2017 RODNEI DENNIS ROSSONI ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE Lactobacillus spp. DA CAVIDADE BUCAL E SUA AÇÃO PROBIÓTICA SOB Candida albicans: FORMAÇÃO DE BIOFILME, INFECÇÃO DE MODELOS INVERTEBRADOS E EXPRESSÃO DOS GENES EFG1, HWP1 e ALS1 São José dos Campos 2017 RODNEI DENNIS ROSSONI ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÂO DE Lactobacillus spp. DA CAVIDADE BUCAL E SUA AÇÃO PROBIÓTICA SOB Candida albicans: FORMAÇÃO DE BIOFILME, INFECÇÃO EM MODELOS DE INVERTEBRADOS E EXPRESSÃO DOS GENES EFG1, HWP1 E ALS1 Tese apresentada ao Instituto de Ciência e Tecnologia, Universidade Estadual Paulista (Unesp), Campus de São José dos Campos, como parte dos requisitos para obtenção do título de DOUTOR, pelo Programa de Pós-Graduação em BIOPATOLOGIA BUCAL, Área de Microbiologia e Imunologia. Orientadora: Profa. Adj. Juliana Campos Junqueira Instituto de Ciência e Tecnologia [internet]. Normalização de tese e dissertação [acesso em 2017]. Disponível em http://www.ict.unesp.br/biblioteca/normalizacao Apresentação gráfica e normalização de acordo com as normas estabelecidas pelo Serviço de Normalização de Documentos da Seção Técnica de Referência e Atendimento ao Usuário e Documentação (STRAUD). Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Profa Leila Novaes - Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação (STATI) do ICT/UNESP. Dados fornecidos pelo autor Ana Paula Mattozo Durante CRB8/6141 Rossoni, Rodnei Dennis Isolamento e caraterização de Lactobacillus spp. da cavidade bucal e sua ação probiótica sob Candida albicans: Formação de biofilme, infecção em modelos de invertebrados e expressão dos genes EFG1, HWP1 e ALS1 / Rodnei Dennis Rossoni. - São José dos Campos : [s.n.], 2017. 99 f. : il. Tese (Doutorado em Biopatologia Bucal) - Pós-graduação em Biopatologia Bucal - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Ciência e Tecnologia, São José dos Campos, 2017. Orientadora: Juliana Campos Junqueira. 1. Candida albicans. 2. Cavidade oral. 3. Interações Hospedeiro-Patógeno. 4. Biofilme. 5. Caenorhabditis elegans. I. Junqueira, Juliana Campos, orient. II. Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Ciência e Tecnologia, São José dos Campos. III. Universidade Estadual Paulista 'Júlio de Mesquita Filho' - Unesp. IV. Universidade Estadual Paulista (Unesp). V. Título. BANCA EXAMINADORA Profa. Adj. Juliana Campos Junqueira (Orientadora) Universidade Estadual Paulista (Unesp) Instituto de Ciência e Tecnologia Campus de São José dos Campos Prof. Tit. Antonio Olavo Cardoso Jorge Universidade Estadual Paulista (Unesp) Instituto de Ciência e Tecnologia Campus de São José dos Campos Profa. Dra. Silvana Soléo Ferreira dos Santos Universidade de Taubaté (UNITAU) Instituto Básico de Biociências Campus Bom Conselho Profa. Dra. Renata de Oliveira Mattos Graner Universidade de Campinas (UNICAMP) Faculdade de Odontologia Campus de Piracicaba Profa. Tit. Maria José Soares Mendes Gianinni Universidade Estadual Paulista (Unesp) Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara Campus de Araraquara São José dos Campos, 04 de dezembro de 2017. DEDICATÓRIA A Deus pela presença constante nos meus dias e por me dar confiança e saúde em buscar os meus sonhos. À minha avó, Silvia Helena da Silva por sempre estar ao meu lado em todos os momentos da minha vida. Meu porto seguro! AGRADECIMENTOS ESPECIAIS À minha orientadora, Profa. Adj. Juliana Campos Junqueira, por todos os anos de trabalho e convivência. Sou muito grato pelos dez anos trabalhados na Microbiologia ao seu lado e por me tornar mestre e doutor sob sua orientação. Pela sua paciência, dedicação, amizade e pelas oportunidades antes nunca sonhadas. Meu eterno agradecimento! Ao Prof. Tit. Antonio Olavo Cardoso Jorge, minha admiração pelo seu conhecimento e disposição em sempre ajudar. Desde a minha primeira iniciação científica na disciplina de Microbiologia sempre acompanhou meu desenvolvimento e me incentivou na vida acadêmica. Sou muito grato por ter o senhor como exemplo. Toda a minha formação profissional devo a vocês dois. Meus eternos mestres! AGRADECIMENTOS À minha família pelo amor, carinho, companheirismo e alegria em diversos momentos de minha vida. À Universidade Estadual Paulista (Unesp), na pessoa do diretor, Estevão Tomomitsu Kimpara, do Instituto de Ciência e Tecnologia de São José dos Campos, e da vice-diretora Rebeca Di Nicoló. Ao Programa de Pós-graduação em Biopatologia Bucal, na pessoa da coordenadora Profa. Adj. Luciane Dias de Oliveira e vice coordenador Prof. Dr. Mauro Pedrine Santamaria. Aos docentes do Programa de Pós-graduação em Biopatologia Bucal. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela concessão de Bolsa de estudos no país (Processo 2013/25181- 8), Bolsa BEPE (Processo 2014/12458-4) e Auxílio à Pesquisa (Processo 2015/09770-9) que possibilitou a aquisição dos materiais necessários para a realização deste trabalho. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) por financiar as minhas pesquisas que desenvolvi desde 2007, sendo quatros Iniciações Científicas, Mestrado, Doutorado e Estágio no Exterior. À Profa. Dra. Silvana Soléo Ferreira dos Santos que participou da minha vida na UNESP em vários momentos inclusive as “caronas” até Caçapava. Gratidão por ter sido seu aluno de graduação e tê-la na minha Qualificação do curso de Mestrado, Doutorado e agora na defesa da tese. À amiga Patrícia Pimentel de Barros, que sempre me apoiou e ajudou no decorrer desses quatros anos e pelas palavras de incentivo quando eu mais precisei nos Estados Unidos. A nossa amizade vai além do âmbito profissional da UNESP e sou muito grato por isso. Obrigado por tudo! Aos professores Beth Burgwyn Fuchs e Eleftherios Mylonakis por me permitir desenvolver parte desse estudo no laboratório de Doenças Infecciosas do Rhode Island Hospital, da Brown University que me proporcionou um crescimento profissional e pessoal enorme. Foi um dos maiores desafios da minha vida. Aos amigos “conquistados” durante meu estágio em Providence que pude compartilhar os momentos da minha vida tornando-os mais alegres. Muito obrigado a Soraya Eatemadpour, Noelly de Queiroz Ribeiro, Cleide Viviane Buzanello Martins e Thais Furtado Ferreira Magalhães. À amiga Marisol dos Santos Velloso, que foi minha “companheira de aventuras” nos primeiros meses nos Estados Unidos. Foi muito bom ter sua amizade e companhia naqueles dias. Muito obrigado! À amiga Fernanda Freire por estar ao meu lado dividindo os bons e não tão bons momentos da pós-graduação. Juntos no curso de mestrado, estágio no exterior e em todo doutorado. Muito obrigado pela amizade e pelo carinho de sempre! Aos meus amigos do laboratório, em especial à Jéssica Diane dos Santos, Leileane Cohn, Mirian Marcolan de Melo, Tamara Carneiro, Liliana Scorzoni, Janaína Araújo de Alvarenga, Michele Peneluppi, Simone Furgeri Godinho Vilela, Ana Carolina Chipoletti, Maíra Terra Garcia, Luciana Ruano de Oliveira Fugisaki, Lívia Mara Figueiredo, Rafaella Braga, Adeline Larceda Jorjão e Elis de Andrade Lima Zutin, por terem me dado força, amizade e carinho durante a realização deste trabalho. Ao amigo Felipe de Camargo Ribeiro pela amizade, companheirismo e por toda ajuda que tem me dado recentemente na UNESP. Sou grato por ter sua companhia! À amiga Claudia Aparecida do Carmo pela amizade sincera desde que entrei na UNESP. Muito obrigado pelo apoio e pela confiança em mim, sempre torcendo pelo meu sucesso! Aos técnicos Sérgio Giovanny Alves e Domingos Gonçalves Pontes, pela colaboração e amizade durante todo os anos que estou no Laboratório de Microbiologia e Imunologia. Aos funcionários da seção técnica de pós-graduação, Bruno Shiguemitsu, Ivan Oliveira Damasceno, Rosemary de Fátima Salgado e Sandra Mara Cordeiro, pela paciência, prontidão no atendimento, e amizade conquistada durante esses anos. Ao Carlos Alberto Guedes e Michele Ramos dos Santos por toda a ajuda, colaboração e paciência nos trâmites relativos à FAPESP. À Dra. Thais Cachuté Paradella pela ajuda das lindas fotos obtidas a partir da microscopia eletrônica de varredura. À equipe da Biblioteca pela ajuda na elaboração deste trabalho, contribuindo com o acesso ao material bibliográfico e à