UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL AMINOPEPTIDASE DE Mesorhizobium sp. DESCOBERTA POR MINERAÇÃO DE DADOS GENÔMICOS COM APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS E SEU IMPACTO NA FISIOLOGIA BACTERIANA Elwi Guillermo Machado Sierra Microbiologista 2016 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL AMINOPEPTIDASE DE Mesorhizobium sp. DESCOBERTA POR MINERAÇÃO DE DADOS GENÔMICOS COM APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS E SEU IMPACTO NA FISIOLOGIA BACTERIANA Elwi Guillermo Machado Sierra Orientadora: Profª. Dra. Eliana Gertrudes de Macedo Lemos Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Microbiologia Agropecuária. 2016 Machado, Elwi Guillermo Sierra M149a Aminopeptidase de Mesorhizobium sp. descoberta por mineração de dados genômicos com aplicações biotecnológicas e seu impacto na fisiologia bacteriana / Elwi Machado Sierra. – – Jaboticabal, 2016 xii, 100 p. : il. ; 29 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2016 Orientador: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos Banca examinadora: Maria Celia Bertolini, Eleni Gomes, Mariana Carina Frigieri, Marcos Tulio Oliveira Bibliografia 1. Expressão genica. 2. Dados genômicos. 3. Prospecção- enzimas. I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 631.847 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal. DADOS CURRICULARES DO AUTOR Elwi Guillermo Machado Sierra – Nascido em 12 de Agosto de 1980 em Barquisimeto, Venezuela. Iniciou sua graduação em Microbiologia em Fevereiro de 1999 na Universidade Libre de Barranquilla na cidade de Barranquilla, Colômbia, concluindo seu curso em Junho de 2004. Em Março de 2007 ingressou no curso de Pós-graduação em Biotecnologia de Micro-organismos na Faculdade de Ciências - Universidade dos Andes (ULA), em Mérida, Venezuela, obtendo o título de Mestre em Biotecnologia de Micro-organismos. Em agosto de 2012 ingressou no curso de Doutorado em Microbiologia Agropecuária na Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – (FCAV- UNESP), na cidade de Jaboticabal, SP, sob a orientação da Profa. Dra. Eliana Gertrudes de Macedo Lemos, como bolsista Capes. “O saber não nos torna melhores nem mais felizes.” Mas a educação pode ajudar a nos tornarmos melhores, se não mais felizes, e nos ensinar a assumir a parte prosaica e viver a parte poética de nossas vidas Edgar Morin DEDICATÓRIA Esta meta lograda con esfuerzo y sacrificio, pero con el objetivo siempre en mente se lo dedico a: Las hermanitas Sierra – El destino me premio no con una, sino con cinco madres, no le puedo pedir más nada a la vida Familias Díaz y Aranguren – gracias por tratarme como un hijo más, y sobre todo por hacer de Yani esa increíble mujer Las familias Orozco Sierra y Sierra Fontalvo Daniela Rodríguez – Es difícil ver como creces y darme cuenta que no eres una bebe Fuani, Olaya, Delfina - Mi ermanita la gran H (Marcela) – Tu valentía siempre me ha motivado e inspirado. Mi Madre, Elina – Tu apoyo incondicional cada vez me sorprende más. Mi Padre, Willian – aunque de joven nunca lo entendí, ahora me queda muy claro porqué siempre me presionaste por ir cada vez más lejos. La persona más importante, Yani – te dedico no solo este logro, sino todos los alcanzados en los últimos 9 años y los próximos 99. AGRADECIMENTOS Á Dra. Eliana Gertrudes de Macedo Lemos, pela orientação e oportunidade de realizar um sonho que tenho esperando quase 30 anos; Ao Programa de Pós – Graduação em Microbiologia Agropecuária e a Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinária – FCAV-UNESP; A CAPES pela bolsa concedida; Ao João Carlos Campanharo, Camila Cesario e Luciano Kishi, pela assistência e ensinamentos transmitidos; Á minhas companheiras de bancada e amigas para a vida toda, as Doutoras: Elisângela Gomes, Thaís Maester, Mariana Pereira, Rosmeriana Garcia e Erica Lopes, obrigado por compartir um pouquinho de suas vidas. A todos da equipe LBMP, que no início deste caminho não foi fácil, mas com o tempo vocês viraram minha família. A Fernando e Wilmar, Colombia (el país), nos espera con los brazos abiertos. A Cris, Sonia e Augusto, minha família em Brasil. Á Dra. Yani Cristina Aranguren Díaz, no tengo las palabras para agradecerte todo lo que has hecho por mí, toda la vida estaré eternamente agradecido…TE AMO. Esta es una forma sencilla, pero que siempre les recordara lo mucho que estoy agradecido con ustedes……Gracias Totales i SUMÁRIO Página LISTA DE TABELAS ................................................................................................. iv LISTA DE FIGURAS .................................................................................................. v ABREVIATURAS ...................................................................................................... ix LISTA DE UNIDADES ................................................................................................ x RESUMO .................................................................................................................. xi ABSTRACT .............................................................................................................. xii 1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 1 2. REVISÃO DE LITERATURA................................................................................ 3 2.1 Mesorhizobium sp. ........................................................................................ 3 2.1.1 Generalidades ........................................................................................ 3 2.1.2 Aplicações biotecnológicas ..................................................................... 3 2.2 Peptidases .................................................................................................... 5 2.2.1 Generalidades e classificação ................................................................ 5 2.2.2 Sistema proteolítico nas bactérias .......................................................... 6 2.2.3 Classificação das peptidases .................................................................. 7 2.2.4 Aplicação industrial das peptidases ...................................................... 11 2.2.5 Inibidores de proteases ........................................................................ 12 2.3 Aminopeptidases......................................................................................... 13 2.3.1 Generalidades ...................................................................................... 13 2.3.2 Aplicações industriais ........................................................................... 13 3. OBJETIVOS ...................................................................................................... 15 4. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 16 4.1 Sequenciamento do genoma do isolado ..................................................... 16 4.1.1 Construção das bibliotecas ................................................................... 16 4.1.2 Análise das Sequências e Anotação genômica .................................... 16 4.2 Prospecção de genes de interesse biotecnológico no genoma do Mesorhizobium sp J5. ........................................................................................... 17 4.3 Mineração de dados na literatura científica ................................................. 17 4.4 Análise das sequências............................................................................... 18 4.5 Modelagem molecular ................................................................................. 18 4.6 Amplificação dos genes codificadores de enzimas proteolíticas ................. 19 4.6.1 Quantificação e análise do DNA ........................................................... 20 ii 4.6.2 Digestão dos fragmentos amplificados ................................................. 21 4.6.3 Ligação dos fragmentos ao vetor de expressão .................................... 21 4.6.4 Preparo de células competentes de Escherichia coli ............................ 22 4.6.5 Transformação de células de E. coli BL21(DE3) ................................... 22 4.6.6 Coleta, estoque dos clones e confirmação da clonagem. ..................... 23 4.7 Sequenciamento das ORFs ........................................................................ 23 4.8 Expressão e extração das proteínas recombinantes ................................... 24 4.9 Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) .................................... 25 4.10 Purificação de enzimas proteolíticas ........................................................... 26 4.10.1 Purificação por cromatografia de afinidade ........................................ 26 4.10.2 Purificação por exclusão molecular ................................................... 26 4.11 Zimograma .................................................................................................. 26 4.12 Ensaios espectroscópicos ........................................................................... 27 4.12.1 Dicroísmo circular .............................................................................. 27 4.12.2 Termostabilidade da estrutura secundária ......................................... 27 4.13 Determinação da atividade enzimática ........................................................ 27 4.14 Efeito do pH sobre a atividade da enzima ................................................... 29 4.15 Efeito da temperatura sobre a atividade enzimática .................................... 29 4.16 Influência de íons metálicos, inibidores e detergentes sobre a atividade enzimática ............................................................................................................ 29 4.17 Determinação dos parâmetros cinéticos ..................................................... 30 4.18 Construção do mutante ∆mesoamp ............................................................ 30 4.18.1 Preparação de células competentes de Mesorhizobium sp. J5 ......... 30 4.18.2 Construção do vetor suicida pNPTS138∆mesoamp .......................... 31 4.18.3 Eletroporação de Mesorhizobium sp. J5 ............................................ 31 4.18.4 Seleção dos clones positivos ............................................................. 32 4.19 Caracterização fenotípica da linhagem ∆mesoamp ..................................... 34 4.19.1 Curva de crescimento in vitro de Mesorhizobium sp. J5 vs linhagem ∆mesoamp ........................................................................................................ 34 4.19.2 Produção de exopolisacarídeos (EPS) .............................................. 35 4.19.3 Tolerância ao estresse salino ............................................................ 35 4.19.4 Cinética de lise .................................................................................. 36 4.19.5 Termotolerância ................................................................................ 36 4.19.6 Produção de biofilme ......................................................................... 36 iii 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 38 5.1 Predição de peptidase em Mesorhizobium sp. J5 ....................................... 38 5.1.1 Degradação inicial de proteínas extracelulares..................................... 38 5.1.2 Maquinaria de degradação de proteínas intracelulares......................... 39 5.1.3 Manutenção do pool de aminoácidos ................................................... 39 5.2 Peptidases com potencial biotecnológico no genoma do Mesorhizobium sp. J5 41 5.3 Clonagem das sequências e expressão das enzimas proteolíticas ............. 41 5.3.1 Amplificação e clonagem dos genes no vetor pET28a.......................... 41 5.3.2 Ensaio de expressão e extração das proteínas recombinantes ............ 45 5.4 Análise da sequência da MesoAmp ............................................................ 