Arq Bras Oftalmol. 2009;72(1):152-8 Mitomycin C toxicity in rabbit corneal endothelium Trabalho realizado no Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e Cabeça e Pescoço da Faculdade de Medicina de Botucatu da UNESP - Botucatu (SP) - Brasil. 1 Professora Livre-Docente, Adjunta do Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e Cabeça e Pes- coço da Faculdade de Medicina de Botucatu. Universi- dade Estadual Paulista - UNESP - Botucatu (SP) - Brasil. 2 Professora Titular do Departamento de Morfologia do Instituto de Biociências da UNESP - Botucatu (SP) - Brasil. Endereço para correspondência: Maria Rosa Bet de Moraes Silva. Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP, Departamento de Oftalmologia, Otorrinolarin- gologia e CCP - Distrito de Rubião Júnior s/n, Botucatu - SP - CEP 18618-970 E-mail: rosabet@fmb.unesp.br Recebido para publicação em 03.04.2008 Última versão recebida em 09.02.2009 Aprovação em 17.02.2009 Maria Rosa Bet de Moraes Silva1 Elisa Aparecida Gregório2 Toxicidade da mitomicina C ao endotélio da córnea de coelhos Descritores: Endotélio, córnea; Mitomicina/toxicidade; Microscopia eletrônica de transmis- são; Microscopia eletrônica de varredura; Humor aquoso/metabolismo; Corpo vitreo; Coelhos Objetivo: Avaliar alterações do endotélio corneano após aplicação de mitomicina C na esclera por meio de microscopia eletrônica de transmis- são e de varredura e correlacionar as alterações com tempo, concentração e entre os dois métodos de avaliação. Métodos: Foi avaliado o endotélio corneano dos olhos de 32 coelhos albinos distribuídos em 4 grupos experimentais com 8 coelhos cada um. A mitomicina C foi aplicada sob retalho escleral no olho direito por 5 minutos. Nos grupos G1 e G2 a concentração da mitomicina C foi de 0,5 mg/ml e nos grupos G3 e G4 a concentração foi de 0,2 mg/ml. O exame foi realizado com 15 dias após nos grupos G1 e G3 e com 30 dias nos grupos G2 e G4. Dos 8 animais 4 foram preparados para microscopia eletrônica de transmissão e 4 para microscopia eletrônica de varredura. Os olhos esquerdos de todos animais serviram como controle. Resultados: À microscopia eletrônica de trans- missão foram observadas alterações do endotélio corneano em todos os grupos experimentais: rarefação do citoplasma, dilatação e fragmenta- ção das cisternas do retículo endoplasmático rugoso, aparelhos de Golgi com dilatação das cisternas, redução de vacúolos e irregularidades da membrana celular interna sendo mais intensas em G1 e G2. À microscopia eletrônica de varredura foram observadas alterações em todos grupos experimentais, exceto G1: alteração de forma e tamanho das células e projeções filopoidais mais longas. Conclusões: 1 - A mitomicina C causou alteração no endotélio da córnea tanto na concentração de 0,5 mg/ml como de 0,2 mg/ml observadas 15 e 30 dias após a aplicação; 2 - As alterações foram mais intensas com a maior concentração de mitomicina C (0,5 mg/ml) na microscopia eletrônica de transmissão e não na microscopia eletrônica de varredura; 3 - As alterações tiveram correlação com o tempo na microscopia eletrônica de varredura e não na microscopia eletrônica de transmissão. RESUMO INTRODUÇÃO A mitomicina C (MMC) é um antibiótico antimitótico alquilante deri- vado do Streptomyces caespitosus que inibe a síntese de DNA(1) e tem sido amplamente utilizada em oftalmologia, principalmente em cirurgias anti- glaucomatosas para reduzir a “fibrose” pós-operatória. A MMC aplicada em superfícies oculares externas como a esclera, pode no entanto penetrar no olho e atingir o humor aquoso(2-7). Estudos mostra- ram que após aplicação da MMC na esclera foram observadas lesões tóxicas 72(2)02.pmd 15/4/2009, 13:27152 Arq Bras Oftalmol. 