UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CAMPÛS JABOTICABAL PRODUÇÃO DE UM INOCULANTE BIOLÓGICO PARA A CULTURA DO ALGODÃO DANIEL MANDETTA DE SOUZA JÚNIOR Jaboticabal - SP 2° Semestre de 2022 I UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CAMPÛS JABOTICABAL PRODUÇÃO DE UM INOCULANTE BIOLÓGICO PARA A CULTURA DO ALGODÃO DANIEL MANDETTA DE SOUZA JÚNIOR Orientador: Prof. Dr. Everlon Cid Rigobelo Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para graduação em ENGENHARIA AGRONÔMICA. Jaboticabal - SP 2° Semestre de 2022 II III IV AGRADECIMENTOS A Deus primeiramente, pelo sustento, provisão, graça e misericórdia que são diárias. E por demonstrar seu cuidado conosco desde as coisas mais simples da vida. A minha avó Ana, por todo seu carinho e amor, por todo o suporte e apoio que nunca faltaram. A minha namorada Ana Lígia, por sua companhia, sua paciência e pelo seu amor que me são vitais. A minha família, meus pais Eliana e Daniel por toda a educação e por todo amor que nunca faltou. E minha irmã Isabella que sempre me apoiou. A Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, onde tive o privilégio de adquirir técnicas e conhecimento e me aprimorar. Ao Professor Doutor Everlon Cid Rigobelo, pela orientação, paciência e conhecimento passado durante o desenvolvimento deste trabalho. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (cNPQ) V Aos membros da banca examinadora Doutor Carlos Henrique Barbosa e Edvan Frezarin Aos meus colegas de graduação João Pedro, Matheus e Bruno Zunfrilli por todo o companheirismo durante esta jornada. VI RESUMO O objetivo do presente trabalho consiste no isolamento de bactérias com potencial para produção de inoculante para a cultura do algodão, para tanto, foi realizado o isolamento de microrganismos provenientes dos órgãos vegetais (raiz, caule e folha) do algodoeiro. O isolamento resultou na obtenção de 356 isolados. Estes isolados foram testados em laboratório para avaliação de atividades-chave para a promoção do crescimento vegetal tais quais, solubilização de fosfato inorgânico, fixação biológica de nitrogênio e produção de ácido indolacético (AIA). Ao final dos testes um total de 6 isolados foram selecionados com base nos seus resultados positivos em laboratório. Após isso foram montados dois experimentos em casas de vegetação. Os experimentos contaram com 6 tratamentos inoculados (isolados: 17, 21, 71, 84, 140 e 312) e um controle, sem inoculação. No primeiro experimento avaliou-se a massa seca de parte aérea e de raiz, e teor de N e P da parte aérea. O isolado 312 foi superior ao isolado 17 em relação a massa seca da parte de área, nenhum tratamento inoculado diferiu do controle. No entanto, o isolado 312 apresentou valores maiores que o controle. O segundo experimento foi montado utilizando os mesmos isolados em duas condições distintas de adubação, com 50 e 100% da adubação recomendada. Não foi observada diferença significativa entre as variáveis (massa seca de parte aérea e massa seca da raiz) e isso se deve possivelmente a má qualidade da semente empregada. Apesar dos resultados promissores in vitro os isolados não foram superiores ao tratamento controle em condições de casa de vegetação. É sugerido que se realize a identificação do isolado 312, e que este seja testado em campo, em diferentes concentrações, bem como, em solos mais pobres em N e P, para averiguar sua real capacidade na promoção de crescimento vegetal. Palavras chave: Microbiologia agrícola, nitrogênio fixação, microrganismos do solo, cotonicultura, inoculação ABSTRACT The objective of the present study is the isolation of bacteria with potential for the production of inoculants for the cotton crop. For this, microorganisms were isolated from the plant organs (root, stem and leaf) of the cotton plant. The isolation resulted in 356 isolates. These isolates were tested in the laboratory to evaluate key activities for plant growth promotion, such as inorganic phosphate solubilization, biological nitrogen fixation and indoleacetic acid (IAA) production. At the end of the tests a total of 6 isolates were selected based on their positive results in the VII laboratory. After that, two experiments were set up in greenhouses. The experiments had 6 inoculated treatments (isolates 17, 21, 71, 84, 140, and 312) and one control, without inoculation. In the first experiment, the dry mass of aerial part and root, and N and P content of the aerial part were evaluated. The isolate 312 was superior to isolate 17 with respect to area dry mass, and no inoculated treatment differed from the control. The isolate 312, however, showed higher values than the control. The second experiment was set up using the same isolates in two different fertilization conditions, with 50 and 100% of the recommended fertilization. No significant difference was observed between the variables (aboveground dry mass and root dry mass) and this is possibly due to the poor quality of the seed used. Despite the promoting in vitro results, the isolates were not superior to the control treatment under greenhouse conditions. It is suggested that isolate 312 be identified and tested in the field at different concentrations, as well as in soils poorer in N and P, to verify its real capacity to promote plant growth. Key words: Agricultural microbiology, nitrogen fixation, soil microorganisms, cotton farming, inoculation. SUMÁRIO Página 1 INTRODUÇÃO 1 2 REVISÃO LITERÁRIA 3 2.1 Sobre o Algodão 3 2.2 Sobre as Bactérias Promotoras de Crescimento das Plantas 4 2.3 Fixação Biológica de Nitrogênio 5 2.4 Solubilização de Fosfato Inorgânico 7 2.5 Produção de Ácido Indolacético 9 3 OBJETIVO 11 4 MATERIAIS E MÉTODOS 12 4.1 Isolamento bacteriano 12 4.1.2 Isolamento de bactérias epífitas 13 VIII 4.1.3 Isolamento de bactérias endofíticas 13 4.2 Seleção de bactérias Solubilizadoras de Fosfato Inorgânico 14 4.2.1 Seleção de bactérias fixadoras de nitrogênio 16 4.2.2 Seleção de bactérias produtoras de AIA 16 4.3 Primeiro Experimento em Casa de Vegetação 16 4.4 Acúmulo de Fósforo na Parte Aérea. 