Campus de Botucatu PG-BGA Envolvimento do inflamassoma na imunidade inata e adaptativa em gestantes portadoras de pré-eclâmpsia MARIANA ROMÃO VEIGA Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Doutor no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração Biologia Celular Estrutural e Funcional. Orientadora: Maria Terezinha Serrão Peraçoli BOTUCATU – SP 2017 Instituto de Biociências - Seção Técnica de Pós-Graduação Distrito de Rubião Júnior s/n CEP 18618-970 Cx Postal 510 Botucatu-SP Brasil Tel (14) 3880-0780 posgraduacao@ibb.unesp.br Campus de Botucatu PG-BGA UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Julio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU Envolvimento do inflamassoma na imunidade inata e adaptativa em gestantes portadoras de pré-eclâmpsia MARIANA ROMÃO VEIGA MARIA TEREZINHA SERRÃO PERAÇOLI Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Doutor no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração Biologia Celular Estrutural e Funcional. BOTUCATU – SP 2017 Instituto de Biociências - Seção Técnica de Pós-Graduação Distrito de Rubião Júnior s/n CEP 18618-970 Cx Postal 510 Botucatu-SP Brasil Tel (14) 3880-0780 posgraduacao@ibb.unesp.br Campus de Botucatu PG-BGA 1 Trabalho realizado nos laboratórios do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biociências – UNESP - Botucatu com auxílio da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). Processos nº 2012/24697-8, 2013/00534-5. 2 DEDICATÓRIA 3 Dedico este trabalho à minha família pelo amor, apoio, confiança e motivação incondicional. Que sempre me impulsiona em direção à minha vitória frente aos desafios da vida “Só se vê bem com o coração, o essencial é invisível aos olhos”. Antoine de Saint-Exupéry Aos meus pais, José Carlos e Helena, que me deram a vida e me ensinaram a vivê-la e que, com muito amor e cuidado, me levaram a acreditar que tudo é possível! Ao meu esposo, José Alberto (Beto), por todos esses anos de muito amor, amizade, apoio e felicidade. Aos meus irmãos, Danilo e Gustavo, pelo carinho e atenção que sempre tiveram comigo, cuidando sempre dessa caçulinha. Aos meus sobrinhos, Natália, Murilo, João Pedro e Felipe que alegram a minha vida todos os dias! À minha Tia Maria, segunda mãe que esteve sempre presente e com muito carinho me apoiou nessa jornada. Ao Sr. Veiga e D. Marisa, Tia Sílvia, Vó Flora, Luciana e Erick por me acolherem em sua família com tanto carinho. Obrigada por todo apoio! À toda minha família, minha cunhada Renata, Vó Lourdes, Tia Lúcia, Tio Wilson, a todos tios, tias, primos e primas, obrigada por serem meu porto seguro, mais que qualquer outra coisa, por serem tudo o que acredito ser uma FAMÍLIA. Vocês são a minha vida! 4 AGRADECIMENTOS 5 AGRADECIMENTO ESPECIAL À minha orientadora Maria Terezinha Serrão Peraçoli, por todos os ensinamentos, sabedoria, compreensão e ajuda, por ser exemplo, profissional e principalmente pessoal. Meu muito obrigada pelo carinho, amizade e dedicação em todos esses anos de trabalho e convívio. “Há pessoas que nos falam e nem as escutamos, há pessoas que nos ferem e nem cicatrizes deixam, mas há pessoas que simplesmente aparecem em nossas vidas e nos marcam para sempre.” Cecília Meireles 6 AGRADECIMENTOS Às meninas do LAB 3, Mariana, Vanessa e Priscila pela amizade, ajuda, ensinamentos, erros e risadas, obrigada por produzirem um ambiente de trabalho tão divertido e agradável. Aos meus queridos amigos, Paola e Fernando, pelas horas de diversão, discussão, alegria e por permitirem que eu fizesse parte de suas vidas. Aos amigos de longe, Pamella (Pam), Patrícia (Paty), Marcelo (Korone), Wilson (Fuzita), William, Camila (Cami), Ana Paula (Aninha), Leandro (Ledo), Sidarta e Amanda (Cacau), que apesar de longe, estão sempre perto, obrigada por todas as conversas! Aos amigos, Célio, Alessandra, Cristiano, Fernanda (Felícia), Vitor, Rafael (Banana), Bruno, Adriana, Daniel (Lello), Juliana, Marcelo (Bolinha) e Jaqueline que tornaram meus dias muito mais felizes. Ao Dr. Peraçoli, Dra. Vera, Dr. Leandro, Dr. Roberto e aos demais docentes e funcionários do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, por sempre estarem disponíveis a ajudar. Ao prof. João Pessoa, prof. Ramon e Dra. Graziela, do Departamento de Microbiologia e Imunologia, por disponibilizarem seu laboratório e colaborarem com o andamento de meu trabalho. A todos docentes, funcionários e colegas do Departamento de Microbiologia e Imunologia, por toda ajuda e pela boa convivência. Aos funcionários da Unidade Básica de Saúde do Jardim Iolanda, Botucatu, sempre prontas a ajudar. Às gestantes que aceitaram participar desse trabalho, meu muito obrigada, sem vocês nada seria possível. 7 Ao programa de Pós-graduação em Biologia Geral e Aplicada, por possibilitar a realização deste trabalho, e aos funcionários pela disposição e eficiência em todas as necessidades. À FAPESP, pelo auxílio financeiro para realização deste projeto Processos nº 2012/24697-8 e 2013/00534-5. Agradeço a todos que de alguma forma contribuíram para a realização desse trabalho e que principalmente contribuíram para formação da pessoa que sou hoje. 8 “Na vida, não existe nada a temer, mas a entender.” Marie Skłodowska Curie 9 SUMÁRIO 10 SUMÁRIO RESUMO................................................................................................................... 11 ABSTRACT ............................................................................................................... 15 INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 19 OBJETIVOS .............................................................................................................. 21 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 23 CAPÍTULO I ........................................................................................................... 24 CAPÍTULO II .......................................................................................................... 41 CAPÍTULO III ......................................................................................................... 74 CONCLUSÕES ....................................................................................................... 102 ANEXOS ................................................................................................................. 104 ANEXO 1 – ARTIGO SUBMETIDO PARA PUBLICAÇÃO ................................... 105 ANEXO 2 – PARECER DO CONSELHO DE ÉTICA EM PESQUISA .................. 144 ANEXO 3 – TERMOS DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO........... 150 OUTRAS ATIVIDADES .......................................................................................... 153 1.1. HISTÓRICO ESCOLAR FINAL (ANEXO 01) ............................................. 154 1.2. ATA DE DEFESA (ANEXO 02) .................................................................. 154 1.3. PARTICIPAÇÃO EM EVENTOS CIENTÍFICOS ........................................ 154 1.4. PUBLICAÇÕES .......................................................................................... 154 1.5. ANAIS DE EVENTOS CIENTÍFICOS ......................................................... 155 1.6. PRÊMIOS ................................................................................................... 156 1.7. TREINAMENTO TÉCNICO ........................................................................ 157 1.8. AVALIAÇÃO DE TRABALHOS .................................................................. 