47 5.5 A estrutura dimérica da MesoAmp possui elevado grau de conservação .... 51 5.6 Expressão e avaliação da estrutura quaternária da MesoAmp .................... 54 5.7 MesoAmp apresenta atividade numa extensa faixa de pH e temperatura ... 56 5.8 MesoAmp é uma enzima altamente dependente de íons metálicos ............ 57 5.9 Análise de dicroísmo circular e termoestabilidade ....................................... 60 5.10 Efeito de reagentes desnaturantes e inibidores na atividade da MesoAmp . 61 5.11 MesoAmp mantém sua atividade na presença de altas concentrações de sal, detergentes e solventes orgânicos........................................................................ 62 5.12 MesoAmp foi imobilizada e reutilizada com sucesso ................................... 68 5.13 Impacto da MesoAmp sobre a fisiologia do Mesorhizobium sp J5. .............. 68 5.14 Halo-tolerância de Mesorhizobium sp J5 e da linhagem ∆mesoamp ........... 75 5.15 Produção de exopolisacarídeos (EPS) ........................................................ 77 5.16 Produção de biofilme .................................................................................. 77 6. CONCLUSÕES ................................................................................................. 79 7. REFERÊNCIAS ................................................................................................. 81 8. ANEXOS ........................................................................................................... 91 iv LISTA DE TABELAS Página Tabela 1. As peptidases e seus mecanismos de ação. .............................................. 8 Tabela 2.Propriedades dos oligonucleotídeos iniciadores de síntese utilizados para amplificação dos genes codificadores de peptidases. .............................................. 20 Tabela 3. Propriedades dos oligonucleotídeos iniciadores utilizados para gerar a mutação do gene mesoamp. .................................................................................... 31 Tabela 4. Peptidases com potencial biotecnológico no genoma de Mesorhizobium sp. J5 ............................................................................................................................. 43 Tabela 5. Caraterísticas das proteínas selecionadas obtidas a partir de ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/). .......................................................................... 45 Tabela 6. Efeito dos diferentes cátions bivalentes sobre a atividade da MesoAmp. . 59 Tabela 7. Valores de Km e Kcat de amino-peptidases ou leucina-amino-peptidases presentes em outros micro-organismos. .................................................................. 60 Tabela 8. Efeito de inibidores e agentes desnaturantes sobre a atividade da MesoAmp*. ............................................................................................................... 64 Tabela 9. Efeito dos detergentes na atividade da MesoAmp*. ................................. 66 Tabela 10. Estudos relacionados com a amino-peptidase M29 e seu impacto na fisiologia bacteriana. ................................................................................................ 70 v LISTA DE FIGURAS Página Figura 1. Mecanismo catalítico das peptidases. As enzimas proteolíticas reconhecem as ligações peptídicas (entre o grupo amino de um aminoácidos e o grupo carbóxilo do outro aminoácidos) das proteínas, realizando um ataque nucleofílico com ajuda de uma molécula de agua. .............................................................................................. 6 Figura 2. Mecanismo de hidrólise das principais famílias de Peptidases. Nos sítios ativos da Serina (nas Serina-peptidases) e Cistina (nas Cistina-peptidases) interagem com um grupo aceptor de prótons para promover o ataque nucleofílico sobre a ligação peptídica. As Aspartato-peptidases, Metalo-peptidases e Treonina-peptidases precisam de uma molécula de água para realizar o ataque nucleofílico. O processo geral de excisão da ligação peptídica é o mesmo para todas as proteases. a) Serina- peptidases, b) Cisteina-peptidases, c) Aspartato-peptidase, d) Metalo-peptidases e e) Treonina-peptidase. ................................................................................................... 9 Figura 3. Mapa do vetor pET-28a. A. Vetor usado para a expressão das ORFs codificadoras de enzimas proteolíticas; B. Região de clonagem e expressão do vetor pET28. ..................................................................................................................... 22 Figura 4. Esquema da reação de hidrólise da L-Leucina-p-nitroanilida por enzimas proteolíticas.............................................................................................................. 28 Figura 5. Esquema da PCR overlapping para a construção da versão deletada do gene mesoamp. As letras A, B, C e D indicam a posição dos oligonucleotídeos iniciadores no genoma de Mesorhizobium sp. J5. .................................................... 32 Figura 6. Mapa do vetor pNPTS138 usado na mutação sítio dirigida. ..................... 33 Figura 7. Evento de deleção do gene mesoamp usando o vetor suicida pNPTS138∆mesoamp. ............................................................................................. 34 Figura 8. Modelo do sistema proteolítico de Mesorhizobium sp J5, baseada na mineração dos dados genômicos. As peptidases descritas em vermelho apresentam atividade de amino-peptidase. ................................................................................. 40 Figura 9. Eletroforograma dos fragmentos gênicos de interesse, em gel de agarose 1% e corado com brometo de etideo. A. Marcador de tamanho molecular 1kb DNA ladder (Fermentas). Canaletas (1,2,3) Marcador de tamanho molecular 1kb DNA ladder (Fermentas); Eletroforograma das ORFs 3, 6, 8 e 9 – A seta vermelha sinaliza a temperatura escolhida para as futuras amplificações. Triângulos cinzas na parte superior sinalizam o gradiente de temperatura usada na PCR. ................................ 44 Figura 10.Eletroforograma do DNA plasmidial extraído de alguns clones para confirmar a clonagem da construção pET28-mesoamp. A. Marcador de tamanho molecular 1kb DNA ladder (fermentas). Canaletas: 1-10 Amplificação por PCR dos clones com a construção pET28-mesoamp; canaleta J5: Amplificação por PCR do DNA genômico de Mesorhizobium sp. J5. ................................................................ 45 Figura 11. Eletroforograma em gel de poliacrilamida 12% com SDS (SDS-Page) do extrato celular total da bactérias E. coli BL21 transformada como pET28-mesoamp. Canaletas: (1) Marcador de tamanho molecular (Precision Plus Protein Unstained vi BioRad), (2) extrato celular (EC) sem indução, (3) EC após 4 h de indução com 0,1 mM de IPTG, (4) EC após 6 h de indução, (5) EC após 12 h de indução, (6) EC após 24 h de indução. A seta da direita (◄) sinaliza a banda de proteína sobre-expressa (MesoAmp) com um tamanho molecular compatível com MesoAmp. ...................... 47 Figura 12. Dendrograma das relações filogenéticas entre as peptidases da família M29 e MesoAmp (seta preta). Construído com o algoritmo de máxima verossimilhança, com bootstrap de 1000 e usado a matriz de substituição de aminoácidos LG (LE; GASCUEL, 2008) ................................................................... 48 Figura 13. Estrutura cristalográfica resolvidas experimentalmente usadas para a construção do modelo tridimensional de MesoAmp. Os códigos acima de modelo indicam o código PDB. PDB1ZJC: modelo de Staphylococcus aureus, PDB4ICQ: Streptococcus thermophilus e PDB2AYI: Thermus thermophilus. ............................ 49 Figura 14. Alinhamento multiplex de sequências sinalizando as regiões conservadas de MesoAmp presentes também nos membros mais representativos da família de amino-peptidase M29. O alinhamento de sequências de aminoácidos de MesoAmp e amino-peptidase T de Thermus thermophilus (MER001285), amino-peptidase II de Geobacillus stearothermophilus (MER001287), amino-peptidase S de Streptococcus thermophilus (MER005731), e amino-peptidase S de Staphylococcus aureus (MER014416), usando ClustalX e exibidos com Espript 3 (http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/). A estrutura secundária prevista de MesoAmp é mostrada na parte superior, com as espirais indicando a hélice α, e as setas indicando folha β. A barra colorida na parte inferior do alinhamento representa a escala de conservação [não-conservados (azul), para estados altamente conservadas (roxo)] para cada um dos aminoácidos de MesoAmp, de acordo com a análise do servidor ConSurf. Os motivos conservados que fornecem uma assinatura para metaloproteases termofílicas se apresentam em caixas cinzas. Os resíduos de ligação a metais estão indicados por um círculo (●), e os resíduos catalíticos são indicados por um triângulo (▲). ............................................................................................... 50 Figura 15. Configuração do sítio ativo de MesoAmp. Resíduos catalíticos (Tyr361), de ligação a metais (Glu259, Glu325, His354, His387), interagindo com o substrato. Os números pequenos indicam a distância em Å das pontes de hidrogênio.................. 51 Figura 16. Análise do gráfico Ramachandran de MesoAmp. Os resíduos de Isoleucina 12 e Asparagina 104 e 127 estão em regiões não permitidas. ................................. 52 Figura 17. Características estruturais do modelo MesoAmp. A. Sobreposição das estruturas tridimensionais de MesoAmp (azul) e AmpS de Staphylococcus aureus desvio quadrático médio (RMSD), B. Sobreposição do resíduo catalítico (Tyr 361) e os resíduos de ligação a metais Glu259, Glu325, His354, His387 e Asp389, com os resíduos na estrutura de contrapartida AmpS, as esferas pretas representam os íons de cobalto, C. Representação do sítio catalítico do MesoAmp (S1) e da cavidade de ligação ao substrato (S2). ........................................................................................ 52 Figura 18. Super expressão e purificação de MesoAmp em sua forma ativa. A. Eletroforograma SDS-PAGE para cada etapa de purificação.de MesoAmp. Canaletas: (1) Marcador de peso molecular, (2) Fração solúvel antes da indução, (3) Fração solúvel após indução com IPTG, (4) Proteínas não ligadas na resina de Ni-NTA, (5) MesoAmp eluída com 500 mM de imidazol, (6) MesoAmp purificada após vii cromatografia de filtração em gel. A seta na direita indicam o peso molecular da MesoAmp. B. Perfil de eluição de MesoAmp por filtração em gel utilizando Superdex- 200. Linha preta (▬) corresponde ao mAu medida a 280 nm; Barra cinza: atividade relativa em porcentagem de MesoAmp. Pico 1 corresponde à agregação de oligômeros de MesoAmp com baixa atividade. Pico 2: frações com alta atividade enzimática. Caixa superior esquerda: análise do peso molecular da MesoAmp nativa com proteínas padrões [Tiroglobulina bovina (670 kDa), γ-globulina (150 kDa), albumina (43 kDa), Ribonuclease A (13,7 kDa) e Ácido ρ-amino benzoico (pABA) (0,13 kDa)] usando a analises de regressão lineal para a determinação do tamanho molecular dos oligômeros (1) e dos homodímeros (2). Caixa superior direita: análise de SDS-PAGE das frações obtidas pela cromatografia de filtração em gel. Canaletas: (1) Marcador de peso molecular, (2-4) Pico 1, (5-10) Pico 2. ................................... 55 Figura 19. Análise físico-químico da MesoAmp. A. O efeito do pH sobre a atividade enzimática usando diferentes tampões: Mcllvaine (▲); Citrato de sódio (Δ); Fosfato de sódio (♦); Tris-HCl (●); Bicarbonato de sódio-hidróxido (▼); Glicina-hidróxido de sódio (◊); Fosfato monossódico-hidróxido de sódio (○). B. Efeito da temperatura sobre a atividade da MesoAmp determinada com 100 mM de tampão Bicarbonato de sódio- hidróxido (pH 8,5). As letras minúsculas na parte superior dos valores (a-k) indicam a diferença significativa entre cada condição testada, de acordo com ANOVA e teste de Tukey a 5% de probabilidade. Tabela inferior: faixa de pH e os diferentes tampões testados para a determinação do pH ótimo. ............................................................. 