19 4.5 Acúmulo de Nitrogênio na Parte Aérea. 19 4.6 Segundo Experimento em Casa de Vegetação 20 4.7 Análise estatística de dados 22 5 RESULTADOS 22 5.1 Resultados do Isolamento 22 5.2 Teste de Solubilização de Fosfato Inorgânico 24 5.2.3 Determinação da Solubilização de Fosfato Inorgânico pelos isolados 26 5.3 Fixação Biológica de Nitrogênio 27 5.4 Teste de Produção de Ácido Indolacético (AIA) 27 5.5 Determinação do Matéria Seca 28 5.6 Acúmulo de Fósforo e na Parte Aérea. 29 5.7 Acúmulo de Nitrogênio na Parte Aérea. 30 5.8 Segundo Experimento em Casa de Vegetação 30 6 DISCUSSÃO 30 7 CONCLUSÕES 31 LITERATURA CITADA 33 1 1 INTRODUÇÃO O algodoeiro em especial o Gossypium hirsutum L. raça latifolium Hutch. é uma das dez principais espécies domesticadas pelo ser humano entre mais de 230 mil espécies de plantas superiores. O algodoeiro é a única espécie domesticada, tida em termos econômicos como trina, por produzir fibra – seu principal produto – que atualmente ainda veste quase metade da humanidade, óleo que serve para alimentação humana e para produção de energia (biodiesel) (BELTRÃO & AZEVEDO 2008.) Nos últimos anos, o Brasil tem se mantido entre os cinco maiores produtores mundiais de algodão ao lado de países como China, Índia, EUA e Paquistão. Ocupa o primeiro lugar em produtividade e o cenário interno é promissor, pois está entre os maiores produtores mundiais de algodão em pluma. Após a produção de 2,5 milhões de toneladas de pluma na safra 2021/2022, a produção de pluma deverá voltar a subir em 2022/2023 no Brasil. A produção foi projetada em 2,9 milhões de toneladas pela Associação Brasileira de Produtores de Algodão (ABRAPA, 2022). A pobreza química e a acidez dos solos do Cerrado podem reduzir a produtividade do algodoeiro se medidas adequadas de correção e adubação não forem adotadas. O conteúdo de fósforo (P) é limitado em solos ácidos, como os de Cerrado, tornando-se indisponível às plantas, pela rápida formação de complexos insolúveis com cátions, especialmente Al e Fe (Vance et al. 2003). E no algodoeiro, a demanda por P é alta do início da formação dos botões florais até a maturação (FRYE & KAIRUZ, 1990). 2 A produção de algodão envolve a utilização de grande quantidade de insumos agrícolas e fertilizantes. Nesse contexto, várias pesquisas têm apresentado o uso de microrganismos promotores de crescimento de plantas como alternativa para melhorar a eficiência de absorção de nutrientes pelas plantas (OLIVEIRA et al., 2002), e também como mitigadoras de estresses abióticos (PORTO,2004) e estresses bióticos como resistência a fitopatógenos (THULER & BORTOLI, 2006). O uso de microrganismos tem grande impacto no cultivo pois diminui os custos de produção e os impactos ambientais causados pelo uso indiscriminado de fertilizantes na agricultura (PEDRAZA et al., 2010). Os microrganismos presentes no solo desempenham um papel fundamental no agroecossistema. A rizosfera é a área do solo que fica adjacente às raízes da planta, com isso, a interação entre os microrganismos do solo e as raízes das plantas são intensas (PÉREZ- JARAMILLO, MENDES, RAAIJMAKERS, 2016). A utilização de bactérias promotoras do crescimento de plantas (BPCP) é uma alternativa que se difunde cada vez mais na agricultura. Essas bactérias, encontradas principalmente na região da rizosfera, podem atuar como agentes protetores contra patógenos, sintetizar fitormônios, atuar na melhoria do aporte de nutrientes pelas plantas e induzir mudanças na fisiologia, permitindo melhores processos de floração, germinação e estabelecimento das plantas (EGAMBERDIYEVA & HÖFLICH, 2004; KENNEDY, CHOUDHURY & KECSKÉS, 2004; COMPANT et al., 2005; HAYAT et al., 2010). 3 As BPCPs utilizadas como inoculantes biológicos são uma ótima alternativa para o enfrentamento de grandes desafios da produção agrícola brasileira, incluindo a produção de algodão. Entretanto, não há no mercado nenhum inoculante registrado para algodão. Neste sentido, o trabalho objetivou selecionar isolados bacterianos de plantas de algodão com potencial para inoculante nesta cultura. 