Maria Inês Meira Dolfini Efeitos do FK-506 na regeneração de nervos após Neurorrafia Látero-terminal. Estudo em ratos. Tese de Doutorado Botucatu 2014 Maria Inês Meira-Dolfini Efeitos do FK-506 na regeneração de nervos após Neurorrafia Látero-terminal. Estudo em ratos. [Effects of FK-506 on nerve regeneration after side-to-end Neurorrhaphy. Study in rats.] Tese apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Doutor em Bases Gerais da Cirurgia. Orientandor: Prof. Adj. Fausto Viterbo Botucatu 2014 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE Meira-Dolfini, Maria Inês. Efeitos do FK-506 na regeneração de nervo após neurorrafia látero- terminal. Estudo em ratos. = Effects of FK-506 on nerve regeneration after side-to-end Neurorrhaphy Study in rats / Maria Inês Meira-Dolfini. – Botucatu : [s.n.], 2013 Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina de Botucatu Orientador: Fausto Viterbo Capes: 40102149 Músculos – Regeneração. 2. Nervos periféricos. 3. Nervos – Cirurgia. Palavras-chave: FK-506; Neurorrafia látero-terminal; Regeneração nervosa. Comissão Examinadora Maria Inês Meira Dolfini Efeitos do FK-506 na regeneração de nervos após Neurorrafia Látero-terminal. Estudo em ratos. [Effects of FK-506 on nerve regeneration after side-to-end Neurorrhaphy. Study in rats.] Tese apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Doutor em Bases Gerais da Cirurgia. Comissão Examinadora Presidente e orientador: Prof. Dr. fausto Viterbo Examinador: Prof. Dr. Alexandre L. R. Oliveira Examinador: Prof. Dr. Amilton Antunes Barreira Examinador: Prof. Dr. Carlos Márcio Nóbrega de Jesus Examinador: Prof. Dr. José de Anchieta de Castro e Horta Júnior Botucatu, SP ______ de _________________ de ________. Botucatu 2014 Epígrafe Dedicatória DDedicatória Dedicatória DDEDICO ESTE TRABALHO: À DEUS, “Ao Sr. da minha história, que além de conceder-me o dom mais precioso que uma mulher pode desejar: o de ser Esposa e Mãe, ainda me permitiu o dom de estudar um pouco o seu invento mais valioso: a vida.” Ao meu Esposo e Filhos: Silmar, Mariana, Pedro, André e Clara “Obrigada por me darem o presente mais valioso desta Terra: o “tempo”, o qual deveria ter sido destinado integralmente a vocês, mas que por amor, vocês me permitiram utilizar parte dele para realização deste trabalho. Saiba que foi sempre pensando em vocês, que eu fiz o melhor que eu podia...” Aos meus pais: José Felício Meira Ana Inês Coracine Meira “Que com paciência e orações participaram das minhas idas e vindas nesta estrada....” “Pai.... o que eu não daria para tê-lo aqui... nenhum elogio conseguirá ser tão doce quanto seria o seu....” Agradecimentos Especiais AAgradecimentos Especiais Agradecimentos Especiais Ao PProf. Dr. Fausto Viterbo, Nem todos tem a sorte de ser aceita por um orientador com as suas características: competência, inteligência, conhecimento e reconhecimento da sociedade. Portanto, por ter me aceito e por tudo que se dignou a me ensinar, o meu mais profundo agradecimento, reconhecimento e respeito. Agradecimentos Especiais AAos que sempre estiveram do meu lado: Joaquim e Ana William e Denise Renato e Camila Henrique ainda não sei como agradecer tanto... Por isso continuo pedindo a Deus que o faça por mim.” de maneira muito especial : Ednelson Henrique Bianchi “ .. que durante todo o tempo do meu trabalho prático esteve ao meu lado, me auxiliando. Muito Obrigado...” e com todo o carinho do mundo: Cleide D. T.T Neves, Cristiane Neves Alessi Pissulin, Janete Caprioli Carrocini, Roselaine Palhares Alves, Magno C. Viera, Antonio F. Ferrari, Felipes V.Rodrigues, Willys Tristão e Nader Wafae (in memória) Com vocês eu sempre aprendo algo, todos os dias. Resumo RResumo Resumo A neurorrafia látero-terminal sem lesão do nervo doador representou grande avanço na área de microcirurgia de nervos periféricos. O coto distal do nervo receptor é suturado na face lateral do nervo doador, sem prejudicá-lo. Desde 1994, o FK-506, uma droga imunossupressora, tem sido utilizado para impedir a rejeição do aloenxerto nos transplantes de órgãos e apresentou, em alguns estudos, como ação secundária, efeitos positivos sobre a regeneração nervosa periférica. O objetivo desse trabalho foi estudar se a administração de FK-506 traria benefícios na regeneração do nervo após neurorrafia látero-terminal. Foram utilizados 80 ratos Wistar, divididos em 4 grupos experimentais. Cada rato teve seu nervo fibular esquerdo seccionado e a extremidade distal suturada término-lateralmente ao nervo tibial. Os animais do grupo I, II e III foram submetidos à administração de FK-506 com dose de 1,0, 0,5 e 0,25 mg/kg/dia, respectivamente, durante dois meses, enquanto os animas do grupo Controle (GC) não receberam nenhuma droga. Após dois meses da cirurgia, os ratos foram submetidos ao teste da marcha, estudo eletrofisiológico e análise das fibras musculares e nervosas. O grupo II (GII) apresentou o músculo tibial cranial (MTC) com menor massa (p < 0,05) e maior amplitude (p = 0,019). Os resultados do número total de fibras nervosas foram maiores para GII (p < 0,001). Não houve diferença significativa entre os grupos para os índices funcionais. Com base em nosso modelo experimental, pudemos concluir que a administração de FK-506 na dose de 0,5 mg/Kg/dia diminuiu o ganho de massa corporal e massa do músculo tibial cranial e aumentou a regeneração das fibras nervosas, embora não tenha conseguido alterar a resposta funcional. Palavras-chave: neurorrafia látero-terminal, regeneração nervosa, FK-506. Abstract AAbstract Abstract The latero-terminal neurorrhaphy without injury to the donor nerve, represented great advances in microsurgery of peripheral nerves. The receptor nerve distal stump was sutured on the lateral side of the donor nerve, without harming it. Since 1994, FK-506, an immunosupressive drug, has been used to prevent allograft rejection in organ transplants and presented, in some studies, as a secondary action, positive effects on peripheral nerve regeneration. The aim of this work was to investigate whether the administration of FK-506 would benefit nerve regeneration after a latero-terminal neurorrhaphy. We used 80 Wistar rats, divided into four experimental groups. Each rat had its left fibular nerve sectioned and the distal stump sutured to the lateral of the tibial nerve. The animals of group I, II and III were subjected to the administration of FK-506 in an amount of 1.0, 0.5 to 0.25mg/K/day, respectively, for two months, while the aminals of the control group received no drug. Two months after surgery the rats were submitted to the walking test, eletrophysiological study and analysis of muscle and nerve fibers. The group II (GII) showed cranial tibial muscle (MTC) with lower mass (p < 0.05) and higher amplitude (p = 0.019). The results by the total number of nerve fibers was higher for GII (p < 0.001) . There was no significant difference between groups for functional indices. Based on our experimental model, we could conclude that the administration of 0.5 mg/Kg/dia of FK-506 decreased body mass gain and mass of MTC and increased regeneration of nerve fibers, although not able to change the functional response. Keywords: side-to-end neurorraphy, nerve Regeneration, FK-506. Lista de Abreviações LLista de Abreviações Lista de Abreviações AIAE - Abertura intermediária dos artelhos da pata experimental AIAN - Abertura intermediária dos artelhos da pata contralateral APE - Abertura do passo experimental APN - Abertura do passo contralateral ATAE - Abertura total dos artelhos da pata experimental ATAN - Abertura total dos artelhos da pata contralateral BDNF - Fator Neurotrófico derivado do Encéfalo CMAP - Potencial de ação muscular composto CNTF - Fator Ciliar Neurotrófico COBEA - Colégio Brasileiro de Experimentação Animal CPE - Comprimento total da pata experimental CPN - Comprimento total da pata contralateral FDA - Food and Drug Administration – US Fig. - Figura FKBP - Imunofilina (fk-bining protein isoenzime) G - Gramas GC - Grupo controle – não recebeu nenhuma dose da droga GI - Grupo I – (1,0 mg/Kg/dia) GII - Grupo II – (0,5 mg/Kg/dia) GIII - Grupo III – (0,25 mg/Kg/dia) HE - Hematoxilina e eosina IFF Bain - Índice Funcional do n. Fibular segundo Bain IFI De Medinaceli - Índice Funcional do n. Isquiático segundo De Medinaceli IFI Bain - Índice Funcional do n. Isquiático segundo Bain i.p. - Intraperitoneal M. - Músculo MCL - Membro contralateral (membro direito sem NLT) ME - Membro experimental (membro esquerdo com NLT) Mg/Kg - Micrograma/Kilograma MLCL - Músculo do lado contralateral MLE - Músculo do lado experimental MO - Microscópio Óptico Ms - Milissegundos Lista de Abreviações MTC - Músculo tibial cranial mV - Milivolt N. - Nervo N1 - Segmento distal do n. fibular comum esquerdo N2 - Segmento proximal do n. fibular comum esquerdo N3 - Área da NLT N4 - Segmento do nervo fibular comum direito NEF - Fator de Crescimento Neurotrófico NGF - Fator de crescimento neuronal Ng/ml - Nanograma/mililitro NLT - Neurorrafia látero-terminal NN. - Nervos NTL - Neurorrafia término-lateral NTT - Neurorrafia término-terminal P - Nível de significância PPS - Pitch Pattern Sequence – padrão de frequência PVPI - Polivinilperrolidona-iodo SN - Sistema Nervoso SNC - Sistema Nervoso Central SNP - Sistema Nervoso Periférico Tab. - Tabela TAM - Teste de avaliação da marcha TI - Distância entre o 2º e o 4º artelhos TS - Distância entre o 1º e o 5º artelhos µm - Micrômetro µg/l - Microgramas por litro µs - Microssegundos Lista de Ilustrações LLista de Ilustrações Lista de Ilustrações Figura 1A - Fixação do coto proximal à musculatura adjacente.................................. 52 Figura 1B - Fixação do coto distal do n. fibular comum ao n. tibial........................... 52 Figura 2AB - Técnicos preparando os ratos para o corredor da marcha........................ 53 Figura 2CD - Fitas com as marcas das patas dos ratos................................................... 53 Figura 3A - Impressão nítida da pata........................................................................... 56 Figura 3B - Impressão não nítida da pata.................................................................... 56 Figura 4A - Eletromiógrafo – Shappire II 4ME........................................................... 57 Figura 4B - Posicionamento dos eletrodos.................................................................. 57 Figura 5A - Imagem do n. isquiático e seus ramos...................................................... 58 Figura 5B - Esquema do n. isquiático e seus ramos.................................................... 58 Figura 6 - Secção transversal do MTC...................................................................... 58 Figura 7 - Escolha de cinco fibras musculares por imagem...................................... 59 Figura 8 - Escolha de cinco fibras nervosas por imagem.......................................... 61 Figura 9 - Gráfico das médias das massas iniciais e finais dos animais................... 65 Figura 10 - Gráfico das médias do MTC (MLCL e MLE)......................................... 66 Figura 11 - Gráfico das médias dos índices funcionais............................................... 67 Figura 12 - Médias obtidas no estudo eletrofisiológico (latência / amplitude)........... 68 Figura 13A - Corte histológico do MTC (MLCL – GC)............................................... 69 Figura 13B - Corte histológico do MTC (MLCL – GI)................................................. 69 Figura 13C - Corte histológico do MTC (MLCL – GII)............................................... 69 Figura 13D - Corte histológico do MTC (MLCL – GIII).............................................. 