UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CAMPUS DE JABOTICABAL INDUÇÃO DA CARDIOMIOPATIA DILATADA COM DOXORRUBICINA EM MODELO EXPERIMENTAL COM COELHOS Fábio Nelson Gava Médico Veterinário JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL 2011 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CAMPUS DE JABOTICABAL INDUÇÃO DA CARDIOMIOPATIA DILATADA COM DOXORRUBICINA EM MODELO EXPERIMENTAL COM COELHOS Pós-graduando: Fábio Nelson Gava Orientador: Prof. Dr. Aparecido Antonio Camacho Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, Campus de Jaboticabal, como parte das exigências para obtenção do titulo de Mestre em Medicina Veterinária (área de concentração em Clínica Médica Veterinária). JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL Fevereiro de 2011 Gava, Fábio Nelson G279i Indução da Cardiomiopatia dilatada com doxorrubicina em modelo experimental com coelhos / Fábio Nelson Gava. – – Jaboticabal, 2011 xv, 53 f. : il. ; 28 cm Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2011 Orientador: Aparecido Antonio Camacho Banca examinadora: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos, Glaucia Bueno Pereira Neto Bibliografia 1. Doxorrubicina. 2. Coelhos. 3. Ecodopplercardiografia. 4. Histopatologia I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 619:616.12:636.92 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal. i DADOS CURRICULARES DO AUTOR FÁBIO NELSON GAVA - filho de Aparecido Nelson Gava e Marlene Aparecida Pellegronotti Gava, nascido em 06 de Março de 1984 na cidade de Piracicaba –SP. Em 2002, ingressou no curso de Medicina Veterinária na Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, Jaboticabal. De 01/08/2004 à 31/07/2005 foi bolsista PIBIC/CNPq de iniciação científica, orientado pela Profa. Dra. Rosângela Z. Machado. Em 2006 foi bolsista FAPESP de iniciação científica, sob orientação do Prof. Dr. Aparecido Antonio Camacho. Graduou-se em Janeiro de 2007 e em seguida participou do programa de residência em Medicina Veterinária e Saúde Pública, na área de Clínica Médica de Pequenos Animais, no período de 01/02/2007 à 31/01/2009 na Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, Jaboticabal. Em 2009 ingressou no Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária (Clínica Médica) e desde então foi bolsista FAPESP. ii “Não há nada de nobre em sermos superiores ao próximo. A verdadeira nobreza consiste em sermos superiores ao que éramos antes” (Esopo) iii A todos que me ajudaram na execução desse trabalho DEDICO iv AGRADECIMENTOS A Deus, pela vida; Aos meus pais, por todo amor, cuidado e suporte; Ao meu irmão, pelo companheirismo e por acreditar tanto em mim; A toda minha família, pela torcida; Ao meu orientador, professor Aparecido Antonio Camacho, pelas oportunidades, pela orientação desde a iniciação científica e pela confiança. Agradeço por todos os anos de aprendizado e por me acalmar sempre quando alguma coisa dá errado; A professora Rose, pela grande ajuda neste trabalho, desde sua execução até a finalização. Agradeço pelas valiosas considerações na qualificação e pela oportunidade do aprendizado. Acima de tudo, por trabalhar ao lado de uma pessoa tão coerente e sensível; Ao professor Canola, pela oportunidade de ministrar aulas em sua disciplina, por disponibilizar o Serviço de Radiologia para essa pesquisa e pelas valiosas considerações apresentadas na qualificação; A professora Mirela, pela amizade, pelos ensinamentos desde a época da graduação, estando sempre muito prestativa e pela possibilidade de utilizar o Laboratório de Oncologia para diluição do quimioterápico; A minha segunda família: República Nazarena, na qual moro há 9 anos. Aos ex- moradores, aos atuais e aos agregados: Thiago, Franco, Gustavo, Maurício, Marcelo, Gustavo Oda, Fábio e Sabrina. A convivência ao lado de vocês me faz uma pessoa muito melhor. A nossa funcionária Sandrinha, por ser uma pessoa tão especial em nossas vidas; Aos meus amigos que entraram comigo na pós-graduação na cardiologia: Evandro e Edna. Vocês foram fundamentais para realização desse trabalho. Muito obrigado pelo companheirismo e risadas durante nossa trajetória; A amiga Tatiana, por me ajudar na realização desse e de muitos outros trabalhos, além de ser uma grande pessoa. Aos outros amigos da cardiologia: Daniel, João Paulo, Gláucia, Marlos e Rodrigo. Vocês me ensinaram muito; v As alunas de Iniciação científica: Cristiane, Monica e Thaís, pela ajuda durante todo esse trabalho; As amigas Adriana, Carol e Thassila, pela ajuda na realização das radiografias dos animais; A todos os estagiários que passaram pelo Serviço de Cardiologia, pelo apoio prestado; A funcionária “Chica” do laboratório de histopatologia, pela ajuda na confecção das lâminas; A amiga Geórgia, meu eterno “Anjo da Guarda”, por me confortar sempre nas horas mais difíceis; A amiga Natália, pelos momentos de diversão e companheirismo; As amigas Letícia, Andressa, Érica e Daniela, por estarem presentes sempre; Aos inúmeros amigos que conquistei durante minha trajetória em Jaboticabal. São muitos e todos muito importantes; A todos os professores, funcionários, pós-graduandos e residentes do Hospital Veterinário da FCAV-UNESP- Jaboticabal, pela ajuda e amizade; A Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, Jaboticabal e a pós- graduação, pela oportunidade; Ao biotério da UNESP- campus de Botucatu, pelo fornecimento dos animais utilizados nesse estudo; Aos meus cães Vida, Benhur, Barão, Mel, Tata, Negão e ao cavalo Gaucho. Vocês completam minha felicidade; A todos os animais. Em especial aos coelhos que participaram dessa pesquisa; A todos que colaboraram de alguma forma para a realização desse trabalho. vi Agradeço, A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pela bolsa de mestrado e pelo auxílio concedido para esse estudo; vii SUMÁRIO Página Lista de abreviaturas............................................................................ ix Lista de tabelas..................................................................................... xi Lista de figuras..................................................................................... xii RESUMO................................................................................................ xiv ABSTRACT............................................................................................ xv 1. INTRODUÇÃO.................................................................................... 1 2. REVISÃO DE LITERATURA.............................................................. 2 3. OBJETIVOS....................................................................................... 8 4. MATERIAL E MÉTODOS................................................................... 9 4.1 Local de realização da pesquisa...................................................... 9 4.2 Animais............................................................................................. 9 4.3 Indução da cardiomiopatia dilatada com doxorrubicina.................... 10 4.4 Avaliações......................................................................................... 10 4.4.1 Radiografia..................................................................................... 11 4.4.2 Eletrocardiografia........................................................................... 12 4.4.3 Ecodopplercardiografia.................................................................. 12 4.4.4 Análise histológica......................................................................... 14 4.4.5 Análise estatística.......................................................................... 14 5. RESULTADOS................................................................................... 16 5.1 Mortalidade....................................................................................... 16 5.2 Achados radiográficos...................................................................... 17 viii 5.3 Achados eletrocardiográficos............................................................ 19 5.4 Achados ecodopplercardiográficos................................................... 21 5.5 Análise histológica............................................................................ 29 6. DISCUSSÃO....................................................................................... 37 7. CONCLUSÕES................................................................................... 43 8. REFERÊNCIAS.................................................................................. 