RESSALVA Atendendo solicitação do (a) autor (a), o texto completo desta tese será disponibilizado a partir de 13/06/2021 BRUNA JORDÃO MOTTA CORAZZA AVALIAÇÃO CLÍNICA DO EFEITO DE DIFERENTES MEDICAÇÕES INTRACANAIS NOS NÍVEIS DE RESOLVINAS E LIPOXINAS PERIAPICAIS: novas perspectivas endodônticas 2018 BRUNA JORDÃO MOTTA CORAZZA AVALIAÇÃO CLÍNICA DO EFEITO DE DIFERENTES MEDICAÇÕES INTRACANAIS NOS NÍVEIS DE RESOLVINAS E LIPOXINAS PERIAPICAIS: novas perspectivas endodônticas Dissertação apresentada ao Instituto de Ciência e Tecnologia, Universidade Estadual Paulista (Unesp), Campus de São José dos Campos, como parte dos requisitos para obtenção do título de MESTRE, pelo Programa de Pós-Graduação em ODONTOLOGIA RESTAURADORA. Área: Endodontia. Linha de pesquisa: Estudos Clínicos e Laboratoriais de Materiais e Técnicas Endodônticas. Orientadora: Profa. Tit. Dra. Marcia Carneiro Valera São José dos Campos 2018 Instituto de Ciência e Tecnologia [internet]. Normalização de tese e dissertação [acesso em 2019]. Disponível em http://www.ict.unesp.br/biblioteca/normalizacao Apresentação gráfica e normalização de acordo com as normas estabelecidas pelo Serviço de Normalização de Documentos da Seção Técnica de Referência e Atendimento ao Usuário e Documentação (STRAUD). Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Prof. Achille Bassi e Seção Técnica de Informática, ICMC/USP com adaptações - STATI, STRAUD e DTI do ICT/UNESP. Renata Aparecida Couto Martins CRB-8/8376 Corazza, Bruna Jordão Motta Avaliação clínica do efeito de diferentes medicações intracanais nos níveis de resolvinas e lipoxinas periapicais: novas perspectivas endodônticas / Bruna Jordão Motta Corazza. - São José dos Campos : [s.n.], 2018. 99 f. : il. Dissertação (Mestrado em Odontologia Restauradora) - Pós-Graduação em Odontologia Restauradora - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Ciência e Tecnologia, São José dos Campos, 2018. Orientador: Marcia Carneiro Valera. 1. Periodontite periapical. 2. Endotoxina. 3. N-acetil cisteína. 4. Resolvina. 5. Lipoxina. I. Valera, Marcia Carneiro, orient. II. Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Ciência e Tecnologia, São José dos Campos. III. Universidade Estadual Paulista 'Júlio de Mesquita Filho' - Unesp. IV. Universidade Estadual Paulista (Unesp). V. Título. http://www.ict.unesp.br/biblioteca/normalizacao http://www.ict.unesp.br/biblioteca/normalizacao BANCA EXAMINADORA Profa. Tit. Marcia Carneiro Valera (Orientador) Universidade Estadual Paulista (Unesp) Instituto de Ciência e Tecnologia Campus de São José dos Campos Prof. Adj. José Benedito Oliveira Amorim Universidade Estadual Paulista (Unesp) Instituto de Ciência e Tecnologia Campus de São José dos Campos Prof. Associado José Flávio Affonso de Almeida Universidade Estadual de Campinas (Unicamp) Faculdade de Odontologia de Piracicaba São José dos Campos, 13 de dezembro de 2018. DEDICATÓRIA Dedico este trabalho aos meus queridos pais, Claudia e Cezar, que com tanto sacrifício investiram em minha educação, permitindo que eu tivesse acesso a um estudo de qualidade e que pudesse, com muito esforço, chegar até aqui. Que por várias vezes se sentaram ao meu lado, ao longo de minha jornada como estudante, e dedicaram seu tempo ao meu aprendizado, demonstrando, assim, a importância da educação na vida de uma pessoa, e me incentivando a sempre fazer meu melhor. Acompanharam-me de perto durante todo esse processo, para que eu não desistisse ou desanimasse. Muito da minha perseverança e força de vontade vieram desse cuidado e amor dedicados a mim, e hoje tenho certeza de que sou um bom fruto do trabalho árduo de vocês como pais. Vocês me mostraram o quanto é gratificante obter os resultados positivos das boas escolhas. À minha irmã Nathalia, que sempre esteve ao meu lado e se orgulhou do meu trabalho, se preocupou comigo e cuidou de mim, se mostrando minha melhor amiga e companheira para o resto da vida. Amo-os imensamente, e tenham certeza de que este trabalho é dedicado inteiramente a vocês. AGRADECIMENTO ESPECIAL Agradeço muito à minha orientadora, Prof. Tit. Marcia Carneiro Valera, por ter aceitado me orientar mesmo com tantas responsabilidades em mãos. Tenha certeza de que a senhora me inspirou e motivou a buscar o meu melhor ao longo da minha pós- graduação pois acreditou no meu potencial, e mesmo com a quantidade enorme de orientados conseguiu se dedicar ao meu aprimoramento com tanto cuidado, sempre sendo minuciosa nas correções e nos “puxões de orelha” sem deixar sua doçura e delicadeza de lado. Mostrou-me o que é ser uma professora mais do que apaixonada pela sua função, quando deixava seu horário de almoço de lado para poder nos avaliar e nos ajudar a aprimorar a tão árdua prática da docência. Levo