69 Figura 13E - Corte histológico do MTC (MLE – GC).................................................. 69 Figura 13F - Corte histológico do MTC (MLE – GI)................................................... 69 Figura 13G - Corte histológico do MTC (MLE – GII).................................................. 69 Figura 13H - Corte histológico do MTC (MLE – GIII)................................................. 69 Figura 14 - Gráfico da área, diâmetro máximo e mínimo dos MLEs......................... 70 Figura 15 - Gráfico da área, diâmetro máximo e mínimo dos MLCLs....................... 71 Figura 16 - Gráfico das médias do total de fibras musculares por campo.................. 73 Figura 17A - Corte histológico do N4 (GC).................................................................. 74 Figura 17B - Corte histológico do N4 (GI).................................................................... 74 Figura 17C - Corte histológico do N4 (GII).................................................................. 74 Figura 17D - Corte histológico do N4 (GIII)................................................................. 74 Figura 17E - Corte histológico do N1(GC) ................................................................... 74 Lista de Ilustrações Figura 17F - Corte histológico do N1 (GI).................................................................... 74 Figura 17G - Corte histológico do N1 (GII).................................................................. 74 Figura 17H - Corte histológico do N1 (GIII)................................................................. 74 Figura 18 - Gráfico da área, diâmetro máximo e mínimo do N1................................ 75 Figura 19 - Gráfico da área, diâmetro máximo e mínimo do N4................................ 76 Figura 20 - Gráfico das médias do total de fibras nervosas por campo...................... 77 Figura 21 - Segmento proximl do n. fibular comum esquerdo (N2)........................... 78 Lista de Tabelas LLista de Tabelas Lista de Tabelas Tabela 1 - Médias e desvios padrões das massas individuais iniciais e finais dos animais........................................................................................................ 64 Tabela 2 - Médias e desvios padrões das massas do MTC para o MLCLe para o MLE........................................................................................................... 66 Tabela 3 - Médias e desvios padrões dos índices funcionais....................................... 67 Tabela 4 - Médias e desvios padrões obtidos no estudo eletrofisiológico................... 68 Tabela 5 - Médias e desvios padrões da área, diâmetro máximo e mínimo das fibras musculares dos MLEs................................................................................. 70 Tabela 6 - Médias e desvios padrões da área, diâmetro máximo e mínimo das fibras musculares dos MLCLs.............................................................................. 71 Tabela 7 - Médias e desvios padrões do total de fibras musculares por campo.......... 72 Tabela 8 - Médias e desvios padrões da área, diâmetro máximo e mínimo das fibras nervosas dos segmentos N1........................................................................ 75 Tabela 9 - Médias e desvios padrões da área, diâmetro máximo e mínimo das fibras nervosas dos segmentos N4........................................................................ 76 Tabela 10 - Médias e desvios padrões do total de fibras nervosas por campo.............. 77 Sumário SSumário Sumário Resumo Abstract Lista de Abreviações Lista de Ilustrações Lista de Tabelas 1. Introdução.................................................................................................................... 26 2. Revisão de literatura ................................................................................................... 28 2.1 Nervo....................................................................................................................... 29 2.2 Lesão, degeneração e regeneração nervosa............................................................. 30 2.2.1 Lesão............................................................................................................. 30 2.2.2 Degeneração e regeneração nervosa............................................................. 31 2.3 Neurorrafia látero-terminal..................................................................................... 34 2.4 FK-506.................................................................................................................... 41 2.4.1 Estrutura química do FK-506........................................................................ 42 2.4.2 Indicação e mecanismo de ação.................................................................... 42 2.4.3 Apresentação e dosagem............................................................................... 43 2.4.4 Absorção, concentração sérica e metabolização........................................... 43 2.4.5 Efeitos colaterais........................................................................................... 44 2.4.6 Influência na regeneração axonial................................................................. 44 3. Objetivo......................................................................................................................... 48 4. Método.......................................................................................................................... 50 4.1 Animais................................................................................................................... 51 4.2 Procedimentos cirúrgicos........................................................................................ 51 4.3 Testes utilizados...................................................................................................... 53 4.3.1 Teste de avaliação da marcha........................................................................ 53 4.3.2 Estudo eletrofisiológico................................................................................ 56 4.4 Sacrifício e coletas de peças histológicas................................................................ 57 4.4.1 Aferição da massa corporal e do MTC......................................................... 58 4.4.2 Processamento histológico das fibras musculares........................................ 59 4.4.3 Processamento histológico dos segmentos nervosos.................................... 60 4.5 Análise estatística.................................................................................................... 62 5. Resultados..................................................................................................................... 63 5.1 Massa corporal........................................................................................................ 64 Sumário 5.2 Massa do MTC........................................................................................................ 65 5.3 Teste de avaliação da marcha.................................................................................. 66 5.4 Teste eletrofisiológico............................................................................................. 67 5.5 Estudo histológico das fibras musculares............................................................... 69 5.6 Estudo histológico dos segmentos nervosos........................................................... 73 6. Discussão....................................................................................................................... 79 6.1 Teste de avaliação da marcha.................................................................................. 89 6.2 Teste eletrofisiológico............................................................................................. 91 6.3 Massa corporal e massa do MTC............................................................................ 92 6.4 Análise histológica do MTC................................................................................... 93 6.5 Análise histológica dos segmentos nervosos.......................................................... 93 6.6 Atuação do FK-506................................................................................................. 94 6.7 Considerações......................................................................................................... 99 7. Conclusão...................................................................................................................... 100 8. Referências Bibliográficas........................................................................................... 102 9. Anexos........................................................................................................................... 132 9.1 Painel....................................................................................................................... 133 9.2 Certificado............................................................................................................... 134 9.3 Tabelas.................................................................................................................... 135 9.4 Análise Estatística................................................................................................... 141 9.5 Artigo...................................................................................................................... 163 Introdução 26 IIntrodução Introdução 27 1. INTRODUÇÃO Há muito os cientistas vem procurando soluções para os traumatismos graves por transecção em nervos periféricos, na busca de reparação funcional, já que a ocorrência desse tipo de lesão é rotineira na prática clínica e sua recuperação pode necessitar de intervenção cirúrgica. No século II, Galeno (131-201 d.C.) já discorria sobre a potencialidade da regeneração neural (apud Geuna et al., 2006) e, situada entre os anos 1210 e 1277, encontra- se a descrição da primeira cirurgia em nervos periféricos, realizada por William de Saliceto, na Bolonha (apud Viterbo, 2003), tendo sido Gabrieli Ferrara, em 1596 (apud Artico et al., 1996), no entanto, o primeiro a descrever detalhadamente a técnica de sutura em nervos. Logo no início dos estudos em nervos periféricos foram publicadas as suturas término-terminais, bem como os enxertos de nervos sadios quando havia perda de tecido nervoso. Em 1851, já se sabia que o nervo, uma vez seccionado, sofreria degeneração no seu coto distal conforme a publicação intitulada Experiments on the section of the glossopharingeal and hipoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers, de Waller. Sunderland (1968) descreveu a anatomia interna do nervo e a sutura fascicular microcirúrgica utilizando informações e observações feitas em acidentados durante a II Guerra Mundial, quando neurorrafias e enxertos foram muito realizados. Revisão da Literatura 28 RRevisão da literatura Revisão da Literatura 29 2. REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Nervo Nosso Sistema Nervoso (SN) está preparado para nos conectar, perceber e responder ao meio ambiente externo e interno. Anatomicamente, o SN está dividido em SNC (parte protegida por estojos ósseos: esqueleto cefálico e coluna vertebral) e SNP (distribuído por todo o tecido mole do corpo). Dentre as estruturas que fazem parte do SNP encontram-se os nervos, conjuntos de fibras nervosas, que conectam as mais diversas partes do corpo ao SNC. Cada fibra nervosa periférica é constituída de axônio e uma bainha de neurilema. E de acordo com a disposição desta bainha de neurilema pode-se distinguir duas classes de fibras periféricas: fibras mielinizadas, onde as células de Schwann (neurolemócitos) envolvem