RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 18/01/2024. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS DE JABOTICABAL EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE LIPASES EXTRACELULARES Tainá Carolini Maria Bióloga 2023 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS DE JABOTICABAL EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE LIPASES EXTRACELULARES Tainá Carolini Maria Orientadora: Profa. Dra. Eliana G. de Macedo Lemos Coorientadoras: Dra. Pâmela A. Maldaner Pereira Dra. Elisângela Soares Gomes Pepe Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Microbiologia Agropecuária. 2023 Impacto potencial desta pesquisa Pesquisa sobre lipases e sua ação em ácidos graxos de cadeias longas terá amplo impacto: indústria de alimentos, biotecnologia, saúde, biorremediação, sustentabilidade e avanços científicos. Maior compreensão levará a processos eficientes, medicamentos inovadores e gestão de resíduos aprimorada, impulsionando progresso científico. Potential impact of this research Research on lipases and their ability to degrade long-chain fatty acids promises substantial impact across various domains: food industry, biotechnology, human health, bioremediation, pharmacology, sustainability, and scientific advancement. In- depth understanding of lipase functioning will yield opportunities for more efficient and sustainable processes, potentially influencing drug formulation and organic waste management. The research may also stimulate further scientific breakthroughs, contributing to the expansion of knowledge in this field. DADOS CURRICULARES DO AUTOR Tainá Carolini Maria, nascida em 19/02/1996 na cidade de Monte Alto – SP, graduada em Ciências Biológicas pela Universidade Estadual Paulista, e mestrado em Microbiologia Agropecuária pela mesma universidade. AGRADECIMENTOS É com imensa alegria que dedico este trabalho a Deus, fonte de toda sabedoria e inspiração, e começo agradecendo a minha família, especialmente aos meus pais, Antônio e Beatriz, por seu amor incondicional, apoio constante e crença inabalável em meu potencial; as minhas irmãs, Aline e Lorrani, que sempre estiveram ao meu lado, incentivando-me e celebrando cada conquista; ao meu sobrinho Antony, que trouxe tanta alegria e inspiração para minha vida; a Mia, por sua lealdade incondicional e companhia amorosa durante todas as horas de estudo; e ao Pedro, por seu amor, paciência e apoio. Agradeço de coração à minha orientadora Eliana, que me guiou com sabedoria, experiência e dedicação. Sua orientação meticulosa e valiosas contribuições foram fundamentais para o desenvolvimento desta dissertação. Sou grata pela sua paciência, incentivo e pelos desafios que me fez enfrentar para crescer academicamente. Às minhas coorientadoras, Elis e Pâmela, agradeço pelo apoio adicional e valiosas contribuições em minha pesquisa. Sua expertise e orientação foram essenciais para a conclusão deste trabalho. Ao técnico João Carlos, por sua disponibilidade, habilidade e dedicação em auxiliar-me nas atividades práticas e experimentais. Sua experiência e conhecimento foram cruciais para o sucesso dos experimentos realizados. Aos meus amigos e colegas de laboratório, agradeço pela amizade, colaboração e pelo ambiente encorajador em que crescemos juntos. Suas contribuições científicas e apoio emocional foram inestimáveis durante toda essa jornada. Ao Programa de Microbiologia Agropecuária e a Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal pela oportunidade de estudar e desenvolver minha pesquisa nesse ambiente acadêmico de excelência. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), processo n° 19/20825-0. À CAPES, o presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001. A todos mencionados e àqueles que, de alguma forma, contribuíram para o meu crescimento acadêmico e pessoal, meu mais profundo agradecimento. Que este trabalho possa trazer contribuições significativas para a área de microbiologia agropecuária e inspire outros pesquisadores a seguir em busca do conhecimento e do progresso científico. iv EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE LIPASES EXTRACELULARES RESUMO - Lipases verdadeiras são caracterizadas pela capacidade de catalisar a liberação de ácidos graxos livres de triacilgliceróis de cadeia longa na interface óleo-água. As lipases bacterianas são as que apresentam maior versatilidade, são mais estáveis e reativas em meio orgânico. Quanto às suas aplicações, destacam-se o uso na produção de biodiesel e na biorremediação de águas residuais. É estimada a existência de 5000 enzimas lipolíticas bacterianas, entretanto, apenas 10% dessas foram estudadas experimentalmente, por isso a importância de buscar por lipases com novas especificidades. Diante disso, o principal objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar novas lipases verdadeiras. Para tanto, 10 isolados bacterianos foram avaliados quanto a atividade lipolítica e, em seguida, quanto a atividade lipolítica no sobrenadante. Aqueles com resultado positivo, tiveram suas lipases parcialmente purificadas por precipitação com sulfato