2 REVISÃO LITERÁRIA 2.1 Sobre o Algodão O algodão (Gossypium L.) é originário da península Arábica, do Paquistão, África Central e das Américas. É uma planta da família Malvaceae, com porte médio, herbáceo/arbóreo, anual/perene, ciclo de 165-180 dias, C3 e com uma arquitetura cônica (CEPEA, 2020). O algodão é uma das principais culturas produzidas do Brasil sendo este um dos maiores produtores mundiais dessa cultura. A colheita é realizada com 140 a 200 dias de idade, variando conforme a cultivar e as condições climáticas e ambientais. Quando o capulho do algodoeiro amadurece, mostra então a matéria fibrosa que envolve as sementes. Depois de colhido, o algodão é levado às algodoeiras, onde se separa a fibra do caroço. A fibra é matéria-prima para a indústria têxtil e de fiação (NEVES & PINTO, 2012). O algodoeiro é uma cultura altamente exigente quanto à qualidade do solo, portanto áreas acentuadamente ácidas ou pobres em nutricionalmente, excessivamente úmidas ou sujeitas a encharcamento e os solos rasos ou compactados não favorecem o cultivo desta cultura (CARVALHO, 1996) 4 O uso do solo de forma intensiva e o aumento da produtividade agrícola esgotam os nutrientes do solo, a reposição de nutrientes é extremamente necessária para atingir uma boa produtividade (GWATHMEY, 2005). O alto consumo de fertilizantes é justificado pelo fato da produção estar concentrada nas regiões do Cerrado, onde os solos dessas regiões não fornecem condições nutricionais ideais, gerando maiores custos para a produção da cultura (BUENO et. al 2004). 2.2 Sobre as Bactérias Promotoras de Crescimento das Plantas Plantas são seres holobiontes, hospedam diversos microrganismos associados, dentro e fora de seus tecidos, estes constituem então o microbioma vegetal. Microrganismos estes que podem estabelecer relações mutualísticas, comensalistas e/ou parasitárias com as plantas (SCHLAEPPI & BULGARELLI, 2015). As bactérias promotoras de crescimento em plantas (BPCPs) são aquelas que apresentam a capacidade de colonizar as raízes das plantas e estimular o crescimento e rendimento das plantas cultivadas (CHANWAY et al., 1989). Estas bactérias colonizam o interior das plantas e estabelecem uma relação mutualística entre planta e bactéria. O início desta relação ocorre com a estimulação à colonização vegetal por sinalizações radiculares liberadas pelas plantas (exsudatos). Além disso, a colonização pode ocorrer através da entrada de bactérias pelas das aberturas naturais, como os estômatos nas folhas, ou por ferimentos presentes nas 5 plantas. Uma vez presente no interior da planta, as bactérias podem colonizar demais estruturas como folhas e caule (AFZAL et al., 2019). As (BPCPs) estão presentes no solo naturalmente e frequentemente são isoladas da rizosfera de diversas plantas. Os gêneros mais estudados são: Pseudomonas, Azospirillum, Rhizobium e Bacillus. Os benefícios diretos gerados por estes microrganismos sobre o desenvolvimento das plantas são amplos, como na germinação de sementes, emergência de plântulas e crescimento das plantas (LAZARETTI & BETTIOL, 1997) como a fixação biológica de nitrogênio (Baldani et. al, 2000), solubilização de fosfato (KUKLINSKY-SOBRAL et al., 2004; GULATI et. al, 2009) produção de fitohormônios (MARIANO & KLOEPPER, 2000). E também existem os benefícios indiretos antagonismo contra patógenos ou resistência a drogas, podendo assim então, favorecer o aumento da produtividade de plantas cultivadas comercialmente (PEDRINHO, 2009). 2.3 Fixação Biológica de Nitrogênio Após o carbono, oxigênio e hidrogênio, o nitrogênio (N) aparece como quarto elemento mais abundante nas plantas, além disso ele é o primeiro nutriente fundamental para o desenvolvimento vegetal, e está presente na formação de proteínas, ácidos nucléicos, clorofila e hormônios exigidos pelas plantas. No algodão, o nitrogênio está diretamente relacionado ao metabolismo, produtividade e qualidade da fibra produzida (WILD & RUSSELL, 1992). 6 Apesar de haver uma abundância de N2 na atmosfera terrestre, os organismos eucariotos (plantas e animais) são incapazes de utilizar este elemento de forma direta. Apenas uma porção dos organismos procariotos é capaz de converter ou reduzir enzimaticamente o nitrogênio da atmosfera em amônia, esta pode ser incorporada para o crescimento e manutenção das células vegetais. A fixação biológica de nitrogênio é a maior responsável pelo aporte de nitrogênio nos sistemas biológicos, contribuindo com cerca de 65% do nitrogênio fixado. (NEWTON, 1999) Os organismos capazes de realizar esta conversão são denominados diazotróficos e o mecanismo responsável pela incorporação de N à biomassa é chamado de fixação biológica de nitrogênio (FBN) (MARIN et.al, 1999). Espécies dos gêneros Bacillus e Pseudomonas apresentam a capacidade de fixar nitrogênio biologicamente sendo dominantes na rizosfera vegetal em que habitam. As espécies do gênero Azospirillum são amplamente encontradas nos solos de regiões tropicais. A espécie Azospirillum brasilense apresenta resultados satisfatórios quando inoculadas em milho, trigo e sorgo.(CHEN et al.,1994;DOBEREINER & DEPOLLI, 1980; MILANI, 2016;FERREIRA et al., 1987) Na fixação industrial do N2, cujo processo é chamado de Haber- Bosch, utiliza-se temperaturas por volta de 200 oC e pressões em torno de 200 atm, sendo dispendiosa do ponto de vista energético. Já no processo de fixação biológica de nitrogênio (FBN), organismos procariotos são capazes de assimilar o N2 atmosférico e convertê-lo a forma assimilável (NH3). A fixação biológica de nitrogênio 7 FBN acontece pela ação da enzima nitrogenase, o que do ponto de vista energético é dispendioso para o organismo que a realiza, a reação pode ocorrer à temperatura ambiente e pressão atmosférica graças a um sistema enzimático apropriado. O processo industrial converte cerca de 80 X 1012 g ano-1 de Nitrogênio molecular em amônia, enquanto, em processos de fixação naturais a conversão é de cerca de 190 X 1012 g ano-1. Deste total fixado por processos naturais, os relâmpagos são responsáveis por cerca de 8%, as reações fotoquímicas, entre óxido nítrico gasoso (NO) e o ozônio (O3), produzindo o ácido nítrico (HNO3), por cerca de 2% e a fixação biológica de nitrogênio (FBN) por bactérias ou algas azuis responsáveis por aproximadamente 90%. Por isso se faz necessário o estudo destes organismos tão importantes para a agricultura (TAIZ & ZEIGER, 2004; REIS et al., 2006; PEDRINHO, 2009). 