apenas um axônio, individualmente, formando bainha de mielina; e as amielínicas, onde as células de Schwann envolvem grupos de axônios e não produzem mielina. Essas fibras nervosas, juntas, formam cordões esbranquiçados, razoavelmente fortes por estarem unidas por tecido conjuntivo, dispostos da seguinte forma: cada fibra é envolvida por um tecido conjuntivo muito delicado denominado endoneuro; envolvendo várias fibras com suas bainhas de neurilema mais o endoneuro aparece a segunda camada de tecido conjuntivo, denominada de perineuro, que funciona como uma barreira frente a substâncias estranhas, formando fascículos de fibras nervosas. A quantidade de fibras por fascículos é extremamente variável. Vários feixes são envolvidos pela terceira camada conjuntiva, o epineuro, constituindo o conjunto denominado de nervo. Esses revestimentos conjuntivos permitem microambiente próprio para a passagem de vasos sanguíneos e linfáticos, além da presença de uma população de células constituídas de fibroblastos (mais organizados no perineuro) e, ocasionalmente, macrófagos e mastócitos. Podemos utilizar diversos parâmetros para classificar os nervos, dentre eles, a direção do estímulo que o percorre: sensitivo (aferente – conduzem informações dos receptores sensoriais ao SNC) e motores (eferentes – conduzem informações do SNC aos órgãos periféricos, como glândulas e músculos) ou ainda mistos, quando apresentam os dois componentes. Revisão da Literatura 30 2.2 Lesão, degeneração e regeneração nervosa 2.2.1 Lesão Os nervos estão sujeitos às mais diversas alterações patológicas. Várias classificações foram feitas na tentativa de facilitar a compreensão das disfunções causadas por essas lesões, das quais duas ficaram mais conhecidas: a de Seddon (1943) e a de Sunderland (1968). Sunderland delineou cinco níveis de lesão do nervo - de grau I a V - que podem ser correlacionados aos três níveis de acometimento dos nervos apresentados por Seddon: neuropraxia, axoniotmese e neurotmese. Na neuropraxia, ou Grau I, há um bloqueio de condução (provocado por trauma ou isquemia local do nervo), sendo uma lesão a nível bioquímico (provavelmente na bainha de mielina) e não estrutural (Ferreira, 1999). A recuperação se dá sem ocorrer o processo de degeneração Walleriana, de forma rápida (alguns dias ou semanas), espontânea e completa (Batista & Araújo, 2010). Na axoniotmese, ou Grau II, o bloqueio de condução ocorre devido à perda de continuidade do axônio (normalmente provocada por esmagamento, tração excessiva ou trauma fechado do nervo), embora o tecido conjuntivo envolvente se mantenha preservado. Nessa situação ocorre a degeneração Walleriana dos axônios comprometidos no segmento distal à lesão. Axônios degenerados misturam-se a células macrofágicas e, simultaneamente, há proliferação abundante de células de Schwann (Henriques, 2004). A regeneração axonial permite recuperação funcional do nervo entre dois e seis meses (a regeneração ocorre em torno de um mm ao dia), o que é possível pelo fato de as bainhas conjuntivas manterem-se intactas (Roque, 2008). A neurotmese (forma mais grave de lesão nervosa), considerada por Seddon como a que leva à ruptura total dos nervos (causada por projéteis de arma de fogo, armas brancas, mordidas de animais ou fraturas com deslocamentos), foi classificada por Sunderland em três graus distintos: III, IV e V. O grau III apresenta ruptura axonial e da bainha mais interna, o endoneuro; o grau IV apresenta perda de axônios com rompimento do endoneuro e perineuro, mas com manutenção do epineuro; e o grau V representa realmente a ruptura total, com completa solução de continuidade, já que além do axônio, todas a bainhas conjuntivas Revisão da Literatura 31 (endoneuro, perineuro e epineuro) se romperam também. Neste caso, a atuação cirúrgica é inevitável para que se tente uma recuperação funcional. 2.2.2 Degeneração / Regeneração O modelo animal permite, por observação, compreender muito da regeneração axonial. Após uma lesão (neurotmese), é possível observar, em vários momentos distintos, o início de diversas alterações estruturais. Em seguida a uma ruptura, os corpos de neurônios correspondentes (tanto na área anterior da medula quanto no gânglio da raiz dorsal) apresentam aumento da atividade metabólica, que se dá em torno de seis horas pós-injúria, podendo permanecer do 4º ao 20º dia (Burnett & Zager, 2004), e que se caracteriza pelo aumento no tamanho e deslocamento do núcleo para a periferia, o qual se torna eosinófilo e sofre dispersão dos grânulos de Nissl, refletindo a prioridade em produzir neurotransmissores que estimulem o crescimento e a reparação axonial, como lipídeos, RNA mensageiro, tubulinas e fatores de crescimento, entre outros. Segue-se uma fase de supervivência e regeneração, levando em consideração a intensidade da agressão traumática (quanto maior a intensidade, mais intensa a reação retrógrada), a proximidade da lesão com o corpo do neurônio (quanto mais próximo, mais provável a morte celular), a idade do paciente (quanto mais jovem, melhor a resposta regenerativa) e a manipulação cirúrgica adequada. Outras consequências da lesão são a ruptura da barreira hematonervosa e a exposição a proteínas que atuam sobre os antígenos, podendo levar a uma reação autoimune e desencadear um ciclo de degeneração. O axônio seccionado responde ao trauma, distintamente, nos dois cotos resultantes: proximal e distal. No coto proximal, já na primeira hora aparecem modificações devido à resposta inflamatória, que afeta aproximadamente a extensão de 1 cm (Henriques, 2004), onde os restos de axônios e mielina vão sendo degradados, estendendo-se por um ou dois nódulos de Ranvier, caso a lesão esteja muito próxima do corpo celular pode haver apoptose (Lee & Wolf, 2000; Burnett & Zager, 2004). Observa-se, ainda, uma diminuição do diâmetro da bainha de mielina (da linha de incisão até o corpo celular), que pode ou não se recuperar mais tardiamente, embora persista uma perda de +/- 20%, segundo Henriques (2004). Se a degradação chegar ao corpo celular, o coto proximal também pode entrar no mecanismo dito “degeneração Walleriana” e é fagocitado. Ainda, esse coto se comporta como um sítio de intensa atividade, pois as células de Schwann multiplicam-se e migram formando as bainhas Revisão da Literatura 32 de Bungner (Batista & Araújo, 2010). No coto distal, como consequência da separação do centro trófico, a maioria dos axônios são reduzidos a detritos amorfos em 24 horas, ocorrendo o processo que tem seu início em um período de 48 a 96 horas pós-lesão, denominado “degeneração Walleriana” (Verdú et al., 2000). Há desorganização dos neurotúbulos e neurofilamentos, simultaneamente com a degeneração e a fragmentação da bainha de mielina, em 48 horas. A mielina fragmentada é transformada em gordura neutra, favorecendo a ação dos macrófagos hematógenos que, junto com os fragmentos de axônios, são eliminados. As células de Schwann tornam-se metabolicamente muito ativas, aumentam em número e ganham função fagocitária, devido às citocinas que são sintetizadas e secretadas pelos macrófagos. Também secretam fatores neurotróficos, as neurotrofinas (como por exemplo, o fator de crescimento neuronal - NEF e o fator neurotrófico derivado do encéfalo - BDNF), que entre outras funções, estimulam o crescimento axonial, pois se dispersam ao redor do axônio, em grande quantidade e, segundo Ide (1996), promovem a sobrevivência neuronal, estimulando o crescimento. Embora haja a fragmentação dos axônios e posterior fagocitose, as membranas conjuntivas são preservadas. Normalmente, após três semanas, encerra-se o mecanismo que leva à degeneração Walleriana. Após uma intervenção cirúrgica de aproximação dos cotos, a sequência de regeneração pode ser observada em cinco diferentes regiões: corpo celular, extremidade proximal (área de injúria até o corpo celular), área de injúria (propriamente dita), extremidade distal (área de injúria até o órgão-alvo) e órgão-alvo (Burnett & Zager, 2004). No corpo celular, o núcleo volta à sua posição central e os grânulos de Nissl se reorganizam. Há uma troca momentânea na função celular: a prioridade passa de transmissão sináptica para reparação celular. Para isso, o metabolismo celular é reprogramado a ponto de se tornar capaz de produzir uma larga quantidade de proteínas necessárias para a regeneração e o crescimento. As células de Schwann, no coto proximal, proliferam, alinham-se longitudinalmente e se organizam em colunas, as Bandas de Büngner, forrando os tubos endoneurais, orientando o novo crescimento axonial que ocorre mediado por fatores quimiotáteis (Stoll & Muller, 1999; Belkas et al., 2004; Campbell, 2008), favorecido pela criação desse microambiente adequado. De cada axônio partem de dois a três novos brotos. Distalmente a esses brotamentos nervosos há um cone de crescimento ou bulbo, cuja atividade determina a direção do crescimento nervoso (Lundborg, 2000; Henriques, 2004), com inúmeras projeções digitiformes que exploram esse microambiente e que apresentam a capacidade de estimular o alongamento axonial (através de fatores neurotróficos, fatores Revisão da Literatura 33 promotores de neuritos, precursores de matriz e fatores metabólicos), além de produzir proteínas que determinam limpeza do caminho até o órgão-alvo, dissolvendo a antiga matriz de mielina (Lee & Wolf, 2000). Regeneração axonial, porém, não é sinônimo de recuperação funcional. Para isso, é necessário também um processo de maturação. Mudanças morfológicas de maturação do axônio (restauração da dimensão e da velocidade de condução) prosseguem além da regeneração axonial, em velocidade bem menor, e se prolongam por aproximadamente um ano ou, dependendo do local da lesão, por até 5-6 anos (Hall, 2001), e a recuperação somente ocorrerá se houver restabelecimento da conexão com o órgão-alvo (Rovak et al., 2000). Segundo Verdú et al. (2000), Waldram (2003) e Henriques (2004), mesmo após longos períodos (pós-reparação), tanto a dimensão quanto a velocidade de condução permanecem abaixo dos valores normais. A orientação do avanço da extremidade depende das características do segmento distal. Na ausência de uma estrutura guia, os axônios regenerados tornam-se tortuosos, e formam-se os neuromas, brotos axoniais imaturos que não levam à reconexão músculo- nervosa (Favero et al., 2007). A média de crescimento do axônio é ainda muito discutida pelos autores: 0,5-3 mm/dia (Cardoso, 1992); 3-4 mm/dia e 2-3 mm/dia após esmagamento e ruptura, respectivamente (Stoll & Muller, 1999); apenas 1 mm/dia (Grant et al., 1999; Hall, 2001; Fernandez et al., 2007; Batista & Araújo, 2010). E é necessário também levar em consideração os principais fatores influentes na regeneração: o gap nervoso, a formação de neuromas, a extensão da lesão, a distância entre o corpo do neurônio e a extremidade a ser reparada, a idade do paciente e a técnica empregada para a reparação nervosa (Dourado et al., 2003). Aparentemente, o neurônio periférico humano mantém a capacidade de iniciar a regeneração por pelo menos até 12 meses depois da lesão (Burnett & Zager, 2004). Mas como consequência da perda de estímulos, o músculo, que é órgão-alvo do nervo motor, sofre progressiva atrofia já nas primeiras semanas, chegando à perda de 80 % de suas fibras em um período de quatro meses. Portanto, é geralmente aceito que, se não houve alcance do nervo até a placa motora em um período máximo de 12 meses, fica muito reduzida a chance de reparo funcional. Já os órgãos-alvos dos nervos sensoriais - corpúsculo de Ruffini, corpúsculos de Meissner e células de Merkerl - mantêm-se viáveis por um tempo bem maior, favorecendo a reparação sensorial (Siqueira, 2007). Revisão da Literatura 34 A regeneração do nervo periférico lesado, com