de amônio e posteriormente foi realizado um zimograma para confirmar atividade lipolítica das enzimas. Os microrganismos, por sua vez, tiveram o DNA extraído para o sequenciamento do gene 16S rRNA, seguido de análises filogenéticas. Uma das lipases obtidas foi submetida a um ensaio de cromatografia gasosa para observação do padrão de degradação dos ácidos graxos presentes no azeite de oliva, e a mesma foi caracterizada bioquimicamente. Quatro dos microrganismos avaliados apresentaram halo de degradação em meio de cultura LB suplementado com azeite de oliva e três deles apresentaram evidência de produção de enzimas extracelulares, através da detecção de proteína por eletroforese SDS-Page no sobrenadante filtrado de cultura liquida induzida com azeite. Após a purificação, as lipases obtidas tiveram a atividade lipolítica comprovada através do zimograma. Os microrganismos foram classificados como pertencentes ao gênero Burkholderia. O isolado denominado D15, escolhido para a continuação dos estudos por apresentar o maior halo lipolítico, produz uma lipase com atividade específica de 0.297 U/mg para o substrato C14 em condições iniciais de análise (pH 8, 30 °C), esta enzima também apresentou uma degradação expressiva dos ácidos graxos presentes no azeite, seu pH e temperatura ótimos foram 4,5 e entre 40 e 60 ºC (substrato C12), respectivamente. As características apresentadas pela lipase produzida pelo isolado D15 são muito interessantes do ponto de vista biotecnológico, com potencial de aplicação na indústria alimentícia, por exemplo, devido a preferência por pH ácido e estabilidade em uma ampla faixa de temperatura; e biorremediação, já que apresentou alta capacidade de degradação de ácidos graxos de cadeia longa. Além disso, outras duas lipases bacterianas extracelulares foram obtidas, podendo serem exploradas em estudos posteriores. Palavras-chave: atividade lipolítica, degradação de azeite, perfil de ésteres metílicos por cromatografia gasosa v EXPRESSION, PURIFICATION, AND CHARACTERIZATION OF EXTRACELLULAR LIPASES ABSTRACT - True lipases are characterized by their ability to catalyze the release of long-chain free fatty acids from triglycerides at the oil-water interface. Bacterial lipases are the most versatile, stable, and reactive in organic media. Their applications include the production of biodiesel and the bioremediation of wastewater. It is estimated that there are 5,000 bacterial lipolytic enzymes, but only 10% of these have been experimentally studied, highlighting the importance of seeking lipases with new specificities. Therefore, the main objective of this work was to identify new true lipases. To this end, 10 bacterial isolates were evaluated for lipolytic activity and then for lipolytic activity in the supernatant. Those with positive results had their lipases purified by ammonium sulfate precipitation, followed by zymogram analysis to confirm the lipolytic activity of the purified enzymes. The microorganisms, in turn, had their DNA extracted for 16S rRNA gene sequencing, followed by phylogenetic analysis. One of the obtained lipases was subjected to gas chromatography to observe the degradation pattern of fatty acids present in olive oil, and it was biochemically characterized. Four of the evaluated microorganisms showed degradation halo in LB culture medium supplemented with olive oil, and three of them showed evidence of extracellular enzyme production through protein detection by SDS-Page electrophoresis in the filtered supernatant of oil-induced liquid culture. After purification, the obtained lipases had their lipolytic activity confirmed by zymogram analysis. The microorganisms were classified as belonging to the Burkholderia genus. The isolate named D15, chosen for further studies due to its largest lipolytic halo, produces a lipase with a specific activity of 0.297 U/mg for the C14 substrate under initial analysis conditions (pH 8, 30 °C). This enzyme also showed significant degradation of fatty acids present in olive oil, with optimal pH and temperature of 4.5 and between 40 and 60 °C (substrate C12), respectively. The characteristics exhibited by the lipase produced by the D15 isolate are highly interesting from a biotechnological standpoint, with potential applications in the food industry, for example, due to its preference for acidic pH and stability over a wide temperature range, and in bioremediation, as it demonstrated a high capacity for degrading long-chain fatty acids. Furthermore, two other extracellular bacterial lipases were obtained, which could be explored in further studies. Keywords: lipolytic activity, olive oil degradation, profile of methyl esters by gas chromatography. 