comigo um pouco da senhora, do seu caráter e competência, da sua dedicação e esforço. Foi um prazer e uma honra ser sua orientada. AGRADECIMENTOS Agradeço primeiro e imensamente à Deus por sempre estar ao meu lado e escutar minhas orações, me ajudando a enfrentar todas as etapas deste trabalho lindo e complexo. Por sempre me mostrar qual o melhor caminho a se tomar e pela calma e tranquilidade que coloca em meu coração nos momentos mais difíceis, me ajudando a lidar com as situações e a me manter centrada sempre. Por atender aos meus pedidos e permitir a realização dos meus sonhos. Aos meus pais Claudia e Cezar e irmã Nathalia, que me incentivaram a continuar estudando e me aprimorando, que são meu porto seguro nos momentos de aflição e que estendem a mão sempre que necessário. Vocês são o combustível que mantém os meus planos e sonhos vivos e é por vocês que me dedico e me esforço tanto. À minha tia e madrinha Adriana, pelo acolhimento e abrigo no último ano, pela ajuda e companhia durante minhas semanas cansativas de especialização. Você foi fundamental para que eu pudesse realizar mais um sonho meu, isso não tem preço. Às amigas, Fernanda Tessarin, Vanessa Mazza e Vanessa de Faria, que felizmente continuaram a fazer parte da minha vida e tornaram os dias de trabalho pesado no mestrado em dias mais leves e alegres. Agradeço pelos cafés, cervejas, almoços e desabafos. Vocês são mulheres incríveis e me orgulho muito de tê-las como amigas. Aos colegas de pós-graduação que ingressaram no mestrado comigo, Laís, Thais e Ricardo pela companhia e coleguismo inigualáveis. À minha equipe de pesquisa, Felipe, Esteban e Cássia, que me acolheram e me ajudaram muito desde o início, vocês foram fundamentais para que esse trabalho fosse para a frente, obrigada por tudo. Aos meus colegas de pós-graduação Rayana, Amjad, Alessandra, Felipe, Christian e Diego por todo o conhecimento compartilhado e pela amizade. Às professoras Janete e Estela e à equipe de propedêutica, que me ajudaram permitindo que eu buscasse e triasse meus pacientes em sua clínica, que sempre se lembravam de me enviar casos para que eu pudesse alcançar minha meta, e dedicaram um pouco do seu tempo a me escutar e me auxiliar. Eu não tenho palavras para descrever a minha gratidão. Ao professor Sérgio, que tão gentilmente separava radiografias para que eu selecionasse os casos que se encaixavam em minha pesquisa, e que sempre com muita dedicação e prontidão atendia às minhas dúvidas e pedidos, o senhor é um professor sensacional. Obrigada. Ao professor José Flávio Affonso de Almeida, por gentilmente aceitar fazer parte da minha banca examinadora em um momento tão importante para minha carreira. Às alunas de iniciação, Dani Junqueira, Dani Oliveira, Bia, Karol e Karina, pelo auxílio durante a pesquisa, sempre atendendo aos meus pedidos e estando prontas para ajudar. Ao professor Frederico Canato Martinho, por ter me aceitado como aluna de iniciação e inicialmente de mestrado. Por ter confiado em meu trabalho e por sempre ter demonstrado isso. O senhor me ajudou a crescer como profissional e pessoa, e a escolha de fazer pós-graduação foi em parte pela sua ajuda e orientação excelentes. Muito obrigada. Ao Sr. Carlos Guedes e Michelle Ramos do Apoio à Fapesp pela sempre muito atenciosa disposição em me atender e orientar diante de qualquer dúvida ou problema. Muito obrigada. À Faculdade de Odontologia de São José dos Campos – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, através de seu Diretor, Prof. Dr. Estevão Tomomitsu Kimpara, e ao Programa de Pós-graduação em Odontologia Restauradora, sob coordenação do Prof. Adj. Alexandre Luiz Souto Borges. À Capes pela concessão de bolsa de mestrado. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP que concedeu bolsa de mestrado (Processo nº 2016/26012-3) e auxílio pesquisa (Processo 2014/25789-9). À Josi e Fernanda, por sempre estarem prontas a nos auxiliar no agendamento de exames, atendimentos clínicos e materiais. Vocês são maravilhosas meninas. À triagem, em especial à Márcia, que com muita paciência nos recebia regularmente e montava listas de triagem para que pudéssemos realizar o agendamento e avaliação de pacientes para esta pesquisa. Aos pacientes, que se comprometeram e confiaram em nosso trabalho. Muito obrigada! Sem vocês essa pesquisa não seria possível. À todos que direta ou indiretamente colaboraram na execução deste trabalho. Muito Obrigada! “O que eu penso, não muda nada além do meu pensamento, o que eu faço a partir disso, muda tudo! ” Leandro Karnal SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS ....................................................................................... 