157 11 RESUMO 12 Introdução: A pré-eclampsia (PE) destaca-se como uma das principais causas de morbidade e mortalidade tanto materna como fetal, se caracteriza por ativação anormal do sistema imune inato e adaptativo. No plasma de gestantes portadoras de PE encontram-se níveis elevados de estruturas moleculares associadas ao estresse e morte celular, denominados padrões moleculares associados ao dano (DAMPs) como, proteína de choque térmico (Hsp70), HMGB1 (high mobility group box 1), Hialurona (HA) e Ácido Úrico, que parecem contribuir diretamente com a patogênese dessa doença. Essas DAMPs ligam-se a receptores presentes em células da imunidade inata, podendo ativar um complexo intracelular denominado inflamassoma, responsável pelo processamento e liberação de IL-1β e IL-18. Essas citocinas são potentes mediadores inflamatórios e importantes na ativação da resposta imune adaptativa, auxiliando a ativação de células T em Th17 e Th1, respectivamente. Na PE, a ocorrência de resposta inflamatória sistêmica parece decorrer da deficiência no controle de células T efetoras por células T reguladoras (Treg). Portanto, o balanço entre células Treg e Th17 pode ser crítico para a tolerância ao feto e para a prevenção da doença. Objetivos: O presente trabalho teve como objetivos: Avaliar o estado de ativação, endógena e induzida pelas DAMPs (urato monossódico (MSU), HA e Hsp70), em monócitos, pela identificação da presença do inflamassoma e associação com a produção de citocinas; Avaliar o envolvimento das subpopulações de células T (Th1, Th2, Treg e Th17) pela análise dos fatores de transcrição e pelo padrão de citocinas produzidas por essas células estimuladas com as DAMPs (MSU, HA e Hsp70). Métodos e Resultados: Foram estudadas 20 gestantes portadoras de PE, 20 gestantes normotensas (GN) e 20 mulheres saudáveis não grávidas (MNG). O plasma foi separado e armazenado à -80°C para dosagem das DAMPs (ácido úrico, HA, HMGB1 e Hsp70). Monócitos de sangue periférico foram incubados na presença ou ausência das DAMPs (MSU, HA e Hsp70). O sobrenadante obtido após 18h de cultivo foi aspirado e empregado para dosagem das citocinas TNF-α, IL-1β e IL-18 por ELISA. A presença de inflamassoma nessas células foi avaliada pela quantificação de RNAm de NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL-1β, IL-18, TNF-α e HMGB1 por RT-qPCR após 4h de cultura. Os resultados mostraram concentração plasmática elevada de MSU, HA, Hsp70 e HMGB1 e expressão gênica endógena de 13 NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL-1β, TNF-α e HMGB1 significativamente maior em gestantes com PE em comparação aos grupos GN e MNG. Em relação à produção endógena de citocinas, IL-1β foi maior no grupo PE em relação aos grupos GN e MNG, enquanto IL-18 e TNF-α estão aumentadas apenas no grupo PE comparado ao grupo GN. O estímulo de monócitos de gestantes pré-eclâmpticas e de mulheres não grávidas com MSU induziu aumento na expressão gênica de NLRP3, caspase-1 e TNF-α em relação à expressão endógena nesses grupos, enquanto esse efeito não foi observado em gestantes normotensas. Quando os monócitos foram estimulados com HA observou-se aumento da expressão de RNAm de NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL-1β, TNF-α e HMGB1, enquanto Hsp70 estimulou apenas a expressão de RNAm de TNF-α. A análise das citocinas por ELISA mostrou que monócitos de gestantes com PE produziram níveis endógenos e estimulados com MSU mais elevados de IL-1β, IL-18 e TNF-α em comparação ao grupo GN. Todos os grupos apresentaram aumento de IL-1β após estímulo com HA e aumento de IL-1β e TNF-α quando estimulados com Hsp70. Para estudo das subpopulações de células T as células mononucleares do sangue periférico foram avaliadas pela expressão endógena dos fatores de transcrição para células T-bet (Th1), GATA3 (Th2), RORc (Th17) e Foxp3 (Treg) por citometria de fluxo. Essas células foram cultivadas na ausência ou presença das DAMPs e o sobrenadante foi empregado para determinação das citocinas de perfil Th1 (IFN-γ e TNF-β), Th2 (IL-4), Treg (IL-10 e TGF-β1) e Th17 (IL-17 e IL-22) por ELISA. Os resultados mostraram polarização para perfis inflamatórios Th1/Th17 e diminuição de perfis anti-inflamatórios Th2/Treg em gestantes portadoras de PE associados a níveis endógenos elevados das citocinas inflamatórias TNF-α, IFN-γ, IL-17 e diminuídos de TGF-β e IL-10 quando comparadas com gestantes normotensas. O estímulo das células com MSU induziu aumento de IFN-γ, IL-22 em todos os grupos estudados, enquanto os estímulos com MSU e HA induziram aumento de IL-17 somente no grupo de normotensas. As DAMPs MSU e Hsp70 induziram aumento significativo da produção de TNF-α nos grupos de PE e MNG. Níveis elevados de TGF-β1 foram produzidos por células de gestantes portadoras de PE estimuladas com MSU, HA e Hsp70, enquanto HA e Hsp70 induziram diminuição da produção dessa citocina em gestantes normotensas. Conclusões: A maior expressão gênica endógena de NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL-1β, HMGB1 e TNF-α em monócitos de gestantes pré-eclâmpticas 14 confirma o estado de ativação dessas células na PE. Assim como a ativação endógena para perfil Th1/Th17 e expressão elevada de citocinas inflamatórias em gestantes pré-eclampticas demonstra o desbalanço inflamatório presente nessas gestantes. As DAMPs foram capazes de estimular tanto a resposta imune inata como a adaptativa em gestantes pré-eclâmpticas sugerindo que essas alarminas desempenham papel na ativação do sistema imune e na liberação de citocinas inflamatórias participando na patogênese dessa importante síndrome da gestação. Palavras-chave: Pré-eclâmpsia, citocinas, DAMPs, monócitos e subpopulações de células T. 15 ABSTRACT 16 Introduction: Preeclampsia (PE) stands out as one of the main causes of morbidity and mortality both maternal and fetal, characterized by abnormal activation of the innate and adaptive immune system. Plasma of pregnant women with PE shows high levels of molecular structures associated to stress and cell death, called damage associated molecular patterns (DAMPs) such as heat shock protein (Hsp70), HMGB1 (high mobility group box 1), Hyaluronan (HA) and Uric Acid, which seem to contribute directly to the pathogenesis of this disease. These DAMPs bind to receptors present in cells of innate immunity, and can activate an intracellular complex called inflammasomes, responsible for the processing and release of IL-1β and IL-18. These cytokines are potent inflammatory mediators and important in the activation of the adaptive immune response, aiding the activation of T cells in Th17 and Th1, respectively. In PE, the occurrence of a systemic inflammatory response appears to be a consequence of deficiency in effector T cell control by regulatory T cells (Treg). Therefore, the balance between Treg and Th17 cells may be critical for fetus tolerance and disease prevention. Objectives: This study aimed to: evaluate the activation state, endogenous and induced Damps (monosodium urate (MSU), HA and Hsp70) in monocytes, identifying the presence of inflammasomes and association with cytokine production; assess the involvement of T cell subpopulations (Th1, Th2, Treg and Th17) by the analysis of transcription factors and the pattern of cytokines produced by these cells stimulated with DAMPS (MSU HA and Hsp70). Methods and Results: Twenty pregnant women with PE, 20 normotensive pregnant women (NT) and 20 healthy non-pregnant women (NP) were studied. Plasma was separated and stored at -80ºC for determination of DAMPs (uric acid, HA, HMGB1 and Hsp70). Peripheral blood monocytes were incubated in the presence or absence of DAMPs (MSU, HA and Hsp70). The supernatant obtained after 18 h of culture was aspirated and used for determination of cytokines TNF-α, IL- 1β and IL-18 by ELISA. The presence of inflammasomes in these cells was evaluated by quantification of mRNA of NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL-1β, IL-18, TNF-α and HMGB1 by RT-qPCR after 4h of culture. The results showed high plasma concentration of MSU, HA, Hsp70 and HMGB1 and endogenous gene expression of NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL-1β, TNF-α and HMGB1 significantly higher in pregnant women with PE compared to NT and NP groups. In relation to the 17 endogenous production of cytokines, IL-1β was higher in the PE group compared to the NT and NP groups, while IL-18 and TNF-α were increased only in the PE group compared to the NT group. Monocytes of pre-eclamptic and non-pregnant women stimulated with MSU induced an increase in the gene expression of NLRP3, caspase-1 and TNF-α regarding endogenous expression in these groups, however this effect was not observed in normotensive pregnant women. When monocytes were stimulated with HA, increased mRNA expression of NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL-1β, TNF-α and HMGB1 was observed, whereas Hsp70 stimulated TNF-α mRNA expression only. Cytokine analysis by ELISA showed that monocytes from pregnant women with PE produced higher levels endogenous and stimulated with MSU of IL- 1β, IL-18 and TNF-α compared to the NT group. All groups showed increase of IL-1β after stimulation with HA and increase of IL-1β and TNF-α when stimulated with Hsp70. For the study of T cell subpopulations, peripheral blood mononuclear cells were evaluated