RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 29/06/2018. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL PRODUÇÃO, EXPRESSÃO E CARACTERIZAÇÃO DA METALOCARBOXIPEPTIDASE RECOMBINANTE Gabriela Cabral Fernandes Bióloga 2018 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL PRODUÇÃO, EXPRESSÃO E CARACTERIZAÇÃO DA METALOCARBOXIPEPTIDASE RECOMBINANTE Gabriela Cabral Fernandes Orientadora: Profa. Dra. Eliana Gertrudes de Macedo Lemos Coorientador: Prof. Dr. Manoel Victor Franco Lemos Coorientadora: Dra. Mariana Rangel Pereira Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Microbiologia Agropecuária. 2018 Fernandes, Gabriela Cabral F363p Produção, expressão e caracterização da metalocarboxipeptidase recombinante / Gabriela Cabral Fernandes. – – Jaboticabal, 2018 vi, 69 p. : il. ; 29 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2018 Orientadora: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos Banca examinadora: Roberto da Silva, Lúcia Maria Carareto Alves, Maria Helena de Souza Goldman, João Martins Pizauro Junior Bibliografia 1. Caracterização cinética e estrutural. 2. Carboxipeptidase. 3. Metalocarboxipeptidase. 4. Mineração genômica I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 576.8:579.84 Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP Campus de Jaboticabal/SP - Karina Gimenes Fernandes - CRB 8/7418 DADOS CURRICULARES DO AUTOR Gabriela Cabral Fernandes – nascida em Jaboticabal, estado de São Paulo, em 14 de março de 1986. Ingressou no curso de Ciências Biológicas (Licenciatura Plena e Bacharelado) em março de 2006 pelo Centro Universitário de Araraquara (UNIARA), Araraquara – SP, obtendo o título de Bióloga em dezembro de 2009. Durante sua graduação, foi estagiária do Laboratório de Bioquímica de Micro- organismos e Plantas, departamento de Tecnologia, da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP-Jaboticabal, onde em 2011 esteve vinculada ao projeto temático (2008/58114-3) da FAPESP. Foi bolsista CAPES e em julho de 2014, recebeu o título de Mestra em Agronomia (Genética e Melhoramento de Plantas), pela FCAV-UNESP, onde em agosto do mesmo ano ingressou no Doutorado em Microbiologia Agropecuária. Realizou seu Doutorado Sanduiche na University of Cambridge, UK, no Department of Biochemistry, Hollfelder´s group, com o financiamento do Programa de Doutorado Sanduiche no Exterior (PDSE-CAPES), de maio a agosto de 2017. “Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas Graças a Deus, não sou o que era antes”. Marthin Luther King AGRADECIMENTOS Primeiramente agradeço ao Pai Maior e Seus Anjos protetores por toda energia, calma, paz, esperança e fé que emanaram no decorrer desses anos, pois certamente sem essa força imensa eu não teria chegado ao fim. A minha família pela loucura, pelo estresse, pelas risadas e principalmente por ser minha base. As minhas amoras: Daniele, Jéssica, Juliana e Suzana, por todos os momentos de descontração, risadas e desabafos. Vocês não imaginam o bem que me fazem. Ao “Bonde da Cerveja” por toda a ajuda dentro e fora do laboratório. Como eu sempre digo: “Vocês são os presentes que a Unesp me deu”. A minha orientadora Profa. Dra. Eliana G. de Macedo Lemos que ao longo desses anos tem me mostrado o melhor caminho a seguir. Obrigada, por não ter desistido de mim. Aos amigos Elwi, Elis e Aliandra por me introduzirem ao “Mundo das proteínas”. A toda a família LBMP pelo convívio e constante aprendizado. Ao querido Dr. João Carlos Campanharo, que sempre foi um pai, amigo e excelente profissional. A ti toda minha gratidão. Aos professores e funcionários do Departamento de Tecnologia e do Departamento de Biologia Aplicada à Agropecuária que estiveram sempre dispostos a me ajudar. A querida amiga e co-orientadora Dra. Mariana R. Pereira, pela acolhida na Inglaterra, pelos momentos, conversas e por contribuir muito para minha formação. Aos professores do Department of Biochemistry, da University of Cambridge - UK: Florian Hollfelder e Marko Hyvonen, pela acolhida durante meu Doutorado Sanduiche e pelos ensinamentos. Ao Paul Brear pela paciência em me explicar acerca da Cristalografia. Aos colegas do Hollfelder´s group pela recepção e acolhida. Ao Programa do Pós-graduação em Microbiologia Agropecuária e a Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – FCAV/Unesp. A seção de Pós-graduação da FCAV-Unesp pela atenção e excelentes serviços. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. E as pessoas que passaram pela minha vida contribuindo direta ou indiretamente para a realização desse sonho. Muito obrigada! i SUMÁRIO ABREVIATURAS ....................................................................................................... iii LISTA DE UNIDADES ............................................................................................... iv RESUMO..................................................................................................................... v ABSTRACT. ............................................................................................................... vi 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 7 2. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 8 2.1 Chitinophaga sp. - Generalidades e aplicações biotecnológicas ....................... 8 2.2 Mineração de genes em dados genômicos (GDM) .......................................... 10 2.3 Peptidases: considerações gerais e classificação ........................................... 11 2.3.1 Família M32 das metalocarboxipeptidases termofílicas ................................ 15 2.3.2 Inibidores de proteases ................................................................................. 16 3. OBJETIVOS .......................................................................................................... 16 3.1 Objetivos específicos ....................................................................................... 17 4. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 17 4.1 Sequenciamento do genoma do isolado .......................................................... 18 4.1.1 Análise das Sequências e Anotação genômica ......................................... 19 4.2 Mineração no genoma de Chitinophaga sp. para prospecção de genes de interesse ................................................................................................................ 19 4.3 Análise das sequências ................................................................................... 20 4.4 Amplificação dos genes codificadores de enzimas proteolíticas ...................... 20 4.4.1 Quantificação e análise do DNA ................................................................ 22 4.4.2 Digestão dos fragmentos amplificados ...................................................... 23 4.4.3 Ligação dos fragmentos ao vetor de expressão ........................................ 23 4.4.4 Transformação bacteriana da célula competente ...................................... 24 4.4.5 Coleta, estoque dos clones e confirmação da clonagem ........................... 24 4.5 Expressão e extração da proteína recombinante ............................................. 25 4.6 Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) ........................................ 26 4.7 Purificação de enzimas proteolíticas ................................................................ 26 4.7.1 Purificação por cromatografia de afinidade ................................................ 26 4.7.2 Purificação por exclusão molecular ........................................................... 27 4.8 Determinação da atividade enzimática ............................................................ 27 4.9 Avaliação dos parâmetros cinéticos ................................................................. 28 ii 4.10 Efeito da temperatura sobre a atividade enzimática ...................................... 28 4.11 Avaliação do efeito do pH sobre a atividade da enzima ................................. 29 4.12 Fluorometria de varredura diferencial ............................................................ 29 4.13 Ensaio de cristalização da enzima ChtCP ..................................................... 30 4.13.1 Coleta de dados, processamento e refinamento da estrutura ................. 30 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 31 5.1 Sequenciamento, análise das sequências e anotação genômica .................... 31 5.2 Predição de peptidases no genoma de Chitinophaga sp. ................................ 31 5.3 Identidade sequencial de aminoácidos de ChtCP com metalopeptidases termofílicas. ............................................................................................................ 32 5.4 Amplificação e clonagem do gene no vetor pHAT2 ......................................... 33 5.5 Ensaio de expressão e extração das proteínas recombinantes ....................... 34 5.6 Expressão e avaliação da estrutura quaternária da enzima ChtCP ................. 36 5.7 Cinética enzimática .......................................................................................... 39 5.8 Substrato específico requerido para atividade de ChtCP ................................. 40 5.9 Avaliação do pH e temperatura requeridos pela enzima ChtCP ...................... 42 5.10 A influência dos íons metálicos e inibidores de peptidases na atividade enzimática da ChtCP ............................................................................................. 46 5.11 O efeito dos íons metálicos sob a temperatura de desnaturação enzimática 47 5.12 Estrutura geral da ChtCP e seu sítio ativo ..................................................... 