11 RESUMO ........................................................................................................... 13 ABSTRACT ....................................................................................................... 15 1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 17 2 REVISÃO DE LITERATURA ..................................................................... 25 2.1 Periodontite Apical ...................................................................................... 25 2.2 Medicação Intracanal ................................................................................. 28 2.2.1 Hidróxido de Cálcio ................................................................................. 28 2.2.2 N-acetil cisteína ......................................................................................... 31 2.3 Mediadores lipídicos ................................................................................... 34 2.3.1 Resolvinas .................................................................................................. 34 2.3.2 Lipoxinas ................................................................................................... 36 3 PROPOSIÇÃO ............................................................................................... 40 4 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................... 41 4.1 Procedimentos Experimentais .................................................................... 41 4.1.1 Seleção dos Pacientes ............................................................................... 41 4.1.2 Divisão dos grupos experimentais ........................................................... 42 4.1.3 Intervenções odontológicas ...................................................................... 43 3.1.4 Preparo biomecânico................................................................................ 46 4.1.5 Medicação intracanal ............................................................................... 48 4.1.6 Segunda sessão e obturação ..................................................................... 49 4.2 Análise Antimicrobiana – Unidades formadoras de colônia (UFC/mL) 51 4.3 Quantificação de Endotoxinas (LPS) pelo Ensaio Cinético Cromogênico de Lisado de Amebócitos de Limulus (LAL) ................................................. 52 4.4 Quantificação dos Mediadores Lipídicos pelo Ensaio Imunoenzimático (ELISA) ............................................................................................................. 54 4.5 Análise estatística ........................................................................................ 55 5 RESULTADO ................................................................................................. 56 5.1 Análise da efetividade do tratamento endodôntico .................................. 56 5.1.1 Avaliação da atividade antimicrobiana para microrganismos aeróbios e anaeróbios ....................................................................................................... 56 5.1.2 Análise da redução de endotoxinas dos canais radiculares .................. 62 5.2 Análise da efetividade anti-inflamatória das medicações intracanais ... 64 5.2.1 Avaliação do efeito das medicações sobre os níveis de resolvina E1, D2 e lipoxina A4 do fluido intersticial .................................................................. 64 6 DISCUSSÃO ................................................................................................... 69 7 CONCLUSÃO ................................................................................................ 75 REFERÊNCIAS ................................................................................................ 76 APÊNDICE ........................................................................................................ 91 ANEXOS ............................................................................................................ 94 LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Radiografia de dente com necrose pulpar e lesão periapical com indicação para tratamento endodôntico ................................................. 42 Figura 2 – Imagens ilustrativas da intervenção endodôntica: a- realização de barreira de resina, b- profilaxia com pasta profilática e c- desinfecção do campo operatório e coroa dental1 ............................................................ 44 Figura 3 - Imagens ilustrativas da intervenção endodôntica: a- abertura coronária e b- coletas do canal 1 ................................................................... 45 Figura 4 - Microtubos com as coletas para análise de endotoxina e microbiológica, 1 cone armazenado em 1ml de água apirogênica e 3 cones em 1 ml de VMGAIII 1 ....................................................................... 