bibliotecária Renata Aparecida Couto Martins que orientou sua normalização. Aos meus amigos Evelyn Luzia de Souza Santos, Tania Mara da Silva, Felipe Eduardo de Oliveira, Lucélia Lemes Gonçalves, Beatriz Maria da Fonseca e Rosemary Soares de Santana. Obrigado pela amizade, as adversidades respeitadas, a sinceridade ímpar e todo carinho comigo desde sempre. Vocês são essências na minha vida! “Eu disse a uma amiga: – A vida sempre superexigiu de mim. Ela disse: – Lembre-se que você também superexige dela. Sim.” - Clarice Lispector SUMÁRIO RESUMO .................................................................................................................. 12 ABSTRACT .............................................................................................................. 13 1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 14 2 PROPOSIÇÃO ...................................................................................................... 18 2.1 Objetivo geral .................................................................................................... 18 2.1.1 Objetivos específicos ................................................................................ 18 3 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 19 3.1 Seleção de Pacientes ....................................................................................... 19 3.2 Coleta Microbiológica das Amostras .............................................................. 19 3.3 Identificação das amostras e seleção das cepas de Lactobacillus ............. 20 3.4 Cepas de Micro-organismos ............................................................................ 20 3.5 Interação de C. albicans e Lactobacillus spp. em modelos de estudo in vitro .......................................................................................................................... 21 3.5.1 Estudo dos efeitos de Lactobacillus sobre biofilmes de C. albicans por meio da contagem de UFC/mL ....................................................................... 22 3.5.1.1 Preparo da suspensão padronizada de C. albicans e Lactobacillus ..... 22 3.5.1.2 Preparo do sobrenadante da cultura de Lactobacillus ........................... 22 3.5.1.3 Formação dos biofilmes de C. albicans ................................................... 23 3.5.1.4 Determinação do número de UFC/mL ....................................................... 23 3.5.2 Estudo dos efeitos de Lactobacillus sobre a filamentação de C. albicans ................................................................................................................... 24 3.5.3 Estudo dos efeitos de Lactobacillus sobre biofilmes de C. albicans pela quantificação da biomassa total ................................................................... 25 3.5.4 Estudo dos efeitos de Lactobacillus sobre biofilmes de C. albicans pela análise de Microscopia Eletrônica de Varredura ......................................... 25 3.5.5 Avaliação da expressão dos genes alvos EFG1, HWP1, ALS3 e CPH1 de C. albicans nos biofilmes mistos com Lactobacillus ..................................... 26 3.5.5.1 Extração de RNA......................................................................................... 26 3.5.5.2 Transcrição Reversa (RT-PCR) ................................................................. 27 3.5.5.3 Reação em cadeia da Polimerase (PCR) em tempo real ......................... 27 3.6 Interação de C. albicans e Lactobacillus spp. em modelos de estudo in vivo .......................................................................................................................... 28 3.6.1 Interação de Lactobacillus com C. albicans em modelo experimental de Galleria mellonella ............................................................................................. 28 3.6.1.2 Verificação da suscetibilidade de G. mellonella à infecção por Lactobacillus ........................................................................................................... 