by endogenous expression of transcription factors T-bet (Th1), GATA3 (Th2), RORc (Th17) and Foxp3 (Treg) cells by flow cytometry. These cells were cultured in the absence or presence of DAMPs and the supernatant was used to determine cytokines Th1 (IFN-γ and TNF-β), Th2 (IL-4), Treg (IL-10 and TGF-β1) and Th17 (IL-17 and IL-22) by ELISA. The results showed polarization for Th1/Th17 inflammatory profiles and decrease of Th2/Treg anti-inflammatory profiles in pregnant women with PE associated with elevated endogenous levels of the inflammatory cytokines TNF-α, IFN-γ, IL-17 and decreased TGF-β And IL-10 when compared with normotensive pregnant women. Stimulation of the cells with MSU induced an increase of IFN-γ, IL-22 in all studied groups, whereas the stimuli with MSU and HA induced IL-17 increase only in the normotensive group. DAMPs MSU and Hsp70 induced a significant increase in TNF-α production in the PE and NP groups. Elevated levels of TGF-β1 were produced by cells of pregnant women with PE stimulated with MSU, HA and Hsp70, whereas HA and Hsp70 induced decreased production of this cytokine in normotensive pregnant women. Conclusions: The higher endogenous gene expression of NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL-1β, HMGB1 and TNF-α in monocytes of pre-eclamptic women confirms the activation state of these cells in PE. As well as the endogenous activation of Th1/Th17 profile and high expression of inflammatory cytokines in pregnant women with PE demonstrates the inflammatory imbalance present in these pregnant women. 18 DAMPs were able to stimulate both the innate and adaptive immune response in preeclamptic women suggesting that these alarmins play a role in the activation of the immune system and in the release of inflammatory cytokines participating in the pathogenesis of this important gestational syndrome. Keywords: Pre-eclampsia, cytokines, DAMPs, monocytes and T-cell subsets. 19 INTRODUÇÃO 20 A pré-eclâmpsia é uma síndrome específica da gestação humana, que, entre outras manifestações, apresenta desvio da resposta imune para perfil inflamatório intenso, apresentando ativação endógena de células da imunidade inata e adaptativa. Grande parte das gestantes que desenvolvem essa síndrome, não apresentam sinais clínicos de infecção, portanto, acreditamos que a inflamação estéril participa na indução e manutenção dessa inflamação exacerbada presente nessas gestantes. Essa inflamação estéril pode ser desencadeada pela presença de padrões moleculares associados ao dano (DAMPs), que se encontram aumentados no plasma dessas gestantes, contribuindo tanto para a inflamação placentária local como para a inflamação sistêmica e a disfunção endotelial. Nesse contexto de inflamação estéril é interessante conhecer a capacidade dessas DAMPs em ativar a resposta inflamatória em gestantes portadoras PE, tanto na imunidade inata, como na imunidade adaptativa. O presente trabalho foi então formulado e discutido em três capítulos com formato de artigos. Capítulo 1 – artigo científico publicado Endogenous and Uric Acid-Induced Activation of NLRP3 Inflammasome in Pregnant Women with Preeclampsia. PLoS One. 2015; 10(6):e0129095. doi: 10.1371/journal.pone.0129095. Capítulo 2 – artigo submetido para publicação DAMPs induzem inflamação em gestantes portadoras de pré-eclâmpsia. Capítulo 3 – manuscrito em preparação DAMPs induzem polarização da imunidade adaptativa para perfil inflamatório em gestantes portadoras de pré-eclâmpsia 21 OBJETIVOS 22 O presente estudo avaliou, em gestantes portadoras de pré-eclâmpsia: a) A ativação dos inflamassomas NLRP1 e NLRP3, tanto endógeno como estimulados por urato monossódico em monócitos de gestantes portadoras de pré-eclâmpsia e sua associação com produção de citocinas inflamatórias. b) O estado de ativação, endógena e induzida pelas DAMPs (Hsp70 e hialurona), em monócitos de gestantes com PE pela identificação da presença dos inflamassomas NLRP1 e NLRP3 e associação com a produção de IL-1β, TNF-α e IL-18 nessas células. c) O envolvimento das subpopulações de células T (Th1, Th2, Treg e Th17) na fisiopatologia da PE, analisando os fatores de transcrição e perfil de citocinas, estimuladas ou não com as DAMPs (Hsp70, hialurona e urato monossódico), produzidos por essas subpopulações celulares. 23 RESULTADOS E DISCUSSÃO 24 CAPÍTULO I 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 CAPÍTULO II 42 DAMPs induzem inflamação em gestantes portadoras de pré-eclâmpsia Mariana Romão-Veiga1; Mariana Leticia Matias2; Vanessa Rocha Ribeiro2; Priscila Rezeck Nunes2; Vera Therezinha Medeiros Borges2; João Pessoa Araújo Junior1; José Carlos Peraçoli2; Maria Terezinha Serrão Peraçoli1 1 Departamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biociências de Botucatu - UNESP, SP, Brasil. 2 Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP, SP, Brasil. 43 RESUMO A pré-eclampsia (PE) é a principal causa de morbidade e mortalidade tanto materna como fetal. O plasma dessas gestantes contém níveis elevados de estruturas moleculares associadas ao estresse e morte celular (DAMPs), como hialurona (HA) e proteínas de choque térmico (HSP) as quais podem interagir com receptores presentes em células da imunidade inata e ativar um complexo intracelular que promove a inflamação, denominado inflamassoma. O presente estudo teve por objetivo avaliar o envolvimento das DAMPs, HA e Hsp70 na ativação dos inflamassomas NLRP1 e NLRP3 em monócitos. Foram estudadas 20 gestantes portadoras de PE, 20 gestantes normotensas (GN) e 20 mulheres não-grávidas (MNG). O sangue periférico coletado foi centrifugado e o plasma armazenado a -80°C para dosagem das DAMPs (HA, Hsp70 e High mobility group Box 1 (HMGB1). Monócitos de sangue periférico foram incubados na presença ou ausência das DAMPs (HA e Hsp70) e o sobrenadante obtido após 18h de cultivo foi utilizado para dosagem das citocinas Interleucina-1β (IL-1β), IL-18 e fator de necrose tumoral alfa (TNF-) por ELISA. A presença de inflamassoma foi avaliada pela quantificação de RNAm de NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL-1β, IL-18, HMGB1 e TNF-α por RT-qPCR. Os resultados mostraram concentração plasmática de HA, Hsp70 e HMGB1 e expressão gênica endógena de NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL-1β, TNF-α e HMGB1 significativamente maiores em gestantes com PE em comparação às GN e MNG. Em relação à produção endógena de citocinas pelos monócitos, IL-1β foi maior no grupo PE em relação aos grupos GN e MNG, enquanto IL-18 e TNF-α foram aumentadas apenas no grupo PE comparado ao grupo GN. Quando os monócitos foram estimulados com HA observou-se aumento da expressão de RNAm de NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL-1β, TNF-α e HMGB1, enquanto Hsp70 estimulou apenas a expressão de RNAm de TNF-α. Todos os grupos apresentaram aumento de IL-1β após estímulo com HA e aumento de IL-1β e TNF-α quando estimulados com Hsp70. A maior expressão gênica endógena de NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL- 1β, HMGB1 e TNF-α em monócitos de gestantes pré-eclâmpticas confirma o estado de ativação dessas células na PE. A maior expressão gênica do inflamassoma induzido com HA sugere que essa DAMP pode contribuir para a ativação desse complexo em monócitos de gestantes com PE. Apesar de Hsp70 não induzir ativação do inflamassoma, contribuiu para produção de IL-1β e TNF-α pelos 44 monócitos. Esses resultados sugerem a participação dessas DAMPs no processo inflamatório observado na PE. 1. INTRODUÇÃO A adaptação materna à gestação requer uma interação proeminente e rigidamente controlada entre as imunidades inata e adaptativa, para permitir o crescimento e desenvolvimento normais do semi-enxerto fetal (Van Rijn et al., 2008). Durante a gestação humana a principal causa de morbidade, mortalidade e parto prematuro entre 2 a 10% das gestações (ACOG, 2002), é a pré-eclâmpsia (PE), uma síndrome específica da gravidez. Os parâmetros clínicos que identificam o desenvolvimento dessa patologia são: hipertensão arterial (PA ≥ 140 x 90 mmHg) e proteinúria (≥ 300 mg/24h) (NHBPEP, 2000) que se manifestam a partir da vigésima semana de gestação ou nos primeiros dias após o parto. Outras disfunções maternas também estão relacionadas com PE, como insuficiência renal, envolvimento hepático, complicações neurológicas ou hematológicas, disfunção útero-placentária ou restrição de crescimento fetal (Tranquilli et al., 2014; Mol et al., 2016). Na PE ocorre uma reação inflamatória sistêmica exacerbada que inclui ativação de células inflamatórias, como monócitos e granulócitos, bem como células endoteliais, que são parte do sistema inflamatório (Schuiling et al., 1997; Redman et al., 1999; Borzychowski et al., 2006). Essa patologia é caracterizada por produção excessiva de citocinas pró-inflamatórias (Johnson et al., 2002; Redman & Sargent, 2003; Luppi & Deloia, 2006; Peraçoli et al., 2007) bem como por alterações na produção de citocinas reguladoras, como interleucina-10 (IL-10) e fator transformador do crescimento beta (TGF-β) (Pestka et al., 2004; Peraçoli et al., 2008; Raghupathy, 2013). A produção endógena de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) por monócitos do sangue periférico está significativamente mais elevada em gestantes pré-eclâmpticas do que em gestantes normais, sugerindo o estado de ativação dessas células (Peracoli et al., 2007; 2011; Cristofalo et al., 2013). A ativação de leucócitos no sangue periférico de gestantes com PE está associada a genes relacionados à inflamação. Esses leucócitos apresentam hiper- regulação do gene da cadeia leve de NF-κB (NF-κB-1A) em gestantes com PE (Lok 45 et al., 2009), ocorrendo também associação entre aumento de ativação do NF-κB e maior produção de TNF-α e IL-1β por células mononucleares de gestantes pré- eclâmpticas em comparação a gestantes normotensas (Giorgi et al., 2012). A produção mais elevada de TNF-α e IL-1β em gestantes com PE sugere que os efeitos deletérios das altas concentrações circulantes de TNF-α e IL-1β podem estar associados às manifestações mais graves da PE. A resposta inflamatória sistêmica intensa na PE parece estar relacionada com a liberação de substâncias capazes de induzir inflamação como componentes celulares presentes no plasma, derivados de proteínas, polissacarídeos e lipídeos, bem como produtos da matriz extracelular, os quais são denominados padrões moleculares associados ao dano (DAMPs) e considerados importantes moduladores da resposta inflamatória. As DAMPs são representadas por moléculas como ácido úrico (Matias et al., 2015), reativos intermediários do oxigênio, proteínas de choque térmico (HSPs) (Asea et al., 2002; Mandrekar et al., 2008), proteínas liberadas de células como HMGB1 (Park et al., 2004) e produtos liberados da matriz extracelular, como fibronectina e hialurona (Okamura et al., 2001; Campo et al., 2010; Saïd- Sadier & Ojcius, 2012). As Hsps são moléculas ubiquitárias e filogeneticamente conservadas, com funções de chaperonas e com atividade citoprotetora (Hightower, 1991), presentes em todos os organismos (Njemini et al., 2003). A indução de estresse oxidativo leva à produção de Hsp70, que regula a ativação do fator de transcrição nuclear NF-κB e a expressão do gene do TNF-α em monócitos e macrófagos (Mandrekar et al., 2008). Além disso, a liberação de Hsp70 por monócitos/macrófagos atua como “sinal de perigo” estimulando a produção de TNF-α, IL-6 e IL-8 por linhagens de macrófagos humanos, THP-1 (Lee et al., 2013). Concentração sérica elevada de Hsp70 é descrita em gestantes portadoras de PE precoce, sendo esses resultados significativamente maiores do que os obtidos em gestantes portadoras de PE tardia (Peracoli et al., 2013). High mobility group Box 1 (HMGB1) é uma proteína previamente descrita como estritamente nuclear, devido a sua ligação ao DNA e papel na transcrição, reparação e replicação de genes (Bustin, 1999) e posteriormente considerada como citocina com potente atividade inflamatória, devido suas funções extranucleares (Holmlund et al., 2007). Em condições inflamatórias ou de lesão, HMGB1 pode ser 46 secretada ativamente por células da imunidade inata como macrófagos e monócitos e, passivamente pelas células necróticas, sendo considerada “sinal de perigo” (Wang et al., 2004). A literatura demonstra ainda que a liberação de HMGB1 em endotoxemia é dependente da ativação do inflamassoma NLRP3 (Lamkanfi et al., 2010). Cultura de monócitos estimulados com HMGB1 resulta na liberação de TNF- α, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-6, IL-8, mas não de IL-10 ou IL-12 por essas células (Andersson et al., 2000). HMGB1 está aumentada no plasma de gestante com PE quando comparadas com gestantes normotensas (Naruse et al., 2012), sendo descrito que pode contribuir para o desenvolvimento da resposta inflamatória em pacientes com PE (Zhu et al., 2015). O hialurona (HA) é um glicosaminoglicano da matriz extracelular, que em ambientes inflamatórios sofre rápida degradação, resultando no acúmulo de fragmentos com baixo peso molecular (Fraser et al., 1997; Campo et al., 2010). Esses fragmentos ativam a resposta pró-inflamatória via Toll-like receptor (TLR) 2 e TLR4, agindo como DAMP, além de poder ativar o inflamassoma NLRP3 (Yamazaki et al., 2009). Por outro lado, o HA de alto peso molecular gera resposta anti- inflamatória (Taylor et al., 2004; Scheibner et al., 2006; Stern et al., 2006). Níveis plasmáticos elevados de HA são descritos em gestantes portadoras de PE e eclâmpsia (Berg et al., 2001; Romão et al., 2014). As DAMPs exercem seu efeito inflamatório por meio da interação com receptores de reconhecimento de padrão (PRRs) expressos em células da imunidade inata. Esses receptores são considerados componentes centrais do sistema imune inato e estão envolvidos na resposta inflamatória de monócitos (Kim et al., 2005; Mazouni et al., 2008). Os principais são os receptores semelhantes ao Toll (TLRs), que reconhecem e ligam moléculas presentes na superfície de patógenos (Koga & Mor, 2008), além de produtos endógenos de células do hospedeiro, que são liberados durante lesão tecidual e denominados “alarminas” ou DAMPs (Matzinger, 2002; Kim et al., 2005). Assim a ativação dos TLRs por microrganismos ou por produtos endógenos pode regular tanto a fagocitose e atividade microbicida, como também a liberação de citocinas inflamatórias (Krutzik et al., 2005). Outros receptores PRRs compreendem os membros da família de receptores Nod-like ou NLR (proteína contendo domínio de oligomerização nucleotídica), que 47 são proteínas citosólicas que reconhecem PAMPs e DAMPs dentro do citoplasma da célula do hospedeiro e recrutam outras proteínas, formando complexos de sinalização que promovem a inflamação e são denominados inflamassomas, gerando formas ativas de IL-1β (Franchi et al., 2009). Após interação com as DAMPs, diversas proteínas NLRP3 idênticas formam um oligômero e cada NLRP3 do oligômero se liga a uma proteína adaptadora chamada ASC. Esta se liga à forma precursora inativa da enzima caspase-1 que é uma protease de cisteinilaspartato, importante nos mecanismo de apoptose e inflamação (Fuentes-Prior & Salvesen, 2004). A caspase-1 é uma importante proteína inflamatória sintetizada na forma de pró-caspase-1 e se torna biologicamente ativa quando o inflamassoma inicia seu processo de formação (Strowig et al., 2012; Davis et al, 2011) sendo responsável por clivar a pró-IL-1β e a pró-IL-18 em IL-1β e IL-18 biologicamente ativas que, subsequentemente, são secretadas para o meio extracelular (Dinarello, 1999; Pétrilli et al., 2007; Eder, 2009;. Franchi et al., 2009). A ativação do inflamassoma NLRP3 é importante para a defesa do hospedeiro e eliminação de patógenos como fungos, bactérias e vírus, sendo os produtos de sua ativação, IL-1β e IL-18 moléculas protetoras em várias infecções (Dinarello & Fantuzzi, 2003; Dinarello, 2009). Também é ativado em condições de estresse celular ou injúria (Yang et al., 2012). Além disso, algumas evidências indicam que o NLRP3 tem importante papel em doenças inflamatórias como aterosclerose, gota e diabetes tipo I (Duewell et al., 2010; Grishman et al., 2011; Kingsbury et al., 2012). Entretanto, os diferentes ligantes e o mecanismo exato da ativação do inflamassoma NLRP3 ainda não estão bem esclarecidos (Strowig et al., 2012). Várias moléculas endógenas, consideradas sinais de perigo, tais como cristais de ácido úrico, cristais de colesterol, hialurona, radicais livres derivados do oxigênio e ácidos graxos, quando em altas concentrações, induzem ativação do inflamassoma NLRP3, desempenhando papel importante em doenças inflamatórias. Monócitos de gestantes pré-eclâmpticas apresentam hiperativação endógena do complexo inflamassoma, representada por maior expressão gênica e proteica de NLRP3, caspase-1, IL-1β e de TNF-α em comparação às gestantes normotensas (Matias et al., 2015). Segundo Yang et al. (2012), uma melhor compreensão da natureza específica desse inflamassoma seria importante para revelar a 48 fisiopatologia molecular de várias doenças inflamatórias e para identificar terapêuticas potenciais para controle dessas doenças. Os dados da literatura demonstram que a PE apresenta resposta inflamatória exacerbada, representada pela ativação de células da imunidade inata. Assim, o conhecimento das vias do inflamassoma em monócitos ativados pelas DAMPs, presentes no plasma e o perfil de citocinas produzido por monócitos, detectados no sangue periférico de gestantes portadoras de PE poderão contribuir para a melhor compreensão do envolvimento da imunidade inata na fisiopatologia dessa importante patologia da gestação. O presente estudo teve por objetivo avaliar o envolvimento das DAMPs, hialurona e Hsp70 na ativação dos inflamassomas NLRP1 e NLRP3 em monócitos de gestantes portadoras de PE, gestantes normotensas e mulheres não-grávidas. 