46 Figura 5 - Imagens ilustrativas da intervenção endodôntica: a- início da instrumentação, b- odontometria, c- finalização da instrumentação e d- irrigação final ........................................................................................... 48 Figura 6 - Imagens ilustrativas da intervenção endodôntica: a- colocação da medicação, b- selamento ................................................................................. 49 Figura 7 - Fluxograma demonstrativo dos diferentes tempos das coletas de endotoxinas, microbiológicas e do fluido intersticial nos grupos experimentais ....................................................................................................... 50 Figura 8 - Manejo das amostras microbiológicas para semeadura, diluições seriadas até 10 -3 .................................................................................. 52 Figura 9 - Materiais utilizados para quantificação de endotoxinas ..................... 53 Figura 10 - Representação gráfica da quantidade de microrganismos em UFC/mL durante o tratamento endodôntico para microrganismos aeróbios 61 Figura 11 - Representação gráfica da quantidade de microrganismos em UFC/mL durante o tratamento endodôntico para microrganismos anaeróbios ................................. 62 Figura 12 - Representação gráfica da redução de endotoxinas em EU/mL em cada grupo analisado ..................................................................................... 64 Figura 13- Concentrações de RvD2 antes e após o uso da NAC ........................ 67 Figura 14 – Gráficos com as concentrações iniciais e finais de cada mediador lipídico ................................................................................................ 68 Corazza BJM. Avaliação clínica do efeito de diferentes medicações intracanais nos níveis de resolvinas e lipoxinas periapicais: novas perspectivas endodônticas [dissertação]. São José dos Campos (SP): Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Ciência e Tecnologia; 2018. RESUMO O objetivo do estudo foi avaliar o efeito da terapia endodôntica utilizando NaOCl 2,5% e medicações intracanais a base de hidróxido de cálcio e de da N- acetil cisteína (NAC) na desinfecção dos canais radiculares, na redução de endotoxinas e na estimulação de liberação dos mediadores lipídicos Resolvina E1, D2 (RvE1, RvD2) e Lipxina A4 (LxA4). Foram selecionados quarenta dentes unirradiculares, com infecção endodôntica primária e periodontite apical. Os dentes foram aleatoriamente divididos em 3 grupos de acordo com a medicação intracanal a ser utilizada: G1: soro fisiológico + Ca(OH)2 (n=14), G2: N-Acetil Cisteína (n=13), G3: clorexidina (CLX) + Ca(OH)2 (n=14). Amostras bacterianas e de endotoxinas foram coletadas do canal radicular, após abertura coronária, após preparo dos canais com limas reciprocantes (Reciproc) selecionadas de acordo com o diâmetro do canal radicular e a solução irrigante (NaOCl 2,5%) e após medicação intracanal. A análise da atividade antimicrobiana foi através da contagem de unidades formadoras de colônias (UFC/mL) de microrganismos remanescentes no canal radicular e quantificação de endotoxinas (EU/mL) através do teste Limulus Amebocyte Lysate – LAL. Após o preparo biomecânico (PBM) os dentes foram preenchidos com as medicações intracanais de acordo com os grupos por quatorze dias. O fluído intersticial foi coletado após preparo dos canais e após 14 dias de medicação e a quantificação dos mediadores lipídicos (RvE1, RvD2, LxA4) foi realizada através do teste imunoenzimático (ELISA). Os valores obtidos foram tabulados, analisados pelo software GraphPad Prism 6.01 e submetidos aos testes de normalidade de Kolmogorov-Smirnov e Lilliefors e em seguida aos testes Kruskal-Wallis e Dunn e Anova one-way e Tukey (P <0.05). Para carga microbiana, o PBM reduziu em média 96% dos microrganismos aeróbios e 92,5% dos anaeróbios em todos os grupos (p<0,05). A utilização de medicação intracanal à base de Ca(OH)2 manteve os níveis atingidos com o PBM (p>0,05), porém no grupo NAC houve aumento de bactérias. Os níveis de endotoxinas diminuíram após o preparo dos canais e o uso das medicações reduziu o nível de endotoxinas porém sem diferença estatística em relação à redução alcançada com o preparo biomecânico. Quanto aos mediadores lipídicos, somente no grupo NAC foi observado aumento de Rv D2. Concluiu-se que o PBM reduziu significantemente o número de bactérias e a quantidade de endotoxinas do canal, e as medicações à base de Ca(OH)2 foram eficientes na eliminação de microrganismos do canal, entretanto NAC não foi eficaz para a redução da carga microbiana; As três medicações avaliadas foram capazes de atuar no LPS bacteriano. Somente a NAC foi capaz de influenciar positivamente esse resultado com o aumento de RvD2 pós 14 dias da medicação. Os mediadores lipídicos têm grande potencial para uso nos diversos tipos de tratamento endodôntico. Palavras-chave: Periodontite periapical. N-acetil cisteína. Endotoxinas. Resolvinas. Lipoxinas. Corazza BJM. Clinical evaluation of the effect of different intracanal medications on levels of periapical resolvins and lipoxins: new endodontic perspectives[dissertation]. São José dos Campos (SP): São Paulo State University (Unesp), Institute of Science and Technology; 2018. ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the effect of endodontic therapy using 2.5% NaOCl and intracane medications based on calcium hydroxide and N- acetyl cysteine (NAC) on root canal disinfection, reduction of endotoxins and stimulation of release of the lipid mediators Resolvin E1, D2 (RvE1, RvD2) and Lipoxin A4 (LxA4). Forty uniradicular teeth were selected, with primary endodontic infection and apical periodontitis. The teeth were randomly divided into 3 groups according to the intracanal medication to be used: G1: saline + Ca (OH) 2 (n = 14), G2: N-Acetyl Cysteine (n = 13), G3: chlorhexidine CLX) + Ca (OH) 2 (n = 14). Bacterial and endotoxin samples were collected from the root canal after coronary opening after preparation of the channels with reciprocal files (Reciproc) selected according to the root canal diameter and the irrigating solution (NaOCl 2.5%) and after intracanal medication. The analysis of the antimicrobial activity was by count of colony forming units (CFU / mL) of microorganisms remaining in the root canal and quantification of endotoxins (EU / mL) using the Limulus Amebocyte Lysate - LAL test. After biomechanical preparation (PBM) the teeth were filled with intracanal medications according to the groups for fourteen days. The interstitial fluid was collected after preparation of the channels and after 14 days of medication and quantification of the lipid mediators (RvE1, RvD2, LxA4) was performed through the enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA). The values obtained were tabulated, analyzed by GraphPad Prism 6.01 software and submitted to Kolmogorov- Smirnov and Lilliefors normality tests, followed by Kruskal-Wallis and Dunn and Anova one-way and Tukey tests (P <0.05). For microbial load, PBM reduced on average 96% of aerobic microorganisms and 92.5% of anaerobes in all groups (p <0.05). The use of intracanal medication based on Ca (OH) 2 maintained levels reached with PBM (p> 0.05), but in the NAC group there was an increase of bacteria. The endotoxin levels decreased after the preparation of the canals and the use of the medications reduced the endotoxin level, but without statistical difference in relation to the reduction achieved with the biomechanical preparation. As for the lipid mediators, only in the NAC group an increase of D2 Rv was observed. It was concluded that PBM significantly reduced the number of bacteria and the amount of endotoxins in the canal, and Ca (OH) 2-based medications were efficient in the elimination of microorganisms from the canal, however NAC was not effective for reducing the load microbial; The three medications evaluated were able to act on bacterial LPS. Only the NAC was able to positively influence this result with the increase of RvD2 after 14 days of the medication. Lipid mediators have great potential for use in various types of endodontic treatment. Key words: Periapical periodontitis. N-acetyl cysteine. Endotoxins. Resolvins. Lipoxins. 17 1 INTRODUÇÃO As infecções endodônticas ocorrem quando bactérias conseguem entrar no sistema de canais radiculares através de lesões cariosas profundas, trincas, vasos sanguíneos apicais ou mesmo através do periodonto causando danos ao tecido pulpar e provocando necrose deste (Tennert et al., 2014). A contaminação dos canais gera uma resposta do sistema imunológico do hospedeiro levando à inflamação periapical, esse processo terá como sequela a reabsorção de tecidos duros e destruição de outros tecidos formando-se assim a lesão periapical (Nair, 2004). O principal objetivo da resposta inflamatória é detectar e eliminar os fatores que interferem na homeostase, além de proteger o hospedeiro das agressões (Serhan, Chiang, 2009). Uma resposta inflamatória típica é constituída por quatro componentes: indutores inflamatórios; sensores de detecção; mediadores e tecidos-alvo afetados, o tipo e grau da resposta inflamatória são dependentes da natureza do gatilho (bactérias, vírus ou parasitas) e da sua persistência (Medzhitov, 2010). O reconhecimento dos patógenos bacterianos é realizado por receptores de reconhecimento padrão, tais como os