44 ix LISTA DE ABREVIATURAS AD Átrio direito AE Átrio esquerdo AE/AO Relação átrio esquerdo/aorta CMD Cardiomiopatia dilatada DIVEd Diâmetro interno do ventrículo esquerdo em diástole DIVEs Diâmetro interno do ventrículo esquerdo em sístole DC Débito cardíaco DP Desvio padrão ECG Eletrocardiograma EPLVEd Espessura da parede livre do ventrículo esquerdo em diástole EPLVEs Espessura da parede livre do ventrículo esquerdo em sístole ESIVd Espessura do septo interventricular em diástole ESIVs Espessura do septo interventricular em sístole FC Frequência Cardíaca FCAV Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias FEC Fração de encurtamento FEJ Fração de ejeção G1 Grupo 1 G2 Grupo 2 G3 Grupo 3 ITEI Índice de performance miocárdica de Tei OBJ Objetiva P ms Duração da onda P P mv Amplitude da onda P PR ms Duração do intervalo PR PVAO Pico de velocidade do fluxo transaórtico PVMA Pico de velocidade da onda A do fluxo mitral PVME Pico de velocidade da onda E do fluxo mitral PVPUL Pico de velocidade do fluxo transpulmônico PVTA Pico de velocidade da onda A do fluxo tricúspide PVTE Pico de velocidade da onda E do fluxo tricúspide QRS ms Duração do complexo QRS QT ms Duração do intervalo QT R mV Amplitude da onda R S IV Septo interventricular SSPE Separação septal do ponto E da valva mitral x TEVE Tempo de ejeção ventricular esquerda TRIV Tempo de relaxamento isovolumétrico UNESP Universidade Estadual Paulista VD Ventrículo direito VE Ventrículo esquerdo xi LISTA DE TABELAS Página Tabela 1 - Valores de VHS (média ± DP) obtidas a partir de radiografia torácica laterolateral direita de coelhos durante o tratamento com doxorrubicina. Unesp, Jaboticabal, SP (2011) 17 Tabela 2 - Valores dos parâmetros eletrocardiográficos (média ± DP) de coelhos durante o tratamento com doxorrubicina. Unesp, Jaboticabal, SP (2011) 20 Tabela 3 - Valores dos parâmetros ecocardiográficos (média ± DP) de coelhos durante o tratamento com doxorrubicina. Unesp, Jaboticabal, SP (2011) 25 Tabela 4 - Valores dos parâmetros ecodopplercardiográficos (média ± DP) de coelhos durante o tratamento com doxorrubicina. Unesp, Jaboticabal, SP (2011) 26 Tabela 5 - Grau de lesões (média ± DP) obtidos através de análise histológica do miocárdio de coelhos submetidos ao tratamento com doxorrubicina, Unesp, Jaboticabal, SP (2011) 30 xii LISTA DE FIGURAS Página Figura 1 - Radiografia na projeção laterolateral direita de coelho (G1), ilustrando os traçados lineares para o cálculo do VHS. (A) Eixo vertical (B) Eixo horizontal. Unesp, Jaboticabal, SP (2011) 11 Figura 2 - Porcentagem de mortalidade de coelhos durante o tratamento com doxorrubicina. Unesp, Jaboticabal, SP (2011) 16 Figura 3 - Radiografia laterolateral direita de coelho (G2) submetido ao tratamento com doxorrubicina. (A) T0 e (B) T60. Notar abaulamento do ventrículo direito em B (setas). Unesp Jaboticabal, SP (2011) 18 Figura 4 - Radiografia ventrodorsal de coelho (G2) submetido ao tratamento com doxorrubicina. (A) T0 e (B) T60. Notar abaulamento do ventrículo direito em B (setas). Unesp Jaboticabal, SP (2011) 18 Figura 5 - Imagem ecocardiográfica apical quatro câmaras de coelho submetido ao tratamento com doxorrubicina (G2) no T0 (A) e no T60 (B). AD= átrio direito; AE= átrio esquerdo; VD= ventrículo direito; VE= ventrículo esquerdo. Unesp, Jaboticabal, SP (2011) 23 Figura 6 - Imagem ecocardiográfica no modo M de coelho submetido ao tratamento com doxorrubicina (G2) no T0 (A) e no T45 (B). Unesp, Jaboticabal, SP (2011). Notar aumento do diâmetro interno do ventrículo esquerdo em sístole e diástole em B 24 Figura 7 - Imagem ecodopplercardiográfica de coelho do grupo controle (G1) no T0. Presença de fusão de ondas E e A (1). Unesp, Jaboticabal, SP (2011) 24 Figura 8 - Representação gráfica das médias ± DP da Fração de Encurtamento em coelhos durante o tratamento com doxorrubicina. Unesp, Jaboticabal, SP (2011) 27 Figura 9 - Representação gráfica das médias ± DP da Fração de Ejeção em coelhos durante o tratamento com doxorrubicina. Unesp, Jaboticabal, SP (2011) 28 xiii Figura 10 - Médias do grau de vacuolização das células do miocárdio de coelhos submetidos ao tratamento com doxorrubicina. Unesp, Jaboticabal, SP (2011) 31 Figura 11 - Médias do grau de granulação das células do miocárdio de coelhos submetidos ao tratamento com doxorrubicina. Unesp, Jaboticabal, SP (2011) 31 Figura 12 - Médias do grau de fibrose do miocárdio de coelhos submetidos ao tratamento com doxorrubicina. Unesp, Jaboticabal, SP (2011) 32 Figura 13 - Médias do grau de necrose do miocárdio de coelhos submetidos ao tratamento com doxorrubicina. Unesp, Jaboticabal, SP (2011) 32 Figura 14 - Fotomicrografia do ventrículo direito de coelho. (A/B) Miocárdio de animal não tratado com doxorrubicina, sem alterações microscópicas (grupo 1). (C/D) Miocárdio com áreas de fibrose (*) em animal tratado com doxorrubicina (grupo 2). A/C = Hematoxilina e Eosina. B/D = Tricrômio de Masson. Obj. 10x. Unesp, Jaboticabal, SP (2011) 33 Figura 15 - Fotomicrografia do ventrículo direito de coelho tratado com doxorrubicina (G2). (A/A1) Vacuolização (cabeça de seta) e necrose (seta) de cardiomiócitos. (A/A2) Miocárdio com áreas de fibrose (*). (B/B1) Miocárdio com áreas de fibrose (*) e infiltração gordurosa (setas). A/A1/B = Hematoxilina e Eosina. A2/B1 = Tricrômio de Masson. Obj. 40x. Unesp, Jaboticabal, SP (2011) 34 Figura 16 - Fotomicrografia do miocárdio de coelho tratado com doxorrubicina (G2) (A) Ventrículo esquerdo com granulação intracitoplasmática de cardiomiócitos (setas). (B) Septo interventricular com áreas de necrose (setas). Hematoxilina e Eosina. Obj. 40x. Unesp, Jaboticabal, SP (2011) 35 Figura 17 - Fotomicrografia de coelho tratado com doxorrubicina (G2). Comparação da intensidade da deposição de colágeno (corado em azul) entre as regiões anatômicas: (A) Ventrículo direito. (B) Septo interventricular. (C) Ventrículo esquerdo. Notar maior deposição de colágeno em A. Tricrômio de Masson. Obj. 40x. Unesp, Jaboticabal, SP (2011) 36 xiv INDUÇÃO DA CARDIOMIOPATIA DILATADA COM DOXORRUBICINA EM MODELO EXPERIMENTAL COM COELHOS RESUMO - A cardiomiopatia dilatada (CMD) é uma enfermidade caracterizada pelo aumento das câmaras cardíacas e disfunção sistólica. Devido ao fato dessa doença ainda apresentar prognóstico desfavorável aos seres humanos e animais, há a necessidade de criação de modelos experimentais da doença para o teste de novas terapias, como novos fármacos e células-tronco. No trabalho em tela, avaliou-se a indução da cardiomiopatia dilatada em coelhos com a administração de duas doses diferentes de doxorrubicina, por meio de achados radiográficos, eletrocardiográficos, ecodopplercardiográficos e histopatológicos. Foi observada redução significativa na função sistólica após seis semanas de indução, com diminuição da fração de encurtamento e de ejeção. Os achados histopatológicos demonstraram que a cardiotoxicidade decorrente do uso da doxorrubicina desenvolve-se tanto no ventrículo esquerdo quanto no septo interventricular e ventrículo direito. Os resultados desse estudo mostram que a espécie leporina pode ser utilizada como modelo experimental para indução da cardiomiopatia dilatada com doxorrubicina, na dose de 1mg/kg administrada duas vezes por semana por um período de seis semanas consecutivas. Palavras chave: ecodopplercardiografia, doxorrubicina, histopatologia, coelhos xv DILATED CARDIOMYOPATHY INDUCTION WITH DOXORUBICIN IN A RABBIT MODEL ABSTRACT - Dilated cardiomyopathy (DCM) is a disease characterized by increased cardiac chambers and systolic dysfunction. Because of the poor prognosis for humans and animals, studies with new therapeutic modalities have aroused great interest. Thus, there is a need for creation of experimental models of the disease for testing new therapies as new drugs and stem cells. This study was conceived to evaluate an experimental model of dilated cardiomyopathy induced in rabbits with administration of two different doses of chemotherapeutic agent doxorubicin, through radiography, electrocardiography, echodopplercardiography and histopathological findings. Significant reduction in systolic function after six weeks in treated animals, with decrease of ejection and shortening fraction were observed. The histopathologic findings demonstrated that cardiotoxicity due to administration of doxorrubicin occurs in left ventricle, as well as in interventricular septum and right ventricle. The results showed that rabbits can be used as an experimental model of induction of DCM with doxorrubicin, in the dose of 1mg/kg twice a week for a period of six consecutive weeks. Key words: echodopplercardiography, doxorubicin, histopathology, rabbits 1 1. INTRODUÇÃO Frente aos recentes paradigmas éticos aos quais se encontram as pesquisas, a busca por novos modelos de experimentação é uma real necessidade. Considerando que a cardiomiopatia dilatada (CMD) é uma enfermidade frequente e de grande interesse, por ser desafiadora em seu tratamento, tanto em animais domésticos como em seres humanos, o estudo de modelos experimentais para essa doença faz-se necessário. Já existem relatos na literatura da utilização de coelhos para indução da cardiomiopatia dilatada, porém com o avanço da tecnologia e das técnicas diagnósticas, torna-se imprescindível a realização de avaliações mais abrangentes durante o procedimento. A partir do advento da ecodopplercardiografia, é possível estabelecer o início da diminuição da função sistólica, característica da doença em questão e que ainda não está bem estabelecido na espécie leporina, quando submetida à indução da CMD. Tendo em vista estes aspectos, o presente trabalho avaliou o protocolo de indução da cardiomiopatia dilatada com doxorrubicina em coelhos, utilizando-se diferentes doses e frequências de administração, através de análises por radiografia, eletrocardiografia computadorizada, ecodopplercardiografia e achados histopatológicos. 2 2. REVISÃO DE LITERATURA As enfermidades que afetam o miocárdio são denominadas de cardiomiopatias. Essas doenças estão relacionadas com disfunção miocárdica e são causas importantes de insuficiência cardíaca congestiva (ICC). Na Medicina Veterinária, classificam-se em cardiomiopatia dilatada, hipertrófica, restritiva, oculta e arritmogênica ventricular direita (WARE, 2006). A cardiomiopatia dilatada (CMD) é a afecção do miocárdio de maior incidência em cães, caracterizada pelo aumento das câmaras cardíacas, disfunção sistólica, deficiência na contratilidade e consequente desequilíbrio no débito cardíaco (SISSON et al.,1999). Afeta principalmente cães de raças grandes e gigantes, com exceção do Cocker Spaniel (MEURS, 1998; SISSON et al., 1999). A etiologia continua incerta e especula-se que fatores genéticos, nutricionais, infecciosos, isquêmicos, tóxicos, metabólicos ou uma combinação desses estejam envolvidos (CAMACHO, 2007). Contudo, estudos recentes demonstram que fatores genéticos possuem grande importância no desenvolvimento da doença em cães e em seres humanos (MEURS et al., 1998; MEURS et al., 1999). A fisiopatologia da doença consiste inicialmente em lesão miocárdica, com progressiva dilatação das câmaras cardíacas e diminuição da função sistólica. Com a perda progressiva da capacidade contrátil, ocorre um déficit hemodinâmico, com diminuição do débito cardíaco (DC) e da pressão arterial (PA), ativando vários mecanismos compensatórios como aumento do tônus simpático e da liberação da vasopressina (SISSON et al.,1999). Além disso, como resposta à queda da PA, a enzima renina é liberada na circulação e induz a gênese da angiotensina I (AI) por ação direta sobre o angiotensinogênio (SKIDGEL et al., 1984). 