58 Figura 20. Análise espectroscópica e de desnaturação térmica de MesoAmp. A. O espectro de dicroísmo circular em tampão 100 mM de Bicarbonato de sódio-hidróxido (pH 8,5). B. Perfil de desnaturação térmica da estrutura secundária de MesoAmp. As alterações na elipticidade a 222 nm foram representadas graficamente como uma função da temperatura a pH 8,5. A intercepção das linhas pontilhadas indica a temperatura de fusão (Tm) estimada pelo ajuste dos dados utilizando a função sigmoide. ................................................................................................................. 61 Figura 21. Termoestabilidade de MesoAmp usando Leu-p-NA como substrato. A enzima foi incubada a diferentes temperaturas (45 a 80°C) por em intervalos de tempo. ................................................................................................................................. 61 Figura 22. Modelo tridimensional de MesoAmp. A. MesoAmp, Esferas amarelas indicam a posição das cisteínas no modelo. B. Cisteínas (C353, C360, C364) localizadas próximas ao resíduo catalítico de tirosina (Y316). Os números sinalizam a distância (em Å) entre os átomos de enxofre presentes na proteína. C. Estrutura tridimensional de PepS (PDB4ICQ). Esferas amarelas indicam a posição das cisteínas na estrutura. ............................................................................................................. 65 Figura 23. Efeito de solventes orgânicos (a diferentes concentrações) na atividade da MesoAmp. ................................................................................................................ 67 Figura 24. Estabilidade operacional de MesoAmp imobilizada. A atividade enzimática em cada ciclo foi realizada com Tris-HCl pH 8,0; 2 mM de Cobalto e 2 mM de Leu-p- NA e 40 °C, durante 15 min ou até atingir o estado estacionário. ............................ 68 Figura 25. Diagrama de Venn do sistema proteolítico de S. aureus (Staphylococcus aureus USAD300); S. thermophilus (Streptococcus thermophilus CNR21066); L. monocitogenes (Listeria monocytogenes EGD-e) e Mesorhizobium sp J5. Números viii embaixo de cada nome indicam a quantidade de peptidases presentes em cada micro- organismo.As peças sobrepostas de diferentes elipses representam o número de peptidases em comum desses grupos em comparação. .......................................... 71 Figura 26. Eletroforograma para confirmar a mutação no gene mesoamp. 1: Produto de PCR com os oligonucleotídeos A+B; 2: Produto de PCR com os oligonucleotídeos C+D; 3: Produto de PCR de superposição com os oligonucleotídeos A+D; 4: PCR do plasmídeo pNPTS138∆mesoamp; 5: PCR do DNA genômico de Mesorhizobium sp. J5, usando os oligonucleotídeos A+D; 6 e 7: PCR do DNA genômico da linhagem ∆mesoamp (dois mutantes), usando os oligonucleotídeos A+D; M: Marcador de tamanho molecular 1kb DNA ladder (Fermentas) .................................................... 72 Figura 27. Atividade de leucina amino-peptidase global do Mesorhizobium sp. J5 e da linhagem ∆mesoamp. A atividade amino-peptidase foi normalizada usando a mesma concentração de proteína total (1 mg/ml). ................................................................ 73 Figura 28. Crescimento do Mesorhizobium sp. J5 e da linhagem ∆mesoamp em meio líquido TY. O ensaio foi realizado em triplicata e as barras de erro representam o desvio padrão. ......................................................................................................... 74 Figura 29. Efeito do estresse salino no desenvolvimento do Mesorhizobium sp J5 e da linhagem ∆mesoamp. .......................................................................................... 76 Figura 30. Analises dos componentes principais (PCA) dos transportadores ABC de aminoácidos e aminopeptidases M29. Foi possível observar que bactérias que não possuem a enzima aminopeptidase M29 apresentaram uma tendência a possuir uma maior quantidade de transportadores ABC de aminoácidos. Seta vermelha sinaliza a M29. ......................................................................................................................... 76 Figura 31. Produção do exopolisacarídeos (EPS) do Mesorhizobium J5 e do linhagem ∆mesoamp. As caraterísticas reológicas do EPS (viscosidade), foram modificadas pela delação do gene mesoamp. ............................................................................. 77 Figura 32. Produção de biofilme. A. teste in vitro da produção de biofilme por Mesorhizobium sp. J5. (M. sp J5) e o mutante com a deleção no gene mesoamp (∆mesoamp). B. Porcentagem da produção de biofilme. Os dados de absorbância foram normalizados e tratados usando a equação 3. ............................................... 78 ix ABREVIATURAS Abs- Absorbância DO600nm – Absorbância medida a 600 nanômetros de cumprimento de onda aa- Aminoácidos DNA- ácido desoxirribonucleico dNTP- desoxirribonucleotídeos fosfatados EDTA- ácido etilenodiaminotetracético IPTG – isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo Xgal - 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo DMF - N,N’dimethyl-formamida p/v – peso por volume TEB- solução tampão Tris-ácido bórico- EDTA Tris- tris[hidroximetil]aminometano UV- luz ultravioleta v/v- volume por volume BLAST – Basic Local Aligment Sequence Tool E.C. – Enzyme Comission GenBank – banco de sequências de genes e proteínas do NCBI Kb – mil pares de bases NCBI – National Center for Biotechnology Information ORF – Open Reading Frame (Fase de leitura aberta codificadora de proteína) pb – pares de bases PCR – Polymerase Chain Reaction MEROPS – Base de dados curadas para peptidases pH – potencial hidrogeniônico log [H+] pI – ponto isoelétrico r.p.m. – rotações por minuto SAP – Shrimp Alkaline Phosphatase SDS – dodecil sulfato de sódio SDS-PAGE – Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio IUBMB - (União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular) x LISTA DE UNIDADES g – aceleração da gravidade g – grama L – litro g-L – gramas por litro kb – kilobase M – molar mg – miligrama mL – mililitro mM – milimolar µg – micrograma µL – microlitro µM – micromolar ng – nanogramas pb – pares de bases U – unidades V- volt kDa- Quilo Daltons h – horas s – segundos min – minutos xi AMINOPEPTIDASE DE Mesorhizobium sp. DESCOBERTA POR MINERAÇÃO DE DADOS GENÔMICOS COM APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS E SEU IMPACTO NA FISIOLOGIA BACTERIANA RESUMO - A análise de mineração de dados genômicos de Mesorhizobium sp. revelou a presença de uma ORF de 1257pb contendo o gene mesoamp, que codifica uma proteína de 418 aminoácidos. A sequência de aminoácidos deduzida apresenta 50% de identidade com uma amino-peptidase termoestável de Thermus thermophilus, membro da família de peptidase M29, e oito assinaturas caraterísticas das metalo- protease termofílicas foram encontrados. O gene mesoamp foi clonado e expresso em Escherichia coli. A massa molecular da proteína foi avaliada por SDS-PAGE e filtração em gel, o que indicou que a proteína apresenta 45,72kDa e 88,05kDa, respectivamente, sugerindo uma estrutura dimérica da enzima recombinante. A enzima foi nomeada como MesoAmp. Em seguida realizou-se a modelagem 3D estrutural, que mostrou uma região de dimerização e uma região de ligação ao substrato altamente conservada contendo os resíduos de ligação a metais e o resíduo catalítico. A enzima apresentou atividade ótima em pH 8,5 e temperatura de 45°C, foi fortemente ativada por Co2+ e Mn2+, nestas mesmas condições de reação, a enzima apresentou Km e Kcat de 0,2364±0,018mM e 712,1±88,12seg-1, respectivamente. Além disso, foi verificado uma notável estabilidade da enzima em solventes orgânicos e elevadas concentrações de NaCl, além de um alto grau de reutilização sem perda apreciável de atividade o que torna MesoAmp única, este trabalho estabelece as bases para potenciais aplicações biotecnológicas e/ou o desenvolvimento de tecnologias sustentáveis, além de descrever uma das primeiras aminopeptidases solvente e halo-tolerantes identificados para o gênero Mesorhizobium sp. Palavras-chave: Expressão genica, Dados genômicos, Prospecção-enzimas xii AMINOPEPTIDASE FROM A Mesorhizobium sp. DISCOVERED BY GENOMIC DATA MINING WITH POTENTIAL BIOTECHNOLOGY APPLICATION AND ITS IMPACT ON BACTERIAL PHYSIOLOGY ABSTRACT - The genomic data mining analysis of a Mesorhizobium sp. revealed the presence of a 1257-bp open reading frame containing the Mesoamp gene, which encodes a protein of 418 amino acids. The deduced amino acid sequence was 50% identical to the thermostable amino-peptidase from Thermus thermophilus, a member of peptidase family M29, and eight fingerprints signatures for a thermophilic metalloprotease were found. The mesoamp gene was cloned and overexpressed in Escherichia coli. The molecular mass of the protein was assessed by SDS-PAGE and gel filtration, which indicated the protein weighs 45.72kDa and 88.05kDa, respectively, suggesting a dimeric structure of the recombinant enzyme. The enzyme was designated as MesoAmp. The 3D structural modeling showed a dimerization region with highly conserved catalytic and binding metal residues. The enzyme exhibited optimum activity at pH 8.5 and 45°C and was strongly activated by Co2+ and Mn2+. Under these reaction conditions, the enzyme displayed Km and Kcat values of 0.2364±0.018mM and 712.1±88.12seg-1, respectively. Additionally, the remarkable stability of the enzyme in organic solvents, its activity at high concentrations of NaCl and the high degree of reuse without appreciable loss of activity makes MesoAmp unique. In summary, this work lays the foundation for potential biotechnological applications and/or the development of environmentally friendly technologies and describes the first solvent and halo-tolerant amino-peptidases identified for the Mesorhizobium sp genus. Keywords: Gene expression, Mining Data, enzyme prospection 1 1. INTRODUÇÃO O solo é um ambiente complexo e heterogêneo, considerado um extraordinário reservatório da diversidade bioquímica e genética microbiana, tornando-se uma fonte quase inesgotável de biomoléculas, como as enzimas. A busca por enzimas com aplicações industriais tem-se centrado em um número limitado de gêneros microbianos como Bacillus (MARUTHIAH et al., 2013), Pseudomonas (MEENA et al., 2013) e Aspergillus (KANG et al., 2014), deixando outros micro-organismos de interesse biotecnológico, como o Mesorhizobium, em um segundo plano. O gênero Mesorhizobium é composto por 24 espécies distribuídas no mundo todo (WANG et al., 2014a) e caracteriza-se por ser geneticamente variável, apresentando caraterísticas fisiológicas bem distintas entre as espécies. Esta riqueza genética e bioquímica tem sido pobremente estudada, já que 3467 sequências de peptidases conhecidas, putativas ou homólogas de Mesorhizobium encontram-se submetidas na base de dados de peptidases (MEROPS) (RAWLINGS et al., 2014), mas nenhuma foi caracterizada ou estudada até o momento. As peptidases são umas das enzimas mais usadas na indústria biotecnológica, atingindo um mercado de quase 8 bilhões de dólares (LI et al., 2012) e projetado para crescer mais nos próximos anos. Todo este crescimento pode ser alcançado por meio de novas abordagens, como a mineração de genes em dados genômicos (GDM) (ADRIO; DEMAIN, 2014; LUO, 2012). O GDM oferece uma oportunidade sem precedentes na área da biotecnologia, devido à abundância de dados pré-existentes e inexplorados, e usando como padrão sequências similares de enzimas conhecidas. Na atualidade esta metodologia está sendo usada na prospecção de enzimas como endoglucanases, lacases, nitrilases, redutases, xilanases e também de policetídeos sintases, as PKS (BACHMANN; VAN LANEN; BALTZ, 2014; GONG et al., 2013; HE et al., 2014), além de outras de grande valor industrial como as peptidases. As peptidases (E.C. 3.4) são o tipo de enzima mais importante do ponto de vista industrial, capazes de hidrolisar ligações peptídicas entre resíduos de aminoácidos. Podem ser utilizadas em diversas atividades industriais, tais como processamento de bebidas, alimentos, processamento de couro e pele, indústrias têxteis, formulação de 2 detergentes, no amaciamento de carne e formulação de medicamentos. Os micro- organismos são a fonte mais empregada para a obtenção de proteases de uso industrial, obtidas através de processos fermentativos (RAO et al., 1998). As bactérias, fungos filamentosos e leveduras são pesquisados a fim de alcançar novos genes codificadores de proteases, além de aumentar a produtividade e a estabilidade enzimática daqueles que já são admitidos como micro-organismos proteolíticos. Observando a versatilidade das proteases na indústria e a demanda pela descoberta de novas enzimas, este trabalho descreve a mineração de dados genômicos de Mesorhizobium sp J5, para a prospecção e análises de enzimas proteolíticas, visando sua aplicação em processos biotecnológicos. 