas em níveis significativos e, por conseqüência, no processo de degradação desses Tese de doutorado – Guilherme Julião Zocolo 51 vegetais pode ocorrer a contamin