3 Na passagem pelo leito vascular pulmonar, a AI é hidrolisada e transformada em angiotensina II (AII), a partir da ação da enzima conversora de angiotensina (ECA) (SKEGGS et al., 1956, ESTHER et al., 1997). A AII é um potente vasoconstritor e promove a síntese de aldosterona que é um fator determinante para a manutenção da PA. Esta atua nos túbulos distais e nos ductos coletores dos néfrons, promovendo retenção de sódio, água e excreção de íons K+ e H+ (SKIDGEL et al., 1984). Assim, ocorre dilatação das câmaras ventriculares, devido ao aumento da pré- carga, observando-se inicialmente hipertrofia excêntrica, com consequente quadro de insuficiência valvular atrioventricular bilateral. Com o progresso da doença, ocorre infiltração fibrosa, edema intersticial e alargamento das fibras miocárdicas, com piora do quadro de deformidade geométrica das câmaras ventriculares e insuficiência valvar (SISSON et al.,1999; O´GRADY & O´SULLIVAN, 2004). Observa-se também, um comprometimento gradual dos processos metabólicos celulares envolvidos no transporte do íon cálcio, gerando acúmulo deste nas mitocôndrias. Assim, o processo de respiração celular fica prejudicado, predispondo ao quadro de arritmia cardíaca (MEHVAR & BROCKS, 2001; WARE, 2006; CAMACHO, 2007). Como ICC esquerda e direita geralmente estão presentes, os sinais clínicos variam. Os animais podem apresentar fraqueza, letargia, anorexia, taquipnéia ou dispnéia, intolerância ao exercício, tosse, cianose e edema pulmonar nos casos de ICC esquerda. Efusões pleurais e pericárdicas, ascite, hepatoesplenomegalia, distensão de pulso jugular e edema de membros posteriores são característicos de ICC direita (SISSON et al.,1999; O´GRADY & O´SULLIVAN, 2004; WARE, 2006). O diagnóstico da doença baseia-se no histórico clínico, exame físico, achados radiográficos, eletrocardiográficos e principalmente, ecodopplercardiográficos. Ao exame físico, além dos achados de ICC esquerda e/ou direita, alterações do ritmo cardíaco e sopro podem ser auscultados. Os achados radiográficos consistem em: cardiomegalia, distensão de veias pulmonares, edema pulmonar, efusão pleural e/ou pericárdica, ascite e hepatomegalia (SISSON et al.,1999; CAMACHO, 2007). O eletrocardiograma pode revelar aumento de duração e amplitude de onda P, sugerindo sobrecarga atrial; aumento de duração do complexo QRS, sugestivo de 4 sobrecarga ventricular esquerda. A onda R pode apresentar-se suprimida, principalmente nos casos de efusões torácicas. Infra ou supra-desnivelamento de segmento ST, nos casos de hipóxia de miocárdio podem ser observados. O eletrocardiograma é uma excelente ferramenta para o diagnóstico das arritmias que podem estar presentes na cardiomiopatia dilatada, tais como fibrilação atrial e arritmias ventriculares (TILLEY, 1992; WARE, 2006). O diagnóstico definitivo da enfermidade deve ser realizado por meio da ecodopplercardiografia, que permite avaliar as dimensões das câmaras cardíacas e a função miocárdica. As principais alterações ecocardiográficas encontradas na CMD são: dilatação das câmaras cardíacas, hipocinesia do septo e da parede ventricular, diminuição das frações de encurtamento e ejeção, aumento da relação átrio esquerdo/aorta e aumento da distância do ponto E da valva mitral ao septo interventricular. Regurgitação atrioventricular pode ser detectada com o uso do doppler (KOCH et al.,1996; BOON, 1998; SISSON et al.,1999; GARNCARZ , 2007). Dentre os principais achados anatomopatológicos encontram-se aumento de câmaras cardíacas, palidez e adelgaçamento do miocárdio, músculos papilares atróficos e hipertrofia ventricular excêntrica. A análise histopatológica pode revelar degeneração miocárdica com miocitólise, vacuolização e atrofia dos miócitos e necrose miocárdica, principalmente na base dos músculos papilares, septo ventricular e subendocárdio da parede livre do ventrículo esquerdo (TIDHOLM & JÖNSSON, 2005; CAMACHO, 2007). O tratamento da cardiomiopatia dilatada consiste em controlar os sinais de insuficiência cardíaca congestiva, melhorar o débito cardíaco, controlar as arritmias, melhorando a qualidade de vida do paciente. Assim, torna-se necessário o uso de diuréticos, vasodilatadores (inibidores da enzima conversora de angiotensina), antiarrítmicos e agentes inotrópicos positivos (WARE, 2006; CAMACHO, 2007). Porém, devido ao fato dessa enfermidade ainda possuir um prognóstico reservado para seres humanos e animais, a criação de modelos experimentais tem despertado grande interesse científico (KASAMA et al., 2007). Cobaias, camundongos e coelhos são animais que têm sido utilizados para estudos de várias cardiopatias. No entanto, devido ao tamanho, melhores condições de manejo e facilidade de acesso as 5 técnicas diagnósticas como o ecodopplercardiograma, os coelhos são mais utilizados (ROBERT, 2007a). Recentemente várias são as pesquisas que têm utilizado coelhos para o teste de novas medidas terapêuticas para os diversos tipos de cardiomiopatias, como novas drogas e terapia com células-tronco (SIMUNEK et al., 2004; CHEN et al., 2006; LU et al., 2006; AUPPERLE et al., 2007; KAISEROVÁ, et al., 2007; KASAMA et al., 2007; ROBERT, 2007b). Sabendo-se dos efeitos cardiotóxicos da doxorrubicina, esse fármaco pode ser utilizado em modelos experimentais para indução da cardiomiopatia dilatada. Este quimioterápico é um antibiótico do grupo das antraciclinas, que foi isolado a partir de culturas fúngicas de Streptomyces peucetius var. caesius. (OLSON & CAPEN, 1978; SUSANECK, 1983; JACOBS, 1996). A doxorrubicina possui atividade quimioterápica em diversas neoplasias, apresentando largo espetro de ação, especialmente em sarcomas de tecidos moles, osteossarcoma, leucemias, linfomas, carcinomas e tumor venéreo transmissível (DIAS et al., 1997; DAGLI & LUCAS, 2006). O mecanismo preciso de ação antitumoral desse fármaco ainda é desconhecido, porém sabe-se que provoca o desencadeamento de vários efeitos bioquímicos que desempenham papel importante nas atividades terapêuticas e tóxicas (CHABNER et al., 1996). É capaz de afetar a síntese de ácidos nucléicos por inibição da DNA- polimerase e da atividade da RNA-polimerase, ligando-se aos dois filamentos da hélice de DNA, intercalando-se entre os pares de nucleotídeos adjacentes, com modificação da estrutura do cromossomo (BUJA et al., 1973; DAGLI & LUCAS, 2006). Com isso, a doxorrubicina permanece ativa durante todas as fases do ciclo celular, mas com toxicidade máxima na fase S. As células tumorais prosseguem pela fase S, morrendo em G2 (SUSANECK, 1983; CHABNER et al., 1996). Entretanto, os efeitos tóxicos miocárdicos parecem estar relacionados com a oxidação. Acredita-se que a cardiotoxicidade decorre da formação de radicais livres, com reações de peroxidação. A liberação de superóxidos propicia a conversão dos ácidos graxos insaturados da membrana celular miocárdica em peróxidos lipídicos, resultando em alterações estruturais no miócito, com formação de vacúolos, 6 degeneração das mitocôndrias, perda dos miofilamentos e atrofia progressiva das miofibrilas. Sabe-se também que a doxorrubicina pode desencadear liberação de histamina, metabólitos do ácido araquidônico e fator de ativação plaquetário, contribuindo para progressão de lesões no miocárdio. Tais alterações resultam em dilatação cardíaca, perda da capacidade contrátil e remodelamento do músculo cardíaco (SUSANECK, 1983; TOMLINSON et al., 1985; GANZ et al., 1996; TOYODA et al., 1998; TJEERDSMA et al., 1999; SOUSA, 2007). A grande sensibilidade do miocárdio às antraciclinas pode decorrer da baixa concentração celular de enzimas como a catalase, da baixa atividade da glutationa peroxidase e da capacidade limitada em utilizar tióis não protéicos, os quais têm papel cardioprotetor contra oxidação (HERSHKO et al., 1996). Em estudo com cães, SOUZA & CAMACHO (2006) referem à semelhança da cardiomiopatia dilatada induzida pela doxorrubicina com a cardiomiopatia dilatada idiopática, principalmente em relação aos achados ecocardiográficos, como dilatação de câmaras cardíacas e perda da função sistólica. Por meio da análise eletrocardiográfica pelo Holter, PEREIRA-NETO et al. (2006) descreveram que cães tratados com doxorrubicina apresentaram arritmias supraventriculares e ventriculares, comprovando que os efeitos cardiotóxicos da doxorrubicina também influenciam no ritmo cardíaco. Histopatologicamente, as lesões miocárdicas encontradas em cães e humanos tratados com doxorrubicina são muito semelhantes às encontradas na CMD, caracterizadas por degeneração vacuolar, miocitólise, atrofia dos cardiomiócitos, necrose, infiltrado mononuclear, fibrose e infiltração adiposa (KEHOE et al., 1978; VAN VLEET & FERRANS, 1986; MAUDLIN et al., 1992). Na busca por novas terapias para a CMD, SOUSA (2007) refere melhora na função sistólica em cães submetidos à indução da CMD com doxorrubicina após o transplante autólogo de células-tronco hematopoiéticas, ressaltando a importância desse tipo de estudo na busca de melhoria na qualidade de vida desses pacientes. Entretanto, o uso da espécie canina como modelo experimental têm sido alvo de discussão entre vários comitês de ética (NORONHA et al., 2007), tornando-se 7 necessária a criação de novos modelos experimentais fidedignos para a CMD, perpetuando os estudos focados no tratamento dessa enfermidade. Em 1980, JAENKE et al. utilizaram coelhos para avaliar os danos causados pela doxorrubicina, estabelecendo doses máximas toleradas pela espécie. Já em 1985, ARNOLDA et al. estudaram as alterações geradas pela doxorrubicina em coelhos, avaliando à ativação dos mecanismos vasoconstritores. Porém, na época em que esses trabalhos foram realizados, ainda não se dispunha de técnicas modernas de avaliação da anatomia e função cardíaca como a eletrocardiografia computadorizada e o ecodopplercardiograma. Como descrito por JAENKE et al. (1980), a dose máxima de doxorrubicina para coelhos é de 2 mg/kg por semana, por um período de 11 a 16 semanas. Esses autores utilizaram essa dose em duas aplicações semanais, de 1 mg/kg cada. Devido à praticidade, alguns autores referem à possibilidade da utilização de apenas uma aplicação semanal, na dose de 2 mg/kg (CHEN et al., 2006; LU et al., 2006; CHENG et al., 2007). Porém, faltam dados comparando as diferenças entre as duas formas de indução, principalmente em relação ao tempo necessário de administração até a diminuição da função sistólica e da exequibilidade dos exames complementares durante o processo. 