3 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Mesorhizobium sp. 2.1.1 Generalidades O gênero Mesorhizobium sp. foi descrito inicialmente por Jarvis em 1997, a partir de algumas espécies previamente incluídas no gênero Rhizobium. As bactérias deste gênero são gram-negativas, não esporuladas e isoladas principalmente do solo, e recentemente tem sido encontradas em diferentes ambientes incluindo solo ártico (GHOBAKHLOU et al., 2015), esponja marinha (KRICK et al., 2007), solos semiáridos e salinos (DIOUF et al., 2015), e solos contaminados com hidrocarbonetos (TENG et al., 2015). A ampla distribuição geográfica deste gênero sugere a presença de um genoma heterogêneo e extremamente adaptável. Pode-se associar endofiticamente ou estabelecer simbiose com algumas espécies de leguminosas (LARANJO; ALEXANDRE; OLIVEIRA, 2014). Esta relação simbiótica é mantida por um complexo de interações bioquímicas que acontecem durante o desenvolvimento e manutenção dos nódulos fixadores de nitrogênio nas raízes das plantas (DAS et al., 2010). 2.1.2 Aplicações biotecnológicas - Fixador de nitrogênio A interação Mesorhizobium sp.– planta é um excelente exemplo de uma associação simbiótica das bactérias do solo fornecendo nutrientes (hidratos de carbono, vitaminas e purinas) e compostos nitrogenados para a planta (aminoácidos) (DAS et al., 2010). Nos estágios iniciais da simbiose um diálogo molecular extremadamente complexo acontece, envolvendo flavonoides liberados pelas raízes das leguminosas e fatores de nodulação (fatores Nod) sintetizados pelas bactérias. Os fatores Nod são reconhecidos pela planta levando a oscilações do cálcio intracelular, inicialmente em células da epiderme e mais tarde em células corticais permitindo a colonização das bactérias aderidas na superfície da raiz. Nesse momento 4 as células da planta sofrem modificações no núcleo e citoesqueleto formando um canal anóxico (fio de infecção) que a bactéria usa para introduzir-se e formar o nódulo para a fixação de nitrogênio. Nesta estrutura as bactérias se diferenciam em bacteroide tendo a capacidade de fixar nitrogênio atmosférico na forma de amônia (NH4) (OLDROYD, 2013). Além de fixador de nitrogênio, as bactérias de vida livre não- simbióticas podem atuar como bactérias promotoras de crescimento em culturas de importância econômica como o arroz e trigo (LARANJO; ALEXANDRE; OLIVEIRA, 2014). - Produtor de Exopolisacarídeos (EPS) O gênero Mesorhizobium sp. tem a propriedade de produzir uma ampla variedade de polissacarídeos como: polissacarídeos capsulares (KPSs), lipopolissacarídeos (APLs), β (1,2) glicanos e polissacarídeos segregados no meio externo ou sintetizados por enzimas extracelulares ancoradas na parede celular também conhecidos como exopolisacarídeos (EPS), necessários para o estabelecimento de associações simbióticas com as leguminosas, além de proteção contra estresses ambientais (KELLY, 2012) e para as defesas do hospedeiro. A síntese de EPS em Rhizobium é um processo de múltiplos passos regulado por vários genes (exo/exs, xp, orpss) tanto no nível da transcrição como pós- transcrição. Além disso, fatores ambientais como a concentração e natureza da fonte de carbono, nitrogênio, fosfato, a relação Carbono/Nitrogênio, e uma gama diversa de condições de estresse (desidratação, temperatura e força iônica) afetam a produção do EPS e também suas propriedades reológicas (CASTELLANE; OTOBONI; LEMOS, 2015). A descoberta de numerosos EPS de importância industrial e médica com valor comercial significativo já foi documentada (NWODO; GREEN; OKOH, 2012). Seu limitado uso como biomaterial ou modificadores da reologia em sistemas aquosos tem sido, em grande parte, devido ao custo de produção em relação ao seu valor comercial. No entanto, diferentes abordagens vem sendo utilizadas para resolver este problema, incluindo: o uso de substratos mais baratos, otimização das condições de fermentação, desenvolvimento de maior rendimento através da manipulação genética e metabólica e otimizando o processamento (REHM, 2010). O uso de EPS 5 sintetizados por bactérias na medicina incluem: a microencapsulação com alginato, tais como vetores de microesferas para o dosagem de droga, terapias anti-refluxo (NWODO; GREEN; OKOH, 2012), substitutos do plasma (SILVER; AARONSON; VANN, 1988), anticoagulante, antitrombótico, anti-arterosclerótico, anti-angiogese, anti-metastático e anti-inflamatório (DEANGELIS; WHITE, 2002). - Fábrica de biomoléculas O conhecimento do potencial biotecnológico do Mesorhizobium sp. é ainda limitado, poucas biomoléculas com aplicação industrial têm sido relatadas na atualidade [β- (1,2) glucanos cíclico (VENKATACHALAM et al., 2014), L-ribulose-3- epimerase (UECHI et al., 2013), β-transaminase (KIM et al., 2007), celulase (PRASAD; SETHI, 2013), L-ramnose isomerase (TAKATA et al., 2011), piridoxina 4- oxidase (MUGO et al., 2013) e homoserina lactona (KRICK et al., 2007)]. No entanto, a procura por novas enzimas como lipases e peptidases tem levado a olhar novamente os genomas de micro-organismos cultiváveis com potencial industrial, por exemplo: no banco de dados das peptidases (MEROPs), encontram-se 3179 peptidases identificadas em 29 genomas sequenciados e anotados de Mesorhizobium sp., mas não existe nenhuma informação do sistema proteolítico ou qualquer peptidase com aplicações industriais. Atualmente, chegamos num ponto onde estamos gerando mais informação do que é possível analisar, e é a partir dessa observação surge a pergunta: Por que não prospectar genes de interesse industrial (peptidases, lipases e celulases) em genomas de micro-organismos conhecidos, em vez de continuar sequenciando organismos desconhecidos? 2.2 Peptidases 2.2.1 Generalidades e classificação As peptidases são denominadas proteases ou enzimas proteolíticas, estão amplamente distribuídas na natureza (plantas, animais e micro-organismos), hidrolisando ligações peptídicas presentes nas proteínas (Figura 1) (RAWLINGS; SALVESEN, 2013). 6 Figura 1. Mecanismo catalítico das peptidases. As enzimas proteolíticas reconhecem as ligações peptídicas (entre o grupo amino de um aminoácidos e o grupo carbóxilo do outro aminoácidos) das proteínas, realizando um ataque nucleofílico com ajuda de uma molécula de agua. A atividade proteolítica é uma capacidade própria de todos os micro- organismos, no entanto, as proteases não estão somente associadas ao catabolismo proteico, tem-se admitido que a alta especificidade pelo substrato pode regular processos biológicos bem específicos (FREDERIKS; MOOK, 2004). 2.2.2 Sistema proteolítico nas bactérias As bactérias usam proteases para controlar temporal e espacialmente três eventos durante os processos de desenvolvimento morfológico. Estes eventos são: ativação e destruição de proteínas reguladoras, e a produção de sinais. Embora alguns destes acontecimentos sejam inteiramente citoplasmáticos, outros envolvem a proteólise intra-membrana de um substrato, a sinalização transmembranal, ou secreção (KONOVALOVA; SØGAARD-ANDERSEN; KROOS, 2014). As bactérias têm desenvolvido diferentes estratégias regulamentares que lhes permitem adaptar- se à mudança de condições, incluindo mudanças na expressão gênica, diferenciação celular e alterações na motilidade. Em várias dessas estratégias, o sistema proteolítico desempenha um papel essencial. A regulação por proteólise é altamente versátil e envolvido em diversos processos, como respostas ao estresse, crescimento, divisão e diferenciação celular, patogênese, formação e desmontagem de biofilme, secreção de proteínas, esporulação, manutenção do pool de aminoácidos, adsorção, remodelação da superfície celular e tecidos, doença e apoptoses (GUPTA; BEG; LORENZ, 2002), digestão de alimentos, transporte, coagulação do sangue, ativação 7 de zimogênios, ativação de pró enzimas, iniciador de processos de inflamação, liberação de peptídeos fisiologicamente ativos e ativação do sistema complemento (MAURER, 2004; TYE et al., 2002) A proteólise em bactérias se apresenta em duas formas: a proteólise geral, importante para a homeostase de proteínas, remoção de proteínas deformadas ou danificadas e é uma parte essencial do sistema de controle de qualidade das proteínas da célula. A proteólise regulada é a remoção ou modificação por clivagem proteolítica das proteínas em resposta a sinais específicos e depende de um alto grau de especificidade para o substrato, a fim de evitar a degradação aleatória das proteínas. Neste caso, um substrato pode conter um ou mais sinais específicos de degradação conhecidos como “Degrons”, que tem como alvo uma proteína e uma protease específica (KIRSTEIN et al., 2009), resultando na degradação completa de uma proteína ou um sítio de clivagem específico, dando origem a uma proteína modificada, que é a forma ativa ou tem atividade alterada em comparação com a proteína não clivada (JENAL; HENGGE-ARONIS, 2003). Entretanto, apenas micro-organismos que produzem quantidades relevantes de enzimas extracelulares são de importância industrial. Na maioria dos organismos, a produção de peptidases é fortemente influenciada pelas condições nutricionais como fonte de carbono, nitrogênio, açúcares; e ambientais: temperatura, pH, densidade de inóculo, tempo de incubação e aeração (LÓPEZ-OTÍN; BOND, 2008). Embora as proteases possam ser extraídas de plantas e animais, estas não atendem à demanda mundial; a introdução das técnicas de DNA recombinante e a diversidade quase inesgotável dos micro-organismos faz com que o interesse pelas enzimas microbianas aumente cada vez mais. Somado a este fato, a fácil manipulação genética e o pouco espaço e tempo necessários para a síntese de enzimas, obtendo assim, uma produção significativa com baixo custo, tem originado uma substituição quase total das proteases de origem animal ou vegetal pelas proteases microbianas (KASANA; SALWAN; YADAV, 2011; RAO et al., 1998). 