2009;72(1):152-8 153Toxicidade da mitomicina C ao endotélio da córnea de coelhos no corpo ciliar(8-15). Estas lesões tóxicas observadas no corpo ciliar por meio de estudos morfológicos poderiam explicar complicações que ocorrem no pós-operatório de cirurgias antiglaucomatosas, como a hipotonia(8). Uma vez na camada anterior, a MMC poderia causar alte- rações tóxicas também no endotélio da córnea. Recentemen- te foi descrita ceratopatia bolhosa adjacente ao local da tra- beculectomia com o uso de MMC associada às irregularida- des e à necrose de células endoteliais no mesmo local(16). Apesar da MMC ser muito utilizada em todo o mundo em vários tipos de cirurgias antiglaucomatosas, cirurgias refrativas e outras, há poucos estudos que avaliem suas possíveis altera- ções na córnea. Os estudos existentes são controversos em rela- ção às alterações e à redução do número de células endote- liais(17-19). Estes estudos diferem, no entanto, quanto ao tempo de observação, métodos de avaliação, formas de aplicação, concentração, uso de irrigação, o que dificulta comparações. O objetivo deste estudo foi o de avaliar alterações do endotélio corneano de coelhos, após aplicação de MMC na esclera, por meio de microscopia eletrônica de transmissão (MET) e microscopia eletrônica de varredura (MEV) e obser- var se há correlação das alterações entre os dois métodos, com o tempo e com a concentração. MÉTODOS Foi realizado estudo experimental que avaliou o endotélio da córnea por microscopia eletrônica de transmissão e por micros- copia eletrônica de varredura de ambos os olhos de 32 coelhos albinos sadios da raça Norfolk, de ambos os sexos. Os animais foram distribuídos em 4 grupos experimentais de 8 coelhos cada um. O grupo 1 (G1) recebeu 0,5 mg/ml de mitomicina C no OD e foi examinado 15 dias após, o grupo 2 (G2) recebeu 0,5 mg/ml de mitomicina C no OD e foi examinado 30 dias após, o grupo 3 (G3) recebeu 0,2 mg/ml de MMC no OD e foi examinado 15 dias após e o grupo 4 (G4) recebeu 0,2 mg/ml de MMC no OD e foi exa- minado 30 dias após. Os olhos esquerdos (OE) de todos os animais formaram o grupo controle. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP (Pro- tocolo nº 124 CEEA). Após exame dos olhos dos coelhos com auxílio de micros- cópio cirúrgico foi feita abertura conjuntival de base fórnice e retalho escleral de aproximadamente 1/2 espessura medin- do 4/4 mm de lado, localizado entre os músculos reto superior e reto lateral. A MMC (Mitocin® - Bristol - Meyrs Squibb Brasil S/A) foi aplicada nos olhos direitos (OD) sob o retalho, com auxílio de fragmento de algodão estéril que media apro- ximadamente 4 mm de lado, embebido em 0,1 ml de solução de MMC de diferentes concentrações conforme o grupo. O fragmento de algodão foi aplicado durante período de 5 mi- nutos em todos os grupos. Os olhos esquerdos (OE) foram submetidos ao mesmo procedimento cirúrgico, diferindo apenas quanto à solução que embebia o fragmento de algodão que era solução fisiológica (cloreto de sódio a 0,9 mg/ml). Após a retira- da do fragmento de algodão todos os olhos foram irrigados com 20 ml de solução fisiológica. O retalho escleral foi suturado com 2 pontos separados de mononylon 10-0 nas extremidades do mesmo, e a conjuntiva com 1 ponto conjuntivo-escleral de vicryl 7-0, na extremidade medial da abertura. Logo após exame clínico dos olhos sob microscópio cirúr- gico, os animais foram eutanasiados com dose letal de pento- barbital sódico a 4%. Foi realizada enucleação dos olhos e 4 córneas de cada grupo foram processadas para microscopia eletrônica de transmissão e 4 córneas de cada grupo para mi- croscopia eletrônica de varredura. A região da córnea adjacente ao retalho escleral foi processa- da para MET sendo recortada em fragmentos de 1 mm de lado. Os fragmentos foram fixados por imersão em glutaraldeido a 2,5% no tampão fosfato 0,1 M (pH 7,3), pós-fixados em tetró- xido de ósmio 1% no mesmo tampão e incluídos em Araldite. Foram feitos cortes semifinos, que foram corados com azul de toluidina a 1% em solução de bórax a 1% por 15 minutos em platina aquecida. O exame das lâminas assim preparadas permi- tiu a seleção das áreas para o exame ultraestrutural. O exame à MET foi feito em cortes ultrafinos contrastados com acetato de uranila 0,5% em solução alcoólica 50% e citrato de chumbo. As córneas processadas para MEV foram seccionadas ao meio e apenas a parte superior (que estava mais próxima do retalho escleral) foi analisada. As córneas foram fixadas em glutaraldeído 2,5% em tampão fosfato 0,1 M pH 7,3, pós- fixadas em tetróxido de ósmio a 0,5% em água