8 3. OBJETIVOS O trabalho em tela teve como objetivo geral avaliar a espécie leporina como modelo experimental para a cardiomiopatia dilatada induzida com doxorrubicina. Dentro disso, obter o tempo necessário de administração do medicamento até que se inicie a diminuição da função sistólica. Como objetivos específicos pretendeu-se avaliar a exequibilidade de exames complementares atuais na espécie em questão e obtenção de parâmetros em coelhos hígidos e submetidos ao tratamento com doxorrubicina, por meio de análises por radiografia, eletrocardiografia computadorizada, ecodopplercardiografia e achados histopatológicos. 9 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Local de realização da pesquisa O experimento foi conduzido no Laboratório de Cardiologia, no Serviço de Radiologia do Hospital Veterinário “Governador Laudo Natel” e no Departamento de Patologia Veterinária, da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV) da Universidade Estadual Paulista –UNESP - campus de Jaboticabal-SP. O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética e Bem-Estar Animal da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias –UNESP Jaboticabal (protocolo no 5066-09). 4.2 Animais Foram utilizados 30 coelhos da raça Nova Zelândia Branca, adultos, machos e com peso entre 3,0 e 4,0 kg, provenientes de biotério especializado na criação da espécie. Os coelhos foram mantidos em gaiolas individuais de dimensões de 80cm x 50cm x 35cm, com oferta de ração comercial própria para a espécie e água “ad libitum”. Os animais foram distribuídos aleatoriamente, em três grupos experimentais, constituídos de 10 coelhos cada e denominados: G1: grupo controle, G2: grupo doxorrubicina 1 mg/kg duas vezes na semana (terças e sextas-feiras), por seis semanas consecutivas e G3 : grupo doxorrubicina 2 mg/kg uma vez na semana (terças-feiras), por seis semanas consecutivas. 10 4.3 Indução da cardiomiopatia dilatada com doxorrubicina A concentração de 2mg/ml foi obtida a partir da diluição do frasco-ampola de 50mg de doxorrubicina (pó liofilizado)1 em solução fisiológica2 0,9% estéril. Esse procedimento foi realizado em capela3 de fluxo laminar própria para manejo de quimioterápicos. Todos os manipuladores utilizaram acessórios de segurança (luvas, avental, gorro e máscara) durante todas as manipulações e administrações do fármaco. Nenhum animal foi anestesiado durante a administração do fármaco e para correta imobilização foi utilizado um suporte de contenção. Inicialmente foi realizada tricotomia da região auricular e posterior assepsia. O acesso venoso foi realizado através da implantação de scalp no 21 na veia auricular (VILARDO, 2007) e o fármaco diluído foi administrado em “bolus”, de forma lenta. Os animais do grupo G2 receberam doxorrubicina, por via intravenosa, na dose de 1 mg/kg, duas vezes por semana. Já os animais do grupo G3, receberam doxorrubicina, por via intravenosa, na dose de 2 mg/kg, uma vez por semana. Ambos os grupos foram tratados por 6 semanas e eutanasiados após a última avaliação (T60), com injeção intravenosa de propofol, seguida de cloreto de potássio. 4.4 Avaliações As avaliações radiográficas, eletrocardiográficas e ecodopplercardiográficas foram realizadas nos animais de todos os grupos, sem anestesia, antes da administração da doxorrubicina e a cada quinze dias após o início da administração da mesma, da seguinte maneira:  T0: antes da administração da doxorrubicina;  T 15: quinze dias após a primeira administração da doxorrubicina; 1 Cloridrato de doxorrubicina 50mg - Eurofarma 2 Solução Fisiológica de Nacl a 0,9 % - JP Indústria Farmacêutica 3 Capela de fluxo laminar Filtracom ® 11  T 30: trinta dias após a primeira administração da doxorrubicina;  T45: quarenta e cinco dias após a primeira administração da doxorrubicina;  T 60: sessenta dias após a primeira administração da doxorrubicina; 4.4.1 Radiografia Os animais foram submetidos à radiografia torácica, nas projeções laterolateral direita e ventrodorsal, como sugerido por PINTO (2007), apenas com contenção física. A técnica utilizada em todos os animais foi 40 kV, 400 mA e 4 mAs. Foi realizada análise qualitativa e quantitativa para comparação entre os tempos. A partir da radiografia laterolateral direita foi obtido o VHS (Figura 1) como descrito por BUCHAMAN & BUCHELER (1995). Figura 1 - Radiografia na projeção laterolateral direita de coelho (G1), ilustrando os traçados lineares para o cálculo do VHS. (A) Eixo vertical (B) Eixo horizontal. Unesp, Jaboticabal, SP (2011). 12 4.4.2 Eletrocardiografia Para a realização do eletrocardiograma, foi utilizado um aparelho computadorizado4, que permite a observação simultânea das derivações (DI, DII, DIII, aVR, aVL, aVF, rV2, V2, V4 e V10), na velocidade de 50mm/segundo. Os registros foram realizados em sensibilidade 2N, devido às baixas amplitudes, de acordo com a técnica descrita por TILLEY (1992). Durante a realização do exame, os animais foram mantidos em decúbito lateral direito, sobre mesa apropriada, fixando-se os eletrodos5 um em cada membro locomotor, permitindo a obtenção dos traçados eletrocardiográficos que foram gravados em arquivos eletrônicos para posterior interpretação. Foram mensurados os seguintes parâmetros: frequência cardíaca (FC), duração e amplitude de onda P (P ms e P mV), duração do intervalo PR (PR ms), duração do complexo QRS (QRS ms), amplitude de onda R (R mV), duração do intervalo QT (ms). Também foram avaliados o ritmo cardíaco e o segmento ST. 4.4.3 Ecodopplercardiografia Como descrito por STYPMANN et al. (2007), o exame ecodopplercardiográfico pode ser realizado em coelhos sem a utilização de anestésicos, uma vez que alguns fármacos podem alterar a função cardíaca. Primeiramente foi realizada tricotomia da região torácica e seguidamente os animais foram submetidos à contenção física, em decúbito lateral. Para a realização da ecodopplercardiografia, foi utilizado ecodopplercardiógrafo6 com transdutor bifrequencial 7,5 – 10 MHz. Com o animal posicionado em decúbito lateral direito, localizou-se a janela paraesternal direita. Com a visualização bidimensional do ventrículo esquerdo em eixo transversal, obteve-se imagem em modo-M, posicionando o cursor equidistante dos músculos papilares em plano cordal. A partir dessa imagem foram obtidos os seguintes parâmetros: espessura do septo interventricular em diástole (ESIVd); diâmetro interno 4 Módulo de Aquisição de ECG para Computador (ECG-PC versão 2.07)® - Tecnologia Eletrônica Brasileira (TEB). 5 Becton Dickinson B-D 6 300S Pandion Vet – Pie Medical ® Equipment – Maastricht –Holanda. 13 do ventrículo esquerdo em diástole (DIVEd), espessura da parede livre do ventrículo esquerdo em diástole (EPLVEd), espessura do septo interventricular em sístole ESIVs, diâmetro interno do ventrículo esquerdo em sístole (DIVEs) e espessura da parede livre do ventrículo esquerdo em sístole (EPLVEs), fração de ejeção (FEJ) e fração de encurtamento (FEC). Inclinou-se delicadamente o transdutor para obtenção da imagem da distância do ponto E mitral ao septo interventricular (calculado pelo modo- M). Ainda nesse decúbito, obteve-se a imagem da aorta e átrio esquerdo, onde as medidas dessas estruturas foram realizadas no modo bidimensional, para posterior cálculo da relação átrio esquerdo/aorta (AE/AO). Em sequência à imagem anterior, inclinou-se o transdutor dorsalmente até que fosse visibilizada a artéria pulmonar. Utilizando-se dessa imagem, o cursor Doppler foi posicionado distalmente aos folhetos da valva pulmonar, para mensuração do pico de velocidade do fluxo transpulmônico (PVPUL), com o Doppler pulsado. Essa imagem também foi utilizada para mensuração do débito cardíaco (DC). Subsequentemente, o animal foi posicionado em decúbito lateral esquerdo para obtenção da imagem apical quatro câmaras pela janela paraesternal equerda. A partir da imagem bidimensional, o cursor do Doppler pulsado foi posicionado na extremidade dos folhetos da valva mitral e posteriormente da valva tricúspide, para obtenção dos seguintes parâmetros: pico de velocidade de enchimento ventricular esquerdo rápido - onda E, do fluxo mitral (PVEM), pico de velocidade enchimento ventricular esquerdo lento - onda A, do fluxo mitral (PVAM), pico de velocidade de enchimento ventricular esquerdo rápido - onda E, do fluxo tricúspide (PVET) e pico de velocidade enchimento ventricular esquerdo lento - onda A, do fluxo tricúspide (PVAT). A partir da imagem apical cinco câmaras obtida pela mesma janela, posicionou-se o cursor do Doppler pulsado distalmente aos folhetos da valva aórtica, mensurando-se o pico de velocidade do fluxo transaórtico (PVAO). O tempo de ejeção ventricular esquerda (TEVE) foi mensurado do início ao final do fluxo transaórtico. Para a mensuração do tempo de relaxamento isovolumétrico (TRIV), o cursor do Doppler pulsado foi posicionado equidistante entre a via de saída do ventrículo esquerdo e o fluxo transmitral, sendo determinado o tempo desde o término do fluxo transaórtico até o início do enchimento ventricular esquerdo rápido (onda E) do fluxo transmitral. 