2.2.3 Classificação das peptidases 8 A ampla diversidade das peptidases com características únicas (sequências de aminoácidos, especificidade por substratos, pH ótimo e sítios catalíticos) é o principal problema na classificação, contudo, o Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (CI-IUBM), recomenda uma classificação mais ampla, dependendo do sítio de ação sobre a cadeia peptídica. Esta classificação divide as peptidases em dois grandes grupos: (a) Exopeptidases, que hidrolisam a ligação peptídica mais próxima ao terminal amino ou carboxílico da cadeia; (b) Endopeptidases, que realizam cortes randômicos nas ligações internas da cadeia polipeptídica (RAO et al., 1998). Existe também outra classificação mais complexa, que agrupa as enzimas proteolíticas em 14 grupos dependendo do mecanismo de ação (Tabela 1). Tabela 1. As peptidases e seus mecanismos de ação. (RAO et al., 1998) Peptidases Mecanismo de ação Exopeptidases  Carboxi-peptidases 3.4.16 Serina peptidase 3.4.17 Metalo-peptidase 3.4.18 Cisteína peptidases  Amino-peptidase  Dipeptidil peptidases  Tripeptidil peptidases Endopeptidases 3.4.21 Serina proteases 3.4.22 Cisteina proteases 3.4.23 Aspartato proteases 3.4.23.19 Glutamato protease 3.4.24 Metalo-proteases 3.4.25 Treonina proteases Omega peptidases  N-terminus bloqueado  C-terminus bloqueado 9 De maneira geral as famílias das peptidases são classificadas no grupo das hidrolases (grupo 3, subgrupo 4), com três critérios maiores para defini-las: (1) Tipo de reação catalítica (Figura 2), (2) natureza química do sítio de catálises e (3) relação evolutiva com referência à sua estrutura (BARRETT, 1992). Deste modo, as peptidases foram agrupadas em seis classes (TAVANO, 2013): Serina-peptidases (EC 3.4.21), Cisteína-Peptidase (EC 3.4.22), Aspartato-peptidase (EC 3.4.23), Metalo- peptidase (EC 3.4.24), Treonina-Peptidase (EC3.4.25) e Ácido glutâmico-Peptidase (EC 3.4.23.19). Além destas, existem as Peptidases não classificadas (EC 3.4.99), pois não se conhece o mecanismo de ação, sendo que o grupo mais estudado é a Família U40, produzida por bactérias. Figura 2. Mecanismo de hidrólise das principais famílias de Peptidases. Nos sítios ativos da Serina (nas Serina-peptidases) e Cistina (nas Cistina-peptidases) interagem com um grupo aceptor de prótons para promover o ataque nucleofílico sobre a ligação peptídica. As Aspartato-peptidases, Metalo- peptidases e Treonina-peptidases precisam de uma molécula de água para realizar o ataque nucleofílico. O processo geral de excisão da ligação peptídica é o mesmo para todas as proteases. a) Serina-peptidases, b) Cisteina-peptidases, c) Aspartato-peptidase, d) Metalo-peptidases e e) Treonina-peptidase. 10 Dos pontos de vista fisiológico e biotecnológico são quatro os grupos considerados mais relevantes: serina, cisteína, aspartato e metalo–peptidases (RAJASEKHAR et al., 2011).  Serina-peptidases (SP): amplamente distribuídas em eucariotos, bactérias e vírus, indicando uma participação vital no metabolismo desses organismos. Os representantes mais conhecidos são a quimiotripsina e a tripsina (MENGES et al., 1997). Ativas em pH alcalino e neutro, com massa molecular de 18 a 35kDa, mas algumas possuem massas moleculares maiores. As SP são distinguidas por serem inibidas irreversivelmente por 3,4-dicloroisocoumarina (3,4 – DCI), L-3-carboxitrans-2,3-epoxipropil-leucilamido (4-guanidina) butano (E-64), diisopropilfluorofosfato (DFP), tosil-L-lisina clorometil cetona (TLCK), e tiol p- cloromercuribenzoato (PCMB).  Cisteína peptidases (CP): encontradas em todos os organismos, sendo representadas principalmente pela papaína (nome da família) extraída a partir do látex de Carica papaya, constituindo a primeira CP com estrutura tridimensional determinada (RAO et al., 1998). Seu sítio ativo é composto por um resíduo de cisteína, encarregada de coordenar o ataque nucleofílico sobre a ligação peptídica, porém são ativas numa faixa de pH de 6,0 até 7,5. Esta enzima é dividida em grupos que não seguem uma identidade de estrutura tridimensional nem de sequência e provavelmente surgiram de diferentes linhas evolutivas (RAWLINGS; BARRETT, 1994).  Aspartato-peptidase: Pertence à família pepsina, incluindo enzimas digestivas, catepsinas lisossomais e enzimas de processamento, obtidas principalmente a partir de fungos. São ativas em pH ácido (YIN; CHOU; JIANG, 2013). Seu sítio ativo está localizado entre duas subunidades, onde cada subunidade contribui com um resíduo de aspartato, o qual é necessário para a atividade destas enzimas.  Metalo-peptidases: Obtidas a partir de bactérias, fungos e organismos superiores, as metalo-peptidases são ativas numa extensa faixa de pH que vai de 6,0 a 9,0, e uma especificidade geralmente baixa (RAO et al., 1998). Apresentam grande diferença em suas sequências e estruturas, porém a maioria destas enzimas precisa 11 de um íon metálico bivalente o qual é cataliticamente ativo (RAWLINGS; BARRETT, 1995). 2.2.4 Aplicação industrial das peptidases As peptidases apresentam uma grande variedade de aplicações, principalmente na indústria de alimentos, detergentes e farmacêutica, e mais recentemente (pela pressão relacionada ao meio ambiente) em processos de biorremediação (SCHAECHTER et al., 2009) e sínteses de biocombustíveis (HUO; WERNICK; LIAO, 2012; HUO et al., 2011). Dominando o mercado mundial de enzimas com aproximadamente 40% das vendas em 2012 (RAY, 2012). Na indústria de alimentos, o uso das proteases, como a quimosina, para a fabricação de queijo é conhecido desde a antiguidade. Com o descobrimento de novas proteases, seu uso tornou-se mais diversificado, como por exemplo: produção de hidrolisados proteicos a partir das proteínas de soja com alto valor nutricional (RAY, 2012); tratamento e conservação de cerveja, melhoramento das propriedades organolépticas da carne (KUDDUS; RAMTEKE, 2012); hidrólise do glúten conferindo melhores propriedades às massas, síntese de Aspartame, usado como edulcorante artificial, na clarificação de sucos e molho de soja (RAO et al., 1998); e na diminuição da resposta alérgica, pela hidrólise de epitomes antigênicos (TAVANO, 2013). Na indústria de detergentes são utilizadas principalmente as Serino-peptidases produzidas pelas bactérias dos gêneros Bacillus (MAURER, 2004) e Flavobacterium, e pelo fungo Conidiobulos coronatus, micro-organismos GRAS (Geralmente Reconhecidos como Seguros) (KUDDUS; RAMTEKE, 2011). Estas enzimas possuem uma ampla especificidade pelo substrato, estabilidade térmica, pH ótimo alcalino e resistentes na presença de compostos quelantes e agentes oxidantes (RAY, 2012). Na Indústria do couro as proteases substituem produtos químicos altamente contaminantes para o ambiente. O uso das enzimas nessa indústria ainda não é totalmente aceito devido a sua baixa eficiência e custo elevado (ARUNACHALAM; SARITHA, 2009). As proteases atuam na biorremediação de resíduos industriais e domésticos ao solubilizar os resíduos industriais e domésticos, diminuindo a demanda biológica de 12 oxigênio dos sistemas aquáticos. O passo seguinte é a pesquisa de novas proteases estáveis em solventes orgânicos para serem usadas na biorremediação de sistemas não aquosos contaminados com hidrocarbonetos (GUPTA; KHARE, 2006). As aplicações médicas das proteases incluem tratamento de tromboses e diminuição do desenvolvimento de células tumorais (SCHAECHTER et al., 2009); produção de enzimas digestivas para corrigir síndromes de deficiência enzimática (RAO et al., 1998); tratamento de queimaduras, feridas, entre outros (SJÖDAHL et al., 2002). A pesquisa sobre produção de biocombustíveis pelas proteases tem sido estimulada pelas preocupações ambientais e a crescente demanda de energia no mundo sendo que estes são geralmente produzidos a partir de matéria prima rica em carboidratos e lipídeos (HUO; WERNICK; LIAO, 2012). As proteínas não são utilizadas com esta finalidade principalmente pela dificuldade de retirar o grupo amino dos hidrolisados proteicos. Mais recentemente tem sido dada maior atenção à produção de biocombustíveis por subprodutos de natureza proteica. Porém, com o elevado crescimento industrial, a indústria de ração não é capaz de absorver todo esse material proteico produzido (HUO et al., 2011). Huo e colaboradores (2011), procuraram resolver esse problema mediante engenharia genética, gerando uma Escherichia coli YH83 que possui três transaminases exógenas capazes de retirar o grupo amino de hidrolisados proteicos, permitindo à célula gerar álcoois de quatro ou cinco carbonos em condições aeróbias, ou biogás mediante digestão anaeróbica (PERALTA-YAHYA et al., 2012; WERNICK; LIAO, 2013). 2.2.5 Inibidores de proteases Ao falar de proteases é quase inevitável falar de seus inibidores, moléculas que regulam a atividade das enzimas em condições fisiológicas normais evitando a auto hidrólise por peptidases endógenas ou protegendo os organismos do ataque por proteases exógenas (MEGURO et al., 2011), mas podem também interferir diminuindo a atividade de uma enzima num determinado processo industrial (STONER et al., 2004) e gerar perdas no processo. Recentemente, os inibidores de proteases tem recebido mais atenção por seu potencial de aplicação na indústria farmacêutica, 13 usados para inativar irreversivelmente proteases microbianas ou proteases alteradas em doenças humanas (JOHNSON; PELLECCHIA, 2006). 2.3 Aminopeptidases 2.3.1 Generalidades Amino-peptidases são enzimas que catalisam a hidrólises de resíduos de aminoácido na posição N-terminal de peptídeos e proteínas. Estas enzimas estão amplamente distribuídas em procariotos e eucariotos desempenhando importantes funções como degradação de proteínas, essencial para a manutenção do pool de aminoácidos utilizados para a síntese in novo de proteínas, geração de energia metabólica e reciclagem de cofatores. Tem sido demostrado que as amino-peptidases estão presentes em diferentes compartimentos celulares, principalmente no citoplasma (65%), no periplasma e na parede celular (16%), ou segregadas no ambiente externo (16%) (GONZALES; ROBERT-BAUDOUY, 1996). 2.3.2 Aplicações industriais Amino-peptidases desempenham papéis importantes em diversos processos celulares. Como consequência, as aplicações farmacêuticas estão sendo direcionadas para controlar sua atividade em processos fisiopatológicos, bem como ferramentas de diagnóstico ou marcadores de vias fisiológicas (POLANIA; MACCABE, 2007). As aplicações industriais das amino-peptidases microbianas estão associadas principalmente à indústria de alimentos, na produção de hidrolisados proteicos e produtos fermentados ricos em proteínas derivadas de soja, carne, leite e cereais; na elaboração de ingredientes pré-digeridos para nutrição enteral/parenteral; na geração de peptídeos bioativos e produtos de saúde. A utilização de amino-peptidases nestes processos industriais não somente contribui para a melhoria do valor nutricional, mas também para o sabor do produto final, promovendo a degradação dos peptídeos 14 hidrofóbicos que possuem gostos indesejáveis e a libertação de outros peptídeos com sabor agradável e aminoácidos livres (NANDAN; NAMPOOTHIRI, 2013). O uso de endopeptidases conjuntamente com amino-peptidases de ampla especificidade tem sido especialmente bem-sucedido na indústria de alimentos pois reduzem os níveis de epítopos tóxicos e alérgicos presentes em proteínas de leite e cereais. Uma abordagem semelhante foi utilizada para a geração de peptídeos bioativos com anti-hipertensivo, imunomoduladores e peptídeos com propriedades antimicrobianas (POLANIA; MACCABE, 2007). 15 3. OBJETIVOS O presente trabalho teve como objetivo a prospecção e caracterização de enzimas proteolíticas encontradas no genoma do Mesorhizobium sp. (denominado J5). 3.1. Objetivos específicos: i. Prospectar in silico peptidases no genoma do Mesorhizobium sp. J5; ii. Amplificar e clonar os genes codificadores de enzimas proteolíticas em vetor de expressão; iii. Expressar e purificar as proteínas de interesse na fração solúvel; iv. Caracterizar bioquimicamente as enzimas expressas com relação a variação de pH, temperatura, influência de íons, solventes orgânicos e detergentes; v. Construir os modelos das estruturas tridimensionais das proteínas por meio de análises de bioinformática; vi. Verificar a contribuição individual na fisiologia de Mesorhizobium sp. da proteína selecionada através de nocaute do gene de interesse; vii. Estudar os efeitos ocasionados após o nocaute gênico, dentre eles: produção de EPS, halo-tolerância e produção de biofilme. 16 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Sequenciamento do genoma do isolado 4.1.1 Construção das bibliotecas O sequenciamento do genoma completo do isolado de Mesorhizobium sp. J5 foi realizado pela doutora Camila Cesário Fernandes, utilizando a plataforma Illumina, para o qual foram construídas bibliotecas do tipo fragmentos e mate-pair de 2-9 Kb, utilizando o TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation e o Nextera Mate-Pair Sample Preparation Kits (Illumina) respectivamente, de acordo com as recomendações do fabricante. O sequenciamento dessas bibliotecas foi realizado no equipamento HiScanSQ. Para isso foram utilizados os kits Paired-End Cluster Generation Kit v3 (Illumina®) e TruSeq™ SBS Kit v3 - 200 Cycles (Illumina®) e os procedimentos adotados seguiram as recomendações do fabricante. 