destilada, desidratadas em série crescente de álcool, secadas em ponto cítrico com CO 2 líquido, montadas em “stubs” e metalizadas com 15 nm de ouro. Foi feita análise qualitativa das elétron-micrografias de forma mascarada. Foram analisados à MET os seguintes com- ponentes celulares: membrana plasmática e junções celula- res, retículo endoplasmático rugoso (RER), complexos de Golgi, vacúolos e presença/ausência de rarefação no cito- plasma. À MEV foi avaliada a morfologia celular (forma e tamanho comparativo das células) e as projeções filopoidais. Considerou-se o endotélio do grupo controle (OE) como pa- drão de normalidade. As alterações observadas à MET e à MEV foram comparadas. RESULTADOS A avaliação clínica dos olhos tanto do grupo controle como dos grupos experimentais, realizado imediatamente an- tes da eutanásia revelou córneas transparentes sem alteração. No entanto, foram observadas alterações morfológicas nos olhos dos grupos experimentais à MET e à MEV que estão resumidas na tabela 1. Microscopia eletrônica de transmissão (MET) Nos olhos do grupo controle (OE) o endotélio apresentou células com citoplasma com grande número de organelas e 72(2)02.pmd 15/4/2009, 13:27153 154 Toxicidade da mitomicina C ao endotélio da córnea de coelhos Arq Bras Oftalmol. 2009;72(2):152-8 mais denso na parte posterior da célula. As mitocôndrias esta- vam mais concentradas ao redor do núcleo e o grande número de cisternas do retículo endoplasmático rugoso (RER), con- centrado nas laterais das células. Havia grande número de complexos de Golgi bem desenvolvidos e preferencialmente concentrados ao redor do núcleo (Figura 1A). A membrana celular interna apresentava aspecto regular. A membrana ce- lular externa (próxima à membrana de Descemet) apresentava vários vacúolos (Figura 1B). Todos os olhos dos grupos experimentais (OD) subme- tidos à aplicação da MMM independente da concentração apresentaram à MET do endotélio corneano: rarefação do citoplasma (Figura 2A), dilatação e fragmentação das cis- ternas do retículo endoplasmático rugoso (RER) (Figura 2B) e aparelhos de Golgi menores, com dilatação das cis- ternas, redução de vacúolos próximos à membrana de Des- cemet e irregularidades da membrana interna. Houve, no entanto, variação de intensidade, sendo as alterações mais intensas em G1 e G2 (0,5 mg/ml) do que nos grupos G3 e G4 (0,2 mg/ml). Não foi possível observar diferença quanto ao tempo de observação quando foi usada a concentração de 0,5 mg/ml, mas com a concentração de 0,2 mg/ml as alterações foram mais intensas após 30 dias (G4). Microscopia eletrônica de varredura (MEV) No grupo controle o endotélio apresentou-se constituído por células de formato hexagonal regular e com projeções citoplas- máticas nas regiões de junção. Outras projeções esparsas fo- ram observadas homogeneamente distribuídas na superfície celular (Figura 3). A MEV dos olhos dos grupos experimentais (OD) revelou alterações em todos os grupos exceto no G1. Nos olhos examinados após 30 dias da aplicação da MMC (G2 e G4) foram observadas: irregularidades no formato (pleo- morfismo) e tamanho das células (polimegatismo) (Figuras 4A e 4B) e nos olhos examinados após 15 dias e submetidos à MMC a 0,2 mg/ml (G3) foram observadas projeções filopoi- dais mais longas (Figura 4C). DISCUSSÃO A MMC utilizada em cirurgias oftalmológicas é sempre aplicada nas superfícies oculares externas. Mas mesmo a MMC aplicada na esclera pode atingir a câmara anterior(2,4-6) e assim ser tóxica para o endotélio corneano. Esta potencial toxicidade, poderia causar alterações en- doteliais ou agravar alterações endoteliais já existentes de- correntes da idade, do próprio glaucoma ou de patologias as- sociadas(18) que não estavam evidentes, comprometendo as- sim o resultado das cirurgias. Apesar disso, poucos são os estudos que avaliam a toxicidade da MMC para a córnea. No primeiro trabalho que avaliou a toxicidade da MMC para o endotélio corneano, a MMC (0,5 mg/ml) foi injetada na câ- mara anterior de olhos humanos e foi observado após 72 horas, opacificação e espessamento da córnea. Ao exame histopato- lógico realizado após 2 semanas, foi observado