14 Para o cálculo do índice de desempenho miocárdico de Tei (ITEI), mensurou-se o intervalo entre o término do espectro da onda A mitral e o início da onda E mitral subsequente. Desse valor subtraiu-se TEVE, sendo o resultado dividido pelo próprio TEVE (TEI et al., 1995). O resultado das mensurações ecocardiográficas foi considerado a partir da média de três ciclos cardíacos consecutivos. Para os parâmetros Doppler, utilizou-se três ciclos cardíacos com picos máximos de velocidade, com auxílio do sinal de áudio, visando otimizar o espectro do pico de velocidade do fluxo sanguíneo (BOON, 1998; SOUZA, 2004; SOUSA, 2007). 4.4.4 Análise histológica Para análise histológica, foram colhidos fragmentos do ventrículo direito, septo interventricular e ventrículo esquerdo, fixados em solução de formol a 10% tamponado com fosfatos, pH 7,6. Após 24 horas de fixação, os fragmentos foram desidratados em soluções de concentração decrescente de álcool, diafinizados em xilol e incluídos em parafina. Os cortes foram feitos na espessura de 5 μm e corados com hematoxilina e eosina (HE) e com Tricômio de Masson (TM) (BEHMER et al., 1976). As alterações microscópicas foram observadas de acordo com a intensidade de lesões degenerativas (vacuolização, granulação, necrose e fibrose intersticial) e foram graduadas em escores que variaram de 0 a 3. A localização das lesões foi determinada e sua intensidade avaliada em grau 0 (ausência de lesões), grau 1(discreta), grau 2 (moderada) ou grau 3 (acentuada). As lesões foram discretas quando observou-se pequenos focos nas áreas estudadas. A classificação de moderada corresponde às lesões maiores, que poderiam ser multifocais a localmente extensas. As lesões acentuadas envolveram grande parte das áreas anatômicas avaliadas, muitas vezes com coalescência entre elas. 4.4.5 Análise estatística Os dados obtidos a partir do eletrocardiograma, ecodopplercardiograma e VHS foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e teste de Tuckey. 15 Os valores referentes ao grau de lesão na histopatologia passaram por transformação logarítmica (logx + 5), seguida de análise de variância (ANOVA) e teste de Tuckey. A análise estatística foi realizada com o programa “SAS”, considerando p < 0,05 como significativo. 16 5. RESULTADOS 5.1 Mortalidade Não houve óbito nos animais do grupo G1 durante todo o experimento. Os animais do grupo G2 apresentaram 30% de mortalidade no final do experimento e os animais do grupo G3 apresentaram 70% de mortalidade, sendo que já no T30, 50 % dos animais desse grupo já haviam morrido. A representação gráfica da mortalidade durante todo o experimento pode ser observada na Figura 2. Após a avaliação do T60, quando a maioria dos animais sobreviventes do G2 e G3 apresentou diminuição importante na função sistólica, optou-se pela eutanásia dos animais, para evitar maiores índices de mortalidade. Figura 2 - Porcentagem de mortalidade de coelhos durante o tratamento com doxorrubicina. Unesp, Jaboticabal, SP (2011). 0 10 20 30 40 50 60 70 T0 T15 T30 T45 T60 % Mortalidade G1 G2 G3 17 5.2 Achados radiográficos Foi possível observar aumento da silhueta cardíaca durante a análise qualitativa das radiografias torácicas dos animais submetidos ao tratamento com doxorrubicina, a partir do T45. A principal alteração que pode ser vista na projeção laterolateral direita (Figura 3) e ventrodorsal (Figura 4) foi o aumento do ventrículo direito. Porém, essas alterações ocorreram em apenas 30 % dos animais do G2 e 10 % dos animais do G3, a partir do T45. O cálculo do VHS também não revelou alterações significativas nos grupos tratados com doxorrubicina durante todos os tempos de avaliação. A evolução dos valores (média ± DP) do VHS de todos os animais encontra-se representada na Tabela 1. Tabela 1- Valores de VHS (média ± DP) obtidas a partir de radiografia torácica laterolateral direita de coelhos durante o tratamento com doxorrubicina. Unesp, Jaboticabal, SP (2011). Parâmetro Tempos de avaliação T0 T15 T30 T45 T60 VHS G1 8,41±0,58a 8,36±0,28a 8,11±0,31a 8,11±0,43a 8,11±0,43a G2 8,38±0,66a 8,50±0,56a 8,50±0,28a 8,33±0,34a 8,33±0,34a G3 8,31±0,44a 8,50±0,25a 7,95±0,62a 8,13±0,37a 8,13±0,37a VHS= Vertebral Heart Size * Diferença significativa em relação a T0 (p < 0,05). Letras minúsculas diferentes na mesma coluna indicam diferença significativa (p<0,05) entre os grupos. 18 Figura 3 - Radiografia laterolateral direita de coelho (G2) submetido ao tratamento com doxorrubicina. (A) T0 e (B) T60. Notar abaulamento do ventrículo direito em B (setas). Unesp Jaboticabal, SP (2011). Figura 4 - Radiografia ventrodorsal de coelho (G2) submetido ao tratamento com doxorrubicina. (A) T0 e (B) T60. Notar abaulamento do ventrículo direito em B (setas). Unesp Jaboticabal, SP (2011). A B A B 19 5.3 Achados eletrocardiográficos Os parâmetros eletrocardiográficos avaliados durante a administração da doxorrubicina não evidenciaram alterações sugestivas de sobrecarga de câmaras cardíacas. Houve apenas diminuição significativa (p<0,05) da duração do intervalo QT (QT ms) no T45 em relação ao T0 do grupo G1. Ocorreu ritmo sinusal em todos os eletrocardiogramas analisados dos três grupos. Não foi observado nenhum tipo de arritmia durante todas as avaliações. O segmento ST manteve-se isoelétrico em todos registros. A evolução dos valores (média ± DP) eletrocardiográficos avaliados encontra-se representada na Tabela 2. 20 Tabela 2- Valores dos parâmetros eletrocardiográficos (média ± DP) de coelhos durante o tratamento com doxorrubicina. Unesp, Jaboticabal, SP (2011). Parâmetro Tempos de avaliação T0 T15 T30 T45 T60 FC G1 271,30±49,97a 280,62±62,47a 266,11±72,40a 304,00±26,74a 273,75±39,26a G2 210,70±59,89a 263,87±31,28a 254,00±46,63a 277,50±21,87a 258,80±34,02a G3 225,80±31,86a 277,66±49,86a 255,60±37,56a 298,00±19,46a 248,00±21,07a P ms G1 28,10±5,25a 30,00±5,29a 27,11±6,31a 18,62±7,26a 26,75±3,95a G2 29,00±4,54a 35,75±8,18a 29,42±6,21a 22,33±5,71a 31,40±6,22a G3 25,80±5,75a 28,77±5,80a 28,00±5,83a 25,66±9,81a 31,00±7,21a P mV G1 0,03±0,00a 0,02±0,00a 0,02±0,01a 0,01±0,01a 0,03±0,01a G2 0,03±0,01a 0,03±0,01a 0,03±0,01a 0,01±0,00a 0,04±0,00a G3 0,03±0,01a 0,02±0,00a 0,02±0,00a 0,03±0,02a 0,03±0,01a PR ms G1 58,40±18,64a 53,25±11,88a 52,88±15,07a 40,62±14,53a 57,12±11,06a G2 55,80±10,84a 57,87±6,62a 56,00±10,81a 45,00±5,79a 56,40±6,14a G3 54,20±13,47a 53,00±8,95a 54,60±20,37a 41,00±10,14a 55,33±10,78a QRS ms G1 45,90±5,70a 44,00±7,42 a 46,66±5,63 a 36,62±11,17a 41,00±6,82a G2 41,10±6,22a 46,75±10,20a 47,28±6,23 a 37,16±6,30a 44,20±6,68a G3 37,00±6,84a 45,55±7,53 a 46,40±4,77 a 45,66±5,13a 40,00±7,00a R mV G1 0,15±0,04a 0,09±0,04a 0,15±0,06a 0,08±0,07a 0,10±0,04a G2 0,12±0,09a 0,15±0,10a 0,14±0,12a 0,08±0,06a 0,23±0,10a G3 0,13±0,05a 0,16±0,07a 0,17±0,09a 0,18±0,06a 0,13±0,05a QT ms G1 135,90±17,99a 140,62±32,68a 128,77±19,96a 92,87±27,25a* 128,25±36,04a G2 128,30±19,07a 130,50±27,33a 130,42±12,55a 120,50±27,58a 119,40±11,88a G3 119,00±26,96a 130,33±22,31a 148,20±26,40a 110,00±14,79a 119,66±20,81a FC: frequência cardíaca (bpm); P ms: duração da onda P (mseg); P mV: amplitude da onda P (mV); PR ms: duração do intervalo PR (mseg); QRS ms: duração do complexo QRS (mseg); R mV: amplitude da onda R (mV); QT ms: duração do intervalo QT (mseg). mseg= milissegundos; mV= milivolts; bpm= batimentos por minuto. * Diferença significativa em relação a T0 (p < 0,05). Letras minúsculas diferentes na mesma coluna indicam diferença significativa (p<0,05) entre os grupos. 21 5.4 Achados ecodopplercardiográficos Pode ser notada dilatação das câmaras cardíacas na maioria dos animais tratados com doxorrubicina através de análise subjetiva das imagens ecocardiográficas pelo modo bidimensional (Figuras 5 e 6). Ao longo da administração da doxorrubicina observou-se aumento significativo (p<0,05) no diâmetro interno do ventrículo esquerdo em sístole (DIVEs) apenas nos animais do grupo G3 no T60 em relação ao T0. Na análise entre os grupos, houve aumento significativo do DIVEs nos animais do grupo G2 em relação ao G1 no T45. Pode ser observada redução significativa (p< 0,05) na espessura da parede livre do ventrículo esquerdo em sístole (EPLVEs) nos animais do grupo G2 em relação ao grupo G1 no T45 e no T60. Essa diferença não ocorreu com os animais do grupo G3. Não houve diferença significativa (p>0,05) para os parâmetros ESIVs, ESIVd, DIVEd, EPLVEd, SSPE e AE/AO dos animais em relação ao T0, nem entre os grupos durante todos os momentos de avaliação. Em relação à função sistólica, houve redução significativa (p<0,05) nas frações de encurtamento (FEC) e de ejeção (FEJ) nos animais do grupo G2 e G3 no T45 e T60, sendo esse, o ponto decisivo para encerrar a administração de doxorrubicina nos animais tratados. A análise diastólica foi prejudicada devido à fusão das ondas E e A, muito frequente na espécie utilizada (Figura 7). Nos casos onde isso ocorreu, foi considerado o pico de velocidade da onda única, como sendo o pico de velocidade da onda E. Assim, não houve diferença significativa (p>0,05) entre os picos de velocidade de onda E e A em relação ao T0 e nem entre os grupos, tanto para a valva mitral quanto para tricúspide. Também não foi possível obter o cálculo da relação PVE/PVA na mitral e na tricúspide devido à fusão entre as ondas. O estudo do tempo de relaxamento isovolumétrico TRIV também não apresentou diferença significativa entre os tempos de avaliação e entre grupos. Não houve diferença significativa (p>0,05) para os parâmetros obtidos pelo Doppler (PVPUL, PVAO, TEVE, DC e ITEI) dos grupos em relação ao T0 e nem entre os grupos durante os momentos de avaliação. 