29 3.6.1.3 Efeitos de Lactobacillus na infecção por C. albicans em G. mellonella ................................................................................................................ 29 3.6.1.4 Preparo da suspensão de C. albicans e Lactobacillus ........................... 29 3.6.1.5 Injeção de micro-organismos em G. mellonella ...................................... 30 3.6.1.6 Determinação da curva de sobrevivência da G. mellonella .................... 30 3.6.1.7 Contagem de UFC/mL na hemolinfa de G. mellonella ............................. 30 3.6.1.8 Determinação da Densidade Hemocitária ................................................ 31 3.6.1.9 Efeitos de Lactobacillus na expressão dos genes de Gallerymicina e Galiomicina relacionados a peptídeos antifúngicos ........................................... 31 3.6.1.10 Monitoramento da infecção experimental de C. albicans por análise de bioluminescência .............................................................................................. 33 3.6.2 Interação de Lactobacillus com C. albicans em modelo experimental de Caenorhabditis elegans .................................................................................... 34 3.6.2.1 Condições de Manipulação e Cultivo de C. elegans ............................... 34 3.6.2.2 Efeitos de Lactobacillus na infecção experimental por C. albicans em C. elegans - Ensaio de Sobrevivência ............................................................ 35 3.6.2.3 Estudo da filamentação de C. albicans em C. elegans tratados com Lactobacillus ........................................................................................................... 36 3.7 Forma de análise dos resultados .................................................................... 36 4 RESULTADO ........................................................................................................ 38 4.1 Coleta e identificação das amostras de Lactobacillus .................................. 38 4.2 Estudo dos efeitos de Lactobacillus sobre biofilmes de C. albicans por meio da contagem de UFC/mL .............................................................................. 42 4.3 Estudo dos efeitos de Lactobacillus sobre a filamentação de C. albicans . 46 4.4 Análise dos efeitos diretos de L. rhamnosus 5.2, L. fermentum 20.3 e L. paracasei 28.4 em biofilmes C. albicans .............................................................. 50 4.5 Interferência de L. rhamnosus 5.2, L. fermentum 20.3 e L. paracasei 28.4 nos genes de virulência de C. albicans ................................................................ 55 4.6 Efeitos de Lactobacillus na candidose experimental em G. mellonella ...... 60 4.7 Efeitos de L. paracasei 28.4 na infecção por C. albicans em modelo invertebrado de C. elegans .................................................................................... 75 5 DISCUSSÃO ......................................................................................................... 79 6 CONCLUSÃO ....................................................................................................... 88 REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 89 ANEXOS .................................................................................................................. 96 Rossoni RD. Isolamento e caraterização de Lactobacillus spp. da cavidade bucal e sua ação probiótica sob Candida albicans: Formação de biofilme, infecção em modelos de invertebrados e expressão dos genes EFG1, HWP1 e ALS1 [tese]. São José dos Campos (SP): Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Ciência e Tecnologia; 2017. RESUMO O estudo da atividade inibitória de Lactobacillus pode contribuir na descoberta de novas estratégias terapêuticas nas infecções por Candida. Nesse contexto, o objetivo desse estudo foi isolar e identificar Lactobacillus da cavidade bucal de indivíduos livres de cárie e avaliar seu potencial de inibição de C. albicans por meio de estudos in vitro e in vivo. Primeiramente, foram avaliados os efeitos de 30 isolados clínicos de Lactobacillus sobre o número de células viáveis (UFC) em biofilme de C. albicans e sobre