ausência total do endotélio e edema corneano(20). Nas cirurgias oftalmológi- cas porém, a concentração de MMC que pode chegar até o humor aquoso é provavelmente muito menor e sofre influên- cia de vários fatores nem sempre padronizados. A correlação da concentração com a lesão endotelial é con- troversa na literatura. Estudo com córneas de coelhos albinos perfundidas com MMC em diversas concentrações (0,0005; 0,05; 0,25 e 0,5 mg/ml) observou edema corneano não corre- lacionado com a concentração(21). Também foi estudado o efeito da MMC nas concentrações de 0,2, 0,02 e 0,002 mg/ml em cultura de células endoteliais de coelho albino e obser- vou-se após 24 horas, alterações morfológicas tornando-se as células mais “alongadas” e com núcleo mais corado. Estas alterações também não se correlacionaram com a concentra- ção da droga utilizada. No entanto a redução do número de células que ocorreu com todas as concentrações apresentou correlação direta com a maior concentração da droga(22). No entanto, outros autores(23) estudando córneas humanas, observaram instalação rápida de edema corneano, à MEV, desaparecimento das junções intercelulares com formação de vacúolos transcelulares e à MET, formação de vacúolos com ruptura de organelas correlacionadas com a concentração. As Tabela 1. Descrição das alterações observadas no endotélio corneano de coelhos albinos dos quatro grupos experimentais à microscopia eletrônica de transmissão (MET) e à microscopia eletrônica de varredura (MEV) MET MEV Irregularidade de membrana interna. Rarefação do citoplasma. Sem alterações G1 RER - dilatado e fragmentado. Golgi escasso e menor. Redução vacúolos (próx. Descemet). G2 Irregularidade de membrana interna. Rarefação/desorganização do citoplasma. Irregularidade de tamanho e forma RER - dilatado (pouco) e fragmentado. Golgi - dilatação discreta. Redução vacúolos (próx. Descemet). G3 Rarefação citoplasma. RER - dilatado (pouco) e fragmentado. Projeções filopoidais mais longas Golgi - dilatação discreta. G4 Irregularidade de membrana interna. Rarefação no citoplasma. Irregularidade de tamanho e forma RER - dilatado e fragmentado. G1= MMC 0,05 mg/ml - exame após 15 dias; G2= MMC 0,05 mg/ml - exame após 30 dias; G3= MMC 0,02 mg/ml - exame após 15 dias; G4= MMC 0,02 mg/ml - exame após 30 dias 72(2)02.pmd 15/4/2009, 13:28154 155Toxicidade da mitomicina C ao endotélio da córnea de coelhos Arq Bras Oftalmol. 2009;72(2):152-8 A B Figura 1 - Células do OE (controle). A: Unidas por complexo juncional (j) na superfície interna voltada para a câmara anterior (CA). Notar retículo endoplasmático rugoso (rer), complexos de Golgi (G) e núcleo frouxo (N). Membrana de Descement (D). B: Membrana de Descemet (D). Vacúolos citoplasmáticos (v) com material floculado (V) e imagens de fusão de vesículas com liberação de conteúdo (setas). Aumento original X 21.000. alterações ocorreram após perfusão durante 3 horas, com MMC (200 μg/ml) mas não foram observadas com a concentração de 20 μg/ml. Outro estudo confirmou a correlação das lesões com concentração em córneas humanas isoladas e perfundi- das com MMC nas concentrações de 20 e 200 μg/ml, as alte- rações foram observadas apenas na concentração de 200 μg/ml incluindo instalação de edema rápido e destruição de organe- las intracelulares(24). Neste trabalho com padronização de concentração, volu- me, tempo de aplicação e irrigação foram observadas altera- ções tanto à MET como à MEV apesar das córneas permane- cerem transparentes. Não houve correlação das alterações entre os dois métodos de avaliação, mas os resultados mostra- ram mais alterações nas células endoteliais quando se utili- zou maior concentração de MMC à MET mas não à MEV. Também houve correlação das alterações com o tempo de observação, mas não de forma uniforme, pois a correlação foi mais evidente quando foi usada concentração de 0,2 mg/ml e com a MEV. Estudos com microscopia especular mostraram redução do número de células endoteliais após trabeculectomias com uso de MMC que variou de 7% a 14,52%(17,25-27). No único destes estudos com grupo controle, a redução foi significa- tivamente maior no grupo da trabeculectomia com