uma completa reabilitação funcional, sensitiva e motora, continua sendo um desafio para os pesquisadores, quer pela falta de um entendimento completo dos fatores biológicos e moleculares envolvidos na regeneração neural, quer por deficiência da técnica operatória utilizada (Viterbo, 1992a). Na tentativa de diminuir as sequelas das lesões traumáticas dos nervos periféricos, como a perda de sensibilidade e motricidade (e suas consequências), além dos desajustes no córtex cerebral e uma desorganização no mapa cortical (Rosén et al., 2003; Siqueira, 2007), diversas técnicas foram desenvolvidas: 1- neurorrafia término-terminal (NTT) com sutura epineural (Millesi, 1984; Kline, 1990) e com sutura fascicular (Lundborg, 1987), sutura essa, que pode ser realizada com fios de diversos tipos (nylon, pdf) ou ainda através de adesivos biológicos, como a cola de fibrina (Viterbo et al., 1993; Nunes & Silva, 2008); 2- técnicas de tubulização com diversos materiais: polietileno (Gibson & Daniloff, 1989), silicone (Delistoinov et al., 2006), tubos de pericárdio bovino (Virmond & Pereira, 2000), tubo fibrocolagenoso envolto em fáscia (Watanabe et al., 2001), tubulização preenchida com fatores de crescimento ou fatores neurotróficos (Costa et al., 2006; 2009), com tecido adiposo (Moraes, 2009; Rosa Junior, 2010), túbulos biodegradáveis ou não (Ijkema-Paasen et al., 2004), veias invertidas ou não (Barcelos et al., 2003; Roque, 2008), tubulização venosa com m. esquelético (Battiston et al., 2000; Geuna et al., 2000); enxertos de nervos autólogos (Sunderland, 1991; Kotulska et al., 2006), enxertos heterólogos (Heath & Rutkwski, 1998); 3- implantes biossintéticos (Tansey et al., 2011). Todas essas técnicas necessitam ambos os cotos, proximal e distal, disponíveis. Muitas vezes o coto proximal não é viável, nesses casos sacrifica-se um nervo adjacente, que é seccionado, tendo o seu coto proximal utilizado como doador de fibras nervosas. Essa lesão determina sequelas ao nervo doador. Para evitar essa situação Viterbo et al.(1992a) introduziram a técnica da Neurorrafia látero-terminal (NLT), sem lesão do nervo doador. 2.3 Neurorrafia látero-terminal (NLT) Uma opção terapêutica surgiu com a NLT, representando um grande avanço na área de microcirurgia de nervos periféricos. Essa técnica parte do princípio que os axônios do nervo doador emergem pela parede lateral e adentram o nervo receptor (brotamentos laterais), restabelecendo a transmissão dos estímulos elétricos (Viterbo et al, 1992b; Viterbo & Faleiros, 2002; Lundborg, 2000; Lykissas, 2011), Essa técnica é especialmente indicada Revisão da Literatura 35 quando o segmento proximal do nervo não está disponível (Yamauchi et al., 2001; Zhang & Fisher, 2002; Matsuda et al., 2005; Samal et al., 2006), situação essa frequentemente encontrada em patologias como paralisia facial e lesões do plexo braquial. Outra situação em que essa neurorrafia vem sendo utilizada é quando o intervalo entre o coto proximal e o coto distal é acentuadamente grande, necessitando longo enxerto de nervo. Nessa situação a NLT é a alternativa, pois o coto distal pode ser suturado na lateral de algum nervo próximo ao mesmo. Evitando-se enxertos longos de nervo obtém-se recuperação mais rápida, diminuindo sequelas especialmente motoras. Outra vantagem da neurorrafia seria superar a diferença de calibre entre os nervos a serem coaptados (Brown, 1972; Rodrigues & Perez, 2009) e não alterar a função do nervo doador (Luo et al., 1997; Ögun et al., 2003; Sato, 2005; Lykissas, 2011). Na literatura, há controvérsias quanto à denominação desta técnica. Se utilizado como parâmetro a direção dos axônios, de doador para o receptor, teremos uma neurorrafia látero (porção lateral do nervo doador) – terminal (porção terminal do nervo receptor), ou ainda, uma neurorrafia término (porção terminal do nervo doador) – lateral (porção lateral do nervo receptor). Embora, o termo Neurorrafia término-lateral (NTL), tenha sido utilizado de forma genérica para ambas as situações, Dellon et al. (2010) chamaram a atenção para a necessidade de usar-se nomenclatura que defina exatamente o modo com que foi feita a neurorrafia. As primeiras descrições a respeito da utilização da NLT de que se tem notícia são de 1873 e 1895, quando Létiévant e Ballance (apud Ballance et al., 1903), respectivamente, dela fizeram uso em situações de espasmos faciais. Através de incisão na lateral do nervo acessório foi suturado o segmento distal do nervo facial seccionado. Houve retorno dos movimentos faciais, porém de forma associada aos movimentos do ombro, o que não trouxe resultados satisfatórios. Em 1899, Kennedy et al. (apud Al-Qattan, 2001; Zhang & Fisher, 2002) e em 1903, Ballance et al., com a mesma abordagem, trataram patologias semelhantes, porém com incisão maior no nervo doador, feita por Kennedy et al., deixando praticamente apenas o epineuro do lado oposto à NLT intacto. Obtiveram movimentos facias, porém associados aos movimentos do ombro, o que representou resultado inadequado. Em 1901, Barrago e Ciarella (apud Viterbo, 1992a) encontraram resultados semelhantes em cães. Essa técnica, preconizada desde Sherren (1906), ressaltava a importância de secção (longitudinal ou transversal) no nervo doador, praticamente abrindo-o, fazendo com que parte do nervo ficasse comprometido, determinando seqüelas às áreas por ele inervadas e, conseqüentemente, prejuízos ao paciente, levando Babcock (1927) a recomendar o abandono dessa NLT. Revisão da Literatura 36 Os maus resultados daquela época eram agravados pela ausência de microscópio cirúrgico, só introduzido a partir de 1964, e de materiais cirúrgicos inadequados para lesões de tão pequenas dimensões (Lykissas, 2011). Após grande intervalo na literatura, Krivolutskaia et al. (1989) publicaram uma NLT suturando o segmento distal do ramo mandibular (ramo do n. trigêmeo) à lateral do ramo bucal (ramo do n. facial), mas fazendo escarificações com agulhas na lateral do nervo doador. May & Drucker (1993) propuseram a sutura do coto distal do nervo facial à lateral do nervo hipoglosso após incisão parcial neste último, determinando sequelas menores do que as obtidas com NLT do facial ao hipoglosso. Mesmo assim esta proposta determinou sequelas na movimentação da língua. Em 1992 Viterbo et al. introduziram novo conceito de ligação em nervos periféricos, ou seja a NLT ou NTL, sem lesão no nervo doador, inclusive em nervos delgados, sem retirada de janela epineural. Em nervos mais espessos, como nos nervos do plexo braquial, Viterbo et al. recomendam confecção da janela epineural. Os autores observaram que as três camadas de tecido conjuntivo eram absorvidas permitindo que os axônios sofressem brotamentos laterais (sprouting) e penetrassem nos tubos endoneurais do nervo receptor. Essa contribuição foi muito importante, pois a partir daí qualquer nervo passa a ser doador em potencial. Diversos autores confirmaram os achados de Viterbo (1992a/b) e Viterbo et al. (1992) (Lundborg et al. (1994a/b), Ross et al. (1995), Noah et al. (1997). Lundborg et al (1994a/b) ratificaram histologicamente a presença de axônios no segmento nervoso fixado, após 35 dias; e após 90 dias, através da estimulação do nervo tibial, observaram movimentos do m. gastrocnêmio e do m. tibial anterior, sugerindo que fatores provenientes do coto nervoso fixado induziriam os brotamentos laterais de axônios intactos. Outros autores, entretanto, não obtiveram os mesmos resultados de Viterbo et al. (1992a/b). Bertelli et al. (1996) realizou estudo experimental e observou os animais após três e seis meses da cirurgia, sendo a união dos nervos realizada com cola de fibrina. Estes autores não obtiveram resultados funcionais e não realizaram estudos histológicos. Al-Qattan e Al- Tunyan (1998) realizaram NLT com suturas epineurais e sacrificaram os animais após 50 dias, não encontrando regeneração axonial. Em 1995 e em 1998, Viterbo et al. estudaram a NLT com e sem janela de epineuro, encontrando os mesmos resultados. Com modelo experimental semelhante, Matsuda et al. Revisão da Literatura 37 (1995), Battat et al. (1996), Cao et al. (1997), Dourado et al. (2003) e Lykissas (2011), encontraram resultados semelhantes, ou seja, com ou sem fenestrações no epineuro. Em 1998, Tham & Morrison encontraram evidências de axônios mielinizados no nervo receptor, sem nenhuma evidência de dano para o nervo doador e apresentaram resultados com 60% de recuperação na força de contração após três meses da realização da NLT com janela epineural. Giovanolli et al. (2000) utilizando a técnica da NLT sem janela epineural, enfatiza que além de não haver prejuízo para o nervo doador, seus músculos nervo-dependentes também não apresentam prejuízo funcional. Cao et al. (1997), Zhao et al. (1997) e Rosseto et al. (2001) não encontraram igualmente diferença significativa na capacidade de regeneração neural após a NLT, com ou sem janela de epineuro. Zhang et al., em 2000, realizando observação em um período de 8 a 12 meses de pós-operatório e, em 2001, um período de dois a três meses de pós-operatório, encontraram respostas funcionais semelhantes para NLT com ou sem janela epineural, embora o perfil histológico das fibras axoniais das NLT com janela epineural fossem melhores. Em 2001, Yamauchi et al., usando a ação da acetiltransferase, encontraram recuperação funcional após NLT sem janela epineural, observando três meses de pós- operatório e, em 2007, Noditi et al., após uma observação de até dois anos de pós-operatório, constataram que a presença do epineuro não só não interfere na reconstituição axonial, como também não impede a passagem do estímulo elétrico. Haninec et al. (2012) concluíram que a sutura epineural não invade o conteúdo neural, é simples, de fácil execução, não necessitando de grandes amplificações, e observaram, em 13 pacientes, após utilizar a NLT em nervos axilares em paralisia do plexo braquial, reinervação e reconstituição funcional entre sete e doze meses, através de métodos eletrofisiológicos e funcionais. Kalliainen et al. (1999), Haastert et al. (2010) e Frutan et al. (2011), compararam as duas técnicas: NLT com NTT utilizando modelo experimental semelhante, sendo o nervo fibular comum utilizado para a NTT e, para a NLT, o nervo tibial funcionou como doador após ter o coto distal do nervo fibular comum suturado a sua parede lateral. Kalliainen et al. demonstraram que não havia diferença significativa em recuperação de força, após seis meses de cirurgia, Haastert et al., não encontraram diferenças no estudo eletrofisiológico, após oito semanas, embora tenham encontrado uma quantidade maior de axônios mielinizados na distal de uma NTT e Frutan et al. não encontraram diferenças na análise funcional (IFI De Medinaceli - Índice funcional do n. isquiático segundo De Medinaceli), após 16 semanas. Revisão da Literatura 38 Mennen (1998a) utilizou a NLT em estudo em primatas (babuínos) com resultados satisfatórios, confirmado histologicamente com os brotamentos laterais e recuperação funcional através de testes eletrofisiológicos e empregou também a técnica em humanos (1998b e 2003). Em 1998 utilizou a técnica em 22 pacientes e utilizando testes de condução elétrica, demonstrou que, além de respostas clínicas satisfatórias, havia recuperação motora e sensorial. Em 2003, Mennen conseguiu bons resultados utilizando a técnica em 56 pacientes, nas mais diversas injúrias, desde avulsão do plexo braquial até lesões dos nervos digitais, encontrando os melhores resultados na reinervação do m. bíceps (motor) e na reinervação da pele da palma da mão (sensitiva). Amr & Moharram (2005) também relatam sucessos em 11 pacientes tratados com paralisia do plexo braquial com a NLT e enxertos através de NLT . Haninec et