2.4 Solubilização de Fosfato Inorgânico O fósforo é o segundo nutriente mais importante para o desenvolvimento de plantas, ficando atrás somente do nitrogênio. Este elemento é o principal constituinte de combinações vitais como nucleotídeos, lecitina, e também é o constituinte do ATP, molécula de armazenamento e transferência de energia na planta (FORNASIERI FILHO, 1992). O solo possui uma grande reserva de fósforo porém, a maior parte está na forma insolúvel, pois está associado aos fosfatos de cálcio e de magnésio em solos alcalinos e ao fosfato de ferro e de alumínio em solos 8 ácidos, que não podem ser absorvidos pelas plantas, sendo assim, em tais situações, apesar de presente o fósforo não está disponível para as plantas. As maiores reservas de P são as rochas e outros depósitos, como as apatitas e outros minerais primários formados durante a era geológica (RODRÍGUEZ & FRAGA, 1999; PRINSEN et al., 1999; CHAUHAN et al., 2017; KUKLINSKY-SOBRAL et al., 2004; LÓPEZ- BUCIO et al., 2002). Em sua forma solúvel, o fósforo aparece em baixa concentração nos solos, em níveis de até 1 ppm (H2PO4). Os solos agrícolas em sua maioria, contém grandes reservas de fósforo acumulado como consequência de aplicações regulares de fertilizantes fosfatados. Porém, uma grande porção é rapidamente imobilizada após a aplicação, pois, em determinadas condições do pH e do tipo de solo, torna-se indisponível às plantas. Uma solução a isto, é a utilização de processos microbiológicos para aproveitar o fosfato de rochas. Vários estudos têm examinado a habilidade de diferentes espécies bacterianas em solubilizar compostos de fosfato inorgânico. Entre os gêneros que apresentam esta capacidade são: Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium, Burkholderia, Achromobacter, Agrobacterium, Microccocus, Flavobacterium e Erwinia (RODRÍGUEZ & FRAGA, 1999; ZAPATA & AMANN, 1995) Ainda que a diversidade de bactérias solubilizadoras de P no solo seja grande, os níveis populacionais observados normalmente são baixos para que ocorra uma competição com bactérias comumente associadas à rizosfera. Para que a quantidade de P liberada por estes organismos seja suficiente para promover o crescimento vegetal, deve-se promover a 9 inoculação destes organismos em concentrações elevadas. A co- inoculação de espécies solubilizadoras de P juntamente com espécies diazotróficas, bem como o uso conjunto de fungos micorrízicos arbusculares pode prover uma nutrição vegetal equilibrada e apresentar efeitos sinergísticos na promoção do crescimento (BERG et al., 2009; BELIMOV et al., 1995; KUNDU & GAUR, 1984). O mecanismo de ação na solubilização de P mineral é através dos ácidos orgânicos sintetizados por os microrganismos, o que também promove a acidificação do ambiente ao redor da célula microbiana e também da mesma. O ácido glucônico aparece como o ácido mais frequente na solubilização. Outros ácidos presentes na solubilização de fosfatos são os ácidos isovalérico, isobutírico, 2-cetoglucônico, lático e acético. A liberação de prótons H+ para a superfície celular externa nos processos de absorção de cátions ou através do auxílio das ATPases, a produção de substâncias quelantes ou a produção de ácidos inorgânicos (sulfídrico, nítrico e carbônico), podem constituir mecanismos alternativos na solubilização de fosfatos inorgânicos. (RODRÍGUEZ & FRAGA, 1999; PEDRINHO, 2009). 2.5 Produção de Ácido Indolacético Os hormônios vegetais atuam como reguladores naturais de crescimento nas plantas, em baixas concentrações, influenciando os processos fisiológicos. Algumas espécies de microrganismos endofíticos têm apresentado a capacidade de estimular o crescimento das plantas por mecanismos indiretos como o antagonismo contra patógenos ou resistência a drogas e por mecanismos diretos por meio da fixação 10 biológica de nitrogênio, produção de fitohormônios vegetais (SOUZA, 2001). Auxina é o nome dado a um grupo de compostos que estimulam o crescimento. A origem do termo auxina, cujo significado em grego é “crescer”, se dá quando, cientistas examinaram substâncias de crescimento da planta na urina de humanos, nomeadas de auxinas A e B, estas quais foram gradualmente descartadas. Um composto estrutural isolado de fungos recebeu o nome de heteroauxina, atualmente classificada como heteroauxina bioativa, a qual foi determinada mais tarde como 3-ácido indol acético (AIA) (THIMANN, 1977;KÖGL & HAAGEN SMIT, 1931). O ácido indol acético (AIA) é a forma predominante das auxinas. Evidências sugerem que existem outras auxinas indólicas naturais nas plantas, além do AIA, outros compostos sintéticos também favorecem o crescimento das células: o ácido indenoacético, o ácido 2- benzofuranacético, o ácido 3-benzofuranacético, o ácido naftalenacético. Posteriormente, se observou que outros compostos que possuem anel indólico também promovem o crescimento, como o ácido 3-indolpirúvico, o ácido indolbutírico derivados do naftaleno como o ácido naftil-1-acético e o ácido naftoxi-2-acético. Por último, alguns ácidos fenoxiacéticos como o 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D), o ácido 2-metil, 