receptores Toll-like, que são expressos por macrófagos presentes no tecido (Aderem, Ulevitch, 2000; Darveau, 2010). A ligação aos receptores Toll-like induz a produção de citocinas inflamatórias, quimiocinas e mediadores lipídicos pró- inflamatórios, tais como as prostaglandinas que são os principais responsáveis por estabelecer a resposta inflamatória de forma eficaz e promover a eliminação bacteriana. As interleucinas IL-1β, IL-6, fator de necrose tumoral TNF-α e prostaglandina E2 são produzidos localmente nos tecidos inflamados. Citocinas pró-inflamatórias na circulação resultam em leucocitose e presença de proteínas da fase aguda, e a exposição contínua aos agentes agressores, antígenos solúveis 18 reagem expressando anticorpos circulantes específicos para formar complexos imunológicos que irão amplificar a inflamação (Freire, Van Dyke, 2013). A detecção da resposta inflamatória por células da imunidade inata e células residentes desencadeia a produção de mediadores que modulam o destino de inflamação. Neutrófilos, macrófagos, células dendríticas e mastócitos produzem proteínas de baixo peso molecular - citocinas - que controlam o início da inflamação, sua manutenção, amplitude e a duração da resposta. A regulação genética, que conduz à secreção de citocinas pró-inflamatórias a partir de uma variedade de tipos celulares é geralmente dependente da ativação transcricional ativada pelo fator nuclear kappaB (Baldwin, 1996; Hanada, Yoshimura, 2002). As vias do fator nuclear kappaB são ativadas por receptores de reconhecimento padrão, tais como lipopolissacáridos (LPS), através da via do receptor Toll-like (Hanada, Yoshimura, 2002). As quimiocinas, citocinas com funções quimiotáticas, induzem a migração de células para o local da infecção. Uma vez que os leucócitos saem dos vasos sanguíneos, estes são atraídos por gradientes funcionais de fatores quimiotáticos para o local de infecção (Zlotnik and Yoshie, 2000)(Rossi, Zlotnik, 2000; Zlotnik, Yoshie, 2000). As quimiocinas são sintetizadas por uma variedade de tipos celulares, incluindo células endoteliais, epiteliais e do estroma, bem como por leucócitos. O fracasso da resposta inflamatória ou a ativação contínua das respostas torna-se prejudicial para o tecido levando ao desenvolvimento de lesões crônicas, que chamamos de doenças inflamatórias (Cekici et al., 2014). Nas infecções endodônticas primárias, há predomínio de bactérias gram- negativas (Martinho et al., 2010; Rôças, Siqueira, 2010) essas bactérias possuem como constituinte de sua parede celular os lipopolissacarídeos (LPS) (Rietschel, Brade, 1992) que são liberados durante a divisão ou morte das células (Gorbet, Sefton, 2005). Essas moléculas são altamente virulentas, provocando resposta inflamatória exacerbada (Pitts et al., 1982), podendo desencadear a liberação de 19 citocinas pró-inflamatórias como a IL-1 alfa e TNF-alfa, com consequente liberação de matriz de metaloproteinase -1 (MMP-1) causando reabsorção óssea. Sendo assim, para obter o sucesso da terapia endodôntica é necessário eliminar a infecção do canal (Mohammadi, Dummer, 2011), e também inativar os subprodutos dos microrganismos como o LPS a fim de modular a inflamação (Siqueira, Rôças, 2007). A instrumentação do canal radicular resulta em redução significativa, mas não completa, das bactérias (Hulsmann et al., 2005; Shuping et al., 2000), sendo necessário o uso de substâncias químicas auxiliares, como os irrigantes com ação bactericida que são utilizadas durante o preparo biomecânico (Haapasalo et al., 2010; Shuping et al., 2000) e a medicação intracanal para a obtenção da assepsia do sistema de canais, auxiliando na modulação da inflamação (Athanassiadis et al., 2007). O hipoclorito de sódio é a solução irrigadora mais utilizada devido à sua capacidade de dissolver a matéria orgânica e matar microrganismos de forma eficaz (Haapasalo et al., 2010) e o hidróxido de cálcio é a medicação mais utilizada por sua propriedade antimicrobiana associada à liberação de íons hidroxila que são altamente oxidantes e provocam danos à membrana das bactérias, desnaturando proteínas e danificando o DNA (Siqueira, Lopes, 1999). Essa medicação age sobre o LPS bacteriano, inativando-o (Oliveira et al., 2005) e também é capaz de inibir citocinas do tipo Th1, atuando no processo inflamatório (Martinho et al., 2015). A clorexidina (CLX) também tem sido utilizada como medicação intracanal, especialmente associada ao hidróxido de cálcio (Valera et al., 2010b) pois é um agente antimicrobiano de amplo espectro, e possui ação antimicrobiana residual após exposição do canal a essa substância por longos períodos, atua na eliminação de bactérias resistentes e possui baixo grau de toxicidade (Basrani, Lemonie, 2005). 