22 A evolução dos parâmetros ecocardiográficos bem como dos parâmetros obtidos pelo Doppler (média ± DP) durante a administração da doxorrubicina encontram-se representados nas Tabelas 3 e 4. A representação gráfica das médias e desvios-padrão dos parâmetros Fração de Encurtamento e Fração de Ejeção pode ser observada nas Figuras 8 e 9. 23 Figura 5 – Imagem ecocardiográfica apical quatro câmaras de coelho submetido ao tratamento com doxorrubicina (G2) no T0 (A) e no T60 (B). AD= átrio direito; AE= átrio esquerdo; VD= ventrículo direito; VE= ventrículo esquerdo. Unesp, Jaboticabal, SP (2011). A B 24 Figura 6 – Imagem ecocardiográfica no modo M de coelho submetido ao tratamento com doxorrubicina (G2) no T0 (A) e no T45 (B). Unesp, Jaboticabal, SP (2011). Notar aumento do diâmetro interno do ventrículo esquerdo em sístole e diástole em B. Figura 7 – Imagem ecodopplercardiográfica de coelho do grupo controle (G1) no T0. Presença de fusão de ondas E e A (1). Unesp, Jaboticabal, SP (2011). A B 25 Tabela 3- Valores dos parâmetros ecocardiográficos (média ± DP) de coelhos durante o tratamento com doxorrubicina. Unesp, Jaboticabal, SP (2011). Parâmetro Tempos de avaliação T0 T15 T30 T45 T60 ESIVs G1 0,33±0,07a 0,34±0,06a 0,40±0,08a 0,39±0,10a 0,39±0,03a G2 0,33±0,04a 0,35±0,04a 0,36±0,05a 0,29±0,04a 0,35±0,03a G3 0,35±0,08a 0,29±0,09a 0,37±0,08a 0,37±0,03a 0,33±0,10a ESIVd G1 0,24±0,03a 0,26±0,03a 0,30±0,03a 0,30±0,06a 0,28±0,04a G2 0,27±0,03a 0,26±0,03a 0,29±0,04a 0,24±0,05a 0,30±0,06a G3 0,25±0,03a 0,23±0,04a 0,29±0,04a 0,22±0,06a 0,25±0,03a DIVEs G1 0,87±0,16a 0,86±0,15a 0,88±0,13a 0,80±0,13a 0,88±0,13a G2 0,90±0,11a 0,90±0,12a 0,93±0,12a 1,11±0,13b 1,00±0,20a G3 0,80±0,15a 0,90±0,15a 0,88±0,13a 1,01±0,08ab 1,11±0,15a* DIVEd G1 1,35±0,21a 1,32±0,19a 1,32±0,19a 1,31±0,20a 1,40±0,16a G2 1,40±0,15a 1,37±0,18a 1,41±0,12a 1,40±0,16a 1,29±0,24a G3 1,41±0,19a 1,35±0,15a 1.36±0,17a 1,31±0,18a 1,43±0,13a EPLVEs G1 0,39±0,06a 0,39±0,07a 0,44±0,05a 0,49±0,06a 0,47±0,05a G2 0,41±0,03a 0,39±0,04a 0,43±0,06a 0,34±0,05b 0,34±0,07b G3 0,40±0,06a 0,40±0,03a 0,42±0,05a 0,44±0,12ab 0,41±0,09ab EPLVEd G1 0,36±0,06a 0,33±0,07a 0,40±0,04a 0,40±0,06a 0,37±0,02a G2 0,37±0,08a 0,31±0,05a 0,35±0,08a 0,34±0,06a 0,38±0,09a G3 0,34±0,06a 0,35±0,05a 0,39±0,11a 0,48±0,08a 0,36±0,03a SSPE G1 0,05±0,02a 0,04±0,02a 0,06±0,02a 0,03±0,00a 0,06±0,01a G2 0,04±0,02a 0,07±0,02a 0,06±0,02a 0,07±0,01a 0,07±0,02a G3 0,06±0,02a 0,04±0,01a 0,02±0,01a 0,07±0,03a 0,07±0,02a FEC G1 35,24±5,61a 34,27±6,02a 33,90±5,16a 38,57±2,22a 37,35±4,83a G2 35,69±2,39a 33,06±3,60a 33,92±4,18a 20,71±4,02b* 22,66±3,50b* G3 37,46±5,85a 33,83±5,16a 34,80±4,60a 22,66±3,78b* 22,33±4,04b* FEJ G1 68,33±7,54a 66,24±8,89a 66,70±7,07 73,28±3,03a 71,00±5,83a G2 68,99±2,98a 65,30±4,86a 66,78±5,74 45,78±7,44b* 49,50±6,25b* G3 71,01±6,99a 66,70±6,77a 68,00±5,78 49,33±6,80b* 48,33±6,65b* AE/AO G1 1,46±0,13a 1,54±0,33a 1,54±0,28a 1,39±0,19a 1,38±0,16a G2 1,58±0,24a 1,71±0,17a 1,64±0,14a 1,67±0,33a 1,84±0,19a G3 1,49±0,15a 1,77±0,24a 1,51±0,33a 1,65±0,41a 1,55±0,41a ESIVs: espessura do septo interventricular em sístole (cm); ESIVd : espessura do septo interventricular em diástole (cm); DIVEs: diâmetro interno do ventrículo esquerdo em sístole (cm); DIVEd: diâmetro interno do ventrículo esquerdo em diástole (cm); EPLVEs: espessura da parede livre do ventrículo esquerdo em sístole (cm); EPLVEd : espessura da parede livre do ventrículo esquerdo em diástole (cm); SSPE: separação septal do ponto E (cm); FEC: fração de encurtamento (%); FEJ: Fração de ejeção (%); AE/AO : relação átrio esquerdo/aorta * Diferença significativa em relação a T0 (p < 0,05). Letras minúsculas diferentes na mesma coluna indicam diferença significativa (p<0,05) entre os grupos 26 Tabela 4- Valores dos parâmetros ecodopplercardiográficos (média ± DP) de coelhos durante o tratamento com doxorrubicina. Unesp, Jaboticabal, SP (2011). Parâmetro Tempos de avaliação T0 T15 T30 T45 T60 PVPUL G1 0,77±0,09a 0,76±0,13a 0,83±0,17a 0,82±0,19a 0,81±0,06a G2 0,71±0,10a 0,75±0,12a 0,77±0,13a 0,91±0,25a 0,71±0,21a G3 0,72±0,10a 0,87±0,16a 0,95±0,10a 1,02±0,24a 0,89±0,14a PVAO G1 0,76±0,12a 0,76±0,28a 0,78±0,13a 0,83±0,14a 0,90±0,13a G2 0,70±0,14a 0,71±0,13a 0,74±0,19a 0,84±0,18a 0,96±0,29a G3 0,72±0,13a 1,00±0,25a 0,93±0,21a 0,89±0,18a 0,84±0,14a PVME G1 0,65±0,15a 0,72±0,19a 0,79±0,12a 0,72±0,25a 0,74±0,19a G2 0,60±0,22a 0,75±0,21a 0,75±0,12a 0,84±0,19a 0,79±0,26a G3 0,60±0,12a 0,76±0,20a 0,75±0,30a 0,71±0,16a 0,52±0,39a PVMA G1 0,56±0,12a 0,33±0,00a 0,55±0,18a 0,49±0,14a 0,63±0,10a G2 0,50±0,15a 0,54±0,01a 0,60±0,17a 0,66±0,10a 0,49±0,21a G3 0,44±0,09a 0,48±0,07a 0,54±0,00a 0,55±0,00a 0,64±0,24a PVTE G1 0,57±0,16a 0,63±0,14a 0,73±0,17a 0,72±0,15a 0,76±0,13a G2 0,56±0,16a 0,62±0,16a 0,66±0,18a 0,77±0,19a 0,81±0,23a G3 0,55±0,16a 0,69±0,20a 0,80±0,14a 0,82±0,32a 0,72±0,12a PVTA G1 0,53±0,15a 0,65±0,18a 0,75±0,07a 0,52±0,12a 0,56±0,18a G2 0,52±0,16a 0,58±0,11a 0,59±0,12a 0,58±0,07a 0,56±0,20a G3 0,44±0,17a 0,52±0,04a 0,85±0,00a 0,36±0,00a 0,58±0,24a TEVE G1 144,93±14,17a 139,47±25,24a 134,99±36,04a 126,33±19,86a 123,56±14,79a G2 143,42±20,34a 143,58±19,43a 142,28±18,73a 129,19±13,00a 119,10±12,35a G3 139,89±26,16a 131,55±16,48a 139,33±30,46a 131,88±6,86a 117,11±7,16a TRIV G1 35,03±7,51a 36,74±8,79a 31,95±8,84a 28,57±5,68a 31,56±6,20a G2 40,79±13,16a 40,37±5,07a 30,38±5,08a 26,52±3,37a 34,72±9,85a G3 43,69±11,39a 37,66±7,21a 28,73±5,15a 32,88±8,33a 34,16±13,90a DC G1 0,43±0,13a 0,40±0,14a 0,53±0,06a 0,50±0,16a 0,40±0,08a G2 0,34±0,08a 0,48±0,16a 0,40±0,11a 0,41±0,17a 0,37±0,17a G3 0,40±0,11a 0,45±0,14a 0,43±0,10a 0,49±0,29a 0,47±0,06a ITEI G1 0,28±0,14a 0,37±0,16a 0,30±0,12a 0,19±0,13a 0,29±0,08a G2 0,43±0,20a 0,39±0,16a 0,30±0,12a 0,22±0,05a 0,31±0,10a G3 0,39±0,18a 0,38±0,10a 0,21±0,11a 0,32±0,08a 0,35±0,21a PVPUL: pico de velocidade do fluxo trans-pulmônico (m/s); PVAO: pico de velocidade do fluxo trans-aórtico (m/s); PVME: pico de velocidade da onda E do fluxo mitral (m/s); PVMA: pico de velocidade da onda A do fluxo mitral (m/s); PVTE: pico de velocidade da onda E do fluxo tricúspide (m/s); PVTA: pico de velocidade da onda A do fluxo tricúspide (m/s); TEVE: tempo de ejeção ventricular esquerda (mseg); TRIV: tempo de relaxamento isovolumétrico (mseg); DC: débito cardíaco (L/min); ITEI: índice de performance miocárdica de Tei. * Diferença significativa em relação a T0 (p < 0,05). Letras minúsculas diferentes na mesma coluna indicam diferença significativa (p<0,05) entre os grupos. 27 Figura 8 - Representação gráfica das médias ± DP da Fração de Encurtamento em coelhos durante o tratamento com doxorrubicina. Unesp, Jaboticabal, SP (2011). * Diferença significativa (p<0,05) em relação ao T0 do mesmo grupo Ф Diferença significativa (p<0,05) em relação ao G1 no mesmo tempo de avaliação 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 T0 T15 T30 T45 T60 % Fração de Encurtamento G1 G2 G3 Ф * Ф * Ф * Ф * 28 Figura 9- Representação gráfica das médias ± DP da Fração de Ejeção em coelhos durante o tratamento com doxorrubicina. Unesp, Jaboticabal, SP (2011). * Diferença significativa (p<0,05) em relação ao T0 do mesmo grupo Ф Diferença significativa (p<0,05) em relação ao G1 no mesmo tempo de avaliação 0 10 20 30 40 50 60 70 80 T0 T15 T30 T45 T60 % G1 G2 G3 Fração de Ejeção Ф * Ф * Ф * Ф * 29 5.5 Análise histológica Todos os fragmentos coletados dos animais do grupo controle (G1) não apresentaram alterações histopatológicas dignas de nota (Figuras 10, 11,12, 13 e 14 A e B). Na análise microscópica dos cortes de miocárdio dos animais tratados (G2 e G3) observou-se vacuolização, degeneração e necrose das fibras musculares, além de deposição de colágeno intersticial (Figuras 14 C eD) nas três regiões anatômicas avaliadas (ventrículo direito, septo interventricular e ventrículo esquerdo). Também verificou-se discreto infiltrado leucocitário, com predomínio de células mononucleares (linfócitos, macrófagos e plasmócitos). A presença de vacúolos intracelulares foi visibilizada em todos os animais tratados, principalmente ao redor dos núcleos celulares (Figura 15). A intensidade de vacuolização foi significativamente diferente (p<0,05) entre G1, G2 e G3, ocorrendo em maior intensidade neste último grupo. Não houve diferença significativa entre a comparação de intensidade de lesões entre as regiões anatômicas, comprovando que a vacuolização ocorreu na mesma magnitude no ventrículo direito, septo interventricular e ventrículo esquerdo em coelhos tratados com doxorrubicina (Tabela 5, Figura 10). A degeneração das fibras miocárdicas também foi característica marcante nos animais tratados, com perda das estriações citoplasmáticas. Observou-se também focos com variabilidade no diâmetro das células musculares, caracterizando atrofia. Foi possível visualizar dissociação e ruptura de fibras musculares, infiltração gordurosa e deposição de substância granular intracitoplasmática (Figura 16). A intensidade dessa granulação foi significativamente diferente (p<0,05) entre G1, G2 e G3, ocorrendo mais intensamente em G3. Não houve diferença significativa entre as regiões anatômicas, comprovando que a degeneração ocorreu na mesma intensidade no ventrículo direito, septo interventricular e ventrículo esquerdo em coelhos tratados com doxorrubicina (Tabela 5, Figura 11). Também pode ser observada