4-cloro fenoxiacético (AMCP) e o ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético (2,4,5- T), todos possuindo com propriedades herbicidas quando empregados em concentrações elevadas 11 e utilizados como armas químicas na guerra do Vietnã. A principal auxina encontrada nas plantas é o ácido indol acético, conhecido pela sigla AIA. Essa substância é produzida no meristema apical (gema) do caule e transportada através das células do parênquima até as raízes. O transporte do AIA é unidirecional, e depende de energia para ocorrer. O efeito principal das auxinas é promover o crescimento de caules e raízes, através do alongamento das células recém-formadas nos meristemas. Esse efeito depende, no entanto, da concentração do hormônio. Em alguns tecidos as auxinas controlam a divisão celular. O cultivo de tecidos vegetais foi possível graças à ação das auxinas sobre a divisão celular. Em altas concentrações a auxina inibe o alongamento celular e o crescimento do órgão. A sensibilidade das células de diferentes partes da planta a auxina pode variar, o caule, por exemplo, é menos sensível à auxina que a raiz (PEDRINHO, 2009) 3 OBJETIVO Isolar bactérias oriundas de plantas de algodão com habilidade de promoção de crescimento em plantas desta mesma cultura. 12 4 MATERIAIS E MÉTODOS Figura 1: Esquema das etapas de isolamento bacteriano até teste em casa de vegetação. 4.1 Isolamento bacteriano O isolamento dos microrganismos foi realizado de acordo com a metodologia proposta por Kuklinsky-Sobral et al. (2004). No presente estudo não foi adicionado o fungicida Imazil ao meio TSA 10%. Vinte plantas de algodão (10 plantas com a tecnologia Glytol ®ml x Libertylink ® e 10 plantas da cultivar IMA 7501 WS) foram cultivadas em casa de vegetação. As plantas de algodão foram cultivadas em vasos de 5 dm³ preenchidos com latossolo Vermelho, no período de setembro a novembro de 2020. Trinta dias após a semeadura, as plantas em estádio fenológico V4 foram coletadas e separadas em raízes, caule e folhas. Todo o material vegetal foi lavado em água corrente (para retirar o excesso de solo) e posteriormente acondicionado em sacos de papel. 13 Posteriormente, o material vegetal foi levado ao laboratório para as análises correspondentes. 4.1.2 Isolamento de bactérias epífitas As bactérias epífitas foram isoladas do caule, folhas e raízes das plantas de algodão. Pesou-se três gramas de material vegetal de cada cultivar. O material foi colocado em frascos de Erlenmeyer contendo 25 gramas de esferas de vidro de 0,1 cm de diâmetro e 50 mL de solução salina tamponada com fosfato estéril (Na2HPO4: 1,44 g; KH2PO4: 0,24 g; KCl: 0,20 g; NaCl: 8,00 g por litro; pH: 7,4), agitando-se na frequência de 150 rpm a 28 ºC por 1 hora. Após a agitação, foram plaqueados 5 mL do conteúdo do frasco Erlenmeyer em 10% de ágar de triptona de soja (TSA). As placas foram mantidas a 28 ºC por 15 dias. As colônias foram isoladas e repicadas em duplicata em tubos inclinados de TSA, mantidas a 28 ºC por 2 dias e, em seguida, armazenadas a 4 ºC. 4.1.3 Isolamento de bactérias endofíticas As bactérias endofíticas foram isoladas após a desinfecção de 3 g de caule, folhas e raízes usando lavagem serial com hipoclorito. O processo de desinfecção procedeu da seguinte forma: lavagem em água destilada por um (1) minuto, Etanol 70% por um (1) minuto, Hipoclorito a 2% por quatro (4) minutos, Etanol 70% por trinta (30) segundos e por fim enxaguados em água destilada. A eficiência do processo de desinfecção foi verificada por plaqueamento de alíquotas de água destilada esterilizada usadas na lavagem final das plantas. Essas alíquotas foram 14 colocadas em 10% de ágar de triptona de soja e mantidas a 28 ºC por 15 dias. Após a desinfecção, o material vegetal foi cortado e triturado em 10 mL de solução salina estéril tamponada com fosfato. A solução resultante foi transferida para frascos de 50 mL, mantidos sob agitação constante a 28 ºC e 150 rpm por 1 hora. Posteriormente, 5 mL da solução foi colocada em 10% de TSA e mantido a 28 ºC por 15 dias. As colônias foram isoladas e mantidas em tubos inclinados de TSA (10%) a 28ºC por 48 horas e, após esse período, armazenadas em geladeira a 4 ºC. 4.2 Seleção de bactérias Solubilizadoras de Fosfato Inorgânico A seleção das bactérias epífitas e endofíticas solubilizadoras de fosfato inorgânico foi realizada de acordo com Verma, Ladha e Tripthi (2001). Os isolados foram cultivados em meio ágar contendo fosfato inorgânico (15g ágar; 10g glicose; 5g NH4Cl; 1g NaCl; 1g MgSO4.7H2O; 0,8g Ca3(PO4)2; pH 7,2), sendo inoculadas cinco colônias por placa mantidas a 28 ºC por 48 horas. A capacidade de solubilizar fosfato inorgânico foi observada pela presença de halo claro em volta das colônias. Após isso, foi verificada a capacidade de solubilização de Fosfato Inorgânico destes isolados com a presença de outras fontes de fósforo no meio. Estas fontes foram: Apatita de Araxá e Fosfato de Ferro, 36 isolados foram selecionados por apresentarem um halo em volta da colônia. Foi realizada uma seleção a partir da avaliação do halo formado por colônias bacterianas capazes de solubilizar fósforo em meio ágar. 15 Este meio continha fosfato inorgânico sólido: fosfato de cálcio (0,8 g L-1) a avaliação foi realizada até o décimo quinto (15º) dia após a inoculação utilizando 2 repiques no centro por placa. No décimo quinto (15º) dia foi calculado o índice de solubilização (IS) por meio da