4.1.2 Análise das Sequências e Anotação genômica Ao término do sequenciamento os arquivos fastq (com os adaptadores trimados) foram analisados pelo doutor Luciano Kishi usando o programa CLC Genomics Workbench 6.0.5, o qual faz uma avaliação de qualidade das sequências geradas com posterior trimagem/corte das regiões onde foram identificadas leituras com baixa qualidade (Phred score < 20). Após esta etapa foi realizado o procedimento de clusterização ou montagem pelo algorítimo (De Novo Assembly – com os parâmetros padrão de montagem) com a finalidade de gerar a sequência consenso de cada linhagem (estimadas em 9.000.000 pb), a fim de permitir a anotação genômica. Para a anotação do genoma foi utilizado o programa Prokka 1.5.2 (Prokka: Prokaryotic Genome Annotation System – http://vicbioinformatics.com/). 17 4.2 Prospecção de genes de interesse biotecnológico no genoma do Mesorhizobium sp J5. A anotação das ORFs foi realizada no RAST (Rapid Annotation Using Subsystem Technology) (OVERBEEK et al., 2014). E realizada uma pesquisa para ORFs que codificam genes de enzimas proteoliticas, as ORFs selecionadas foram comparadas individualmente num banco de dados de peptidases, MEROPS , utilizando a ferramenta de alinhamento local, BLASTN, e em um banco de dados de Seqüência de proteínas patenteadas (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Alguns critérios de seleção foram utilizados: E-value <1e-04 (limiar relativamente rigoroso para garantir a alta cobertura e baixos resultados falso-positivos); porcentagem de identidade ≤ 35%; a posição dos resíduos do sitio catalítico e/ou de ligação a metais; assim como presença dos motivos proteicos; foram levados em conta para definir as proteases. Além disso, a cobertura ≤ 60%; e as sequências redundantes foram excluídas. Para obter mais conhecimentos sobre a maquinaria proteolítica do gênero Mesorhizobium sp, as sequências de proteínas de cada uma das ORFs selecionadas foram submetidas a uma pesquisa exaustiva contra a base de dados MEROPs (RAWLINGS et al., 2014). 4.3 Mineração de dados na literatura científica Para identificar a informação bioquímica e cinética para cada proteína de interesse biotecnológco encontrada foram usadas as bases de dados BRENDA (CHANG et al., 2015), UniProt (sequência de proteínas e informação funcional) (CONSORTIUM, 2015) e MEROPS (RAWLINGS et al., 2014). As proteínas de interesse foram selecionadas de acordo com a característica físico-química de proteínas homólogas, as quais foram anteriormente caracterizadas e discutidas na literatura. Foram considerados os seguintes parâmetros: pH ótimo 5 ≤ ou ≥ 8, temperatura ótima 10ºC≤ ou ≥ 40ºC, e a estabilidade na presença de agentes desnaturantes e de solventes orgânicos, que são características enzimáticas desejadas na indústria. 18 4.4 Análise das sequências As assinaturas de proteínas e motivos conservados foram observados no InterProScan (MITCHELL et al., 2015), e os dados físico-químicos teóricos foram gerados a partir do ProtParam ExPASy (http://www.expasy.org/). Para estimar a conservação evolutiva de cada um dos aminoácidos traduzidos a partir dos genes selecionados, suas sequências foram alinhadas com sequências de aminoácidos das famílias das peptidases de interesse, utilizando o programa CLUSTAL W (THOMPSON; HIGGINS; GIBSON, 1994). O alinhamento foi analisado com o servidor ConSurf (ASHKENAZY et al., 2010). Além disso, foi realizada uma análise com o servidor SignalP 4.1 (PETERSEN et al., 2011), com o intuito de se identificar possíveis peptídeos sinais. Para as análises das relações filogenéticas, 24 sequências de aminoácidos de peptidases da familia M29 (Anexo 1) obtidas da dase de dados de peptidases (MEROPs) mais a sequências de aminoácidos de MesoAmp foram alinhadas com o Clustal W (THOMPSON; HIGGINS; GIBSON, 1994) com um alinhamento par a par com abertura do gap de 35 e extensão 0,75. O arquivo de alinhamento foi submetido a Mr. Bayes 3.2 (RONQUIST; HUELSENBECK, 2003) para estabelecer a melhor modelo de evolução. Os dendrogramas foram construídos com auxílio do programa MEGA 5 (TAMURA et al., 2011) usando máxima verossimilhança, com bootstrap de 1000 e a matriz de substituição de aminoácidos LG (LE; GASCUEL, 2008). 4.5 Modelagem molecular Foi realizada uma pesquisa de proteínas estruturalmente semelhantes às protéinas de interesse utilizando a ferramenta BLASTp no banco de dados de proteínas PDB (Protein Data Bank). Os modelos moleculares foram construídos utilizando o programa Modeller 9.10 (FISER; SALI; ŠALI, 2003) e o servidor I-Tasser (YANG et al., 2014), com os parâmetros fornecidos, com base nas coordenadas estruturais (dados de cristalografia) de proteínas similares depositadas no banco de dados PDB (HOLM et al., 2008). A avaliação da qualidade dos modelos foi realizada 19 por ModFold (MCGUFFIN; BUENAVISTA; ROCHE, 2013). Os escores da conservação da posição do aminoácido exibida pelo servidor Consurf foram projetadas na estrutura das protéinas de interesse, os volumes das cavidades proteicas foram calculados por KVfinder (OLIVEIRA et al., 2014) e o programa PyMOL (DELANO, 2004) foi utilizado para visualizar os modelos gerados. 4.6 Amplificação dos genes codificadores de enzimas proteolíticas Uma vez identificadas as ORFs codificadoras de enzimas proteolíticas no genoma de Mesorhizobium sp J5, procedeu-se com a clonagem das sequências em vetor de expressão pET28a. Para isso foram desenhados oligonucleotídeos iniciadores (primers) com sítios de restrição adequados nas regiões inicial e final do gene para a clonagem direcional (Tabela 2). O vetor pET28 caracteriza-se por possuir uma sequência codificadora de uma cauda de poli-histidina na região N-terminal da proteína super-expressa que permite a purificação da proteína por cromatografia de afinidade. Para determinar a temperatura de pareamento (Tm) ótima dos primers foram feitas reações de PCR, nas seguintes condições: 2 μL de Tampão 10X [Tris- HCl 200mM, pH 8,8; 100 mM (NH4)2SO4; 100 mM KCl; 1% (v/v) Triton X-100]; 0,5 μL de dNTP (4mM); 0,5 μL de MgCL2 (50mM); 5 pmol de cada primer; 1 U de Taq Polimerase; 200 ng de DNA genômico do Mesorhizobium sp J5; e água Milli-Q ultra pura para totalizar o volume final de reação de 20 μL. As reações foram submetidas ao seguinte programa do termociclador gradiente: passo inicial a 95°C por 1 minuto, 30 ciclos a 95°C por 2 min, e um gradiente de temperatura de 60 °C até 65 ºC por 1 minuto, 72°C por 1 minuto, e um passo final de 72ºC por 5 min e estocadas a 4ºC. Definida a Tm das reações de PCR, novas reações foram feitas utilizando-se uma enzima de alta fidelidade e baixa taxa de erro, a Pfu DNA Polimerase (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA). As reações foram realizadas nas seguintes condições: 2 μL de Tampão 10X [200mM Tris-HCl (pH 8,8), 100mM (NH4)2SO4, 100 mM KCl, 1 mg/mL BSA, 1%Triton X-100 (v/v), 20 mM de MgSO4 (Thermo Scientific)]; 0,5 μL de dNTP (10mM); 200ng de DNA genômico; 10 pmol de cada primer (forward e reverse); 0,5 μL da Pfu DNA Polimerase (2,5 U/mL, Thermo Scientific); e água ultra 20 pura para totalizar o volume final de reação de 50 μL. As reações foram submetidas ao programa descrito acima, no entanto, com temperatura de pareamento de 61,2ºC. Após o término da reação uma alíquota de 2μL das reações de PCR foi aplicada em gel de agarose 1% contendo brometo de etídeo (0,5 mg/μL), a fim de se visualizar a amplificação dos produtos de PCR. Os produtos resultantes da PCR foram purificados com o kit PCR clean-Up system (Promega, Madison, Wisconsin, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Tabela 2.Propriedades dos oligonucleotídeos iniciadores de síntese utilizados para amplificação dos genes codificadores de peptidases. ORF Enzima de restrição Oligonucleotídeos (5’→ 3’) TM (ºC) Tamanho do fragmento (pb) ORF3 NdeI XhoI GCCCATATGAAGTCAATTGCAGGTA TTCTCGAGCGAATGCTTGCC 58,3 57,3 1040 ORF6 NdeI XhoI CAGGCATATGATCATGACCACACATTCG CGAACTCGAGCCCTCAGGCCCACT 66,6, 59,5 1256 ORF8 NdeI XhoI CAGCATATGGACATGATGAACCCGAGA TCGCTCGAGTGGTCAGCTCTCGTAG 63,3 60,2 1514 ORF9 BamHI HindIII AGCCGGATCCGCTATGTCCTTTCAGA GATCAAGCTTTACGCGGTTCCATA 57,3 63,2 1478 Tm = Temperatura de pareamento Letras sublinhadas = sítio de restrição das enzimas. 4.6.1 Quantificação e análise do DNA O DNA fosmidial foi quantificado por espectrofotometria em aparelho NanoDropTM 1000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, Delaware, USA) e a qualidade do DNA e a presença de proteínas contaminantes foi verificada pela relação 260/280nm. O resultado das extrações foi visualizado em gel de agarose 1% contendo brometo de etídio (0,05 mg/mL). A eletroforese foi realizada em uma cuba horizontal e conduzida em tampão TBE 1X [Tris 89mM, Ácido Bórico 89 mM e EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) 2,5 mM, pH 8,3] a 80 V por 1 hora e 30 min. As amostras foram preparadas contendo 5 μL de DNA e 3 μL de tampão de corrida [0,025% de azul de bromofenol (p/v) e 50% de glicerol (p/v)]. Foi aplicado o padrão de tamanho 21 molecular 1kb DNA Ladder (Fermentas, Burlington, Ontário, CA) e a imagem foi visualizada e documentada sob luz UV em aparelho fotodocumentador Gel Doc 1000 (Bio-Rad, Hercules, Califórnia, USA), através do software Quantity OneR (Bio-Rad). 4.6.2 Digestão dos fragmentos amplificados Os dois produtos gênicos amplificados foram digeridos com as enzimas de restrição XhoI, NdeI, HindIII e BamHI de acordo com a construção presente em cada gene, conforme apresentado no Anexo 1. Todas as reações de digestão foram realizadas segundo as instruções do fabricante e a quantificação foi feita em aparelho nanodropTM 1000 spectrophotometer. 4.6.3 Ligação dos fragmentos ao vetor de expressão O vetor pET28a (Novagen, Gibbstown, New Jersey, USA) foi digerido com as mesmas enzimas de restrição dos produtos gênicos de modo a apresentar extremidades compatíveis, de acordo com o descrito na Figura 3. Assim o vetor e os insertos foram submetidos a uma reação de ligação para a produção de DNA recombinante (SAMBROOK; RUSSELL, 2001) utilizando T4 DNA Ligase (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, USA). 22 Figura 3. Mapa do vetor pET-28a. A. Vetor usado para a expressão das ORFs codificadoras de enzimas proteolíticas; B. Região de clonagem e expressão do vetor pET28. 