al. (2012) utilizaram em pacientes, com bons resultados, na reinervação do nervo axilar. Em 2005, Bontioti et al. e em 2006, Ozbek & Kurt conseguiram bons resultados utilizando apenas um nervo doador para dois nervos receptores lesionados (nn.radial e/ou mediano e/ou ulnar suturados ao n. musculocutâneo e nn. sural e fibular comum suturados ao n. tibial, respectivamente), e algumas associações começaram a aparecer, como por exemplo, o uso da NLT associado ao laser de baixa potência (Gigo-Benato et al., 2004) e a eletroestimulação (Maciel, 2011).Tanto a associação com o laser quanto a eletroestimulação mostraram favorecer a velocidade da reparação, sendo eficientes na recuperação funcional do músculo e do nervo. Relatos de sucesso em reconstruções de nervos sensitivos passaram a ser frequentes: Viterbo (1993), Lundborg et al. (1994b), Tarasidis et al. (1998), Kanje et al. (2000), Frey & Giovanoli (2003), Ögun et al. (2003), Yüksel et al. (2004), Voche & Quattara (2005), Kovacic et al. (2007) e Noditi et al. (2007). Frey & Giovanoli (2003) relataram dois casos, o n. digital ulnar do polegar suturado à lateral do n. mediano e outro, o n. digital ulnar do dedo anelar suturado à lateral do n. radial do mesmo dedo. A sensibilidade foi recuperada em ambos pacientes, sem alterações na sensibilidade da área do nervo doador quando comparado ao correspondente contralateral, acreditando ser esse o modelo ideal para o estudo em regeneração sensorial. Yüksel et al. (2004) obtiveram bons resultados em dois casos extremos que não teriam nenhuma chance de reparo direto, suturando n.ulnar à lateral do n. mediano e em outro caso, suturou os nn. mediano e radial ao n. ulnar. Em 1998, Tarasidis et al. e, em 1999, Matsumoto et al. sugerem que apenas os axônios sensitivos é que teriam brotamento lateral após a NLT. Pannucci et al., em 2007, e Dvali & Revisão da Literatura 39 Myckatyn, em 2008, após uma revisão de literatura, acrescentaram que, embora os axônios motores também respondam com brotamentos laterais, somente os sensitivos é que responderiam sem nenhuma lesão deliberada no nervo doador. Em contrapartida, Lundborg et al., Sawamura & Abe e Tham & Morrison, em 1994b, 1997 e 1998, respectivamente, descreveram ótimos resultados para os brotamentos laterais em axônios motores, enquanto Samal et al. (2006) e Dubový et al. (2011) relataram resultados com capacidade similar, tanto para axônios motores quanto para os sensitivos. Autores como Lutz et al. (2000), Terzis & Papakonstantinou (2000) levantaram a importância de se trabalhar com nervos com alta contagem axonial, após observarem que o n. mediano apresentava diferença de reinervação se suturado na parede do n. ulnar ou do n. radial, apresentando melhores resultados quando suturado ao n. ulnar. Com esse volume de trabalhos confirmando os achados de Viterbo (1992a), deu-se início a uma discussão sobre qual seria o mecanismo de regeneração nervosa após a NLT. A teoria mais aceita, apontada por Viterbo em 1992ab, é a capacidade do nervo em emitir brotamentos laterais, o que também foi enfatizado por diversos outros autores (Liu et al, 1999; Zhang et al., 1999; 2000; Kanje et al., 2000; Giovanoli et al., 2000; Yamauchi et al., 2001; Hayashi et al., 2004; Zhu et al., 2005; Bontioti et al., 2005; Flores, 2006; Pondaag & Gilbert, 2008; Zhu et al., 2008; Beris & Lykissas, 2009; Cheng et al., 2011; Dubový et al., 2011). O mecanismo pelo qual ocorre o brotamento lateral ainda não está bem esclarecido. Para alguns autores (Zhu et al., 2005 e 2008; Beris & Lykissas, 2009; Lykissas, 2011) o brotamento lateral seria obtido a partir de estímulos proporcionados pelas neurotrofinas (fatores de crescimento tipo-insulina I e II, fatores de crescimento nervosos, fatores de crescimento de fibroblastos, fator ciliar neurotrófico (CNTF), assim como fatores associados ao contato físico no ponto anastomótico) provenientes da região do nódulo de Ranvier do nervo doador, mais próximo ao local da fixação dos nervos; ou, ainda, seria o resultado de uma combinação desses sinais ou fatores, que além de promoverem o brotamento lateral também são capazes de promover o crescimento axonial (Fortes et al., 1999; Caplan et al., 1999; Bajrovic et al., 2002). As células de Schwann passariam para o epineuro do nervo receptor, preparando a passagem dos axônios intactos provenientes do brotamento lateral, brotamentos esses que apresentam múltiplos filopedia, os quais aderem à lâmina basal da célula de Schwann, utilizando-a como guia (Lundborg, 2000; Campbell, 2008; Geuna et al., 2009; Batista & Araújo, 2010). Zhu et al. (2005) desenvolveram a micro-tease technique, uma técnica que demonstra o brotamento lateral de fibras do nervo doador, inúmeras pequenas fibras na região Revisão da Literatura 40 mais próxima do primeiro nódulo de Ranvier, a partir do local da NLT. As neurotrofinas liberadas pelas células de Schwann usariam como meio de transporte o epineuro e seriam transferidas, por difusão, ao perineuro e endoneuro (Noah et al., 1997; Al-Qattan & Al- Thunyan, 1998; Liu et al., 1999). Ainda, a presença da célula de Schwann, contendo laminina e fribonectina, favorece o avanço da regeneração axonial, pois estimula tanto a região do nódulo de Ranvier do nervo doador quanto o coto distal do nervo receptor (Tarasidis et al., 1997), em que a distância dessa regeneração é limitada mais pela extensão dos processos das células de Schwann do que propriamente pelo crescimento axonial (Flores et al., 2000; Betini, 2010), já que o axônio para de crescer se, ao invés de encontrar as colunas formadas pelas células de Schwann, adentrar em tecido conectivo. Uma variação da técnica descrita por Viterbo et al. (1994b) e, posteriormente, confirmada por outros autores como Lykissas et al., 2007 e Lykissas, 2011, mostra que tanto o coto proximal quanto o distal poderiam ser suturados na lateral do nervo doador. A vantagem teórica seria que os brotamentos axoniais do coto proximal cresceriam pelo nervo doador e aumentariam o número de fibras nervosas no coto distal, receptor. Jung et al. (2009) acrescentaram que o coto proximal, que em outra técnica seria inviável e inútil, nesta contribuiria para estimular o aparecimento de mais um sítio de brotamento lateral. Distintos nervos coaptados a um único nervo doador, também foi experimentado (Ozbek & Kurt, 2006). Outra variação da técnica, também bastante recente, é o embraçamento, por meio da qual o nervo receptor abraça o nervo doador e é preso a ele mediante um único ponto, sendo especialmente indicado para áreas cirúrgicas mais profundas (Viterbo et al., 2012). Recentemente, novas indicações para a NLT foram introduzidas, como para a reinervação em paralisia de m. orbicular dos olhos (Sundine et al; 2003); recuperação em paralisia de pregas vocais (Liu et al., 2005), recuperação sensitiva em paraplégicos (Viterbo & Ripari, 2008), prevenção e/ou solução para os neuromas dolorosos (Ayan et al., 2007; Viterbo & Ripari, 2008; Aszmann et al, 2010; Batista & Araújo, 2010), e utilização em nervos autonômicos (Dong et al., 2012; Gao et al., 2012). As pesquisas prosseguiram buscando melhores resultados funcionais após secção de nervo periférico com a NLT, para isso, além das variações na técnica original e a diversidade de indicações, também foram sendo associadas diferentes substâncias, dentre as quais citamos: 1 - adesivos biológicos, ao invés de suturas, como cola de fibrina (Viterbo et al., 1993; Nunes & Silva, 2008); 2 - fatores de crescimento ou fatores neurotróficos (Flores et al., Revisão da Literatura 41 2000; Johnson et al., 2008); 3 - agentes farmacológicos (Atikins et al., 2007; Casha et al, 2008), entre esses, os imunossupressores vem sendo estudados. 2.4 FK-506 Tacrolimus, também conhecido como FK-506 ou Fujimicin (C44H69O12), é um antibiótico macrolídeo com ação imunossupressora, produzido pelo Streptomyces tsukubaensis, descoberto em 1984, por Goto et al, no solo da cidade de Tsukuba, na região norte do Japão. A droga recebeu, inicialmente, o nome completo de FK900506, e foi relatada pela primeira vez no 11º Congresso Internacional da Sociedade de Transplante, realizado em Helsinki, em 1986, já apresentada como FK-506. No ano seguinte, foi demonstrado como opção terapêutica quando apareceu na literatura o primeiro relato experimental, in vitro e em animais. Entre 1987 e 1988 foi desenvolvido o primeiro uso de ELISA para quantificá-lo. Em 1989, foram feitos os primeiros ensaios clínicos, em Pittsburgh, e em 1991, durante o 1º Congresso Internacional sobre FK-506, realizado também nessa cidade, foram apresentadas informações relativas a mecanismo de ação, eficiência clínica, toxidade e metabolismo (Wallemacq & Reding, 1993). Em 1992 essa droga passou a ser designado também com o nome de Tacrolimus, resultante da união do nome da bactéria que o produz e sua ação - Tsukubaensis Macrolide Immunossupressant (Kino et al., 1987a,b). Aprovado pela FDA (Food and Drug Administration - US), em 1994, para uso em transplantes (fígado, rim, coração, intestinos, pâncreas, pulmão, pele, córnea, medula óssea e demais órgãos) (Selzner et al., 2001), o mesmo vem sendo comercializado pela empresa Asteltas Pharma Inc., com os nomes comerciais Prograf®, Advagraf®, Protopic® e Tacrolimus®, e pela empresa Janssen-Cilag Pty Ltd, com o nome de Prograf-XL®. Revisão da Literatura 42 2.4.1. Estrutura química do FK-506 Tacrolimus é um pó branco que, dissolvido em acitonitrila e mantido em baixa temperatura, toma a forma de prismas cristalinos. O Tacrolimus puro, em forma de prismas, resulta da recristalização. É insolúvel em água (hidrófobo) e solúvel em metanol, etanol, acetona e etil acetato. 2.4.2. Indicação e mecanismo de ação Sua primeira e principal indicação é como droga imunossupressora, com a função de impedir a rejeição do aloenxerto no transplante de órgãos (Starzl et al., 1989; Garcia et al., 2004; Prada, 2004). O FK-506, com base no sítio de ação imunorregulatório, é classificado como inibidor de transcrição do primeiro sinal para ativação do linfócito T, pois se difunde prontamente para o citoplasma da célula T (Armstrong & Oellerich, 2001). O FK-506 atua na via de sinalização de cálcio, inibindo a atividade da calcineurina (proteína fosfatase 2B - ativada por cálcio) somente após se ligar a uma diferente imunofilina, a fk-bining protein isoenzyme 120 (FKBP- 12 / fosfatase 2B), interferindo nessa via de transdução no sinal de imunoativação das células T (Thomson et al., 1995; Scott et al., 2003). As imunofilinas ligadoras do FK-506 (FKBPs) se associam a receptores de glicocorticoides ou de progesterona, por meio da ação de proteínas de fase aguda da inflamação (heat shock proteins). A ligação do FK-506 aos receptores de glicocorticóides protege-o contra a degradação ou inativação, promovendo a sua translocação Revisão da Literatura 43 para o núcleo e potencializando a sua ligação no DNA, inibindo a transcrição de diversas citocinas inflamatórias e mimetizando o efeito dos corticóides (Thomson et al., 1995). Também inibe a ativação das células B, através de sua ação sobre as células T e sobre o bloqueio da transcrição do gene TNF-a por um anticorpo Ig (Fagiuoli et al., 1992; Estévez, 2004). Tem uma atividade similar à da Ciclosporina, embora com estrutura química diferente. Estudos indicam que o FK-506 tem maior potência imunossupressora, mesmo em menor volume. In vitro, o Tacrolimus é de 10 a 100 vezes mais potente (Kino & Goto, 1993; Jain & Fung, 1996; Scott et al., 2003; Garcia et al., 2004), enquanto seus efeitos colaterais, como a nefrotoxicidade, são menores (Wang et al., 1997). 