razão entre o diâmetro do halo e o diâmetro da colônia (BERRAQUEIRO et al., 1976). E de acordo com Silva Filho e Vidor (2000), a solubilização pode ser classificada em baixa solubilização (IS < 2), média solubilização (2< IS < 3) e alta solubilização (IS > 3). Foram selecionados os isolados que obtiveram um índice maior ou igual a 2,5 no 15º dia após a inoculação. Um isolado de B. subtillis da coleção do laboratório foi utilizado como controle positivo quanto à solubilização de fosfato de cálcio Foi feita a quantificação de Fósforo através do método Colorimétrico do Molibdato-Vanadato (BEZERRA & BARRETO, 2011), utilizou-se meio de cultura segundo NAHAS (1994), a saber: 0,1g NaCl; 1g NH4Cl; 0,2g KCl; 0,5g CaCl2.2H2O; 1,2g MgSO4.7H2O; 10g Glicose; 0,5g Extrato de levedura; 5g de Ca3(PO4)2; 1000 mL H2O destilada; pH: 7,0. Após isso foram adicionados 30 mL de meio em cada Erlenmeyer, foram inoculados cada um com um isolado, e incubados por 48 horas a 120 rpm em 28°C. Em seguida 5 mL da cultura incubada foi colocada em centrífuga por 10.000 rpm durante 10 minutos. Foram inseridos em tubos de ensaio 1 mL do sobrenadante + 4 mL de H2O + 2 mL da solução de Molibdato-Vanadato. A leitura foi realizada no espectrofotômetro com o comprimento de onda a 420 nm. 16 4.2.1 Seleção de bactérias fixadoras de nitrogênio A seleção de bactérias fixadoras de nitrogênio ocorreu segundo a capacidade de crescimento em meio semissólido livre de nitrogênio, em meio NFb (DOBEREINER; BALDANI; BALDANI,1995). Foram repicadas 4 colônias em cada placa e posteriormente mantidas a 28°C por 48 horas. A capacidade de fixação de nitrogênio foi identificada pela presença de um halo em volta da colônia. 4.2.2 Seleção de bactérias produtoras de AIA Para determinação da produção de AIA, utilizou-se e adaptou-se o meio de cultura DYGS (2g Glicose; 1,5g Peptona; 2g Extrato de levedura; 2 g KH2PO4.7H20; 0,5 MgSO4.7H2O; L- triptofano 5mM- 0,5106; 1000 mL H₂ O; pH: 6,8; RODRIGUES NETO et al., 1986). Onde 20 mL de meio foram colocados em Erlenmeyer de 125mL, posteriormente a isso os isolados foram inoculados e incubados por 48 horas a 120 rpm a 28ºC. Em seguida, 5 mL da cultura incubada foi colocada em centrífuga por 10.000 rpm durante 10 minutos. Retirou-se 2 mL do sobrenadante e adicionou-se 2 mL do reagente Salkovski e posteriormente, foram incubados por 30 minutos a temperatura ambiente no escuro. Após este período ocorreu a leitura em espectrofotômetro a 530 nm. 4.3 Primeiro Experimento em Casa de Vegetação Foi realizado um experimento em casa de vegetação, na Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias- UNESP FCAV coordenadas (-21.242931161734884, -48.29845001250984), em 17 Jaboticabal no nordeste paulista, nos meses de setembro a novembro de 2021, para avaliação da capacidade de promoção de crescimento de cada isolado obtido nos testes laboratoriais. O experimento foi realizado com temperatura, umidade e irrigação controladas. Os isolados foram nomeados segundo a ordem em que foram isolados e estes foram: 17, 21, 71, 84, 140 e 312. O experimento foi realizado com a cultivar com tecnologia Glytol ® x Libertylink ®, com semeadura de plantio de 3 cm de profundidade e o delineamento foi em blocos ao casualizados com 6 tratamentos inoculados e o controle, sem inoculação. A saber: Tratament o Isolado Testado Tratamento 1 Isolado 17 Tratamento 2 Isolado 21 Tratamento 3 Isolado 71 Tratamento 4 Isolado 84 Tratamento 5 Isolado 140 Tratamento Isolado 18 6 312 Tratamento 7 Sem inoculação Tabela 1: Tabela de tratamentos do primeiro experimento em casa de vegetação Cada tratamento contou com 4 repetições e em cada repetição havia 2 plantas por vaso, a adubação ocorreu de acordo com análise química do solo, seguindo a recomendação de Malavolta et al. (2006). Os isolados foram crescidos em caldo nutriente a 28°C por 24 horas. A aplicação de cada isolado ocorreu num volume de 5mL, durante a semeadura, quinze dias após a emergência (DAE) e com a última aplicação aos 45 dias DAE, totalizando assim 3 aplicações. As plantas foram coletadas aos 60 DAE em estádio fenológico R1, coletando-se parte aérea e raíz. Após a coleta das amostras estas foram lavadas, devido a presença de moscas-branca, o procedimento da lavagem da parte aérea ocorreu da seguinte forma: Foram colocadas 4 bandejas para uma lavagem serial. A 1° bandeja contou com água e 1% do volume de detergente neutro, a 2° bandeja continha todo o volume em água, a 3 ° e 4° continham água deionizada. Cada amostra foi levemente esfregada durante 30 segundos em cada bandeja seguindo a ordem da 1° até a 4° bandeja. Após a lavagem, cada amostra foi seca e colocada em uma estufa (a 65°C) de ventilação forçada durante 72 horas. Após a secagem, cada amostra foi pesada em balança semi-analítica para obtenção da massa de matéria seca da parte aérea e raiz. Os parâmetros 19 avaliados foram: massa seca da parte aérea e da parte radicular e o acúmulo de fósforo e nitrogênio da parte aérea. 