2. CASUÍSTICA E MÉTODOS 2.1. Casuística Foram estudadas 20 gestantes portadoras de PE (grupo de estudo) e 20 gestantes normotensas (grupo controle) que realizaram assistência pré-natal na maternidade do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP. Também foram incluídas no estudo 20 mulheres saudáveis, não-grávidas, doadoras voluntárias do Banco de Sangue do Hemocentro da Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP. As gestantes foram consideradas portadoras de PE quando, sem antecedente, manifestaram hipertensão arterial (≥140x90mmHg) associada à proteinúria ( 300mg em urina coletada durante 24 horas), após a 20ª semana de gestação (NHBPEP, 2000). Todas as mulheres envolvidas no estudo foram previamente informadas quanto à finalidade da pesquisa e assinaram o termo de consentimento esclarecido. Para as gestantes com idade menor que 18 anos o termo foi assinado também por seus pais ou responsáveis. O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP (Protocolo nº 349.847). 49 2.2. Colheita de sangue Foram coletados 10 mL de sangue por punção venosa para avaliação da expressão gênica e produção de citocinas por monócitos de gestantes portadoras de PE no momento do diagnóstico da doença e, de gestantes normotensas no momento em que foram pareadas com as gestantes com PE. O sangue das mulheres não- grávidas foi obtido durante a doação de sangue. 2.3. Separação do plasma Sangue periférico foi colhido por punção venosa, sendo 10 mL colocados em tubo estéril contendo 10 U/mL de EDTA (Greiner bio-one, Americana - Brasil), após centrifugação a 1500 rpm por 10 min, o plasma obtido foi armazenado a -80°C até o momento da determinação das DAMPs (Hialurona, Hsp70 e HMGB1) por ELISA. 2.4. Isolamento e cultura de monócitos Após separação do plasma, as células mononucleares foram obtidas por separação em gradiente de Ficoll-Paque Premium (GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Sweden), segundo técnica previamente descrita (Peracoli et al., 2011). O anel rico em células mononucleares foi lavado duas vezes com meio de cultura RPMI por 10 min a 1500 rpm. Após esse procedimento, as células foram ressuspendidas em meio de cultura RPMI suplementado com 2mM de L-glutamina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), 40 μg/mL de gentamicina e 10% de soro bovino fetal inativado (Gibco BRL Life Technologies, Breda, The Netherlands). Para identificação dos monócitos, 50 μL da suspensão de células mononucleares foram incubados por 10 min a 37ºC com 450 μL da solução de vermelho neutro a 0,02%. Os monócitos foram diferenciados por apresentarem citoplasma de coloração vermelha e a concentração celular foi ajustada para 5x105 monócitos viáveis/mL. As células foram distribuídas em placas de cultura de 24 orifícios (Linbro, Flow Lab, USA) e incubadas por 90 min a 37ºC, em tensão de 5% de CO2. As células não- aderentes foram eliminadas por lavagem dos orifícios da placa com meio de cultura RPMI. 2.5. Obtenção de sobrenadante de cultura de monócitos 50 Os monócitos obtidos conforme descrito no item 2.4., foram incubadas a 37⁰C, em tensão de 5% de CO2 por 18h, na ausência ou presença de 2,5 ng/mL Hsp70 (Sigma) e 100 µg/mL Hialurona (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). O sobrenadante obtido após 18h de cultivo foi aspirado, centrifugado e distribuído em alíquotas, conservadas a - 80ºC até o momento da dosagem pela técnica de ELISA. 2.6. Determinação das DAMPs e das citocinas pela técnica de ELISA Para quantificação das DAMPs (HA, Hsp70) no plasma e das citocinas IL-1β e TNF- nos sobrenadantes de cultura de monócitos, tratados ou não com HA e/ou Hsp70, foram empregados kits comerciais específicos obtidos da R&D Systems. A IL-18 foi quantificada em plasma com kit MBL (MBL-Medical & Biological Laboratories, Nagoya, Japan). O HMGB1 foi quantificado em plasma utilizando kit IBL Internacional – Shino Test (Hamburg, Germany). Nos ensaios, as concentrações dos anticorpos monoclonais e policlonais, bem como das citocinas recombinantes específicas, utilizadas nas curvas-padrão, foram recomendadas pelo fabricante. O limite de sensibilidade dos kits foi de 0,4 ng/mL para hialurona, 125 pg/mL para Hsp70, 0,1 ng/mL para HMGB1, 3,9 pg/mL para IL-1β, 25,6 pg/mL para IL-18 e 15,6 pg/mL para TNF-α. 2.7. Avaliação da expressão de transcritos relacionados à inflamação Os monócitos foram submetidos à análise da expressão em nível transcricional dos genes que codificam as proteínas NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL- 1β, IL-18 e TNF-α. O RNA total dos monócitos foi extraído por meio do sistema Total RNA Purification Kit (Norgen Biotek Corp., Thorold, ONL2V4Y6, Canada), conforme protocolo do fabricante. Após a extração, a fim de garantir a completa remoção de DNA genômico, 1µg de RNA total foi incubado com DNAse I Amp Grade (Invitrogen®). A pureza e qualidade relativa de todas as amostras de RNA total obtidas foram determinadas por espectrofotometria utilizando o equipamento Nanodrop® 2000 Spectrophotometer, Thermo ScientificTM. Posteriormente, a síntese de DNA complementar (cDNA) para execução da Reação em Cadeia da Polimerase acoplada a transcrição reversa (Reverse Transcription-coupled Polymerase Chain Reaction – RT-PCR) foi realizada com 450ng de RNA total por 60µl de reação, 51 utilizando ImProm-IITM Reverse Transcription System, conforme protocolo do fabricante. A quantificação da expressão gênica de NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL-1β, IL- 18 e TNF-α foi efetuada por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR) utilizando GoTaq® RT-qPCR Master Mix (Promega, Madison, WI, USA). O aparelho utilizado foi 7500 Fast Real Time PCR Systems (Applied Biosystems, USA). As diversas variantes dos alvos estudados foram alinhadas no programa MEGA 5.05 e, posteriormente, cada iniciador foi escolhido por meio do programa Primer-BLAST. Iniciadores situados na junção éxon-éxon garantem a pureza da reação, ou seja, a ausência de qualquer DNA genômico que possa contaminá-la. As sequências dos iniciadores utilizadas no presente estudo estão detalhadas no quadro 1. Cada reação foi definida em duplicata no total de 20µl cada, o qual contém 0,3µM de cada iniciador (sense e anti-sense), 2µl de cDNA, 10µl de master mix e 6,8µl de água livre de nuclease. Adicionalmente, foi inserido um controle, também em duplicata, o qual foi incluído em cada reação a fim de provar que não há contaminação. As condições para a reação de RT-qPCR foram: denaturação inicial a 96°C-2min e 40 ciclos a 95°C-15s e 60°C-60s, seguido de uma curva melting. A amplificação de cada transcrito específico foi confirmada pelo perfil da curva melting gerada no final de cada reação. Quadro 1: Sequências dos iniciadores para a análise da expressão dos genes caspase-1, IL-1β, IL-18, NLRP1, NLRP3 e TNF-α em estudo por RT-qPCR. Gene Forward primer (5’-3’) Reverse primer(5’-3’) GeneBank NLRP1 (1728)TCCGGCTCCCATTAGACAGA(1747) (1810)AGACCCATCCTGGCTCATCT(1791) NM_033004.3 NLRP3 (2826)GAGGAAAAGGAAGGCCGACA(2845) (2917)TGGCTGTTCACCAATCCATGA(2897) NM_004895.4 CASP1 (1065)AGACATCCCACAATGGGCTC(1084) (1172)TGAAAATCGAACCTTGCGGAAA(1151) NM_033292.3 IL1B (544)GAGCAACAAGTGGTGTTCTCC(564) (653)AACACGCAGGACAGGTACAG(634) NM_000576.2 IL18 (438)ACTGTAGAGATAATGCACCCCG(459) (517)AGTTACAGCCATACCTCTAGGC(496) NM_001562.3 TNF (325)GCTGCACTTTGGAGTGATCG(344) (462)GGGTTTGCTACAACATGGGC(443) NM_000594.3 HMGB1 (1404)TACGAAAAGGATATTGCTGC(1423) (1505)CTCCTCTTCCTTCTTTTTCTTG(1484) NM_001313893.1 GAPDH (684)CGTGGAAGGACTCATGACCA(703) (801)GGCAGGGATGATGTTCTGGA(782) NM_002046.4 52 Os valores de expressão dos transcritos analisados foram normalizados com base na análise concomitante da expressão do gene codificador da enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH). O cálculo da expressão diferencial dos genes selecionados foi efetuado pelo método de processamento de dados em relação a uma curva padrão (Larionov et al., 2005). Todas as condições, inclusive o GAPDH de cada amostra e o controle negativo da reação (No template Control – NTC; sem DNA) foram analisadas em duplicatas. Para análise da expressão relativa, amostras de RNA obtidas de gestantes do grupo controle foram reunidas e, após análise da expressão gênica, essa amostra recebeu o valor relativo de 100. Todas as outras amostras receberam valores relativos a essa amostra. 