a formação de hifas. Os isolados que obtiveram os maiores efeitos inibitórios sobre C. albicans foram selecionados para os testes de determinação da biomassa total dos biofilmes pela absorbância do cristal violeta, análise da arquitetura dos biofilmes por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e quantificação da expressão de genes de C. albicans (ALS3, HWP1, EFG1 e CPH1) por qPCR. Esses isolados também foram submetidos a estudos in vivo usando os modelos de Galleria mellonella e Caenorhabditis elegans. Para o estudo em G. mellonella, a infecção experimental foi avaliada pela curva de sobrevivência, quantificação da carga fúngica na hemolinfa, densidade hemocitária, quantificação da expressão gênica de peptídeos antifúngicos (Gallerymicina e Galiomicina) e monitoramento da infecção de C. albicans por análise de bioluminescência. No modelo de C. elegans, a infecção foi avaliada por meio dos ensaios de curva de sobrevivência e estudo da filamentação de C. albicans. Os resultados dos ensaios in vitro demonstraram que L. paracasei 28.4, L. rhamnosus 5.2 e L. fermentum 20.4 foram as cepas com maior atividade antimicrobiana sobre os biofilmes de C. albicans. Nessas cepas, todos os genes analisados foram regulados negativamente na associação com Lactobacillus quando comparados com o grupo controle. No estudo in vivo, a injeção de L. paracasei 28.4 em G. mellonella infectadas com C. albicans aumentou a sobrevida das larvas, o número de hemócitos e a expressão de peptídeos antifúngicos, reduzindo assim a UFC de C. albicans. Em C. elegans, L. paracasei 28.4 também foi capaz de aumentar a sobrevida dos vermes infectados com C. albicans e reduzir a filamentação. Conclui-se que L. fermentum 20.4, L. paracasei 28.4 e L. rhamnosus 5.2 tem potencial para serem usados como probióticos na cavidade bucal devido sua ação anti-biofilme e sua regulação negativa dos genes de virulência de C. albicans. L. paracasei 28.4 foi capaz de prolongar a sobrevida nos dois modelos experimentais infectados com C. albicans por apresentarem ação antifúngica e imunomodulatória. Palavras-chave: Lactobacillus. Candida albicans. Cavidade oral. Interações Hospedeiro-Patógeno. Biofilme. Caenorhabditis elegans. Rossoni RD. Isolation and characterization of Lactobacillus spp. from oral cavity and their probiotic action in Candida albicans: biofilm formation, infection in invertebrate models and EFG1, HWP1 and ALS1 gene expression [doctorate thesis]. São José dos Campos (SP): São Paulo State University (Unesp), Institute of Science and Technology; 2017. ABSTRACT The study of the antifungal activity of Lactobacillus may contribute to the discovery of new therapeutic strategies for Candida infections. In this context, the objective of this study was to isolate and identify Lactobacillus from the oral cavity of caries- free subjects and to evaluate its effects through in vitro and in vivo studies. First, the effects of 30 clinical isolates of Lactobacillus on the number of viable cells (CFU) in biofilms of C. albicans and on hyphae formation were evaluated. The isolates that obtained the highest inhibitory effects on C. albicans were selected for biofilm biomass determination by violet crystal absorbance, analysis of biofilm architecture by scanning electron microscopy (SEM) and quantification of the expression of C. albicans (ALS3, HWP1, EFG1 and CPH1) by real time PCR. These isolates were also submitted to in vivo studies using the Galleria mellonella and Caenorhabditis elegans models. For the study in the model of Galleria mellonella, the experimental infection was evaluated by the survival curve, quantification of the fungal load in the hemolymph, hemocitary density, the gene expression of antifungal peptides (Gallerymicin and Galiomicin) and monitoring of C. albicans infection by bioluminescence analysis. In the Caenorhabditis elegans model, the infection was evaluated by the survival curve assays and the study of C. albicans filamentation. The results of in vitro tests demonstrated that L. paracasei 28.4, L. rhamnosus 5.2 and L. fermentum 20.4 were the strains with the