MMC (14,52%) do que no grupo da trabeculectomia sem MMC (3,73%)(17). Comparações entre os diversos trabalhos e com este estu- do são muito difíceis não apenas porque parte dos trabalhos foi realizada em córneas humanas e outra parte em córneas de animais, mas também por empregarem metodologias bastante diferentes para aplicação da MMC assim como para a avalia- ção das alterações. Parte dos trabalhos não refere sequer o volu- me de MMC utilizado, o uso e volume da solução de irrigação e o tipo de veículo utilizado para aplicação. O único estudo a apresentar resultados com fotos de MEV e MET(23), estudou córneas humanas de banco de olhos e descre- veu alterações de organelas semelhantes às que encontramos. Observaram, no entanto formação de grande número de vacúo- los com desaparecimento de células que diferem de nossos resultados. Esta diferença pode ser decorrente, além de outros fatores, da agudeza do experimento e da alta dose de mitomi- cina C (200 μg/ml) que entrou em contato direto com o endo- télio por perfusão das córneas. Estudo com córneas humanas “in vitro” perfundidas com MMC (20 μg/ml) e examinadas à MET e MEV só descreve que houve alteração de organelas sem especificá-las(24). Outros autores perfundiram córneas humanas e 72(2)02.pmd 15/4/2009, 13:28155 156 Toxicidade da mitomicina C ao endotélio da córnea de coelhos Arq Bras Oftalmol. 2009;72(2):152-8 A B Figura 2 - A: OD de G2. Célula endotelial alterada. *= Observa-se rarefação da parte citoplasmática voltada para a membrana de Descemet (D), câmara anterior (CA), núcleo (N). X 16.500. B: OD de G1 com cisternas de retículo endoplasmático rugoso (rer), tortuosas, dilatadas e fragmentadas e ausência de aparelho de Golgi. Membrana de Descement (D). X 23.000. Figura 3 - OE (controle). Células poligonais ou hexagonais de padrão regular, delimitadas por junções entre células formando bordas serrilhadas discretas na superfície celular (setas). X 1.110. de coelhos albinos com MMC (0,5 mg/ml) durante 10 e 30 minutos e também observaram vacuolização do citoplasma(28). Neste trabalho, e nos citados acima (que não usaram per- fusão), não se conhece a quantidade da droga que atingiu o endotélio corneano. Provavelmente foi muito menor do que 200 μg/ml, dose geralmente empregada nos trabalhos de perfusão. Assim mesmo, alterações puderam ser detectadas ape- sar das córneas terem se mantido transparentes durante o período do experimento. Deve-se ressaltar ainda que, nos trabalhos que a avaliação endotelial foi realizada por microscopia especular, esta foi feita no centro da córnea, portanto longe do local da cirurgia, provavelmente subestimando as alterações. O fato das alterações observadas no presente trabalho terem sido em animais jovens e sadios sugere que poderíamos encontrar alterações em maior número e/ou de maior intensi- dade se os animais fossem velhos e/ou glaucomatosos, condi- ção esta comum na prática clínica. Outro aspecto a ser considerado é que as alterações descri- tas têm maior probabilidade de ocorrer quando da perfuração acidental da esclera durante a cirurgia ou em escleras muito finas ou ainda, quando o “turnover” de humor aquoso estiver reduzido como em cirurgias que utilizam viscoelástico, pro- longando o tempo de contato da droga com o endotélio. No presente trabalho olhos com perfuração acidental durante a cirurgia foram excluídos. Apesar da maioria dos estudos clínicos em pacientes sub- metidos à trabeculectomia com utilização de dose única de MMC no intraoperatório não se referir à toxicidade corneana, este trabalho e os citados acima demonstraram que a toxici- dade pode ocorrer. Como a maioria dos estudos foi aguda ou de curto prazo (3 meses), existe a possibilidade de que altera- ções ou perdas de células endoteliais continuem a longo prazo, particularmente em pacientes que já apresentam baixa contagem no pré-operatório. Assim, mais estudos clínicos bem controlados e com observações de longo prazo se fazem necessários, pois estudos em animais como o coelho podem não estar demonstrando a gravidade das alterações, já que diferentemente do endotélio corneano humano, o do coelho tem grande atividade proliferativa(29). Finalmente não se pode descartar a possibilidade de ocorrer efeito tardio cumu- lativo da MMC(30). 