2.8. Análise Estatística Os resultados foram avaliados por análise de variância, empregando-se testes não-paramétricos (Teste U de Mann-Whitney ou Kruskal-Wallis, seguido de comparações múltiplas pelo teste de Dunn), segundo o programa estatístico PRISM, (Graph Prism for Windows, version 6.01, GraphPad, CA, EUA). O nível de significância adotado para todos os testes realizados foi de 5% (p < 0,05). 3. RESULTADOS 3.1. Características clínicas dos grupos estudados A análise das características clínicas das gestantes portadoras de PE, gestantes normotensas e mulheres não grávidas (Tabela 1) mostrou não haver diferença estatística entre a idade materna dos grupos avaliados. Da mesma forma, não houve diferença significativa entre as gestantes com PE e normotensas, com relação aos parâmetros de raça, idade gestacional e paridade. Os valores da pressão arterial sistólica e diastólica foram significativamente maiores (p< 0,05) nas gestantes portadoras de PE em relação às gestantes normotensas e mulheres não grávidas. Adicionalmente, os níveis de proteinúria e de ácido úrico foram significativamente mais elevados (p< 0,05) no grupo de gestantes com PE em comparação com o grupo de gestantes normotensas. 53 Tabela 1. Características clínicas e laboratoriais. Caracteristicas Gestantes portadoras de pré-eclâmpsia (n = 20) Gestantes normotensas (n = 20) Mulheres não grávidas (n = 20) Idade (anos) 25 (15 – 40) 26 (14 – 41) 24 (21 – 40) Cor Branca (%) Não-branca (%) 82,3 17,7 89,3 10,7 84,0 16,0 Idade gestacional (semanas) 34 (24 – 40) 35 (23 – 39) – Paridade Nulípara (%) Multípara (%) 63 37 68 32 – Pressão arterial sistólica (mmHg) 160 # (140 – 200) 110 (90 – 112) 114 (100 – 120) Pressão arterial diastólica (mmHg) 110 # (90 – 120) 69 (63 – 70) 70 (65 – 80) Proteinúria (mg / 24h) 1510* (300 – 19800) < 300 ND Ácido úrico (mg/dL) 5,8 # (4,5 – 10,1) 3,8 (2,2 – 4,6) 4,1 (2,8 – 4,8) Os valores estão expressos em percentagem ou em mediana, com os valores mínimo e máximo entre parênteses. ND = não determinado. * (p < 0,05) vs gestantes normotensas (teste U de Mann- Whitney). # (p< 0,05) vs gestantes normotensas e mulheres não grávidas (teste de Kruskal-Wallis). 3.2. Concentração das DAMPs (hialurona, Hsp70 e HMGB1) no plasma Na Tabela 2 estão representadas as concentrações plasmáticas de HA, Hsp70 e HMGB1. Os níveis dessas DAMPs foram significativamente maiores no plasma de gestantes portadoras de PE quando comparadas com gestantes normotensas e mulheres não grávidas. Tabela 2. Concentrações das DAMPs em plasma. Parâmetros Gestantes portadoras de pré- eclâmpsia Gestantes Normotensas Mulheres não grávidas Hialurona (ng/mL) 135,5 # (20,4 – 296,8) 62,4 (2,5 – 199,7) 42,8 (3,3 – 165,0) Hsp70 (pg/mL) 907,1 # (404,63 – 1272,8) 680,23 (7,5 – 1090,4) 655,43 (12,7 – 1083,4) HMGB1 (ng/mL) 8,11 # (1,864 – 97,809) 2,09 (1,682 – 4,789) 2,15 (1,848 – 18,854) Resultados expressos em mediana (valores mínimo e máximo entre parênteses) # (p<0,05) vs gestantes normotensas e mulheres não grávidas (teste de Kruskal-Wallis). 54 3.3. Expressão de genes relacionados ao inflamassoma em monócitos estimulados ou não com Hialurona A expressão gênica de NLRP1 e NLRP3 (fig 1A e 1B) encontra-se aumentada em monócitos de gestantes portadoras de PE, estimulados ou não com HA, quando comparado com os grupos GN e MNG. Também é possível notar menor expressão dos genes NLRP1 e NLRP3 em monócitos de GN, estimulados ou não com HA, quando comparado com o grupo MNG. O grupo PE apresentou diferença significativa entre monócitos não estimulados (HA-) e estimulados (HA+) com aumento da expressão de NLRP1 e NLRP3 nos estimulados. Observa-se ainda na figura 1C, que a expressão do gene da caspase-1 em monócitos de gestantes com PE, estimulados ou não com HA, foi maior quando comparada com os grupos GN e MNG. Além disso, monócitos de gestantes normotensas, estimulados ou não com HA, tiveram menor expressão de caspase-1 em comparação com o grupo de mulheres não grávidas. Os grupos PE e MNG apresentaram diferença significativa entre monócitos não estimulados (HA-) e estimulados (HA+) com aumento da expressão de caspase-1 nos estimulados. O tratamento das células com 200 µM de glibenclamida, composto capaz de inibir o inflamassoma NLRP3, induziu menor expressão de caspase-1 por monócitos de mulheres não-grávidas, mesmo quando estimulados com HA (HA+) (fig 1D). 55 Figura 1: Expressão gênica de NLRP1 (A), NLRP3 (B) e caspase-1 (C) em monócitos de gestantes portadoras de pré-eclâmpsia (PE), gestantes normotensas (GN) e mulheres não grávidas (MNG), estimulados ou não com Hialurona (HA). Expressão de caspase-1 (D) por monócitos de mulheres não grávidas cultivados com 50 µM ou 200 µM de glibenclamida e estimulados ou não com HA. * p<0,05 entre os grupos HA-; + p<0,05 entre os grupos HA+; # p<0,05 entre HA- e HA+; • p<0,05 entre os tratamentos (teste de Kruskal-Wallis). O aumento da expressão gênica da citocina IL-1β (fig 2A) é observado em monócitos de gestantes portadoras de PE, estimulados ou não com HA, quando comparado com os grupos GN e MNG. Além disso, é possível notar diminuição na expressão do gene IL-1β em monócitos de GN, estimulados ou não com HA, quando comparado com o grupo MNG. Foi demonstrado ainda que o estímulo com hialurona (HA+) induz aumento da expressão gênica de IL-1β em monócitos de gestantes com PE e no grupo MNG. Com relação a IL-18 (fig 2B) observa-se maior expressão em monócitos de gestantes com PE, estimulados ou não com HA, em comparação com o grupo GN. Além disso, monócitos do grupo GN estimulados com HA, apresentaram menor expressão gênica dessa citocina em relação ao grupo MNG. Observa-se ainda que 200 µM de glibenclamida foi capaz de inibir a expressão de IL-1β por monócitos de mulheres não-grávidas, mesmo quando estimulados com HA (HA+) (fig 2C). 56 A expressão gênica de HMGB1 (fig 2D) foi maior em monócitos de gestantes portadoras de PE, estimulados ou não com HA, quando comparado ao grupo GN. Menor expressão desse gene foi detectada em monócitos de GN, estimulados ou não com HA em comparação com o grupo MNG. Observa-se ainda que o HA foi capaz de estimular a expressão gênica de HMGB1 no grupos PE e MNG. Na figura 2E observa-se grande aumento da expressão gênica de TNF-α em monócitos de gestantes com PE, estimulados ou não com HA, quando comparados com os grupos de GN e MNG. No entanto, o grupo de gestantes normotensas apresentou menor expressão de TNF-α em monócitos estimulados com HA (HA+) do que no grupo MNG. Além disso, observa-se diferença significativa entre a expressão gênica de TNF-α em monócitos não estimulados (HA-) e estimulados com HA (HA+), de gestantes com PE e de MNG. 57 Figura 2: Expressão gênica de IL-1β (A), IL-18 (B), HMGB1 (D) e TNF-α (E) em monócitos de gestantes portadoras de pré-eclâmpsia (PE), gestantes normotensas (GN) e mulheres não grávidas (MNG), estimulados ou não com Hialurona (HA). Expressão de IL-1β (C) por monócitos de mulheres não grávidas cultivados com 50 µM ou 200 µM de glibenclamida e estimulados ou não com HA. * p<0,05 entre os grupos HA-; + p<0,05 entre os grupos HA+; # p<0,05 entre HA- e HA+; • p<0,05 entre os tratamentos (teste de Kruskal-Wallis). 