4.6.4 Preparo de células competentes de Escherichia coli Para o preparo de células competentes de E. coli seguiu-se protocolo de SAMBROOK e RUSSELL, (2001). Uma colônia de E. coli foi inoculada em 5 mL de meio LB sem antibiótico e incubada a 37ºC por 16-18 h, então 3 mL da cultura foram transferidos para 100 mL de LB sem antibiótico e incubado a 30ºC, com agitação de 250 r.p.m. até atingir uma DO600nm entre 0.4-0.5. Após, a cultura foi centrifugada a 3000 g por 10 min a 4ºC, e o precipitado foi ressuspendido gentilmente em 15 mL de CaCl2 (50 mM) gelado, incubado no gelo por 15 min e centrifugado novamente, sendo este procedimento com CaCl2 repetido duas vezes para lavagem das células. Por fim, o precipitado celular foi ressuspendido gentilmente em 500 L de glicerol a 10% estéril e armazenado em alíquotas de 200 L a –80ºC. 4.6.5 Transformação de células de E. coli BL21(DE3) As transformações foram realizadas com células competentes de E. coli BL21(DE3), previamente retiradas do freezer -80ºC e descongeladas em banho de 23 gelo por aproximadamente 5 min. Na reação foram utilizados 10 μL do DNA ligado (construção pET28a+ORF) e 200 μL da célula competente BL21(DE3). A transformação foi feita por choque térmico e, para isso, a reação foi colocada por 20 min em banho de gelo e logo em seguida, submetida a 42°C, por 90 s, sendo recolocada no banho de gelo por mais 2 min. Após a transformação, foram adicionados 790 μL de meio SOC [2% de triptona (p/v), 0,5% de extrato de levedura (p/v), 1 mL de NaCl 1 M, 0,25 mL de KCl 1 M, 1 mL de Mg2+ 2 M filtrado a 0,22 μm e 1 mL de glicose 2 M filtrada sob as mesmas condições] para propiciar o desenvolvimento das células transformadas, sendo as mesmas submetidas a agitação orbital de 200 r.p.m., a 37°C por 90 min. Após incubação das células transformadas, alíquotas de 100 μL da cultura foram distribuídas em placas de petri contendo o meio LB sólido com 50 mg/mL de ampicilina, IPTG 0,1 M e 20 μL de X-GAL, 50 mg/mL dissolvidos em DMF. As células transformadas foram incubadas a 37ºC por 16-18 h. 4.6.6 Coleta, estoque dos clones e confirmação da clonagem. A coleta dos clones foi realizada com palitos de madeira estéril, os mesmos foram colocados em 5mL de meio LB com canamicina (50 μg/mL). Os tubos foram incubados sob agitação orbital constante a 250 r.p.m., 37ºC, por 20 h. Após este período, uma alíquota de 800 μL da cultura foi transferida para tubo criogênico contendo 200 μL de glicerol 100% esterilizado e estocados a –80ºC. A confirmação da clonagem foi feita através da reação de PCR em colônias. Os clones coletados foram depositados em microtubos de 0,25 mL estéreis e adicionados 20 µL de tampão de lise celular (KCl 50 mM, Tween 20 0,1% e Tris-HCl 10 mM, pH 8,3), sendo submetidos a 99°C por 30 min para a lises celular. Após, 4 µL do sobrenadante foram utilizados para a reação de PCR com os oligonucleotídeos iniciadores específicos para cada ORF, e a visualização do resultado foi feita em eletroforese em gel de agarose a 1%. 4.7 Sequenciamento das ORFs 24 Após a PCR das colônias com os clones positivos foi realizada extração de DNA plasmidial utilizando o kit Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega) para posterior sequenciamento e confirmação da inserção do fragmento no vetor pET28. Para a reação de sequenciamento os DNAs plasmidiais foram amplificados em microplacas nas seguintes condições: 100 ng de DNA plasmidial, 3,0 µL de tampão de sequenciamento 5X v3.1, 1,0 µL de BigDye v3.1 (Applied Biosystems Carlsbad, Califórnia, USA), 10 pmol do oligonucleotídeo, sendo que as reações foram feitas separadamente para Forward e Reverse, e água deionizada estéril para completar o volume de 10 µL. As placas foram levadas ao termociclador, com os seguintes ciclos: desnaturação a 96°C por 1 minuto; 39 ciclos de 96°C por 15 s; 65°C por 15 s, 60°C por 4 min e ciclo final a 4°C até serem retiradas. Após a reação de sequenciamento procedeu-se com a lavagem da placa, o DNA amplificado foi precipitado com 80 µL de isopropanol 75%, incubando-se em temperatura ambiente por 15 min, sendo posteriormente centrifugadas a 4.000 r.p.m. por 45 min a 15°C, o sobrenadante foi descartado e as amostras foram lavadas duas vezes com 180 µL de etanol 70%, e centrifugadas a 4.000 r.p.m. por 5 min. a 15°C. O sobrenadante foi descartado e o excesso de etanol foi retirado a vácuo por 5 min. As amostras foram ressuspendidas em 10 µL de formamida e incubadas por 5 min a 95°C, a fim de obter o DNA em fita simples e aplicadas no sequenciador automático ABI 3730 XL DNA Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA) seguindo recomendações do fabricante. 4.8 Expressão e extração das proteínas recombinantes Inicialmente foi realizado o teste de expressão das proteínas de interesse. Para isso, uma colônia isolada de E. coli BL21(DE3) transformada foi inoculada em 50 mL de meio de cultura LB com canamicina a 50 µg/mL, que permaneceu sob agitação durante 16 h, a 37°C, 200 r.p.m.. Alíquotas de 2 mL foram inoculadas em frascos contendo 200 mL de meio LB com canamicina, que permaneceram sob agitação de 200 r.p.m., 37°C, até atingir a fase logarítmica de crescimento, com D.O600nm entre 0,4 e 0,6. A indução foi feita adicionando 0,1 mM de IPTG à cultura, que permaneceu nas mesmas condições descritas por 2 h. 25 Foram coletadas alíquotas de 1 mL da cultura no tempo zero (T0 - antes da indução) e no tempo 2 (T2 – 2 h após a indução) e centrifugadas por 10 min a 1700 g, para que fosse possível analisar a expressão da proteína de interesse em comparação às proteínas totais. Após confirmar a expressão, diferentes condições foram testadas, com variações na temperatura, tempo de incubação, aeração (volume de meio de cultura por frasco tipo erlenmeyer) e concentração de IPTG. Uma vez determinada a melhor condição de expressão de cada proteína, ensaios de expressão em volumes maiores foram realizados, seguindo o procedimento descrito anteriormente. Para a extração das proteínas, as células foram coletadas por centrifugação a 12000 g por 20 min. A extração iniciou-se pela homogeneização do precipitado celular no tampão de extração (Tris-HCl 100mM, pH 8, com NaCl 200mM; Triton X100 0,2% e Imidazol 10mM), numa relação de 10 mL do tampão por litro de cultura. As células foram rompidas por ultrassom em sonicador Branson Sonifier 250 (Branson, Connecticut, USA), com 30% da razão cíclica por até 30 min com intervalos de 30 s. As amostras foram submetidas à centrifugação por 20 min, a 4°C, 38724 x g, para separação de extratos solúveis (sobrenadante) e insolúveis (precipitado de restos celulares). 4.9 Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) A análise da expressão das proteínas foi realizada através da eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida 10% SDS-PAGE (LAEMMLI, 1970), com o sistema mini-protean (Bio-Rad). A corrida foi realizada a 20 mA, com o tampão de corrida Tris-Glicina [50 mM de Tris-HCl; 150 mM de Glicina e 0,1% de SDS (p/v)]. O preparo das amostras ocorreu com a adição do tampão de amostra 2X e fervura por 10 min a 95°C e o gel foi corado com Coomassie Brilliant Blue [40% de metanol (v/v); 10% de ácido acético glacial (v/v) e Coomassie R-250 a 0,1% (p/v)] e descorado em solução contendo 10% de ácido acético (v/v) e 10% de etanol (v/v). Cada etapa da obtenção da proteína foi analisada individualmente por meio de SDS-PAGE. 26 4.10 Purificação de enzimas proteolíticas 4.10.1 Purificação por cromatografia de afinidade Os extratos celulares obtidos na fração solúvel foram submetidos à purificação por cromatografia de afinidade a metal usando a resina Ni-NTA Agarose (Qiagen, Venlo, Limburgo, Holanda), carregada com níquel, o que permite a purificação de proteínas com cauda de histidina (6xHis tag). Assim, foram acrescentados ao tampão de extração, descrito no item 4.8, para lavagem da coluna de polipropileno (Bio-Rad) e eluição da proteína, um gradiente de imidazol (de 20 mM a 1 M), que também possui afinidade pelo níquel, compete com os aminoácidos da histidina pela ligação à resina e possibilita a eluição da proteína. 4.10.2 Purificação por exclusão molecular As frações de interesse coletadas da purificação por afinidade foram concentradas em concentrador para centrifugação Amicon Ultra, MWCO 30 kDa (Merck MilliPore, Billerica, Massachusetts, USA). O material concentrado foi submetido à purificação por filtração em gel em aparelho Akta Pure System, filtro de 280 nm e célula de fluxo de 0,5 mm, com a coluna HiLoad Superdex 200 16/60 (GE Healthecare, Little Chalfon, UK) para purificação de proteínas de pesos moleculares de 10 kDa até 600 kDa e um volumem de coluna de 120 ml. O equilíbrio da coluna foi feito com dois volumes do tampão (100 mM de Tris-HCl, pH8,0; 200 mM de NaCl e 5% glicerol), com as amostras coletadas em uma fração de 0,5 mL/min. O resultado foi analisado pela formação do pico baseado num padrão de proteínas: Tiroglobulina bovina (670 kDa), γ-globulina (150 kDa), albumina (43 kDa), Ribonuclease A (13,7 kDa) e Ácido ρ-amino benzoico (pABA) (0,13 kDa), usando a analises de regressão lineal dos volumes de eluição de cada padrão. 4.11 Zimograma 27 A detecção da atividade da proteína purificada no gel de PAGE 10% foi realizada por meio de um zimograma, utilizando L-leucina – β – naftilamina como substrato (KUO et al., 2004). As eletroforeses foram feitas a 4ºC e voltagem constante de 100 V por 4 h. Ao final, o gel foi submerso em tampão bicarbonato de sódio – NaOH 100 mM, pH 8, 0,4% L-leucina-β-naftilamina, 0,6% de Fast Black K, 4 mM CoCl2 e incubado a 40ºC por 1 hora. Um gel foi utilizado para o zimograma e o outro foi corado com Coomassie Brilliant Blue. 4.12 Ensaios espectroscópicos 4.12.1 Dicroísmo circular A análise da estrutura secundária foi realizada pela técnica de Dicroísmo Circular (CD) no Espectropolarímetro JASCO-810 (Jasco Corporation, Tókio, Japão) com o controlador de temperatura Peltier Type Control System PFD425S. O experimento prosseguiu na temperatura constante de 10°C, com 30 scans consecutivos, em cubeta de quartzo de 0,1 mm de caminho óptico, no comprimento de onda de 260 a 195 nm, e os espectros da média entre as medidas armazenados. Os dados foram corrigidos, descontando-se a interferência do tampão. 4.12.2 Termostabilidade da estrutura secundária Para avaliação da termoestabilidade das proteínas foram usados ensaios de desenovelamento térmico, monitorado no comprimento de onda de 222 nm, entre as temperaturas de 20°C a 110°C; com intervalo entre as coletas de 0,5°C. A temperatura de transição do desenovelamento (Tm) foi assumida como a temperatura do ponto de inflexão da curva de desnaturação e, os dados foram plotados e tratados pelo programa Origin 8.0 (Origin Lab Corporation, Copyright 1991-2007) segundo ajuste não linear para Tm. 4.13 Determinação da atividade enzimática 28 A atividade da enzima foi determinada pela detecção espectrofotométrica a 405 nm da ρ-nitroanilida liberado a partir do substrato L-leucina-ρ-nitroanilida (Leu-p-NA) mostrado na Figura 4 (WANG et al., 2014b), usando o coeficiente de extinção molar (εpNA = 9,620 M−1cm−1). Figura 4. Esquema da reação de hidrólise da L-Leucina-p-nitroanilida por enzimas proteolíticas. O substrato foi ressuspendido em etanol a 100 mM e estocados a -20°C. O ensaio padrão, a menos que especificado de outra forma, constituiu-se de: 2 mM de L-Leucina-ρ-nitroanilida, em um tampão de reação a 100 mM de Bicarbonato-NaOH pH 8,0; 2 mM CoCl2 num volume final da reação de 200 µL com medições da absorbância (405 nm) a cada 30 s por até 20 min, a 40ºC, usando um espectrômetro MultiScan Go (Thermo Scientific). Regressões lineares para determinação das velocidades iniciais (Vo) de reação assim como o cálculo do desvio padrão foi feito no programa SkanIT 3.2 (Thermo Scientific), considerando-se o coeficiente de extinção molar da p-nitroanilida para cada reação (Equação 1/Equação 2). Todos os experimentos foram realizados em triplicata e como controles foram utilizados sistemas de reação nas mesmas condições sem a presença de enzima. Uma unidade de atividade enzimática (U) foi definida como 1 µmol de p-nitroanilida liberada por minuto. Equação 1 Equação 2 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑡𝑜 = 𝐴𝑏𝑠 εpNA 29 4.14 Efeito do pH sobre a atividade da enzima O efeito do pH foi investigado medindo-se a atividade enzimática em tampões a uma concentração de 100 mM com diferentes valores de pH. Foram testados: McIlvaine (pH 3,0 até 4,5); Citrato de sódio (pH 4,0 até 6,5); Fosfato de sódio (6,5 até 8,0); Tris-HCl (pH 7,0 até 8,5); Bicarbonato-NaOH (8,5 até 11); Glicina-NaOH (8,5 até 10,5) e Fosfato monosódio-NaOH (11,0 até 12,0), conforme ensaio padrão descrito anteriormente. 4.15 Efeito da temperatura sobre a atividade enzimática A atividade da enzima em diferentes temperaturas foi determinada medindo-se a atividade de 10 a 90°C, no ensaio padrão. Após o término do tempo determinado de incubação a absorbância foi determinada e transformada em Mol de produto. A termoestabilidade foi determinada pela medição da atividade enzimática residual após incubação da solução da enzima em diferentes temperaturas, na faixa de 45°C a 80°C, por até 1 h, no termociclador em modo gradiente. Após o término do tempo de incubação, os tubos foram resfriados em gelo e a atividade residual foi determinada. 