72(2)02.pmd 15/4/2009, 13:28156 157Toxicidade da mitomicina C ao endotélio da córnea de coelhos Arq Bras Oftalmol. 2009;72(2):152-8 CONCLUSÕES 1. A MMC causou alterações no endotélio da córnea tanto na concentração de 0,5 mg/ml como de 0,2 mg/ml observadas 15 e 30 dias após a aplicação; 2. As alterações foram mais intensas com a maior concen- tração de MMC (0,5 mg/ml) na MET e não na MEV; 3. As alterações tiveram correlação positiva com o tempo na MEV e não na MET. ABSTRACT Purpose: To evaluate corneal endothelium alterations after applying mitomycin C to the sclera using transmission and scanning electron microscopy, correlating alterations with time, concentration, and evaluation methods. Methods: The corneal endothelium of both eyes of 32 albino rabbits was evaluated and distributed into four groups of 8. Mitomycin C was applied under a scleral flap in the right eye for 5 minutes. Mitomycin C concentrations were 0.5 mg/ml for G1 and G2 and 0.2 mg/ml for G3 and G4. Examinations were performed 15 days after application to G1 and G3, and 30 days after application to G2 and G4. Four cornea in each group were prepared for transmission electron microscopy and four for scanning electron microscopy. Left eyes of all animals were used as controls. Results: Transmission electron microscopy showed corneal endothelium alterations in all groups: rarefied cytoplasm, dilation and fragmentation of rough endoplasmic reticulum cisternae, Golgi apparatus with cisternal dilation, reduced vacuoles, and irregularities of internal membrane more noticeable in G1 and G2. Scanning electron microscopy revea- led alterations in all groups except G1: changes in the shape A B C Figura 4 - A: OD de G2. Células de padrão irregular, de tamanhos variados. X 1.155. B: OD de G4 - células de padrão irregular quanto ao tamanho e projeções na região de junção. X 1.110. C: OD de G3 - células de padrão regular, porém com abundantes projeções filopodais alongadas tanto nas regiões de junção celular como na superfície celular (seta). X 1.110. and size of cells and longer filopodial projections. Conclu- sions: 1 - Corneal endothelium alterations were seen at both 0.5 and 0.2 mg/ml concentrations and at 15 and 30 days after my- tomicin C application; 2 - Alterations were more intense with higher mytomicin C concentration by transmission electron but not by scanning electron microscopy; 3 - The alterations corre- lated with time by scanning electron microscopy but not by transmission electron microscopy. Keywords: Endothelium, corneal; Mitomycin/toxicity; Mi- croscopy, electron, transmission; Microscopy, electron, scan- ning; Aqueous humor/metabolism; Vitreous body; Rabbits REFERÊNCIAS 1. Crooke ST, Bradner WT. Mitomycin C: a review. Cancer Treat Rev. 1976; 3(3):121-39. 2. Kawase Y, Matsushita H, Yamamoto T, Kitasawa Y. Mitomycin concentration in rabbit and human ocular tissues after topical administration. Ophthalmology. 1992;99(2):203-7. 3. Kirchhoff B, Diestelhorst M. The effect of mitomycin C on the aqueous humor dynamics in glaucomatous eyes [abstract]. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1993;34:815. 4. Sarraf D, Ezzuduemhoi RD, Cheng Q, Wilson MR, Lee DA. Aqueous and vitreous concentration of mitomycin C by topical administration after glauco- ma filtration surgery in rabbits. Ophthalmology. 1993;100(10):1574-9. 5. Seah SK, Prata JA Jr, Minckler DS, Koda RT, Baerveldt G, Lee PP, et al. Mitomycin C concentration in human aqueous humor following trabeculec- tomy. Eye. 1993;7(Pt 5):652-5. 6. Seah SKL, Minckler DS, Prata Jr. JP, Koda RT, Baerveldt G, Hever DK. Mitomycin C level in aqueous humor during trabeculectomy [abstract]. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1993;34:815. 7. Machado CG, Susanna Jr R. Effect of irrigation on mitomycin-C concen- tration and pharmacokinetics parameters in rabbit’s eyes. In: Kriegestein GK, editor. Glaucoma update VI. New York: Springer; 1999. p.219-21. 