presença de pleomorfismo nuclear, com núcleos maiores sugerindo hipertrofia focal de cardiomiócitos. O aspecto de fibras retraídas, hialinas e com núcleos picnóticos permitiu caracterizar a presença de necrose (Figuras 15 A e 16 B). A intensidade dessa lesão foi significativamente maior (p<0,05) nos grupos tratados em relação ao G1, para o 30 septo interventricular e ventrículo direito. Isso também foi observado no ventrículo esquerdo dos animais do grupo G2. Não ocorreu diferença significativa (p>0,05) na comparação das lesões no ventrículo esquerdo dos animais do G3 em relação ao G1 e G2. Não houve diferença significativa entre as regiões anatômicas, comprovando que a necrose ocorreu na mesma intensidade no ventrículo direito, septo interventricular e ventrículo esquerdo em coelhos tratados com doxorrubicina (Tabela 5, Figura 13). A fibrose e/ou aumento da matriz extracelular por deposição de colágeno entre as fibras miocárdicas degeneradas foi observada nas lesões mais avançadas (Figuras 14 C, D e 15). A intensidade da fibrose foi avaliada pela coloração de Tricômio de Masson. A deposição de colágeno foi significativamente maior (p<0,05) nos grupos tratados em relação ao G1, para o ventrículo direito e esquerdo. Porém, para o septo interventricular houve diferença significativa entre os três grupos, sendo maior no grupo G2. Houve maior deposição de colágeno no ventrículo direito (p<0,05) em comparação com o septo interventricular e o ventrículo esquerdo em todos os coelhos tratados com doxorrubicina (G1 e G2) (Tabela 5, Figuras 12 e 17). Tabela 5 - Grau de lesões (média ± DP) obtidos através de análise histológica do miocárdio de coelhos submetidos à indução da cardiomiopatia dilatada com doxorrubicina, Unesp, Jaboticabal, SP (2011). Lesões Regiões anatômicas VD SEPTO IV VE Vacuolização G1 0aA 0aA 0aA G2 1,42±0,78bA 1,57±0,78bA 1,14±0,37bA G3 2,66±0,57cA 2,66±0,57cA 2,33±0,57cA Granulação G1 0aA 0aA 0aA G2 1,57±0,78bA 1,57±0,78bA 1,42±0,78bA G3 2,66±0,57cA 2,66±0,57cA 2,33±0,57cA Fibrose G1 0aA 0aA 0aA G2 2,28±0,75bA 1,85±0,69bB 1,71±0,48bB G3 2,00±0,00bA 1,33±0,57cB 1,33±0,57bB Necrose G1 0aA 0aA 0aA G2 1,00±0,57bA 1,14±0,69bA 1,00±0,81bA G3 1,33±0,57bA 1,66±0,57bA 0,66±1,15abA VD= ventrículo direito; SEPTO IV = septo interventricular; VE= ventrículo esquerdo Letras minúsculas diferentes na mesma coluna indicam diferença significativa (p<0,05) entre os grupos. Letras maiúsculas diferentes na mesma linha indicam diferença significativa (p<0,05) entre as regiões anatômicas. 31 Figura 10 – Médias do grau de vacuolização das células do miocárdio de coelhos submetidos ao tratamento com doxorrubicina. Unesp, Jaboticabal, SP (2011). Ф Diferença significativa (p<0,05) entre os grupos na região anatômica Figura 11 – Médias do grau de granulação das células do miocárdio de coelhos submetidos ao tratamento com doxorrubicina. Unesp, Jaboticabal, SP (2011). Ф Diferença significativa (p<0,05) entre os grupos na região anatômica 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 VD SEPTO IV VE Vacuolização G1 G2 G3 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 VD SEPTO IV VE Granulação G1 G2 G3 Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф 32 Figura 12 – Médias do grau de fibrose do miocárdio de coelhos submetidos ao tratamento com doxorrubicina. Unesp, Jaboticabal, SP (2011). * Diferença significativa (p<0,05) em relação às outras regiões anatômicas do mesmo grupo Ф Diferença significativa (p<0,05) entre os grupos na região anatômica Ʊ Diferença significativa (p<0,05) em relação ao G1 na região anatômica Figura 13 – Médias do grau de necrose do miocárdio de coelhos submetidos ao tratamento com doxorrubicina. Unesp, Jaboticabal, SP (2011). Ʊ Diferença significativa (p<0,05) em relação ao G1 na região anatômica 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 VD SEPTO IV VE Fibrose G1 G2 G3 * * 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 VD SEPTO IV VE Necrose G1 G2 G3 Ф Ф Ф Ʊ Ʊ Ʊ Ʊ Ʊ Ʊ Ʊ Ʊ Ʊ 33 Figura 14 – Fotomicrografia do ventrículo direito de coelho. (A/B) Miocárdio de animal não tratado com doxorrubicina, sem alterações microscópicas (grupo 1). (C/D) Miocárdio com áreas de fibrose (*) em animal tratado com doxorrubicina (grupo 2). A/C = Hematoxilina e Eosina. B/D = Tricrômio de Masson. Obj. 10x. Unesp, Jaboticabal, SP (2011). A B C D 34 Figura 15 – Fotomicrografia do ventrículo direito de coelho tratado com doxorrubicina (G2). (A/A1) Vacuolização (cabeça de seta) e necrose (seta) de cardiomiócitos. (A/A2) Miocárdio com áreas de fibrose (*). (B/B1) Miocárdio com áreas de fibrose (*) e infiltração gordurosa (setas). A/A1/B = Hematoxilina e Eosina. A2/B1 = Tricrômio de Masson. Obj. 40x. Unesp, Jaboticabal, SP (2011). A A1 A2 B B1 35 Figura 16 – Fotomicrografia do miocárdio de coelho tratado com doxorrubicina (G2) (A) Ventrículo esquerdo com granulação intracitoplasmática de cardiomiócitos (setas). (B) Septo interventricular com áreas de necrose (setas). Hematoxilina e Eosina. Obj. 40x. Unesp, Jaboticabal, SP (2011). A B 36 Figura 17 – Fotomicrografia de coelho tratado com doxorrubicina (G2). Comparação da intensidade da deposição de colágeno (corado em azul) entre as regiões anatômicas: (A) Ventrículo direito. (B) Septo interventricular. (C) Ventrículo esquerdo. Notar maior deposição de colágeno em A. Tricrômio de Masson. Obj. 40x. Unesp, Jaboticabal, SP (2011). A C B 37 6. DISCUSSÃO Os índices de mortalidade encontrados nesse estudo denotam o potencial tóxico da doxorrubicina em coelhos, na dependência da dose utilizada. A administração de 1 mg/kg duas vezes na semana mostrou-se segura e passível de realização, sem alto índice de mortalidade, permitindo avaliações fidedignas até o final do experimento. Tal fato corrobora com outros trabalhos utilizando doxorrubicina em coelhos (JAENKE et al., 1980; ARNOLDA et al., 1985; CHEN et al., 2010). Porém, devido a praticidade, alguns autores modificaram essa técnica, passando a administrar 2 mg/kg uma vez por semana, o que foi responsável por perda de 70 % dos animais no estudo em tela, prejudicando as avaliações no T45 e no T60 do grupo G3. Esse alto índice de mortalidade também foi encontrado por KLIMTOVÁ et al. (2002). Muitos autores não relatam os índices de mortalidade encontrados em seus estudos. A mortalidade dos animais pode ser explicada pelo grande potencial tóxico da droga em diversos órgãos. Mielossupressão, nefrotoxicidade e hepatotoxicidade são outros efeitos colaterais determinantes para o uso da doxorrubicina. As antraciclinas produzem radicais livres altamente reativos, capazes de lesar membranas celulares e o DNA. Assim, esse fármaco pode exercer toxicidade em diversos órgãos, tempo e dose- dependente (DIAS et al., 2003; DAGLI & LUCAS, 2006). A técnica radiográfica utilizada mostrou-se eficiente para a espécie, sem a necessidade de utilização de fármacos anestésicos para contenção. Tal fato confirma com os dados referidos por PINTO (2007). Os achados radiográficos e valores de VHS corroboram com dados encontrados por ONUMA et al. (2010), em coelhos submetidos a radiografia, confirmando os valores de VHS para a espécie, que podem ser utilizados em outros estudos. 38 Entretanto, a análise radiográfica não mostrou aumento significativo no tamanho dos corações dos animais tratados com doxorrubicina durante todos os tempos de avaliação. BUJA et al. (1973), SUSANECK (1983) referiram que a radiografia torácica não representa um método sensível para o diagnóstico da CMD induzida por doxorrubicina. Devido ao fato de alguns animais apresentarem aumento na análise radiográfica subjetiva, sugere que se o experimento tivesse se estendido além do T60, esse aumento pudesse ter sido significativo, uma vez que os efeitos cardiotóxicos da doxorrubicina são tempo e dose- dependentes (MAUDDLIN et al., 1992; ROBERT, 2007a). Porém, essa não era a intenção desse estudo, uma vez que a ecodopplercardiografia foi capaz de detectar achados da cardiomiopatia dilatada precocemente. O mesmo fato pode ser observado com os achados eletrocardiográficos, onde não houve nenhuma alteração significativa sugestiva de sobrecarga de câmaras cardíacas até o período estudado. Em estudo eletrocardiográfico com coelhos, PATÁCOVA et al. (2007) referem aumento na duração do complexo QRS apenas após a oitava semana de administração da droga. Assim, uma vez que outros exames são capazes de detectar com antecedência as alterações cardíacas decorrentes do uso da doxorrubicina, o exame eletrocardiográfico tem sido menos utilizado para esse fim. SOUSA (2007) em trabalho com doxorrubicina em cães, apesar de encontrar alterações na duração do QRS e amplitude de onda R, ressalta que esses valores não se mantiveram alterados, devido à inadequada sensibilidade do exame eletrocardiográfico em detectar alterações na dimensão das câmaras cardíacas (TILLEY, 1992; GOODWIN, 2002). Em contra-partida, SANTOS et al. (2010) referem a importância da utilização do ECG em seres humanos que utilizam doxorrubicina em tratamentos quimioterápicos, com achados de taquicardia sinusal, bloqueio de ramo esquerdo e alterações na onda R. Tais autores afirmam alterações no padrão do ECG durante ou após o uso do quimioterápico, pode auxiliar no diagnóstico de disfunção miocárdica. 