3.4. Produção de citocinas por monócitos estimulados ou não com Hialurona Na figura 3A observa-se produção endógena de IL-1β, produzida por monócitos de gestantes portadoras de PE significativamente mais elevada em 58 relação aos grupos GN e MNG. O estímulo com HA induziu maior produção de IL-1β pelas células de gestantes pré-eclâmpticas apenas quando comparada ao grupo GN. Também é possível notar diminuição dos níveis da citocina em monócitos de GN estimulados com HA na comparação com o grupo MNG. Além disso, observa-se diferença significativa entre a produção de IL-1β por monócitos dos três grupos estudados, estimulados com HA (HA+) e a produção basal de citocina por essas células. Observou-se aumento da produção de IL-18 por monócitos de gestantes com PE não estimulados com HA, em relação ao grupo GN (Figura 3B). Nota-se também diminuição nos níveis da citocina por monócitos de GN, não estimulados com HA, quando comparada com o grupo MNG. No entanto, observou-se produção significativamente menor de IL-18 por monócitos de gestantes com PE e de mulheres não grávidas estimulados com HA (HA+) quando comparados com a produção por células que não foram estimuladas (HA-). Na figura 3C observa-se maior produção endógena e estimulada com HA de TNF-α por monócitos de gestantes portadoras de PE em relação ao grupo GN. Também é possível notar menor liberação da proteína TNF-α por monócitos de gestantes normotensas, estimulados ou não com HA, quando comparado com o grupo MNG. Além disso, monócitos de mulheres não grávidas estimulados com HA apresentaram maior produção de TNF-α em relação à produção basal por essas células. Não houve diferença significativa entre os níveis basais e estimulados por HA em monócitos de gestantes pré-eclâmpticas. 59 Figura 3: Produção de IL-1β (A), IL-18 (B) e TNF-α (C) por monócitos de gestantes portadoras de pré-eclâmpsia (PE), gestantes normotensas (GN) e mulheres não grávidas (MNG), estimulados ou não com Hialurona (HA). * p<0,05 entre os grupos HA-; + p<0,05 entre os grupos HA+; # p<0,05 entre HA- e HA+ (teste de Kruskal-Wallis). 3.5. Expressão de genes relacionados ao inflamassoma em monócitos estimulados ou não com Hsp70 A expressão gênica de NLRP1, NLRP3 e caspase-1 (figura 4A, 4B e 4C) encontra-se aumentada em monócitos de gestantes portadoras de PE, estimulados ou não com Hsp70, quando comparado com os grupos GN e MNG. Menor expressão desses genes foi observada em monócitos de GN, estimulados ou não com Hsp70, quando comparado com o grupo MNG. O estímulo com Hsp70 não alterou a expressão gênica de NLRP1, NLRP3 e caspase-1 nos três grupos estudados. 60 Figura 4: Expressão gênica de NLRP1 (A), NLRP3 (B) e caspase-1 (C) em monócitos de gestantes portadoras de pré-eclâmpsia (PE), gestantes normotensas (GN) e mulheres não grávidas (MNG), estimulados ou não com Hsp70. * p<0,05 entre os grupos Hsp70-; + p<0,05 entre os grupos HSP70+; # p<0,05 entre Hsp70- e Hsp70+ (teste de Kruskal-Wallis). O aumento da expressão gênica da citocina IL-1β (fig 5A) é observado em monócitos de gestantes portadoras de PE, estimulados ou não com Hsp70, quando comparado com os grupos GN e MNG. No entanto, o grupo GN apresenta diminuição na expressão do gene IL-1β em monócitos estimulados ou não com Hsp70, quando comparado com o grupo MNG. A expressão gênica de IL-18 (fig 5B) e HMGB1 (fig 5C) tanto endógena como estimulada por Hsp70 em monócitos de gestantes portadoras de PE está aumentada em relação ao grupo GN. Menor expressão do gene HMGB1 foi detectada em monócitos de GN, estimulados com Hsp70 em comparação com o grupo MNG. O estímulo com Hsp70 não induziu aumento da expressão genica de IL-1β, IL-18 e HMGB1 por monócitos dos três grupos estudados. Na figura 5D observa-se aumento da expressão gênica de TNF-α em monócitos de gestantes com PE, estimulados ou não com Hsp70, quando comparados com os grupos de GN e MNG. Além disso, observa-se diferença significativa entre a expressão gênica de TNF-α em monócitos não estimulados (Hsp70-) e estimulados com Hsp70 (Hsp70+), em todos os grupos estudados. 61 Figura 5: Expressão gênica de IL-1β (A), IL-18 (B), HMGB1 (C) e TNF-α (D) em monócitos de gestantes portadoras de pré-eclâmpsia (PE), gestantes normotensas (GN) e mulheres não grávidas (MNG), estimulados ou não com Hsp70. * p<0,05 entre os grupos Hsp70-; + p<0,05 entre os grupos Hsp70+; # p<0,05 entre Hsp70- e Hsp70+ (teste de Kruskal-Wallis). 3.6. Produção de citocinas por monócitos estimulados ou não com Hsp70 Na figura 6A observa-se produção endógena de IL-1β, produzida por monócitos de gestantes portadoras de PE significativamente mais elevada em relação aos grupos GN e MNG. O estímulo com Hsp70 induziu maior produção de IL-1β pelas células de gestantes pré-eclâmpticas apenas quando comparada ao grupo GN. Também é possível notar diminuição dos níveis da citocina em monócitos de GN estimulados com Hsp70 comparado com o grupo MNG. Além disso, observa- se diferença significativa entre a produção de IL-1β por monócitos dos três grupos estudados, estimulados com Hsp70 (Hsp70+) e a produção basal dessas células (Hsp70-). Observou-se aumento da produção de IL-18 por monócitos de gestantes com PE não estimulados com Hsp70, em relação ao grupo GN (Figura 6B). Nota-se 62 também diminuição nos níveis endógenos da citocina por monócitos de GN quando comparada com o grupo MNG. O estímulo com Hsp70 não induziu aumento da produção de IL-18 por monócitos dos grupos PE, GN e MNG. Figura 6: Produção de IL-1β (A), IL-18 (B) e TNF-α (C) por monócitos de gestantes portadoras de pré-eclâmpsia (PE), gestantes normotensas (GN) e mulheres não grávidas (MNG), estimulados ou não com Hsp70. * p<0,05 entre os grupos Hsp70-; + p<0,05 entre os grupos Hsp70+; # p<0,05 entre Hsp70- e Hsp70+ (teste de Kruskal-Wallis). Na figura 6C observa-se maior concentração de TNF-α tanto endógena como estimulada com Hsp70 produzida por monócitos dos grupos PE e MNG em relação ao grupo GN. Além disso, monócitos de gestantes portadoras de PE, de normotensas e mulheres não grávidas estimulados com Hsp70 apresentaram maior produção de TNF-α em relação à produção basal por essas células. 4. DISCUSSÃO O presente estudo avaliou a participação das DAMPs, HA, Hsp70 e HMGB1 na resposta inflamatória sistêmica observada na PE. As concentrações plasmáticas dessas DAMPs foram significativamente maiores em gestantes portadoras de PE quando comparadas com gestantes normotensas e mulheres não grávidas. Esses resultados confirmam estudos prévios da literatura (Berg et al., 2001; Naruse et al., 63 2012; Peracoli et al., 2013; Romão et al., 2014; Zhu et al., 2015) evidenciando a presença de níveis sistêmicos elevados dessas DAMPs nas gestantes pré- eclâmpticas e sua participação na patogênese da PE. A origem dessas DAMPs, no plasma, não é conhecida, mas existem evidências de que podem ser liberadas a partir de tecidos lesados e células necróticas e incluem componentes de matriz extracelular degradados, proteínas de choque térmico, proteína HMGB1 e ácidos nucleicos, entre outros. Na PE, muitas dessas DAMPs são conhecidas por contribuir tanto para a inflamação placentária local como para a inflamação sistêmica e a disfunção endotelial. Considerando que na PE o sinciciotrofoblasto placentário é submetido a estresse oxidativo e inflamatório, moléculas inflamatórias como Hsp70, HMGB1, Galectin 3 e Synctin 1 são transportadas por microvesículas e podem atuar como DAMPs tanto na placenta quanto nas células mononucleares do sangue periférico em gestantes com PE (Iversen, 2013). Assim, a liberação pela placenta de microvesículas e nanovesículas originadas do sinciciotrofoblasto para a circulação materna, pode exercer atividade pró-inflamatória, antiendotelial e pró-coagulante in vitro, características dessa síndrome materna (Sargent et al., 2003; Chen et al., 2016). Segundo Khan & Hay (2015) é possível que estas micropartículas possam atuar como DAMPs, induzindo hiperativação de inflamassoma e resultando no estado inflamatório exagerado na PE. Em trabalho recente demonstramos ativação do inflamassoma NLRP3 em placenta de gestantes pré-eclâmpticas, representada por aumento da expressão gênica de NLRP3, caspase-1, IL-1β, TNF-α e HMGB1 e níveis elevados de caspase-1 e dessas citocinas inflamatórias em homogenato placentário (Weel et al., 2016). No presente estudo, a análise da expressão gênica de NLRP1 e NLRP3, de caspase-1, bem como de IL-1β, IL-18, HMGB1 e TNF-α em monócitos do sangue periférico de gestantes portadoras de PE mostrou que esses parâmetros encontram- se elevados nessas gestantes e confirma resultados anteriores da ativação espontânea desses inflamassomas na PE (Matias et al., 2015). Esses resultados associados com aumento da expressão