2.4.3. Apresentação e dosagem Os nomes comerciais utilizados são Prograf® e Advagraf®, comprimidos de 0,5 mg, 1,0, 3,0 e 5,0 mg, sendo o Advagraf® de liberação prolongada. São também apresentados na forma líquida, em ampolas de 1,0 e 5,0 mg/ml, e numa formulação tópica, o Protopic®, de 0,1% e 0,03%. O Prograf-XL®, da Janssen-Cilag, é apresentado em forma de blisters, com dosagem de 0,5 mg, 1,0 e 5,0 mg, com liberação gradual (Peters et al., 1993; Australian Public, 2010). A dose inicial é de 0,075 – 0,3 mg/kg/dia para adultos e 0,15 – 0,3 mg/kg/dia para crianças. 2.4.4. Absorção, concentração sérica e metabolização A absorção dessa droga é rápida, porém pobre e incompleta no trato gastrointestinal, determinando biodisponibilidade que varia entre 4 % a 89 %, sendo em média de 20 % a 25 %, e não é influenciada pela bile, o que lhe confere uma vantagem particular em transplante hepático. Sua concentração sérica máxima é alcançada entre 30 e 60 minutos ou, na administração oral, após 1-2 horas; depois, circula ligada a proteínas plasmáticas, linfócitos e hemácias e sofre extensa metabolização via fígado e, em menor grau, na mucosa intestinal, resultando em mais de 15 metabólitos. A meia-vida de eliminação média é de dez horas, sendo sua depuração maior em crianças, e reduzida na presença de severa disfunção hepática (Spencer et al., 1997). Revisão da Literatura 44 O FK-506 pode ser quantificado em níveis sanguíneos, em soro, no sangue total ou no plasma, embora segundo Ventakamanan et al., (1991), seja difícil desenvolver uma técnica específica e sensível, devido à sua baixa absorção e concentração no plasma e no sangue. No sangue total, é encontrado em uma concentração de 10 a 30 vezes maior que no plasma, porque é sequestrado pelos eritrócitos (Moreira, 2008). A concentração sanguínea total deve permanecer entre 10 µg/l e 15 µg/l, em um período curto, e entre 5 µg/l e 10 µg/l, após períodos mais longos. Distribui-se na maioria dos tecidos e atravessa a placenta (1/3 da concentração encontrada no plasma materno), sendo que os níveis observados no leite materno são similares aos encontrados no plasma e, segundo Scott et al. (2003), mesmo em pacientes com neurotoxicidade referente à droga, não aparece no fluído cerebroespinal. 2.4.5. Efeitos colaterais Uma das principais desvantagens do FK-506 é o efeito diabetogênico (Scott et al., 2003), cuja incidência é dose-dependente, e diminui quando seu nível sérico encontra-se abaixo de 10 ng/ml. Pode apresentar condições neurotóxicas como tremores, cefaleias, parestesia, agitação, ansiedade, labilidade emocional, confusão mental, depressão ou euforia, distúrbios de cognição, pesadelos, sonolência, vertigens e enxaquecas. Em ratos, uma dose única de 100 mg/kg foi relatada como letal; em doses repetidas, mostrou efeitos tóxicos em alguns órgãos, como por exemplo, no rim (1,5 a 3,2 mg/kg/dia por 13 semanas), no pâncreas (diabetogênese) e no sistema nervoso, onde doses superiores a 5 mg/kg/dia levaram a efeitos tóxicos mínimos sobre os nervos periféricos, enquanto doses acima de 3,2 mg/kg afetaram o SNC (Estévez, 2004). Não foram evidenciados sinais carcinogênicos em estudos de mais de um ano, em ratos e babuínos, nem potencial embriotóxico (Estévez, 2004), embora uma complicação comum tenha sido o nascimento prematuro com baixo peso corporal (Ramos et al., 2008). 2.4.6. Influência na regeneração axonial Outras indicações têm sido relatadas na literatura, como cicatrização de feridas (Francaville et al., 1989), regeneração de células hepáticas em humanos, estimulação de crescimento de cabelos em mamíferos (Yamamoto et al., 1994); ação neuroprotetora (Castilho Revisão da Literatura 45 et al., 2000) e, mais recentemente, em colites ulcerativas, dermatite atópica severa (Castro, 2006) e vitiligo infantil (Reyes-Perez & Medeiros-Domingues, 2006). Dois relatos, em 1994, demonstraram a possibilidade de o FK-506 estar influenciando a capacidade de regeneração neural in vitro (Lyons et al.) e in vivo (Gold et al.). Outros autores, como Gold et al. (1995), Wang et al. (1997), Fansa et al. (1999) e Doolabh & Mackinnon (1999), descreveram experimentos em que o FK-506 demonstrou acelerar a recuperação funcional através de aumento no crescimento neural ou acelerando o amadurecimento dos brotos neurais. Steiner et al. (1997) descreveram crescimento axonial também em fibras dopaminérgicas e serotonérgicas. Em 1998, Madsen et al. relataram que o FK-506 pode melhorar resultados funcionais em injúrias do SNC, em humanos. Muitos estudos vêm sugerindo papel neuroprotetor no SNC (Butcher et al., 1997; Guo et al., 2001; Benetoli & Milani, 2002) e neurorregenerador no SNP (Lyons et al., 1994; Gold et al., 1995; Wang et al., 1997; Yeh et al., 2007). A teoria do mecanismo de ação aceita, que tenta explicar a atuação do FK-506 sobre a regeneração neural, é a de que, além da ação inibidora da atividade da calcineurina, o FK-506 se ligaria à imunofilina FKBP-12, aumentando a fosforilação do gap-43 (proteína associada de crescimento), ativando-a (Gold & Villafranca, 2003; Hayashi et al., 2005). O gap-43 tem papel relevante no processo de alongamento axonial (Lyons et al., 1994). O FKBP-12 (peso molecular 12kd) é uma proteína que, mediada pelo FK-506 (complexo FK506-FKBP-12), tem a capacidade de inibir a proliferação de célula T, sendo encontrada, também em neurônios ao lado da calcineurina. Portanto, o aumento da regeneração axonial poderia advir do aumento da fosforização ativada por esse complexo, via Gap-43, pela sua capacidade de inibir a atividade da calcineurina (Gold et al., 1995; Gold & Villafranca, 2003). A partir daí, as hipóteses levantadas para a aceleração da regeneração axonial pressupõem que a administração por diferentes períodos levaria ao aumento do número de fibras mielinizadas (Wang et al., 1997; Doolabh & MacKinnon, 1999), ou axônios mais extensos (Wang et al., 1997) e fibras mais longas (Doolabh & Mackinnon, 1999), situações essas possíveis por existir um menor número de destruição dos brotos regenerativos e um aumento no processo de mielinização. Mas em estudos também de Wang et al. (1997), em que se comparava a ação do FK- 506 e da Ciclosporina A sobre a regeneração neural, observou-se que há uma grande separação entre a propriedade imunossupressora e a capacidade de favorecer a regeneração nervosa, pois a Ciclosporina, que apresenta o mesmo mecanismo de ação, não tem nenhuma influência sobre a regeneração nervosa, resultado também observado por Gold & Villafranca Revisão da Literatura 46 (2003) e Cheng et al. (2011). Esta afirmação é contraposta pelo trabalho de Bain et al. (1992), que traz resultados considerados excelentes com o uso da Ciclosporina A. Outras hipóteses foram levantadas (Snyder & Sabatini, 1995; Wang et al., 1997),como a atuação direta do FKBP-12 ativando o TGF-β1, que é conhecido por estimular a síntese do NGF (fator de crescimento neuronal) em células gliais, e neste caso conseguiria ter atuação direta no crescimento axonial, mas ainda sem respaldo científico. Yang et al. (2003) estudaram os efeitos de doses diferentes de FK-506 na regeneração periférica nervosa para determinar se a neurorregeneração poderia ser realçada sem a toxidade da imunossupressão sistêmica. As análises histomorfométricas demonstraram melhorias estatisticamente significativas na neurorregeneração, verificadas nos 30º e 35º dias do pós- operatório, com doses de 0,5 a 1,0 mg/kg/dia. Este estudo demonstrou que a neurorregeneração esteve realçada em doses baixas de FK-506, doses menores até do que as necessárias para a ação como imunossupressor. Sobbol et al. (2003) e Brenner et al. (2004; 2005) estudaram o efeito do FK-506 na neurorregeneração, administrado dias após a cirurgia, para observar se reteria suas propriedades neurorregenerativas quando o início da terapia fosse retardado em direção ao reparo cirúrgico. Mostraram que os efeitos benéficos do FK-506 na neurorregeneração não estão restritos à administração imediata, mas que embora aconteçam, esses efeitos diminuem, significativamente, quando o FK-506 é administrado três dias após a lesão do nervo. A grande contribuição desses autores é a informação de que a administração dessa droga deve ser iniciada no dia da cirurgia. Hayashi et al. (2005) compararam a atuação do FK-506 e da Ciclosporina em diferentes situações, como a sobrevivência de fibroblastos enxertados, neuroproteção e a influência sobre o crescimento axonial. Em 2008, Yildirim et al. relataram melhoras na reparação axonial do n. obturatório. Em 2012, Yan et al. comprovaram que o FK-506 acelera a regeneração tanto em nervos seccionados quanto em enxertos nervosos. Os ratos foram, na grande maioria, o modelo animal para estes estudos, mas, em 2004, Diaz et al. usando coelhos, demonstraram superioridade na regeneração após o uso de FK-506 tópico (comparado a grupos controles), através do preenchimento de túbulos para reparação de nervo craniano seccionado (n. facial). E em 2006, Hontanilla et al. utilizaram como modelo Revisão da Literatura 47 de estudo também o n. facial, mas agora em macacos. Macacos também foram utilizados como modelo de estudo da atuação do FK506 em aloenxertos (Auba et al., 2006). O FK-506 já foi utilizado em aloenxerto de nervos periféricos em humanos, mas somente a sua capacidade imunossupressora foi analisada, não tendo sido avaliada, porém, a capacidade de influir sobre a regeneração axonial (Mackinnon et al., 2001). Embora se encontre uma vasta literatura sobre o uso do FK-506, somente uma publicação estudou o efeito neurorregenerativo na NLT (Chen et al., 2009). O estudo foi realizado em 30 ratos “Sprague-Dawley”, dividido em três grupos. O grupo A (10 ratos) foi tratado com NTT, o grupo B (10 ratos) com NLT recebendo 1,0 mg/kg/dia de solução salina e o grupo C, tratados com NLT recebendo 1,0 mg/Kg/dia de FK-506, durante quatro semanas. A partir da 2º semana de pós operatório, sendo repetido a cada duas semanas (4ª. 6ª, 8ª e 12ª), foram realizados estudos funcionais utilizando-se do IFI De Medinaceli. Na 12ª semana foi realizado o estudo histológico. Em ambos os estudos, funcional e histológico, o grupo que recebeu a droga mostrou diferenças estatísticas com relação ao grupo controle, o que levou os autores a indicarem o uso da NLT associada a FK-506 em casos selecionados de lesões de nervos periféricos, na clínica médica. Portanto, temos que levar em consideração que as lesões de nervos periféricos são muito prevalentes, estando presentes em 5 % das feridas abertas em extremidades, devido a esportes e acidentes automobilísticos (Ijkema-Paassen et al., 2004; Campbell, 2008). Também são responsáveis por 80-90 % das lesões do plexo braquial (Carvalho & Samii, 2003). Após o reparo dessas lesões, na maioria das vezes, se faz necessário tempo prolongado de afastamento do trabalho, mudança de função e, às vezes, aposentadoria (Portincasa et al., 2007; Jaquet et al., 2001). Anualmente a cada trinta mil pessoas, uma apresenta quadro de paralisia facial (principalmente devido ao vírus herpes). As cirurgias de ressecções de tumores e trações durante nascimentos também podem, frequentemente, acarretar lesões nos nervos periféricos (Nehme et al., 2002). Em todas essas situações a NLT é técnica cirúrgica a ser considerada em qualquer parte do corpo (Pardini Jr et al., 2005). Embora as pesquisas tenham avançado muito, a completa reparação da função neural ainda não é obtida (Höke, 2006; Casha et al, 2008). Além de expor a vida do paciente, essas lesões interferem na qualidade da mesma e ainda acarretam custos socioeconômicos (Evans, 2000; Ruis et al., 2005). Tentando obter melhores resultados na NLT decidimos estudá-la associando-a com uso do FK-506. Objetivo 48 OObjetivo Objetivo 49 3. Objetivo Estudar se a administração de FK-506 traria benefícios na regeneração de nervo periférico após neurorrafia látero-terminal. Método 50 MMétodo Método 51 4. Método Toda a parte experimental desse trabalho foi realizada no Laboratório Experimental do Departamento de Cirurgia e Ortopedia (cirurgia, manutenção dos animais durante o período de experimentos e teste de avaliação da marcha (Walking Track Analysis) e no Laboratório de Pesquisa em Nervos Periféricos e Reinervação do Departamento de Urologia (teste eletrofisiológico, sacrifício dos animais, coleta das peças histológicas, confecção e leitura das lâminas histológicas), ambos pertencentes ao Centro de Pesquisa Experimental da Faculdade de Medicina da UNESP, Campus de Botucatu. 