4.16 Influência de íons metálicos, inibidores e detergentes sobre a atividade enzimática Os efeitos da presença de vários reagentes sobre a atividade enzimática foram investigados através da medição da atividade residual, após 5 min de pré-incubação da enzima com cada reagente. A atividade sem a presença de qualquer aditivo foi definida como 100%. Para analisar o efeito dos sais e íons metálicos, CaCl2, Li2SO4, MnSO4, NiCl2, CuSO4, CoCl2, MgSO4, Al2(SO4)3, FeSO4, NaCl ou KCl foi adicionado à reação enzimática. A ação de detergentes, tais como Tween 20, Tween 80 e Triton εpNA = 9.620 𝑀−1 𝑥 ( 0,200𝑐𝑚3 3,141 𝑥(0,325𝑐𝑚)2 ) 30 X-100 a 1%, e 5% (v/v) sobre a atividade enzimática, também foi investigada. Dodecil sulfato de sódio (SDS), brometo de hexadeciltrimetrilamônio (CTAB) ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) foram testados nas concentrações de 0,5mM e 1mM (p/v). A estabilidade das enzimas na presença de glicerol e solventes orgânicos foi avaliada através da medição da atividade residual após incubação da enzima com o solvente durante 30 min. 4.17 Determinação dos parâmetros cinéticos Para obter os parâmetros catalíticos Km (Constante de Michaellis-Menten), Vmax (Velocidade máxima da reação), Kcat (Constante catalítica) e Kcat.Km -1 (Eficiência catalítica), os ensaios foram realizados variando-se as concentrações de Leu-p-NA de 0,05 a 2,5 mM, determinando-se a velocidade inicial (V0) de cada reação. Os resultados foram obtidos pela regressão não linear dos dados, com auxílio do programa GraphPad Prism versão 5.00 para Windows (GraphPad Software, La Jolla California, USA.). 4.18 Construção do mutante ∆mesoamp 4.18.1 Preparação de células competentes de Mesorhizobium sp. J5 As células de Mesorhizobium sp. J5 foram preparadas segundo o protocolo proposto por Sharma 2010. Uma colônia isolada de Mesorhizobium sp. J5 foi inoculada em 5 mL de meio líquido TY (BERINGER, 1974) e incubada a 30ºC por 150 r.p.m. até alcançar a fase estacionária, um 1 mL de cultura foi usado para inocular 200 mL do mesmo meio mantido sob as mesmas condições e cultivadas até atingirem densidade ótica (DO600nm) de 0,1–0,3. Após o desenvolvimento, as células foram centrifugadas a 6000 g, a 4ºC por 30 min e o precipitado celular coletado foi lavado (três vezes) com 200 mL de Glicerol 10% (p/v) gelado; após a última lavagem as células foram ressuspendidas em 200 µL de glicerol 10% e distribuídas em alíquotas de 50 μL em microtubos, congeladas em nitrogênio líquido e estocadas a –80ºC para uso futuro. 31 4.18.2 Construção do vetor suicida pNPTS138∆mesoamp As regiões que flanqueiam o gene de interesse foram amplificadas por PCR utilizando os oligonucleotídeos descritos na Tabela 3. Em seguida, os fragmentos de 510 e 543 pb foram usados como molde para uma segunda etapa de PCR (Overlapping PCR) usando os oligonucleotídeos A e D. O novo produto de PCR de 1053 pb foi digerido utilizando as enzimas de restrição BamHI e EcoRI e ligado ao vetor pNPTS138 previamente digerido com as mesmas enzimas. O fragmento mesoamp de 1284 pb foi removido, mantendo a mesma fase de leitura (ORF) ao longo da deleção para evitar potenciais efeitos polares. O vetor pNPTS138 (Figura 6) é derivado do vetor Litmus 38 que contém o marcador de resistência à canamicina, o gene levansucrase SacB e a capacidade de se transferir por conjugação para uma grande diversidade de bactérias (WEST; YANG; STEPHENS, 2002). Tabela 3. Propriedades dos oligonucleotídeos iniciadores utilizados para gerar a mutação do gene mesoamp. Nome Enzima de restrição Oligonucleotídeos (5’→ 3’) TM (ºC) Produto amplificado P (A)F P (B)R BamHI - TGCGGATCCTGGCGCAGGAAGTGTT CCTCCCTACGTGGGAATCTGACCCATA 69,3 65,3 510pb P (C)F P (D)R - EcoRI GATTCCCACGTAGGGAGGTCGAATGGC CTGGAATTCGTCGGGGACCGGGTTCTG 67,4 69,5 543pb P (A)F P (D)R BamHI EcoRI TGCGGATCCTGGCGCAGGAAGTGTT CTGGAATTCGTCGGGGACCGGGTTCTG - 1053pb TM = Temperatura de pareamento Letras sublinhadas= sítio de restrição das enzimas 4.18.3 Eletroporação de Mesorhizobium sp. J5 Alíquotas de 50 μL de células de Mesorhizobium sp. J5 eletrocompetentes foram descongeladas em banho de gelo por aproximadamente 10 min. Em seguida, foi adicionado 1 µg de DNA do plasmídeo pNPTS138-∆mesoamp, sendo transferidas 32 para eletrocubetas com espaço de 1 mm (Bio-Rad) previamente geladas (4ºC), e colocadas entre os eletrodos do equipamento eletroporador Gene Pulser II (Bio-Rad), onde foi aplicado um pulso elétrico com os seguintes parâmetros: 1800 V de voltagem, 200 V de resistência e 25 FD de capacitância por cerca de 6-10 ms. A corrente gerada altera a estrutura da membrana celular, abrindo poros temporários aquosos na bicamada lipídica que possibilitam a entrada do DNA recombinante na célula-alvo. Após o pulso elétrico as células foram recuperadas em 1,0 mL de meio líquido TY sem antibiótico, incubadas a 30ºC por 4 h e 150 r.p.m.. Posteriormente, alíquotas de 100 µL das células transformadas foram inoculadas em meio TY sólido contendo canamicina a 50 µg/mL. As placas foram devidamente identificadas e incubadas a 30ºC por 72 h. Após o período de incubação foi possível observar vários clones, posteriormente coletados. Figura 5. Esquema da PCR overlapping para a construção da versão deletada do gene mesoamp. As letras A, B, C e D indicam a posição dos oligonucleotídeos iniciadores no genoma de Mesorhizobium sp. J5. 4.18.4 Seleção dos clones positivos O vetor pNPTS138 contendo uma cópia deletada do gene mesoamp foi inserido em Mesorhizobium sp. J5 por eletroporação. O plasmídeo pNPTS138 é capaz de se replicar em E. coli DH10β, mas, no entanto, atua como suicida em Mesorhizobium sp. devido à incapacidade de se replicar na célula de forma autônoma. Por isso é necessário a integração no genoma de Mesorhizobium sp. para permanecer na célula. Uma maneira pela qual o plasmídeo pode se integrar no genoma da bactéria é através da recombinação homóloga no locus do gene alvo. Os transformantes que são 33 resistentes à canamicina e sensíveis à sacarose são candidatos a esse tipo de recombinação. Após as transformações em Mesorhizobium sp., as colônias que cresceram em meio TY contendo canamicina (50 µg/mL) foram repicadas nos meios: TY, TY/canamicina e LB/ sacarose 5%. Somente as colônias que cresceram na presença de canamicina e não cresceram em meio LB/ sacarose 5% foram selecionadas. Essas colônias foram inoculadas em 3 mL de meio TY (Triptona 5 gL-1, extrato de levedura 3 gL-1 e CaCl2 0,67 gL-1) e permaneceram a 30°C por 48 h. Para a seleção do segundo evento de recombinação as bactérias foram inoculadas nos meios sólidos TY, TY/canamicina e TY/ sacarose 5%. Assim, as colônias que foram capazes de se desenvolver em presença de sacarose e que apresentaram sensibilidade à canamicina foram selecionadas (Figura 7). Essas colônias foram repicadas novamente nos meios TY/sacarose 5% e TY/canamicina para certificação do fenótipo (Figura 7). Figura 6. Mapa do vetor pNPTS138 usado na mutação sítio dirigida. 34 Figura 7. Evento de deleção do gene mesoamp usando o vetor suicida pNPTS138∆mesoamp. Para confirmar a deleção foi realizada reação de PCR com os oligonucleotídeos A e D, com o objetivo de comparar o tamanho do fragmento amplificado, estando o gene inteiro presente ou deletado. Colônias de Mesorhizobium sp. J5 carregando a deleção foram repicadas em 20 µL de tampão de lises e aquecidas a 96°C por 15 min, a fim de se obter um lisado homogêneo da diluição; 4 µL desta diluição foram utilizados na reação de PCR em um volume total de 20 µL. Obtido sucesso no processo de mutação, as colônias selecionadas foram desenvolvidas em 3 mL de meio TY líquido, a 30ºC, por 48 h. Do total, 800 µL foram utilizados para a estocagem do material a - 80ºC. 4.19 Caracterização fenotípica da linhagem ∆mesoamp 4.19.1 Curva de crescimento in vitro de Mesorhizobium sp. J5 vs linhagem ∆mesoamp Para se obter a curva de crescimento, 1% (v/v) das culturas de Mesorhizobium sp. J5 e da linhagem ∆mesoamp (DO600nm 0,5) foram inoculadas em meio TY a 30ºC, 35 200 r.p.m. O crescimento das culturas foi monitorado pela leitura da absorbância a 600 nm durante 96 h. 4.19.2 Produção de exopolisacarídeos (EPS) Para a avaliação da produção de EPS pelas culturas de Mesorhizobium sp. J5 e da linhagem ∆mesoamp, as bactérias foram cultivadas em meio TY a 30ºC, 200 r.p.m. Após atingir uma D.O.600nm 1, um ml de cultura foram usadas como pré-inóculo para 99 mL de meio PSY (K2HPO4 1,2 gL-1; KH2PO4 0,8 gL-1; MgSO4 0,2 gL-1; sacarose 30 gL-1; extrato de levedura 1,0 gL-1) e incubadas a 30ºC por 144 h, em agitação orbital a 200 r.p.m. O meio PSY já foi usado em trabalhos anteriores (dados não publicados) no laboratório de bioquímica de micro-organismos e plantas sendo o meio de cultura que apresentou os melhores resultados para produção ótima de EPS. Após a incubação a cultura foi centrifugada a 12000 g por 20 min, e o sobrenadante separado e tratado com um volume de ácido tricloroacético (10% p/v), sendo homogeneizado com agitação constante (90 r.p.m.) durante 30 min, para então ser centrifugado por 20 min, a 12000 g. O material sedimentado foi descartado, e etanol gelado a 96% foi adicionado ao sobrenadante numa relação 3:1 (v/v). A mistura foi refrigerada a 4ºC durante 24 h. Após o período de refrigeração, as amostras foram centrifugadas mais uma vez (10000 g, 4°C, 30 min) para separar o precipitado do solvente. O precipitado foi lavado várias vezes com etanol, e o excesso de foi evaporado. A precipitação com solventes consegue a purificação parcial do polímero por eliminação dos componentes solúveis do meio de cultura (CASTELLANE; OTOBONI; LEMOS, 2015). 4.19.3 Tolerância ao estresse salino Culturas de Mesorhizobium sp. J5 e da linhagem ∆mesoamp foram cultivadas em 100 mL de meio TY a 30ºC sob agitação de 200 r.p.m., até atingir uma D.O.600nm de 0,6; então, 100 µL de cultura foram adicionados em 650 µL de meio TY suplementado com 0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,50 e 2M de NaCl. Após incubação por 72 h a 30ºC a D.O.600nm foi medida. 36 4.19.4 Cinética de lise Culturas de Mesorhizobium sp. J5 e da linhagem ∆mesoamp foram incubadas em meio TY até atingir uma D.O.600nm de 1; após este período as células foram lavadas e ressuspendidas em tampão PBS (contendo 0,05% de triton X-100), numa D.O.600nm de 2. As lises celulares foram determinadas por alterações na D.O.600nm, medidas a cada 30 min. 4.19.5 Termotolerância Culturas de Mesorhizobium sp. J5 e da linhagem ∆mesoamp foram cultivadas em 100 mL de meio TY a 30ºC sob agitação de 200 r.p.m até atingir uma D.O.600nm de 0,6; então, 200 µL de cultura foram incubados a 30, 35, 40, 50, 60 e 70 °C por 30 min. Uma alíquota (0,5 % v/v) da cultura nas diferentes temperaturas foi usada para inocular meio TY, que permaneceram por 72 h a 30ºC e, depois deste tempo, a D.O.600nm foi medida. 4.19.6 Produção de biofilme O teste de produção de biofilme foi realizado segundo o protocolo de HASSAN (2011), com algumas modificações. Uma alíquota de 10 µL de células em suspensão de Mesorhizobium sp. e da linhagem ∆mesoamp numa D.O600nm de 1, foi inoculada em 150 µL de meio TY, PSY, PGY (K2HPO4 1,4 g-l; KH2PO4 1,0 g-l; MgSO4 0,2 g-l; glicerol 10 g-l; extrato de levedura 1,0 g-l) e PGE (K2HPO4 0,5 g-l; MgSO4 0,2 g-l; NaCl 0,1 g-l; extrato de levedura 3,0 g-l e glicose 10,0 g-l), em placas de poliestireno de 96 poços, e incubadas durante 144 h, a 30°C. Após a incubação, o meio remanescente na placa foi descartado e as células não aderidas foram removidas com cinco lavagens com água destilada estéril. As placas foram secas ao ar durante 45 min e cada poço foi corado com 200 µL de solução cristal violeta1 % (p/v) durante 45 min. Após a coloração, as placas foram lavadas (cinco vezes) com água destilada estéril. 37 A análise quantitativa e indireta da produção de biofilme foi realizada pela adição de 200 µL de uma solução de etanol-acetona (4:1). Uma solução etanol- acetona-cristal violeta foi medida a D.O570nm e usada para calcular a pr