highest antimicrobial activity on the biofilms of C. albicans. In these strains, all analyzed genes were negatively regulated in association with Lactobacillus when compared to the control group. In the in vivo study, the injection of L. paracasei 28.4 into the G. mellonella increased survival of the larvae, the number of hemocytes and the expression of antifungal peptides, thus reducing the CFU of C. albicans. In C. elegans, L. paracasei 28.4 was also able to increase the survival of worms infected with C. albicans and reduce the filamentation. We conclude that L. fermentum 20.4, L. paracasei 28.4 and L. rhamnosus 5.2 have potential to be used as probiotics in the oral cavity due to their anti-biofilm action and their negative regulation of virulence genes of C. albicans. L. paracasei 28.4 was able to prolong survival of both experimental models infected with C. albicans for having antifungal and immunomodulatory action. Keywords: Lactobacillus. Candida albicans. Oral cavity. Host-Pathogen Interactions. Biofilm. Caenorhabditis elegans. 14 1 INTRODUÇÃO A cavidade bucal é colonizada por diferentes espécies microbianas que normalmente encontram-se organizadas em biofilmes (Jarosz et al., 2009, Wade, 2013). Os biofilmes são comunidades microbianas tridimensionais aderidas a uma superfície sólida e embebidas em uma matriz de substâncias poliméricas extracelulares mostrando características fenotípicas que os diferenciam da forma planctônica (Harriott, Noverr, 2011). Em uma comunidade microbiana heterogênea existe a comunicação entre os micro-organismos como por exemplo através de quorum sensing e a interação entre as espécies podem ser antagônicas, como a competição por mais nutrientes e consequente inibição do crescimento, ou sinérgicas estimulando o crescimento (Elias, Banin, 2012, Marsh, Zaura, 2017). Candida albicans é uma levedura comensal comumente encontrada na cavidade bucal dos seres humanos, sendo isolada entre 50-70% dos indivíduos saudáveis. Esta levedura é um patógeno oportunista que pode causar infecções recorrentes na mucosa, como também infecções sistêmicas fatais (Sanitá et al., 2011; Ruhnke, 2012; Mayer et al., 2013; Lydia Rajakumari, Saravana Kumari, 2016). Infecções na cavidade bucal por Candida spp., como candidose pseudomembranosa, eritematosa e hiperplásica, são decorrentes da formação de biofilmes compostos por leveduras, pseudohifas e hifas (Samaranayake et al., 2009, Costa et al., 2013). A formação de hifas por C. albicans é um importante fator de virulência, principalmente, para a formação de biofilme e invasão tecidual. O mecanismo molecular que regula a formação de biofilme inicia-se com a aderência dessas leveduras, conferida pelos genes da família ALS, responsáveis por aderência e agregação a outros micro-organismos. O gene HWP1 também codifica uma adesina, porém é expresso somente por hifas de C. albicans (ten Cate et al., 2009; Karkowska-Kuleta et al., 2009). Após a fase de aderência, segue-se a maturação do biofilme, conferido pela expressão do gene EFG1, que está envolvido na regulação da transição morfológica de leveduras para hifas e na habilidade de formar o corpo do biofilme (Blankenship, Mitchell, 2006, Nobile et al., 2006). Probióticos são suplementos alimentares compostos de micro-organismos vivos ou componentes de células microbianas que influenciam beneficamente a 15 saúde do hospedeiro (Fuller, 1989; Markowiak, Śliżewska, 2017). Esses benefícios devem-se principalmente à regulação da microbiota residente, modulação do sistema imunológico das mucosas pela ativação das células linfóides e produção de moléculas antimicrobianas (Herbel et al., 2013). Os lactobacilos são bactérias que colonizam a cavidade bucal e o trato gastrointestinal dos seres humanos na condição de saúde. Espécies de Lactobacillus são utilizadas como probióticos, podendo alterar a composição microbiana do biofilme ou estimular a resposta imunológica do hospedeiro (Tsai et al., 2012; Vestman et al., 2013). O uso de várias espécies de Lactobacillus como probióticos tem sido associado com a redução de doenças inflamatórias crônicas e de