48 6. CONCLUSÃO ....................................................................................................... 53 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 54 iii ABREVIATURAS CP – carboxipeptidase MCP - metalocarboxipeptidase CMC - carboximetilcelulose Abs- Absorbância DO600nm – Absorbância medida a 600 nanômetros de cumprimento de onda aa- Aminoácidos DNA- ácido desoxirribonucleico rRNA – ácido ribonucleico ribossomal dNTP- desoxirribonucleotídeos fosfatados EDTA- ácido etilenodiaminotetracético IPTG – isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo Xgal - 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo DMF - N,N’dimethyl-formamida m/v – massa por volume TEB- solução tampão Tris-ácido bórico- EDTA Tris- tris[hidroximetil]aminometano UV- luz ultravioleta v/v- volume por volume BLAST – Basic Local Aligment Sequence Tool E.C. – Enzyme Comission GenBank – banco de sequências de genes e proteínas do NCBI Kb – mil pares de bases NCBI – National Center for Biotechnology Information ORF – Open Reading Frame (Fase de leitura aberta codificadora de proteína) pb – pares de bases PCR – Polymerase Chain Reaction MEROPS – Base de dados curadas para peptidases pH – potencial hidrogeniônico log [H+] pI – ponto isoelétrico r.p.m. – rotações por minuto SAP – Shrimp Alkaline Phosphatase SDS – dodecil sulfato de sódio SDS-PAGE – Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio DMSO – dimetilsufóxido IUBMB - (União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular) EPS – exopolissacarídeo Z – benziloxilcarbonil A – aminoácido alanina R – aminoácido arginina W – aminoácido triptofano N – aminoácido asparagina E – aminoácido ácido glutâmico D – aminoácido aspartato iv LISTA DE UNIDADES g – aceleração da gravidade g – grama L – litro g-L – gramas por litro kb – kilobase M – molar mg – miligrama mL – mililitro mM – milimolar μg – micrograma μL – microlitro μM – micromolar ng – nanogramas pb – pares de bases U – unidades V- volt kDa- Quilo Daltons h – horas s – segundos min – minutos v PRODUÇÃO, EXPRESSÃO E CARACTERIZAÇÃO DA METALOCARBOXIPEPTIDASE RECOMBINANTE RESUMO - A mineração no genoma de Chitinophaga sp. (8Mb), uma bactéria gram- negativa, isolada de um consórcio bacteriano degradador de biomassa, permitiu acesso ao gene Cht_4039 que possui um motivo de HEXXH característico para as carboxipeptidases (CPs) termoestáveis da família M32. O gene foi expresso em Escherichia coli e a enzima recombinante (ChtCP) foi purificada e caracterizada bioquimicamente em detalhes. Esta carboxipeptidase apresentou atividade máxima a 65°C, conservando 60% da atividade à 80ºC. O pH ótimo foi de 7.5. Esta metaloenzima foi ativada 100% com Mn2+ e 150% com Co2+. A estrutura cristalina da ChtCP foi determinada a uma resolução de 1,2 Å. Quando em contato com íons metálicos teve seu ponto de fusão (Tm) acrescido em até 50% mantendo sua estrutura nativa. Em resumo, este estudo mostra que a ChtCP é um membro termoestável da família M32 CP que apresenta atividade enzimática em um amplo espectro de temperatura (de 20 °C à 99 °C) e ativação na presença de íons metálicos (Co+2, Cr+2, Mg+2, Mn+2 ou Zn+2), características importantes na aplicação industrial. Palavras-chave: caracterização cinética e estrutural; carboxipeptidase; metalocarboxipeptidasse; mineração de genoma. vi PRODUCTION, EXPRESSION AND CHARACTERIZATION OF RECOMBINANT METALOCARBOXYPEPTIDASE ABSTRACT - Mining in the genome of Chitinophaga sp. (8Mb), a gram-negative bacterium, isolated from a bacterial consortium obtained from decomposable material withdrawn from the sugarcane bagasse deposit at an ethanol plant, allowed access to a predicted putative of 500 amino acids encoded by the Cht_4039 gene has a characteristic HEXXH motif for the thermostable M32 carboxypeptidases (CPs) already studied. The gene was expressed in Escherichia coli and the recombinant enzyme (ChtCP) was purified and characterized biochemically in detail. This carboxypeptidase showed maximum activity at 65 °C, preserving 60% of the activity at 80 °C. The optimum pH was 7.5. This metalloenzyme was activated 100% with Mn 2+ and 150% with Co 2+. The crystal structure of ChtCP was determined at a resolution of 1.2 Å. When in contact with metallic ions had its melting point (Tm) increased in up to 50% maintaining its native structure. In summary, this study shows that ChtCP is a thermostable member of the M32 CP family that exhibits enzymatic activity over a wide temperature range (from 20 °C to 99 °C) and activation in the presence of metal ions (Co+2, Cr+2, Mg+2, Mn+2 or Zn+2), important characteristics in the industrial application. Keywords: structural and kinetic characterization; carboxypeptidase; metalocarboxypeptidase; genome mining. 