20 A N-acetil cisteína (NAC) é uma substância derivada da cisteína que possui ação antioxidante pela presença do grupo tiol (Samuni et al., 2013). Os grupos tiol estimulam a síntese de GSH, atuam na desintoxicação e eliminam espécies reativas de oxigênio (ROS) (Cacciatore et al., 2010). Vem sendo estudada e apresentou bons resultados como medicação analgésica em relação à dor pós tratamento endodôntico (Ehsani et al., 2012) e também se mostrou eficaz contra patógenos e biofilme endodônticos em estudos in vitro (Choi et al., 2018; Moon et al., 2016). Tem sido sugerido que defeitos na resolução dos mecanismos inflamatórios resultam em um fenótipo inflamatório presente em doenças crônicas, e os mediadores lipídicos podem eliminar esse fenótipo. Esses mediadores lipídicos pró-resolvedores desempenham o papel de moléculas naturais na manutenção da homeostase, apresentando-se como agentes terapêuticos promissores para doenças humanas (Spite et al., 2014). Durante muitos anos, somente as lipoxinas haviam sido identificadas como mediadores anti-inflamatórios (Serhan et al., 2008), mas atualmente novos mecanismos da suplementação alimentar com ômega-3 e liberação de mediadores lipídicos com ação anti-inflamatória foi descoberto (Serhan et al., 2002, 2000). Esse conjunto separado de mediadores lipídicos tais como as lipoxinas, derivadas do ácido araquidônico ou desencadeadas pela aspirina as resolvinas da série E, derivadas do ácido ômega3-eicosapentaenóico, as resolvinas da série D, derivadas do ácido docosaexaenoico, as protectinas e maresinas atuam como agonistas endógenos para ativar o fim da inflamação, estimulando sua resolução, (Gilroy et al., 2004; Serhan, 2010). Os mediadores lipídicos, atuam como sinalizadores endógenos de parada inflamatória, proporcionando evidências de que a resolução da inflamação é um processo bioquimicamente ativo (Serhan et al., 2000). Esses mediadores lipídicos têm chamado atenção devido a sua potente capacidade anti-inflamatória e pró- 21 resolvedora em concentrações tão baixas quanto nanomols (Serhan et al., 2002). Ambas as ações possuem o mesmo objetivo, eliminar a inflamação e a dor. O tratamento com resolvinas é de particular interesse, pois ao contrário dos anti- inflamatórios, as estratégias das resolvinas não são unicamente dependentes do bloqueio de um evento natural, em vez disso são orientadas para a promoção de uma via de defesa natural (Yoo et al., 2013). As interações seletivas dos mediadores lipídicos com os receptores acoplados à proteína-G, molécula de transdução de sinal, das células da imunidade inata induzem o fim do infiltrado leucocitário, o retorno da permeabilidade vascular, morte dos neutrófilos por apoptose, presença de infiltrado não-flogístico de monócitos e macrófagos e remoção apoptótica de neutrófilos, bactérias e debris necróticos. Estes eventos celulares alcançam o resultado ideal da inflamação, ou seja, a resolução, com o retorno à homeostase tecidual (Freire, Van Dyke, 2013). Resolvinas (Rv) são mediadores lipídicos, com liberação induzida endogenamente durante a fase de resolução da inflamação (Serhan, Chiang, 2009). Estes mediadores lipídicos são biossintetizados a partir dos ácidos graxos essenciais precursores do ômega-3 poliinsaturado de ácido eicosapentaenoico e ácido docosaexaenoico derivados da dieta (Bannenberg et al., 2005). Os principais grupos da família de resolvinas têm estruturas químicas distintas: série E, derivados do ácido eicosapentaenoico; série D, derivados do ácido docosaexaenoico (Simopoulos, 2002). As Rvs da série E são produzidas pelo endotélio vascular via ciclooxigenase-2 modificada pela aspirina que converte ácido eicosapentaenoico em 18R-hydroperoxyeicoapentaenoic e ácido 18S- hydroperoxyeicoapentaenoic. Esses intermediários são rapidamente absorvidos por neutrófilos humanos e metabolizados em RvE1 e E2 pela lipoxigenase-5. A produção de RvE1 é aumentada no plasma de indivíduos que usam aspirina ou ácido eicosapentaenoico, resultando na melhoria dos sinais clínicos 22 inflamatórios (Ho et al., 2010; Makriyannis, Nikas, 2011; Oh et al., 2011). Da mesma forma, demonstrou-se que as Rv da série D, derivadas do ácido docosaexaenoico são capazes de reduzir a inflamação, diminuindo a adesão de leucócitos-plaquetas; e a conversão do ácido docosaexaenoico desencadeada pela aspirina produz moléculas com função anti-inflamatória e pró-resolvedora (Serhan, Chiang, 2009). As lipoxinas (Lx) são moléculas pró-resolvedoras naturais produzidas a partir de ácidos graxos endógenos. Derivados do ácido araquidônico, as lipoxinas têm ações anti-inflamatórias e de resolução potentes (Samuelsson et al., 1987; Serhan et al., 2000, 1995). As LxA4 e B4 foram as primeiras isoladas e identificadas como inibidoras