8. Mietz H, Addicks K, Diestelhorst M, Krieglstein GK. Extraocular application of mitomycin C in a rabbit model: cytotoxic effects on the ciliary body and epithelium. Ophthalmic Surg. 1994;25(4):240-4. Comment in: Ophthalmic Surg. 1995;26(2):166-7. 72(2)02.pmd 15/4/2009, 13:28157 158 Toxicidade da mitomicina C ao endotélio da córnea de coelhos Arq Bras Oftalmol. 2009;72(2):152-8 9. Mietz H, Addicks K, Bloch W, Krieglstein GK. Long-term intraocular toxic effects of topical mitomycin C in rabbits. J Glaucoma. 1996;5(5):325-33. 10. Moraes-Silva MRB, Gregório EA. Efeito da mitomicina C no epitélio ciliar. Estudo experimental em coelhos com microscopia eletrônica de varredura e de transmissão. Rev Bras Oftalmol. 2006;65(1):18-27. 11. Hamada A, Moraes-Silva MRB, Gregório EA. Avaliação ultra-estrutural dos efeitos tóxicos da mitomicina C no epitélio ciliar de olhos de coelhos normais com e sem tratamento hipotensor ocular prévio. Arq Bras Oftalmol. 2007; 70(4):657-66. 12. Teague BJ, Skuta GL, Mardelli PG, Shaver RP, Nordquist RE. Ciliary body and retinal toxicity after subconjunctival injection of mitomycin C in rabbit eyes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995;36:90. 13. Heaps RS, Nordlund JR, Gonzalez-Fernandez F, Redick JA, Conway BP. Ultrastructural changes in rabbit ciliary body after extraocular mitomycin C. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1998;39:1971-5. 14. Hara T, Obata H, Shirato S, Araie M. [The cytotoxic effect of topical mi- tomycin C on the ciliary body in rabbits]. Nippon Ganka Gakkai Zasshi. 1998;102(2):88-94. Japanese. 15. Schraermeyer V, Diestelhorst M, Bieker A, Theisohn M, Mietz H, Ustundag C, et al. Morphologic proof of the toxicity of mitomicyn C on the ciliary body in relation to different application methods. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 1999;237(7):593-600. 16. Mietz H, Roters S, Krieglstein GK. Bullous keratophaty as a complication of trabeculectomy with mitomycin C. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2005; 243(12):1284-7. 17. Sihota R, Sharma T, Agarwal HC. Intraoperative mitomycin C and the corneal endothelium. Acta Ophthalmol Scand. 1998;76(1):80-2. 18. Fukuchi T, Hayakawa Y, Hara H, Abe H. Corneal endothelial damage after trabeculectomy with mitomycin C in two patients with glaucoma and cornea guttata. Cornea. 2002;21(3):300-4. 19. Liu CJ, Tsei CC, Chon JC, Liu JH. Combined trabeculectomy and extracap- sular cataract extraction with mitomycin C. Zhonghua YiXue Za Zhi (Taipei). 1997;60(4):205-12. 20. Derick RJ, Pasquale L, Quigley HA, Jampel H. Potencial toxicity of mitomy- cin C. Arch Ophthalmol. 1991;109(12):1635. 21. Cheeks L, Harris C, Grenn K. Corneal endothelial toxicity of mitomycin C. J Toxicol Cutaneous Ocul Toxicol. 1993;12(1):59-66. 22. Hernandez-Galilea E, Sanchez F, Guzman K, Moro MJ, Vazquez R, Barahona JM. [Efecto de la mitomicina C sobre el endotelio corneal. Estudio in Vitro]. Arch Soc Esp Oftalmol. 2000;75(8):515-21. Spanish. 23. McDermott ML, Wang J, Shin DH. Mitomycin and human corneal endothe- lium. Arch Ophthalmol. 1994;112(4):533-7. 24. Wang J, McDermott ML, Cowden JW, Shin DH. Mitomycin C and the human corneal endothelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1993;34:1195. 25. Anglade E, Dreyer E. The effect of mitomycin C and 5-fluorouracil on corneal endothelium in trabeculectomy surgery. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1993; 34:730. 26. Pastor SA, Williams R, Hetherington J, Dunbar Hoskins H, Goodman D. Corneal endothelial cell loss following trabeculectomy with mitomycin C. J Glaucoma. 1993;2(2):112-3. 27. Dreyer EB, Chaturvedi N, Zurakowski D. Effect of mitomycin C and fluorou- racil supplemented trabeculectomies on the anterior segment. Arch Ophthalmol. 1995;113(5):578-80. 28. Nuyts RM, Holley GP, Edelhauser HF. Effects of mitomycin C on the corneal endothelium. J Toxicol Cutaneous Ocul Toxicol. 1995;14(4):251-64. 29. Mishima S. Clinical investigations on the corneal endothelium. XXXVIII Eduardo Jackson Memorial lecture. Am J Ophthalmol. 1982;93(1):1-29. 30. Smith DL, Skuta GL, Lindenmuth KA, Mush DC, Bergstrom TJ. The effect of glaucoma filtering surgery on corneal endothelial cell density. Ophthalmic Surg. 1991;22(5):251-5. 