4.4 Acúmulo de Fósforo na Parte Aérea. Após a secagem e pesagem, cada amostra de parte aérea foi triturada em moinho tipo Wiley e armazenada em sacos de papel. Após isso, foram pesadas 0,25g de amostra em cadinhos, após a pesagem, os cadinhos foram levados a mufla onde foram incineradas. Após a incineração, cada amostra foi diluída em ácido nítrico (HNO₃ ) 0,1N em balões volumétricos de 25 mL. A determinação do acúmulo de Fósforo na Parte Aérea realizou-se segundo o método Colorimétrico do Molibdato-Vanadato (BEZERRA & BARRETO, 2011). Foram inseridos em tubos de ensaio 1 mL da amostra, 4 mL de H2O e 2 mL da solução de Molibdato-Vanadato. A leitura foi realizada em espectrofotômetro com o comprimento de onda de 420 nm. 4.5 Acúmulo de Nitrogênio na Parte Aérea. Após a secagem e trituração das amostras, o nitrogênio foi determinado empregando o procedimento de destilação a vapor direta (N- DVD), proposto por Roberts et al. (2009) com modificações, como descrito a seguir: pesou-se 0,01g de amostra de parte aérea em tubos macro (25 cm X 17cm de altura,5 cm de diâmetro e volume de 500 mL), o qual foi conectado ao destilador (Tecnal TE 036/1) e recebeu 15 mL de solução de NaOH 10 mol L-1. A mistura foi submetida à destilação até obtenção de 35-40 mL do destilado, o qual foi recebido em 10 mL de solução de H3BO3 20 g L-1. O N-NH4 + foi quantificado por titulação do 20 destilado com solução de H2SO4 0,0097223044 N em titulador automático. 4.6 Segundo Experimento em Casa de Vegetação Foi realizado um segundo experimento em casa de vegetação utilizando a cultivar Glytol ® x Libertylink ®, o delineamento foi em blocos casualizados com 4 repetições por tratamento, com esquema fatorial duplo, onde um fator é constituído por dois níveis de adubação (50% e 100%) e o outro fator, pela inoculação. A adubação ocorreu de acordo com a recomendação de Malavolta et al., (2006). Os tratamentos utilizados foram os seguintes: Tratament o Isolado Testado Adubação Tratamento 1 Isolado 17 Recomend ada Tratamento 2 Isolado 21 Recomend ada Tratamento 3 Isolado 71 Recomend ada Tratamento 4 Isolado 84 Recomend ada Tratamento 5 Isolado 140 Recomend ada 21 Tratamento 6 Isolado 312 Recomend ada Tratamento 7 Isolado 17 Metade da recomenda da Tratamento 8 Isolado 21 Metade da recomenda da Tratamento 9 Isolado 71 Metade da recomenda da Tratamento 10 Isolado 84 Metade da recomenda da Tratamento 11 Isolado 140 Metade da recomenda da Tratamento 12 Isolado 312 Metade da recomenda da Controle Nenhuma inoculação Recomend ada 22 Controle 2 Nenhuma inoculação Metade da recomenda da Tabela 2: Tabela de tratamentos do segundo experimento em casa de vegetação A inoculação foi realizada da seguinte forma: Foi realizada a aplicação de 5 mL de meio de cultura contendo cada isolado no sulco de semeadura. Quinze dias após a emergência, foi realizada uma nova aplicação (5mL) no sulco da planta. As plantas foram coletadas aos 30 DAE em estádio fenológico R1. Os parâmetros avaliados foram: Altura de plantas, volume radicular, massa seca de parte aérea e raiz. 4.7 Análise estatística de dados As premissas de normalidade e heterogeneidade de variância dos resíduos foram analisadas para cada variável por análise gráfica e pelos testes de Shapiro-Wilk e Bartlett. Todas as variáveis foram submetidas à ANOVA e teste de médias de Tukey a 5% de probabilidade. 5 RESULTADOS 5.1 Resultados do Isolamento No total, foram isoladas 356 bactérias, das quais 151 foram isoladas da cultivar Glytol ® x Libertylink ® e 205 isolados da cultivar IMA 7501 WS (Tabela 1). Na cultivar Glytol ® x Libertylink ®, o 94,7% foram isolados da raiz e na cultivar IMA 7501 WS, o 65,36% e 33,17% das bactérias foram isoladas da raiz e da folha, respectivamente. 23 Cultivar Endofítica s (n° de isolados) Epífitas (n° de isolados) Total de isolados Glytol ® x Libertylink ® Caule 3 0 3 Folha 0 5 5 Raíz 92 51 143 Total 151 IMA 7501 WS Caule 3 0 3 Folha 3 65 68 Raíz 58 67 134 Total 205 Total geral 356 Tabela 3. Total de microrganismos isolados. 24 5.2 Teste de Solubilização de Fosfato Inorgânico Dos 74 isolados com capacidade de solubilização de fosfato inorgânico, a maior quantidade foi isolada da raiz e esse grupo abrange bactérias endofíticas e epífitas. Cultivar Endofítica s (n° de isolados) Epífitas (n° de isolados) Total Glytol ® x Libertylink ® Caule 1 0 1 Folha 0 0 0 Raíz 22 15 37 Total 38 IMA 7501 WS Caule 0 0 0 Folha 0 4 4 Raíz 13 19 32 Total 36 Total geral 74 Tabela 4: Isolados selecionados com base na solubilização de fosfato inorgânico. 5.2.1 Avaliação do halo de Solubilização de Fosfato Inorgânico Os resultados da avaliação do halo de solubilização de fosfato inorgânico foram os seguintes: 25 Isolado Índice de Solubilização de Fosfato Inorgânico (IS) 17 2,625 21 2,500 71 2,500 84 2,644 140 3,061 312 5,357 4 2,526 1 2,578 3 2,678 7 2,548 B. subtillis 1,489 Tabela 5. Resultado da avaliação do halo de solubilização de fosfato inorgânico, através do índice de solubilização de fosfato inorgânico. Dos 36 isolados anteriormente selecionados, somente 10 apresentaram resultados positivos no teste 26 5.2.3 Determinação da Solubilização de Fosfato Inorgânico pelos isolados Após os testes realizados em placa, onde 10 isolados apresentaram resultados positivos, foi realizada a determinação de fósforo solubilizado por cada isolado, onde os 6 isolados que foram selecionados apresentaram os seguintes resultados. Figura 2. teste de Solubilização de fosfato inorgânico de diferentes isolados oriundos de algodão. Médias com letras distintas indicam diferenças significativas pelo teste de Tukey (p≤0,05). Os isolados 312, 140, 17 e 84 apresentaram um desempenho satisfatório em comparação ao isolado 21. 