da infiltração de neutrófilos e estimuladoras do recrutamento de macrófagos (Bannenberg et al., 2004; Maddox et al., 1998). Três vias principais de síntese de Lxs foram identificadas, na primeira via, em tecidos de mucosas humanas, tais como no trato gastrointestinal, vias aéreas e na cavidade oral, a oxigenação sequencial de ácido araquidônico pela 15- lipoxigenase e 5-lipoxigenase, seguido por hidrólise enzimática, conduzem à produção de LxA4 e LxB4 (Levy et al., 2001). Na segunda via, em vasos sanguíneos, a 5-lipoxigenase biossintetiza a lipoxina A4, e a 12-lipoxigenase das plaquetas produz a lipoxina B4. A LxA4 regula as funções celulares através da ativação de receptores específicos; estes receptores são expressos por neutrófilos e monócitos. Uma terceira via da síntese é desencadeada pela aspirina. A aspirina promove a acetilação da ciclooxigenase-2, resultando em uma alteração na atividade da ciclooxigenase-2 que passa a produzir 15R-HETE, leucócitos 5- LOX convertem este produto em 15-epi-LXA4 que são denominados lipoxinas desencadeadas pela aspirina. As células que expressam a ciclooxigenase-2 incluem células endoteliais vasculares, células epiteliais, macrófagos e neutrófilos. Além da síntese de lipoxinas, a aspirina também bloqueia a síntese de prostaglandinas por acetilação da ciclooxigenase-2, inibindo a inflamação 23 (Serhan et al., 2008). A LxA4, lipoxinas desencadeadas pela aspirina e a RvE1 mostraram capacidade em inibir o recrutamento de neutrófilos, atenuar a expressão do gene pró-inflamatório e reduzir a gravidade da colite em modelos murinos (Lee et al., 1984; Serhan et al., 2000). A presença de infiltrado neutrofílico e a remoção de fagócitos foram observados quando as RvE1 e D2, Lx e maresinas foram utilizadas no tratamento da colite (Arita et al., 2005; Hudert et al., 2006; Schwab et al., 2007). Em um modelo semelhante, a RvD1 foi associada à regulação de microRNAs, genes-alvo e com a redução de leucotrieno B4, prostaglandina D2, tromboxano A2, prostaglandina F2a no exsudato peritoneal (Fredman et al., 2012; Krishnamoorthy et al., 2012). Em modelos de doenças periodontais, a LxA4 / lipoxinas desencadeadas pela aspirina impediram a perda óssea e de tecido conjuntivo (Wallace, Fiorucci, 2003). Topicamente aplicada, a RvE1 reduziu a inflamação local e a perda óssea induzida pelos osteoclastos no periodonto de coelhos (Hasturk et al., 2006). Na periodontite agressiva localizada, a RvE1 foi capaz de reverter a função defeituosa dos macrófagos (Fredman et al., 2011) e inibir a liberação de superóxidos pelos neutrófilos (Hasturk et al., 2006). Outros estudos também mostram que as resolvinas D e E1 são capazes de contribuir na eliminação bacteriana (Chiang et al., 2012; Seki et al., 2010). Um estudo clínico em pacientes com periodontite moderada a severa avaliou a suplementação da dieta com ômega-3 e aspirina e o tratamento local com raspagem e alisamento radicular. Foi observado que as bolsas periodontais diminuíram de tamanho promovendo aumento nos níveis de inserção clínica e redução nos níveis de mediadores inflamatórios na saliva quando comparados apenas ao tratamento periodontal sozinho (El-Sharkawy et al., 2010). Diante do exposto, o tratamento de doenças periodontais e endodônticas com um ou mais mediadores lipídicos específicos é claramente uma opção na 24 prática odontológica, no entanto, mais estudos são necessários no que diz respeito ao seu uso como medicação intracanal em pacientes com periodontite apical. Portanto, o presente estudo avaliou se medicações a base de Ca(OH)2 com soro fisiológico, Ca(OH)2 com CLX e NAC estimulam ou não a liberação de resolvinas e lipoxinas melhorando o reparo das lesões periapicais. E ainda comparou o efeito destas medicações na eliminação de endotoxinas e microorganismos presentes nas infecções endodônticas primárias. 75 5 CONCLUSÃO Pode-se concluir que: • O preparo biomecânico reduziu significantemente o número de bactérias e a quantidade de endotoxinas do canal, e as medicações à base de hidróxido foram eficientes na eliminação de microrganismos do canal, entretanto NAC não foi eficaz para a redução da carga microbiana; • As três medicações avaliadas foram capazes de atuar no LPS bacteriano; • Quanto ao retorno à homeostasia, somente a NAC foi capaz de influenciar positivamente esse resultado com o aumento de RvD2 pós 14 dias da medicação; • Os mediadores lipídicos têm grande potencial para uso nos diversos tipos de tratamento endodôntico, sendo que mais estudos devem ser realizados para viabilizar sua aplicação clínica, bem como mais estudos devem ser realizados utilizando NAC na resolução das periapicopatias. 76 REFERÊNCIAS* Aderem A, Ulevitch R. 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