39 Não foram encontradas arritmias nos coelhos submetidos à indução da CMD, diferindo dos achados de PEREIRA-NETO et al (2006) onde cães tratados com doxorrubicina apresentaram arritmias supraventriculares e ventriculares. Assim, vale ressaltar que no presente estudo os animais foram observados pontualmente, não submetidos à eletrocardiografia de 24 horas pelo Holter, não sendo possível eliminar a probabilidade de ocorrência de alteração de condução elétrica e/ou arritmias paroxísticas (GOODWIN, 2002; MUCHA, 2007). A única alteração significativa encontrada no exame eletrocardiográfico foi diminuição no intervalo QT, no T45, no grupo G1. Sendo esse o grupo controle, acredita-se que essa diminuição tenha ocorrido devido ao estresse em que os animais se encontravam no momento do exame eletrocardiográfico, o que cursa com aumento da frequência cardíaca. Sabe-se que o intervalo QT é inversamente proporcional a frequência cardíaca (KOYAMA et al., 2002; KIJTAWORNRAT et al., 2006). Todos os valores eletrocardiográficos obtidos nesse estudo foram compatíveis com outros dados obtidos em coelhos, sendo passíveis de consulta para novos experimentos (SZABUNIEWICZ et al., 1971; SAWASAKI et al., 1976). Os dados obtidos pela ecodopplercardiografia denotaram a eficiência desse exame para detecção precoce das alterações da cardiomiopatia dilatada induzida pela doxorrubicina em coelhos. As primeiras alterações encontradas foram dilatação do ventrículo esquerdo em sístole e diminuição da fração de encurtamento e ejeção já no T45 e no T60 dos animais tratados. Essas mesmas alterações também foram observadas por LU et al. (2006) e CHEN et al.(2010) em coelhos, porém, mais tardiamente. Provavelmente, essa detecção foi precoce no estudo em tela, devido ao acompanhamento ecocardiográfico quinzenal realizado. Esses achados refletem a diminuição da função sistólica ocorrida após exposição cumulativa à doxorrubicina. Com essas alterações funcionais encontradas nos animais dos grupos tratados com doxorrubicina, notou-se claramente que essa cardiotoxicidade foi dose-dependente. Quando a dose cumulativa do fármaco atingiu 12 mg de doxorrubicina/kg no T45 (6 semanas), a maioria dos coelhos já apresentava alterações na função sistólica, com valores abaixo dos estabelecidos para a espécie (STYPMANN et al., 2007). Esses achados traduzem a grande sensibilidade que o 40 miocárdio dos coelhos apresenta à exposição à droga e a rapidez de indução da CMD nesses animais, uma vez que toleram administração semanal. O mesmo fato ocorreu em estudo realizado em cães (SOUZA & CAMACHO, 2006), porém, a indução exigiu um tempo maior (12 semanas), uma vez que a droga pode ser administrada somente a cada 21 dias na espécie canina. Pelo fato da espécie utilizada apresentar frequência cardíaca alta, a análise diastólica ficou prejudicada nesse estudo, devido a presença de fusão das ondas E e A nos fluxos transvalvares átrio-ventriculares. Essa fusão também foi observada por FONTES-SOUZA et al. (2006) em estudo com coelhos hígidos anestesiados, com obtenção da separação das ondas E e A em 67% dos animais. Porém, vários autores referem à fragilidade dessa espécie frente a certos fármacos anestésicos e a susceptibilidade de alteração de parâmetros ecodopplercardiográficos, o que deve ser levado em consideração principalmente em experimentos com cardiomiopatias (FONTES-SOUZA et al.,2006; STYPMANN et al., 2007). O tempo de relaxamento isovolumétrico (TRIV) foi a única ferramenta que pode ser utilizada para o estudo diastólico, porém, não revelou alterações significativas. Segundo STYPMANN et al. (2007), esse parâmetro não tem diferença significativa entre coelhos sedados ou não, podendo ser utilizado para análise diastólica. Esses dados não corroboram com achados obtidos por SOUSA (2007), onde cães submetidos ao tratamento com doxorrubicina apresentaram inversão no TRIV. Contudo, não pode-se concluir que os coelhos do estudo em tela não apresentaram alteração diastólica somente pela falta de variação do TRIV. Sabe-se que a análise diastólica é complexa e que deve ser utilizado um conjunto de fatores para sua conclusão, como por exemplo o Doppler tecidual (técnica não disponível no momento desse estudo) (FONTES-SOUZA et al., 2009; SIGNOLET et al, 2009). Sabendo-se que o índice de performance miocárdica (ITEI) não é influenciado pela frequência cardíaca, pode ser utilizado seguramente para análise conjunta da função sistólica e diastólica (TEI et al., 1995). Nesse estudo, esse parâmetro não apresentou diferença significativa, discordando dos achados em cães obtidos por SOUSA (2007). Em seres humanos tratados com doxorrubicina, há alteração do ITEI em crianças (ISHII et al., 2000; EIDEM et al., 2001), mas não em adultos (BALDI et al., 41 2007). Assim, esses fatos demonstram que deve-se ter cautela no momento da avaliação desse índice ecodopplercardiográfico de forma isolada, devido às variações nas respostas inter e intra-específicas frente à terapia com doxorrubicina. Todos os valores ecodopplercardiográficos basais, bem como os obtidos pelo grupo G1 (controle) durante todo o modelo experimental são condizentes aos encontrados por FONTES-SOUZA et al. (2006) e STYPMANN et al. (2007), contribuindo com o fornecimento de valores de normalidade da espécie leporina para a literatura. As alterações microscópicas do miocárdio dos animais tratados com doxorrubicina comprovam os efeitos cardiotóxicos desse fármaco em coelhos e são condizentes com achados descritos em outras espécies e em seres humanos (SIMEONI et al, 2006; TAKEMURA & FUJIWARA, 2007; CHATTERJEE et al, 2010). A vacuolização e a degeneração dos cardiomiócitos ocorreram de forma ampla em todos os animais tratados. Tais lesões são características da toxicidade produzida pela doxorrubicina e também são descritos com essa intensidade em outros estudos (TAKEMURA & FUJIWARA, 2007; CHATTERJEE et al., 2010). GREEN & LEEUWENBURGH (2002) descreveram que esses achados podem ser explicados devido ao acúmulo da droga nas mitocôndrias, com formação de radicais livres, reações de peroxidação com alterações estruturais e funcionais no miócito, formação de vacúolos, degeneração das mitocôndrias, perda dos miofilamentos e atrofia progressiva das miofibrilas. A necrose ocorreu nos animais tratados, porém em intensidade menor do que as outras lesões. Esses dados também são descritos em outras espécies por TAKEMURA & FUJIWARA (2007) e SIMEONI et al (2006), uma vez que a necrose ocorre tardiamente às outras lesões, na dependência do tempo de exposição a droga. A presença de leucócitos (mononucleares) também foi observada nos animais tratados com doxorrubicina neste estudo. Isso também foi descrito por TAKEMURA & FUJIWARA (2007) e CHATTERJEE et al. (2010), estando essas células relacionadas com a degradação do tecido lesionado. Porém, essas células não foram encontradas por SIMEONI (2006) em ratos Wistar submetidos à indução da cardiomiopatia dilatada 42 com doxorrubicina, provavelmente devido ao curto período de tempo em que esses animais foram expostos ao medicamento. Uma vez que a maioria dos estudos descreve as alterações histopatológicas somente no ventrículo esquerdo (TIDHOLM & JÖNSSON, 2005), os dados obtidos nesse estudo permitiram inferir que a intensidade de vacuolização, granulação e necrose ocorreram com severidade semelhante nas três regiões anatômicas estudadas (ventrículo direito, septo interventricular e ventrículo esquerdo). Ademais, a fibrose intersticial ocorreu em maior intensidade no ventrículo direito. Esses fatos comprovam que tal região anatômica do miocárdio de coelhos também é bastante susceptível aos efeitos tóxicos da doxorrubicina. Esse fato difere dos achados histopatológicos descritos por TOYODA et al. (1998) em cães tratados com doxorrubicina, onde o ventrículo direito apresentou discretas alterações, em comparação com o ventrículo esquerdo e o septo interventricular. Essas diferenças também ocorrem na CMD idiopática, onde em estudo imuno-histoquímico com miocárdio de seres humanos com CMD, HERPEL et al (2005) referiram que o remodelamento miocárdico ocorre de forma diferente entre os ventrículos nos estágios tardios da doença. Esses dados refletem a importância do estudo da função do ventrículo direito através da ecodopplercardiografia, uma vez que os achados histopatológicos comprovaram a existência de remodelamento miocárdico nessa região anatômica, após a indução da CMD com doxorrubicina. Porém, esse estudo depende de validações que ainda estão sendo realizadas, até mesmo na medicina humana (HORTON et al., 2009; VITARELLI & TERZANO, 2010). http://translate.googleusercontent.com/translate_c?hl=pt-BR&sl=en&tl=pt&u=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed%3Fterm%3D%2522Horton%2520KD%2522%255BAuthor%255D&rurl=translate.google.com.br&anno=2&usg=ALkJrhip2OUaaRwlyzRzPhAMm-EtUNlr9g http://translate.googleusercontent.com/translate_c?hl=pt-BR&sl=en&tl=pt&u=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed%3Fterm%3D%2522Vitarelli%2520A%2522%255BAuthor%255D&rurl=translate.google.com.br&anno=2&usg=ALkJrhh4FpHF9Wz_mw6t-axI8UMYdW7utg http://translate.googleusercontent.com/translate_c?hl=pt-BR&sl=en&tl=pt&u=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed%3Fterm%3D%2522Terzano%2520C%2522%255BAuthor%255D&rurl=translate.google.com.br&anno=2&usg=ALkJrhiSpAPeg6N3m6dXlaO0uXmhB9-JFw 43 7. CONCLUSÕES Fundamentando-se nos resultados obtidos nesse estudo, pôde-se concluir que:  A espécie leporina pode ser utilizada como modelo experimental para indução da cardiomiopatia dilatada com doxorrubicina, na dose de 1mg/kg administrada duas vezes por semana por um período de 6 semanas;  A ecodopplercardiografia é a técnica diagnóstica mais precisa para avaliação da diminuição da função sistólica em coelhos tratados com doxorrubicina;  Os achados histopatológicos comprovam a semelhança da CMD induzida pela doxorrubicina com a CMD idiopática e confirmam que a diminuição da função sistólica no período estudado decorreu dos efeitos cardiotóxicos da droga;  As alterações cardíacas morfológicas decorrentes do uso da doxorrubicina em coelhos, acometem tanto o ventrículo esquerdo, quanto o septo interventricular e o ventrículo direito 44 8. REFERÊNCIAS * ARNOLDA, L. et al. 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