protéica das citocinas inflamatórias IL-1β, TNF-α e HMGB1 demonstram ativação endógena dessas células quando comparados com monócitos de gestantes normotensas. Assim, a ativação endógena de inflamassomas em monócitos circulantes de gestantes pré-eclâmpticas sugere que essas células podem ser ativadas por alarminas ou DAMPs presentes no 64 plasma. É descrito que esses complexos que promovem a inflamação podem ser ativados por moléculas derivadas do hospedeiro, demonstrando que nosso sistema imunológico não é apenas capaz de reconhecer partículas estranhas, mas também pode reagir a indicadores endógenos de dano celular tais como ATP extracelular, (Mariathasan et al., 2006) estresse metabólico (Schroder et al., 2010), hialurona, um dos principais componentes da matriz extracelular que é liberada durante lesão tecidual (Yamasaki et al., 2009), ácido úrico, reativos intermediários do oxigênio, entre outras DAMPs (Saïd-Sadier & Ojcius, 2012). No presente estudo, o estímulo dos monócitos de gestantes pré-eclâmpticas com HA induziu aumento da expressão gênica de NLRP3 e caspase-1, confirmando os resultados de Yamazaki et al. (2009). No entanto, as células de gestantes portadoras de PE também apresentaram aumento da expressão gênica de NLRP1 quando estimuladas com HA. Essa ligação do HA no inflamassoma NLRP1 pode ser explicada devido a um polimorfismo de NLRP1 variante rs12150220 (L155H) encontrado em gestantes portadoras de PE (Pontillo et al., 2015). A expressão gênica de IL-1β, TNF-α e HMGB1 em monócitos de gestantes pré-eclâmpticas e mulheres não-grávidas estimulados com HA mostrou-se aumentada quando comparada com gestantes normotensas. Esses resultados, em conjunto com a diminuição da expressão de caspase-1 e IL-1β quando os monócitos foram cultivados com HA e glibenclamida, inibidor do inflamassoma (Lamkanfi et al, 2009) comprovam que HA exerce efeito estimulador sobre a atividade inflamatória dessas células por meio da ativação do inflamassoma. Os resultados da ativação dos inflamassomas NLRP1 e NLRP3 em monócitos de gestantes pré-eclâmpticas e de mulheres não grávidas induzidos por HA são semelhantes aos obtidos previamente por estímulo com urato monossódico (Matias et al., 2015) e sugerem que as DAMPs, HA e ácido úrico, quando em concentrações elevadas no plasma, podem estar envolvidas no processo inflamatório sistêmico pela manutenção da ativação dos monócitos das gestantes com PE. Em relação ao estímulo com Hsp70, este não foi capaz de aumentar significativamente a expressão de NLRP1, NLRP3 e caspase-1, sugerindo que essa DAMP não ativa os inflamassomas. Nossos resultados mostram que o estímulo de monócitos com Hsp70 induziu aumento da produção de IL-1β e TNF-α, sugerindo que outra via de ativação possa estar envolvida, provavelmente a via do TLR4. 65 Mandrekar et al. (2008) demonstraram que a indução de estresse oxidativo leva à produção de Hsp70, que regula a ativação do fator de transcrição nuclear NF-κB e a expressão do gene do TNF-α em monócitos e macrófagos. De acordo com por Lee et al. (2013) Hsp70 recombinante humana induz a secreção de citocinas pro- inflamatórias via interação com o receptor TLR4. Segundo Netea et al. (2009; 2010) monócitos humanos do sangue periférico, diferentemente dos macrófagos teciduais, possuem a caspase-1 constitutivamente ativada sendo, portanto, capazes de clivar a pró-IL-1β em IL-1β biologicamente ativa somente com um sinal de ativação, como a interação de ligantes com os receptores TLR2 e TLR4. Assim, a produção de IL-1β é diferentemente regulada em monócitos e macrófagos, refletindo as diferentes funções dessas células na defesa do hospedeiro e na inflamação e representando uma adaptação de cada célula ao seu respectivo ambiente. A ativação dos inflamassomas geralmente requer dois sinais. O primeiro sinal consiste na ativação do receptor TLR resultando na produção de pró-IL-1β e pró-IL- 18, assim como no aumento da transcrição e tradução de moléculas como NLRP3. O segundo sinal está relacionado com a montagem e ativação do inflamassoma e pode ser ativado por uma variedade de estímulos (Martinon et al., 2006). Segundo Bauernfeind et al. (2009) a necessidade dessa dupla estimulação para ativar o inflamassoma poderia ser importante para impedir a ativação descontrolada de NLRP3, responsável por consequências devastadoras no hospedeiro, como ocorre em doenças auto-inflamatórias. Os níveis elevados de TNF-α em gestantes pré-eclâmpticas poderiam atuar no complexo inflamassoma pelo seu efeito estimulador sobre o fator de transcrição nuclear-κB. A síntese de TNF-α, bem como da IL-1β é regulada, em parte, pelo NF- κB, que está mais ativo em células de gestantes com PE (Giorgi et al, 2012). Esse fator regula a transcrição de genes relacionados à inflamação (Matsusaka et al, 1993; Striz et al, 2011) e o TNF-α, por sua vez, age estimulando a ativação de NF- κB, mantendo um ciclo de ativação celular (Vallabhapurapu & Karin, 2009). Sendo assim, apesar de não estar diretamente relacionado com o inflamassoma, TNF-α é uma importante citocina inflamatória produzida no primeiro sinal de ativação desse complexo multiproteico. Estudo recente demonstrou que o estímulo in vitro com TNF- induz, precocemente, a expressão de RNAm de NLRP3 em linhagem de adipócitos 3T3-LI que é detectada logo após uma hora de cultivo, atingindo a 66 concentração máxima 3 h após a estimulação e sugerindo que o gene NLRP3 é um gene responsivo imediato ao TNF-α. A expressão de NLRP3 induzida por TNF-α nessas células depende da via ERK, provavelmente em coordenação com a via do NF-κB (Furuoka et al., 2016). Além disso, de acordo com Bauernfeind et al. (2016), níveis sistêmicos elevados de TNF-α são responsáveis pelo aumento da expressão de NLRP3 e atividade de caspase-1 em tecidos adiposos e fígado em camundongos idosos, sugerindo que a via do inflamassoma NLRP3 tem importante papel nos processos inflamatórios estéreis. Monócitos de gestantes normotensas estimulados com HA e Hsp70 apresentam menor expressão das citocinas inflamatórias IL-1β, IL-18, TNF-α e HMGB1 em relação ao grupo das gestantes pré-eclâmpticas e de mulheres não grávidas. Essa menor expressão observada nas gestantes normotensas poderia ser decorrente da regulação exercida por IL-10 nessas células. O predomínio da citocina anti-inflamatória IL-10 na gestação normal atua na minimização dos efeitos deletérios de uma resposta inflamatória excessiva, sendo capaz de regular a resposta inflamatória que ocorre na gestação pelo controle da expressão gênica de IL-1β e TNF-α. Em trabalho anterior demonstrou-se que monócitos de gestantes pré- eclâmpticas produzem níveis endógenos de IL-10 significativamente menores do que gestantes normotensas, enquanto os valores de TNF-α encontram-se elevados (Cristofalo et al., 2013), corroborando com os achados da literatura (Azizieh et al., 2005). Em conclusão, os resultados do presente trabalho mostram que monócitos de gestantes portadoras de PE apresentam ativação endógena dos inflamassomas NLRP1 e NLRP3 e expressam níveis elevados de IL-1β, IL-18, HMGB1 e TNF-α. A ativação desses inflamassomas associou-se à maior concentração plasmática de HA nessas gestantes. O estímulo de monócitos com HA induziu maior expressão gênica de NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL-1β e HMGB1, bem como a produção de IL-1β foi mais evidente nos grupos de gestantes pré-eclâmpticas e de mulheres não grávidas. O estímulo de monócitos com Hsp70 contribuiu para produção de IL-1β e TNF-α por essas células por meio de mecanismo independente de ativação dos inflamassomas. Esses resultados sugerem a participação dessas DAMPs na resposta inflamatória sistêmica, característica da PE. O estudo de mecanismos envolvidos na ativação de monócitos por DAMPs, dependentes ou não de inflamassomas, em gestantes 67 portadoras de PE permitirá melhor compreensão dessa importante síndrome inflamatória da gestação. 5. REFERÊNCIAS American College of Obstetricians and Gynecologists. Diagnosis and management of preeclampsia and eclampsia. ACOG Practice Bulletin no. 33. Washington, DC.: ACOG; 2002; 2:229–35. Andersson U, Wang H, Palmblad K, Aveberger AC, Bloom O, Erlandsson-Harris H, Janson A, Kokkola R, Zhang M, Yang H, Tracey KJ. High mobility group protein (HMG-1) stimulates proinflammatory cytokines synthesis in human monocytes. J Exp Med. 2000; 192:565n-70. 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