7 1. INTRODUÇÃO Os consórcios bacterianos são constituídos por comunidades microbianas que podem possuir um conjunto de diferentes vias metabólicas que permitem mediar a degradação das diversas moléculas fornecendo enzimas com grande utilidade em processos biotecnológicos aplicados à indústria. A importância destes consórcios se dá, em grande parte, devido à vantagens como especificidade, baixo custo, facilidade de produção em larga escala, aliadas ao aspecto de reduzir efeitos tóxicos quando comparado ao uso de xenobióticos, assim como não geram resíduos ao ambiente. Ao levarmos em consideração o potencial dos consórcios microbianos, as vantagens das enzimas microbianas em processos biotecnológicos e o fato da busca por enzimas com aplicações industriais estar centrada em um número limitado de gêneros microbianos como Bacillus (MARUTHIAH et al., 2013), Pseudomonas (MEENA et al., 2013) e Aspergillus (KANG et al., 2014), novas enzimas, melhoradas e / ou mais versáteis, tem sido a meta de muitos pesquisadores. Isto é facilitado com a exploração de novos genomas bacterianos isolados desses consórcios. Assim, a fim de desenvolver processos de produção eficientes, sustentáveis e economicamente competitivos, o uso da mineração de genomas bacterianos (microbial genome mining) vem sendo explorado como uma abordagem que oferece uma oportunidade sem precedentes na área da biotecnologia, devido à abundância de dados de sequência pré-existentes e inexplorados acumulados, sobretudo, graças ao advento da era “NGS” (next generation sequencing). A mineração de genomas bacterianos, a qual é essencialmente uma metodologia de busca que utiliza como padrão sequências de enzimas da mesma família, está sendo usada na prospecção de enzimas como endoglucanases, lacases, nitrilases, redutases, xilanases (BACHMANN; VAN LANEN; BALTZ, 2014; HE et al., 2014), além de outras de grande valor industrial como as peptidases (SIERRA et al., 2017). O genoma de Chitinophaga sp. CB10, uma bactéria gram-negativa, não- patogênica, filamentosa, mesófila, imóvel, não formadora de esporos (KISH et al., 2017), a qual foi isolada de um consórcio degradador de biomassa e que ainda não teve nenhuma peptidase caracterizada, mostrou em seu genoma uma promissora fonte de busca para novas enzimas. 8 Dentre as hidrolases, as peptidases (E.C. 3.4), são as mais importantes do ponto de vista industrial, devido a capacidade de hidrolisar ligações peptídicas entre resíduos de aminoácidos, reação de caráter extremamente versátil nos mais diversos processos biotecnológicos. Neste sentido, as peptidases podem ser utilizadas em diversas atividades industriais, tais como processamento de bebidas, alimentos, processamento de couro e pele, indústrias têxteis, formulação de detergentes, no amaciamento de carne e formulação de medicamentos. Os micro-organismos são a fonte mais empregada para a obtenção de proteases de uso industrial, obtidas através de processos fermentativos (RAO et al., 1998). Sendo assim, as bactérias, fungos filamentosos e leveduras são alvos crescentes de pesquisa a fim de alcançar novos genes codificadores de proteases, além de aumentar a produtividade e a estabilidade enzimática daqueles que já são admitidos como micro-organismos proteolíticos (Sierra et al., 2017). Um relatório emitido em 2017 mostra que o mercado de peptidases deverá ultrapassar US$ 2,5 bilhões até 2022 (https://www.businesswire.com/news/home/20170220005683/en/Global-Protease Market-Reach-2.50-Billion-2022). Observando a versatilidade das proteases na indústria e a demanda pela descoberta de novas enzimas, este trabalho descreve a mineração de dados genômicos de Chitinophaga sp. CB10, para a prospecção e caracterização cinética e estrutural de uma enzima proteolítica. 53 6. CONCLUSÃO A ChtCP apresentou atividade em um amplo espectro de temperatura que varia de 20° à 99°C. Os membros da família M32 vêm sendo estudados visando a atividade enzimática sob altas temperaturas, porém ao pensarmos em aplicação industrial essa amplitude faz com que ChtCP possa ser explorada em diferentes etapas térmicas do processo. A caracterização estrutural unida à caracterização fisíco-química possibilitou um delineamento racional para futuros experimentos visando à aplicação da enzima na indústria, já que constatamos que ChtCP compartilha regiões homólogas com algumas metalocarboxipeptidases em destaque nos diferentes setores industriais. 54 REFERÊNCIAS AIGLE, B.; LAUTRU, S.; SPITELLER, D.; DICKSCHAT, J. S.; CHALLIS, G. L.; LEBLOND, P.; PERNODET, J.-L. Genome mining of Streptomyces ambofaciens. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, v. 41, n. 2, p. 251–263, 21 fev. 2014. Disponível em: . Acesso em: 18 abr. 2018. 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