72(2)02.pmd 15/4/2009, 13:28158 << /ASCII85EncodePages false /AllowTransparency false /AutoPositionEPSFiles false /AutoRotatePages /None /Binding /Left /CalGrayProfile (Dot Gain 20%) /CalRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1) /CalCMYKProfile (U.S. Web Coated \050SWOP\051 v2) /sRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1) /CannotEmbedFontPolicy /Error /CompatibilityLevel 1.3 /CompressObjects /Off /CompressPages true /ConvertImagesToIndexed true /PassThroughJPEGImages true /CreateJDFFile false /CreateJobTicket false /DefaultRenderingIntent /Default /DetectBlends false /DetectCurves 0.0000 /ColorConversionStrategy /LeaveColorUnchanged /DoThumbnails false /EmbedAllFonts true /EmbedOpenType false /ParseICCProfilesInComments true /EmbedJobOptions true /DSCReportingLevel 0 /EmitDSCWarnings false /EndPage -1 /ImageMemory 1048576 /LockDistillerParams true /MaxSubsetPct 100 /Optimize false /OPM 1 /ParseDSCComments true /ParseDSCCommentsForDocInfo true /PreserveCopyPage true /PreserveDICMYKValues true /PreserveEPSInfo false /PreserveFlatness true /PreserveHalftoneInfo false /PreserveOPIComments false /PreserveOverprintSettings true /StartPage 1 /SubsetFonts true /TransferFunctionInfo /Remove /UCRandBGInfo /Remove /UsePrologue false /ColorSettingsFile () /AlwaysEmbed [ true ] /NeverEmbed [ true ] /AntiAliasColorImages false /CropColorImages true /ColorImageMinResolution 150 /ColorImageMinResolutionPolicy /OK /DownsampleColorImages true /ColorImageDownsampleType /Bicubic /ColorImageResolution 300 /ColorImageDepth -1 /ColorImageMinDownsampleDepth 1 /ColorImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeColorImages true /ColorImageFilter /DCTEncode /AutoFilterColorImages true /ColorImageAutoFilterStrategy /JPEG /ColorACSImageDict << /QFactor 0.40 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /ColorImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /JPEG2000ColorACSImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /JPEG2000ColorImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /AntiAliasGrayImages false /CropGrayImages true /GrayImageMinResolution 150 /GrayImageMinResolutionPolicy /OK /DownsampleGrayImages true /GrayImageDownsampleType /Bicubic /GrayImageResolution 300 /GrayImageDepth -1 /GrayImageMinDownsampleDepth 2 /GrayImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeGrayImages true /GrayImageFilter /DCTEncode /AutoFilterGrayImages true /GrayImageAutoFilterStrategy /JPEG /GrayACSImageDict << /QFactor 0.40 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /GrayImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /JPEG2000GrayACSImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /JPEG2000GrayImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /AntiAliasMonoImages false /CropMonoImages true /MonoImageMinResolution 1200 /MonoImageMinResolutionPolicy /OK /DownsampleMonoImages true /MonoImageDownsampleType /Bicubic /MonoImageResolution 1200 /MonoImageDepth -1 /MonoImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeMonoImages true /MonoImageFilter /CCITTFaxEncode /MonoImageDict << /K -1 >> /AllowPSXObjects false /CheckCompliance [ /PDFX1a:2001 ] /PDFX1aCheck true /PDFX3Check false /PDFXCompliantPDFOnly true /PDFXNoTrimBoxError false /PDFXTrimBoxToMediaBoxOffset [ 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 ] /PDFXSetBleedBoxToMediaBox true /PDFXBleedBoxToTrimBoxOffset [ 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 ] /PDFXOutputIntentProfile (Euroscale Coated v2) /PDFXOutputConditionIdentifier (FOGRA1) /PDFXOutputCondition () /PDFXRegistryName (http://www.color.org) /PDFXTrapped /False /SyntheticBoldness 1.000000 /Description << /DEU /FRA /JPN /PTB /DAN /NLD /ESP /SUO /ITA /NOR /SVE /ENU (Use these settings to report on PDF/X-1a compliance and produce PDF documents only if compliant. PDF/X is an ISO standard for graphic content exchange. For more information on creating PDF/X-1a compliant PDF documents, please refer to the Acrobat User Guide. The PDF documents can be opened with Acrobat and Reader 4.0 and later.) >> >> setdistillerparams << /HWResolution [2400 2400] /PageSize [612.000 792.000] >> setpagedevice