1 1 INTRODUÇÃO As enzimas são moléculas fundamentais aos processos metabólicos celulares, e devido a algumas características que elas apresentam, como alta disponibilidade e produtividade, estabilidade química, capacidade de adaptação e ausência de impactos ao ambiente, elas vêm sendo cada vez mais utilizadas na indústria em diversos setores, como alimentício, farmacêutico, químico e energético (Ken Ugo et al., 2017). Segundo a União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (NC-IUBMB, 1992) as enzimas podem ser agrupadas em sete categorias, de acordo com a reação de catálise específica que realizam (McDonald e Tipton, 2022). Dentre essas categorias, as hidrolases são capazes de hidrolisar diversos compostos, incluindo ésteres e triglicerídeos. Nessa categoria, destacam-se as lipases, que têm uma ampla especificidade de substrato e são capazes de catalisar a liberação de ácidos graxos livres a partir de triacilgliceróis de cadeia longa (Ramnath et al., 2017), sendo amplamente utilizadas devido a sua versatilidade (Javed et al., 2018). As lipases são encontradas em plantas, animais e em microrganismos, sendo que as lipases bacterianas apresentam maior versatilidade, são mais estáveis e reativas em meio orgânico (Ramnath et al., 2017). Estas podem ser intracelulares, extracelulares ou fixadas a membrana; apresentam uma facilidade de manipulação genética e ambiental que permite a produção de enzimas alteradas com alta diversidade catalítica (Javed et al., 2018). As enzimas lipolíticas possuem grande valor na aplicação industrial, sendo empregadas, principalmente, na indústria alimentícia, têxtil, de couro, farmacêutica, cosmética, química fina, energia, biomateriais, papel, celulose e detergentes (Ken Ugo et al., 2017). Apesar de existir um grande número de enzimas lipolíticas bacterianas, poucas foram estudadas experimentalmente, havendo muitas lacunas no conhecimento sobre essas enzimas, como as suas estruturas e mecanismos de ação. (Kovacic et al., 2019). Além disso, a busca por lipases com novas especificidades requer o desenvolvimento de métodos mais eficientes de triagem e seleção de enzimas, bem 2 como a identificação de novos microrganismos produtores de lipases (Hasan et al., 2009). Com base nessas considerações, esta dissertação teve como objetivo identificar novas lipases bacterianas com especificidades ainda não exploradas e, para isso, foram empregadas técnicas de expressão homóloga, triagem enzimática, sequenciamento do gene 16S rRNA, caracterização bioquímica e observação do perfil de digestão de ácidos graxos de cadeia longa de novas 3 lipases verdadeiras, a fim de avaliar o seu potencial biotecnológico, expandir o conhecimento sobre as lipases bacterianas e, consequentemente, contribuir para o desenvolvimento de tecnologias mais sustentáveis e eficientes. 44 6 CONCLUSÃO Diante dos resultados, é possível concluir que a metodologia utilizada foi eficiente para atingir o objetivo proposto. Três microrganismos, D15, MT2 e LP05, tiveram suas lipases parcialmente purificadas, com atividade lipolítica demonstrada por meio de zimograma. Os microrganismos tiveram o gene 16S rRNA sequenciado, e as análises filogenéticas indicaram que as cepas pertencem ao gênero Burkholderia, um dos gêneros de destaque quanto a produção de enzimas lipolíticas. A cepa baceteriana Burkholderia sp. D15, escolhida para a continuação do estudo, apresentou características cinéticas interessantes, como preferência por pH ácido, o que não é comum para lipases de origem bacteriana, e estabilidade em uma ampla faixa de temperatura. Além disso, foi capaz de degradar ácidos graxos de cadeias média e longa presentes no azeite, mesmo fora das suas condições ideais de catalise, em resultado obtido por meio de análise de cromatográfica gasosa. Isso confere a esta enzima um grande potencial de aplicação, visto a facilidade em cultivar o microrganismo, e as especificidades apresentadas pela lipase, podendo ser utilizada em bioprocessos como na produção de alimentos, onde o pH ácido é frequentemente utilizado, na produção de detergentes devido a sua estabilidade em uma ampla faixa de temperatura, e ainda na biorremediação, já que apresentou alta capacidade de degradação em ensaios iniciais. Para tanto, mais estudos devem ser desenvolvidos, como a caraterização completa da lipase, para que as condições sejam otimizadas e haja um maior rendimento e desempenho enzimático. Bem como testes de aplicação devem ser explorados, avaliando a capacidade da enzima na degradação de outros compostos, como gorduras e óleo diesel, que possuem uma composição diferente do azeite utilizado nos ensaios aqui apresentados. No presente trabalho também foram obtidas 45 e purificadas outras duas lipases, que podem ser caracterizadas e exploradas em pesquisas futuras. Desse modo, será possível definir em quais áreas a LipBK e as outras lipases obtidas seriam melhor aproveitadas, e caminhar para uma possível comercialização e aplicação, contribuindo na construção de um futuro mais sustentável e com o desenvolvimento tecnológico. REFERÊNCIAS Balcao VM, Malcata FX (1998) Lipase catalyzed modification of milk fat. Biotechnol Adv 16:309–41. Bharathi D, Rajalakshmi G (2019) Microbial lipases: An overview of screening, production and purification. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology 22. https://doi.org/10.1016/j.bcab.2019.101368 Bradford M (1976) A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. 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