4.1 Animais Foram utilizados oitenta ratos (Rattus norvegicus), da linhagem Wistar, machos, com massa inicial, em média, de 210 g (2 meses), provenientes do Biotério da Universidade Estadual Paulista / UNESP – Campus de Botucatu. Todos os procedimentos cirúrgicos, executados pelo pesquisador para os quatro grupos estudados, foram aprovados pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina da UNESP – Campus de Botucatu, pelo Protocolo nº549 (anexo 9.1). Estando os procedimentos de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal adotado pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA). Todos os animais foram submetidos aos mesmos procedimentos cirúrgicos e, em seguida, distribuídos aleatoriamente em quatro grupos constituídos de 20 animais, sendo Grupo Controle (GC - não recebeu nenhuma droga) e Grupos I (GI), II (GII) e III (GIII) que receberam 1,0 mg/Kg/dia, 0,5 mg/Kg/dia e 0,25 mg/Kg/dia, respectivamente, durante dois meses, via subcutânea, diariamente e tendo seu início logo após a cirurgia. 4.2 Procedimentos cirúrgicos Inicialmente os animais tiveram suas massas aferidas e, em seguida, anestesiados com pentobarbital sódico na dose de 30 mg/Kg, intra-peritonealmente (i.p.). Realizou-se a tricotomia e assepsia com PVPI (polivinilperrolidona-iodo). Método 52 Os animais foram posicionados em decúbito ventral e realizou-se a incisão de 2 a 3 cm na região dorsal da coxa esquerda, longitudinalmente ao maior eixo do membro, comprometendo pele e tecido subcutâneo. A musculatura foi divulsionada e os nervos isquiático, tibial e fibular comum dissecados. O nervo fibular comum foi seccionado e a sua extremidade proximal encurvada para trás, aproximadamente em um ângulo de 100º, e implantada no interior da musculatura abdutora (Fig.1A). A extremidade distal do nervo fibular comum, foi suturada término-lateralmente ao nervo tibial (NLT), sem remoção do epineuro, através de dois pontos com fio nylon monofilamentar 10-0 com agulha cilíndrica e circular (Fig.1B). A NLT foi realizada com auxílio de microscópio cirúrgico DF Vasconcelos com aumento de 16x. A incisão foi suturada por planos, muscular e cutâneo, com fio nylon 5- 0 preto, utilizando-se pontos simples. No lado direito nenhum procedimento foi realizado. Após a cirurgia, os animais foram abrigados em caixas apropriadas contendo cinco animais cada, alimentados (ração e água ad libitum) durante todo o estudo sob condições ambientais, respeitando 12 horas de luz por dia e temperatura controlada (25ºC ± 2ºC), sem limitação de movimento, por dois meses, no Biotério do Laboratório Experimental do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da Faculdade de Medicina da UNESP – Campus de Botucatu. Fig.1- (A) Coto proximal do n. fibular comum sepultado e fixado à musculatura adjacente. (B) Coto distal do n. fibular comum fixado (2 pontos) na lateral do n. tibial. A B Método 53 4.3 Testes utilizados 4.3.1 Teste de Avaliação da Marcha (TAM) No laboratório Experimental do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP, os animais foram previamente treinados e condicionados a andar em corredor de 78 cm x 9 cm coberto por uma tira de papel branco de tamanho adequado, após terem as patas posteriores pintadas com tinta nanquim preta para marcar as pegadas no papel branco (Fig. 2A, 2B, 2C e 2D). Fig.2 - (AB) Técnicos passando a tinta nas patas traseiras do rato e conduzindo o mesmo no corredor da marcha. (CD) Fitas com as marcas das patas dos ratos. As medidas obtidas a partir das pegadas referentes ao MCL (Membro Contralateral, normal) e ME (Membro Experimental), deixadas nas folhas de papéis brancas, foram descritas a seguir: A B C D Método 54 APN - Abertura do passo contralateral (normal). Distância entre a pata MCL e a pata ME. (“to other foot” – distância de uma pata a outra) N - Normal APE - Abertura do passo experimental. Distância entre a pata ME e a pata MCL (“to other foot” – distância de uma pata a outra) E - Experimental CPN - Comprimento da pata contralateral (normal). Tamanho total da pata contralateral. (“print leght” – distância do calcanhar aos artelhos) N - Normal CPE - Comprimento da pata experimental. Tamanho total da pata experimental (“print leght” – distância do calcanhar aos artelhos) E - Experimental ATAN - Abertura total dos artelhos da pata contralateral (normal). (“ total spread” - distância entre o 1º e o 5º artelhos) N - Normal ATAE - Abertura total dos artelhos da pata experimental (“ total spread” - distância entre o 1º e o 5º artelhos) E - Experimental AIAN - Abertura entre os artelhos intermediários da pata Contralateral (normal). (“intermedies toes” - distância entre o 2º e 4º artelhos) N - Normal AIAE - Abertura entre os artelhos intermediários da pata experimetal (“intermedies toes” - distância entre o 2º e 4º artelhos) E - Experimental Método 55 Faz-se necessário lembrar que, valores quanto mais próximos a -100 (menos cem) indicam perdas funcionais, e valores próximos a 0 (zero) indicam animais sem alterações funcionais (0% - normalidade e 100% - déficit total de função / Monte-Raso, 2006). As medidas obtidas foram utilizadas para o cálculo do Índice Funcional do Nervo Isquiático descrito por De Medinaceli et al. (1982) (IFI De Medinaceli), para o índice modificado por Bain et al. (1989) (IFI Bain) e também para o índice específico para a lesão do nervo Fibular (IFF Bain). Em situações em que o animal não apresentou uma caminhada normal, faltando as impressões nítidas necessárias para obtenção das medidas (Fig. 3AB), no lado experimental, foram atribuídos valores arbitrários, segundo orientação de De Medinaceli et al. (1982): APE - 1/3 da distância entre as duas pegadas normais. APN - 2/3 da mesma distância. CPE - 80 mm. ATAE - 6 mm. AIAE - 6 mm. Método 56 Fig. 3 – (A) Seta – Impressão nítida da pata, permitindo medidas. (B) Seta – Impressão não nítida, valores arbitrários são atribuídos. 4.3.2 Estudo eletrofisiológico Em todos os animais, o teste eletrofisiológico do músculo tibial cranial (MTC) e a condução do nervo fibular comum foi realizado imediatamente antes do sacrifício, em temperatura ambiente mantida em torno de 25ºC. Foi utilizado eletromiógrafo da marca Shappire II 4ME (Fig. 4A), no Laboratório de Pesquisa em Nervos Periféricos e Reinervação do Departamento de Urologia da Faculdade de Medicina – UNESP / Campus de Botucatu. Após a anestesia (critérios iguais aos utilizados para a cirurgia), os animais foram imobilizados em decúbito ventral, realizadas a tricotomia e ampla incisão no membro posterior esquerdo (ME) permitindo acesso aos nervos isquiático, tibial, fibular comum, área de NLT e o músculo tibial cranial. O nervo tibial e o sural foram seccionados distalmente, aproximadamente 1 cm abaixo da NLT, evitando assim a passagem de correntes elétricas espúrias. Para o registro do potencial de ação, um eletrodo (eletrodo de referência, vermelho) foi introduzido no tendão do MTC e, um eletrodo (eletrodo ativo, preto) foi introduzido no ventre do músculo tibial cranial do rato. Ainda um terceiro eletrodo (eletrodo dispersivo, cinza) foi introduzido em um músculo distante da região do teste. Os eletrodos, ativo e de referência, sempre distavam 1 cm um do outro (Fig. 4B). O eletrodo de estimulação bipolar, A B Método 57 que deflagra o estímulo elétrico, foi posicionado diretamente sobre o nervo isquiático, proximal à NLT, permitindo a propagação dos impulsos elétricos através dele. A intensidade do estímulo foi de 5,1 volts, a frequência fixada em 1 pps e a duração em 100 µs, dados mantidos para todos os animais. Foram registrados a amplitude (mV) e a latência (ms) do potencial de ação muscular composto (CMAP), em seis conjuntos de medidas para cada animal, sendo escolhido apenas um conjunto, observando a medida que apresentava a maior amplitude registrada. Fig. 4 – (A) Eletromiógrafo Shappire II 4ME. (B) Posicionamento dos eletrodos (estimulação bipolar proximalmente à NLT e os eletrodos de captação em agulha localizados no MTC). 4.4 Sacrifício e coleta de peças histológicas Os animais tiveram sua massa aferida momentos antes do estudo eletrofisiológico e para análise histológica foram retirados os MTCs (direito e esquerdo), o coto distal (N1) e proximal (N2) do nervo fibular comum, área de NLT - segmento do n. tibial e coto distal do n. fibular comum que participavam da NLT (N3) e o n. fibular comum (N4) do MCL. Os animais foram sacrificados, imediatamente, com uma dose letal de pentobarbital sódico administrado i.p. (Fig. 5A e 5B) B A Método 58 Fig. 5 - (A) N1 – Segmento distal do n. fibular comum esquerdo – (ME). N3 – Região da NLT – (ME). (B) N2 - Segmento proximal do n.fibular comum esquerdo - (ME). N4 - Segmento do n. fibular comum direito – para controle - (MCL). N.Ciático N. Fibular comum N. tibial 4.4.1 Aferição da massa corporal e do MTC A massa corporal e o MTC foram aferidos. O MTC direito (MLCL - músculo do lado contralateral) e o MTC esquerdo (MLE – músculo do lado experimental) foram pesados sem o tendão. Fig.6 - Retirada do MTC. Secção transversal do MTC comprometendo toda a sua espessura. 6 N1 N3 Esquerdo Direito N1 N2 N3 N4 Método 59 4.4.2 Processamento histológico das fibras musculares (Análise morfológica e morfométrica) Os músculos tibiais craniais de todos os ratos foram removidos, fixados e mantidos em nitrogênio líquido (-196 ºC) até o momento do processamento histológico. Os músculos foram submetidos a secções transversais, com espessura de 5 µ, na porção central do músculo, comprometendo toda a sua espessura (Fig. 6), utilizando o Criostato Leica CM 1850. Foram realizadas, em média, cinco cortes de um mesmo músculo, permitindo a análise de um corte com menos artefatos histológicos. As lâminas foram identificadas com o número de registro do laboratório, para que o pesquisador não soubesse, no momento da análise, a que grupo o animal pertencia. A numeração real foi revelada apenas no momento da análise estatística. Foram coradas em Hematoxilina-Eosina (HE) e os cortes histológicos foram analisados no microscópio LEICA-DMLB, com lente objetiva de 20x e aumento total de 200x. As imagens foram digitalizadas usando o software Sigma Pro Image, versão 5.0, da Jardel Scientific Corporation. Digitalização das imagens das lâminas histológicas do MTC. Para escolha dos cortes com menos artefatos, as lâminas histológicas foram analisadas ao microscópio óptico (MO) em menor aumento (50x). Para análise das fibras musculares foi utilizado aumento de 200x. As imagens estudadas foram salvas em microcomputador Pentium IV 3.2 HT, 1 GB DDR, HD 80 GB, após serem capturadas por uma câmara digital Leica DFC 280. Fig.7 – Escolha de 5 fibras musculares por imagem. 7 Método 60 Foram analisadas 50 fibras musculares, para cada membro (ME e MCL), de cada animal, usando o software Sigma Pro Image, versão 5.0, da Jardel Scientific Corporation. Para cada lâmina histológica foram digitalizadas dez imagens (dez campos distintos), e em cada um dos campos foram medidas cinco fibras musculares, totalizando 50 fibras para cada lâmina estudada. Para cada campo foram medidas fibras que apareciam por inteiro, localizadas na porção mais externa de cada quadrante e uma fibra central. Isso totalizou 2000 fibras por grupo estudado, sendo 1.000 para o MLE e 1.000 para o MLCL. Morfometria das fibras musculares Para a morfometria das fibras musculares (8.000), digitalizadas e salvas, foram utilizadas as seguintes medidas: área, diâmetro máximo, diâmetro mínimo e número total de fibras musculares por campo tomadas de maneira semiautomática. As medidas foram organizadas em tabelas e calculadas as médias e desvios padrões. 