27 5.3 Fixação Biológica de Nitrogênio Os 6 isolados que foram solubilizadores de Fosfato Inorgânico foram testados para avaliação de sua capacidade de fixar biologicamente o nitrogênio. Todos os isolados 6 foram positivos para este teste, sendo que 5 isolados foram oriundos da raiz e endofíticos e 1 oriunda da raiz e epifítico. Identificação Origem Isolado 17 Endofítico (Raiz) Isolado 21 Endofítico (Raiz) Isolado 71 Endofítico (Raiz) Isolado 84 Endofítico (Raiz) Isolado 140 Endofítico (Raiz) Isolado 312 Epifítico (Raiz) Total 6 Tabela.6 Isolados selecionados com capacidade de fixação biológica de nitrogênio e suas características. 5.4 Teste de Produção de Ácido Indolacético (AIA) Os resultados apresentados pelos isolados no teste de produção de AIA foram os seguintes: 28 Figura 3. Produção de Ácido Indolacético de diferentes isolados bacterianos oriundos de algodão. O isolado 312 apresentou maior produção de AIA que os isolados 21 e 71. Em relação aos demais isolados, o isolado 71 produziu a menor concentração de AIA em comparação aos demais isolados. Médias com letras distintas indicam diferenças significativas pelo teste de Tukey (p≤0,05). 5.5 Determinação do Matéria Seca A matéria seca das raízes não apresentou diferenças significativas entre os tratamentos. Já a matéria seca da parte aérea apresentou os seguintes resultados: 29 Figura 4. Matéria seca da parte aérea de plantas de algodão inoculadas com diferentes isolados 17, 21, 71, 84, 140, 312 e o controle, sem inoculação. Médias com letras distintas indicam diferenças significativas pelo teste de Tukey (p≤0,05). Como pode ser observado na figura 3, o isolado 312 não diferiu do controle, porém apresentou resultados satisfatórios. O isolado 17 apresentou o pior desempenho em comparação ao isolado 312. 5.6 Acúmulo de Fósforo e na Parte Aérea. Os resultados de acúmulo de fósforo na parte aérea do experimento em casa de vegetação não apresentaram diferenças significativas entre tratamentos, apesar de nos testes de solubilização de fosfato inorgânico in vitro os isolados terem apresentado resultados promissores, isto não se refletiu no experimento em casa de vegetação. 30 5.7 Acúmulo de Nitrogênio na Parte Aérea. Os resultados de acúmulo de Nitrogênio não apresentaram diferenças significativas entre os tratamentos, ao contrário dos resultados apresentados pelos isolados no teste de fixação biológica de nitrogênio in vitro, no experimento em casa de vegetação isto não se refletiu. 5.8 Segundo Experimento em Casa de Vegetação Não houve diferença significativa nos parâmetros avaliados neste experimento, nem em relação a adubação e nem em relação a inoculação. 6 Discussão Apesar dos isolados terem apresentado bons resultados in vitro no que tange a solubilização de P, produção de AIA e fixação de N, eles não apresentaram ganhos significativos em massa vegetal, quando empregados em casa de vegetação. Resultados similares já foram relatados por Leoncio (2015). Isso ocorre, pois, as condições in vitro são mais controladas do que no solo, e neste ambiente há mais adversidades ambientais bem como competição com bactérias nativas do solo pela colonização das raízes das plantas, nutrientes, água, entre outros (BECKER et al., 2012). Apesar disso, o isolado 312 mostrou tendências promissoras para a promoção de crescimento vegetal. Em relação ao incremento de massa seca de parte aérea, o isolado 312 foi superior ao isolado 17. 31 O segundo experimento apresentou resultados contrastantes com o esperado, uma vez que, não foi observada diferença entre os tratamentos com 100% e 50% da adubação. Tais dados podem ser explicados pela perda do vigor das sementes, já que no segundo experimento as sementes estavam mais antigas e se desenvolveram muito lentamente. Possivelmente, no primeiro experimento as sementes ainda apresentavam vigor, e conseguiram expressar toda sua genética, respondendo então, a adubação e a inoculação. 7 Conclusões O isolado que apresentou melhores resultados em grande parte dos parâmetros avaliados, foi o isolado 312 (epífita). Os isolados 17, 21, 71, e 140 apresentaram excelentes resultados laboratoriais, porém no experimento em casa de vegetação, estes não apresentaram resultados superiores ao controle. Como visto anteriormente, o isolado 312 apresentou resultados bem expressivos e parece ter potencial para promoção de crescimento vegetal. Por isto, este isolado poderia ser identificado e posteriormente testado novamente em casa de vegetação e em campo. A maior parte dos microrganismos que foram isolados, são oriundos da raiz das plantas de algodão. Os microrganismos que chegaram até o fim da seleção são oriundos da raiz, porém possuem 32 características distintas, os isolados 17, 21, 71, e 140 são endofíticos e o isolado 312 , epifítico. 33 LITERATURA CITADA ABRAPA- Associação Brasileira dos Produtores de algodão, Disponível em: <-https://www.abrapa.com.br/Paginas/dados/algodao-no-brasil.aspx> Acesso em: 23:23 23/01/2022 ABRAPA - Associação Brasileira dos Produtores de algodão, Brasília DF, 22 de setembro de 2021. Acesso em 05/01/2022 AFZAL, I.; SHINWARI, Z. K.; SIKANDAR, S.; SHAHZAD, S. Plant beneficial endophytic bacteria: mechanisms, diversity, host range and genetic determinants: Mechanisms, diversity, host range and genetic determinants. Microbiological Research, v. 221, p. 36-49, 2019 BALDANI, J.I.; SALLES, J.F.; OLIVARES, F.L. Bactérias endofíticas como vetores de genes de resistência a insetos. In: NASS, L.L., VALOIS, A.C.C., DE MELO, I.S., VALADARES-INGLIS, M.C. (eds). Recursos Genéticos e Melhoramento. 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