4.4.3 Processamento histológico dos segmentos nervosos Os segmentos de nervo coletados, coto distal (N1) e proximal (N2) do nervo fibular comum esquerdo, local da neurorrafia (N3) e nervo fibular comum direito (N4) foram fixados em solução de Karnovisk (período superior a 24 horas), passaram por lavagem em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,3) por três vezes, com duração de 5 minutos cada vez e posteriormente sofreram pré-coloração com tetróxido de ósmio a 1 % por 2 horas, refrigerados a 4 ºC até o momento dos procedimentos rotineiros do processamento histológico até a coloração. Após nova lavagem com tampão fosfato, foi realizada desidratação por uma bateria de concentrações crescentes de acetona (50 %, 70 %, 90 % e 100 %). A inclusão em resina Araldite® foi realizada em duas etapas: em solução de resina e acetona (1:1), permanecendo por 24 horas em dessecador; e em resina, após dez minutos em dessecador, permanecendo em estufa a 37 ºC por 1 hora. O emblocamento foi realizado posicionando-se o segmento de nervo em resina Araldite® e mantido em estufa a 60 ºC por 48 horas para polimerização. Os blocos foram preparados para o corte histológico através da eliminação de excesso de resina ao redor do segmento do nervo (trimados) com auxílio de uma lupa Carl Zeiss Jema adaptada, em aumento de 1,6x e lâmina Gillette®. Método 61 Em cortes transversais, foram analisados os seguintes segmentos: segmento distal do nervo fibular comum esquerdo (N1) e segmento do nervo fibular comum direito (N4). Cortes semi-finos (0,5 µm) foram feitos em micrótomo Leica MZ6. Após o corte, a lâmina foi aquecida sobre uma chapa a 45 ºC para secagem e pré-aderência do corte à lâmina do vidro. Para a coloração foi utilizado azul de toluidina 1 % durante cinco minutos, manualmente. Os seguintes segmentos: coto proximal do nervo fibular comum esquerdo (N2) e região da NLT (N3) foram analisados em cortes longitudinais. Após os mesmos procedimentos descritos acima até a realização dos cortes semi-finos, as lâminas foram submetidas à coloração de prata de Bielschowsky. Digitalização das imagens das lâminas histológicas dos segmentos nervosos. Ao MO, em aumento de 100x, foi feito a escolha do corte histológico com menos artefatos, e em aumento de 400x realizou-se a análise das fibras nervosas. As imagens foram salvas em microcomputador Pentium IV 3.2 HT, 1GB DDR, HD 80 GB, previamente capturadas por uma câmera digital Leica DFC 280. As medidas foram feitas utilizando-se software Sigma Pro Image Analysis, versão 5 da Jande Scientific Corporation, de modo semiautomático. Foram salvas duas imagens de diferentes campos de um mesmo corte histológico. Fig.8 – Escolha de cinco fibras nervosas por imagem. 8 Método 62 Medidas dos segmentos nervosos Os segmentos N1 e N4 (cortes transversais) foram submetidos à mensuração das seguintes medidas: área, diâmetro máximo, mínimo e número total das fibras nervosas por campo. As medidas foram feitas de modo semiautomático utilizando-se software Sigma pro Image Analysis, versão 5 da Jandel Scientific Corporation. Análise de brotamento axonial lateral Os segmentos N2 e N3 (cortes longitudinais) foram submetidos à análise das condições das fibras nervosas e do brotamento axonial lateral (crescimento dos axônios do nervo doador para dentro do nervo receptor), respectivamente. O estudo das fibras nervosas, digitalizadas e salvas, foram organizados em tabelas e feitas às médias e desvios padrões. 4.5 Análise estatística Para comparação dos grupos, entre si, foram aplicados testes de normalidade, para posterior aplicação de testes paramétricos ou não-paramétricos. Em uma segunda fase, o teste não paramétrico escolhido foi o de Kruskal-Walls (ANOVA) para amostras independentes e o Teste de Friedman seguido do teste T-Student e teste Tukey para amostras dependentes (Silva & Azevedo, 2009). Em toda a análise foi utilizado o nível de significância p < 0,05 (ou 5 % de significância). Resultados 63 RResultados Resultados 64 5. RESULTADOS Durante as oito semanas de estudo, com exceção de dois animais que foram a óbito antes do sacrifício (ratos 11 e 19 – GC), os animais se mantiveram saudáveis, sem infecções ou úlceras neurodistróficas plantares. 5.1 Massa corporal As médias e desvios padrões das massas iniciais dos animais foram de 200 g (± 0,51) para o GC, de 210 g (± 0,02) para o GI, de 200 g (± 0,01) para GII e de 207 g (± 0,02) para o GIII. O Teste de Friedman, para amostras independentes seguidos de teste T, mostrou não haver diferença na massa inicial entre os grupos (p < 0,001), porém, ao final, houve aumento significativo de massa, em todos os animais. O GC apresentou aumento de massa de 155 %, o GI de 122 %, o GII de 80 % e o GIII de 131 %. Para verificar quais grupos diferiam, foi aplicado o método de comparações múltiplas, que mostrou haver diferenças significativas entre as médias das massas iniciais e as massas finais em todos os grupos, sendo o GC com o maior ganho de massa, diferindo do GIII e GI, que não deferiram entre si, e esses foram maiores que o GII, o qual apresentou o menor ganho de massa, diferindo de todos os grupos (p < 0,001). Com relação à massa final, as médias e os desvios padrões foram de 510 g (± 0,06) para o GC, de 468 g (± 0,06) para o GI, de 360 g (± 0,01) para o GII e de 478 g (± 0,06) para o GIII. O Teste de Friedman, para amostras independentes seguidos de teste T, mostrou que o GC foi maior diferindo do GIII e GI, que não deferiram entre si, e esses foram maiores que o GII (360 g ± 0,01), o qual apresentou a menor massa, diferindo de todos os grupos (p < 0,001) (Tab. 1 – Fig. 9). TABELA 1 - Massa Individual Inicial (g) x Massa Individual Final dos animais (g) Média e Desvio padrão Grupos Massa Inicial (g) Massa Final (g) GC 200 (± 0,51) 510 (± 0,06) GI 210 (± 0,02) 468 (± 0,06) GII 200 (± 0,01) 360 (± 0,01) GIII 207 (± 0,02) 478 (± 0,06) Teste Friedman para amostras independentes seguidos de Teste T (p < 0,001). Massa inicial: GC = GI = GII = GIII / Massa final: GC > GIII = GI > GII. Resultados 65 Massa inicial e final (g) dos animais Fig. 9 – Teste Friedman para amostras independentes seguidos de Teste T (p < 0,001) Massa inicial: GC = GI = GII = GIII / Massa: final: GC > GIII = GI > GII. Letras diferentes indicam diferenças estatísticas (p < 0,001). As massas individuais dos animais aferidas no início e ao final do experimento estão na tabela A dos Anexos. 5.2 Massa do MTC As médias e desvios padrões das massas dos MTCs dos MLEs foram de 0,608 g (± 0,16) para o GC, de 0,640 g (± 0,17) para o GI, de 0,391 g (± 0,05) para o GII e de 0,574 g (± 0,16) para o GIII. As médias e desvios padrões das massas dos MTCs dos MLCLs foram de 0,927 g (± 0,09) para o GC, de 0,934 g (± 0,23) para o grupo GI, de 0,712 g (± 0,01) para o GII e de 0,905 g (± 0,14) para o GIII. Se compararmos a perda da massa muscular entre o MLCL e o MLE, de um mesmo grupo, encontramos uma perda para o GC de 0,062 %, para o GI de 0,063 %, para o GII de 0,106 % e de 0,069 % para o GIII. O Teste F seguido do Teste T student mostrou, tanto para o MLCL como para o MLE, que o GC, GI e GIII não diferiram entre si, e esses foram maiores que o GII, o qual apresentou a menor massa, diferindo de todos os grupos (p < 0,001) (Tab. 2 – Fig. 10). a a a a b c c d Resultados 66 TABELA 2 - Massa (g) do MTC para o MLCL x Massa (g) do MTC para o MLE Média e Desvio padrão Grupos MLCL MLE GC 0,927 (± 0,09) 0,608 (± 0,16) GI 0,934 (± 0,23) 0,640 (± 0,17) GII 0,712 (± 0,01) 0,391 (± 0,05) GIII 0,905 (± 0,14) 0,574 (± 0.16) Teste F seguido do Teste T student (p < 0,001). GII < GC = GI = GIII – Tanto para o MLCL quanto para o MLE. Massa (g) dos MTCs dos MLCLs e dos MLEs Fig. 10 – Teste F seguido do Teste T student (p < 0,001). GII < GC = GI = GIII – Tanto para o MLCL quanto para o MLE Letras diferentes indicam diferenças estatísticas (p < 0,001). As massas dos MTCs individuais aferidas para os MLCLs e para os MLEs estão na tabela B dos Anexos. 5.3 Teste de Avaliação da Marcha (TAM) As médias e desvios padrões do TAM segundo os índices IFI De Medinaceli, IFI Bain e IFF Bain foram, respectivamente de 27 % (± 0,076), 84 % (± 0,226) e 80 % (± 0,259) para o GC, de 19 % (± 0,124), 66 % (± 0,312) e 63 % (± 0,250) para o GI, de 18 % (± 0,124), 61 % (± 0,333) e 62 % (± 0,371) para o GII e de 24 % (± 0,100), 82 % (± 0,170) e 67 % (± 0,39) para o GIII. O Teste de Kruskal-Wallis mostrou não haver diferença significativa entre os a a a c b b b b Resultados 67 grupos para os três índices (p = 0,102 para o IFI De Medinaceli, p = 0,144 para o IFI Bain e p = 0,313 para o IFF Bain) (Tab. 3 – Fig. 11). TABELA 3 - Média e Desvio Padrão dos Índices funcionais Grupo IFI De Medinaceli IFI Bain IFF Bain GC 27 % (± 0,076) 84 % (± 0,226) 80 % (± 0,259) GI 19 % (± 0,124) 66 % (± 0,312) 63 % (± 0,250) GII 18 % (± 0,124) 61 % (± 0,333) 62 % (± 0,371) GIII 24 % (± 0,100) 82 % (± 0,170) 67 % (± 0,390) Teste de Kruskal-Wallis GC = GI = GII = GIII. (IFI De Medinaceli - p = 0,102; IFI Bain – p = 0,144; IFF Bain – p = 0,313). Média dos Índices funcionais em % (IFI De Medinaceli, IFI Bain, IFF Bain) Fig. 11 - Teste de Kruskal-Wallis - GC = GI = GII = GIII. (IFI De Medinaceli - p = 0,102; IFI Bain – p = 0,144; IFF Bain – p = 0,313). Letras diferentes indicam diferenças estatísticas. Os resultados dos índices para cada animal estão na tabela C dos Anexos. 5.4 Teste eletrofisiológico As médias e desvios padrões dos resultados da latência foram de 2,28 ms (± 1,07) para o GC, de 4,04 ms (± 6,94) para o GI, de 3,37 ms (± 0,51) para o GII e de 4,89 ms (± 6,69) para o III. O Teste de Kruskal-Wallis mostrou não haver diferença entre os grupos (p = a a a a b b b b c c c c Resultados 68 0,209). Para a amplitude, as médias e desvios padrões foram de 7,42 mV (± 4,62) para o GC, de 7,73 mV (± 5,63) para o GI, de 10,02 mV (± 6,49) para o GII e de 9,05 mV (± 5,29) para o GIII. O teste de Kruskal-Wallis mostrou que houve diferenças estatísticas entre os GC e o GII, sendo a maior média apresentada pelo GII que diferiu do GC, mas não diferiu do GI e GIII (p = 0,019) (Tab. 4 – fig. 12). TABELA 4 - Médias e Desvios Padrões dos resultados obtidos no estudo eletrofisiológico Grupo Latência (ms) Amplitude (mV) GC 2,78 (± 1,07) 7,42 (± 4,62) GI 4,04 (± 6,94) 7,73 (± 5,63) GII 3,37 (± 0,51) 10,02 (± 6,49) GIII 4,89 (± 6,69) 9,05 (± 5,29) Teste de Kruskal-Wallis Anova - GII > GC = GI = GIII. (latência (ms) -p = 0,209; amplitude (mV) - (p = 0,019). Médias obtidas no estudo eletrofisiológico Figura 12 - Teste de Kruskal-Wallis - GII > GC = GI = GIII. latência (ms) -p = 0,209; amplitude (mV) - p = 0,019. Letras diferentes indicam diferenças estatísticas. Os resultados da latência e amplitude para cada animal estão na tabela D dos Anexos. a b a b c a b a Resultados 69 5.5 Estudo histológico das fibras musculares Morfologia Em todos os grupos estudados, as fibras dos MLCLs, apresentaram características morfológicas típicas de uma fibra muscular estriada esquelética. O contorno celular era preferencialmente poligonal, com tamanhos equivalentes entre si, núcleos periféricos e agrupadas em fascículos, delimitadas por tecido conjuntivo relativamente frouxo (Figs. 13 A, B, C, D). Nos MLEs, as fibras apresentaram-se com discreto polimorfismo, algumas vezes com diminuição da sua área, mas não havia aumento de espessura do co