infecções fúngicas do trato gastrointestinal (Thein et al., 2006; Hasslof et al., 2010). Na cavidade bucal, os lactobacilos estão associados a progressão da cárie dentária por meio de suas características acidogênicas e acidúricas, por isso são frequentemente detectados em lesões de cáries profundas. Entretanto, estudos recentes, sugerem um papel benéfico adicional para os lactobacilos bucais. Determinadas cepas de Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum e Lactobacillus rhamnosus isoladas de indivíduos sem cáries foram capazes de inibir o crescimento in vitro de espécies cariogênicas como Streptococcus mutans e Streptococcus sobrinus de forma mais eficiente do que cepas de Lactobacillus isoladas de indivíduos com cárie ativa (Simark-Mattsson et al., 2007; Million, Raoult, 2013). Estudos in vivo são fundamentais para o estudo das interações microbianas, da patogenicidade de micro-organismos, e descoberta de novos agentes antimicrobianos. Um modelo animal deve reproduzir a patogênese da infecção correspondente nos seres humanos, incluindo colonização e invasão a partir de uma via específica de entrada e interação com o sistema imunológico do hospedeiro (De Repentigny, 2004; Chamilos et al., 2007). Nas últimas décadas, um grande número de modelos invertebrados, incluindo Galleria mellonella, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster e Dictyostelium discoideum, foram desenvolvidos e estão sendo utilizados para estudo da patogenicidade experimental (Arvanitis et al., 2013). Esses modelos têm proporcionado notável conhecimento em diferentes aspectos da infecção microbiana e apresentam inúmeras vantagens em relação aos modelos de mamíferos, como baixo custo na criação, facilidade de manuseio, rapidez na 16 obtenção de resultados e possibilidade de estudos em grande escala, servindo como triagem para os estudos em vertebrados, atendendo assim às questões éticas e legais do princípio dos 3Rs (Reduction, replacement e refinement), bem como da necessidade de se desenvolver métodos alternativos aos animais convencionais (Fedhila et al., 2010; Chibebe Junior et al., 2013a, 2013b; McMillan et al., 2015). Vilela et al. (2015) estudaram a interação entre Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 e Candida albicans em modelo invertebrado de G. mellonella por meio da análise de curva de sobrevivência e quantificação de UFC/mL de C. albicans na hemolinfa das larvas. Os autores verificaram que a injeção de L. acidophilus em G. mellonella infectadas por C. albicans aumentou significativamente a sobrevivência desses animais. Além disso, o número de UFC/ mL de C. albicans na hemolinfa das larvas com candidose experimental foi menor no grupo que recebeu inoculação de L. acidophilus em relação ao grupo controle, demonstrando ação protetora dessas bactérias probióticas na candidose experimental in vivo. O uso de C. elegans tem ganhado muita popularidade como modelo in vivo para uma ampla variedade de estudos de doenças infecciosas, entretanto pouco se conhece sobre os efeitos de bactérias probióticas na prevenção de infecções fúngicas e na resposta imunológica desses nemátodos. Kim e Mylonakis (2012) estudaram os efeitos de L. acidophilus NCFM em infecções bacterianas por Enterococcus faecalis e Staphylococcus aureus em C. elegans. Os autores verificaram que L. acidophilus não é patogênico para C. elegans e que as infecções induzidas nesses nemátodos diminuíram significativamente com a presença de L. acidophilus, além de prolongar a sobrevivência dos nemátodos. Apesar da abundância de interações microbianas na natureza, pouco se sabe sobre os mecanismos que determinam estas interações e sua importância para a saúde humana (Peleg et al., 2010). Se determinadas cepas de Lactobacillus podem suprimir micro-organismos patogênicos, torna-se importante a identificação dessas cepas na cavidade bucal e o estudo da sua interação com C. albicans, auxiliando assim na identificação de cepas com potencial probiótico e na descoberta de novos métodos de prevenção e controle de lesões de Candida, principalmente, em pacientes imunocomprometidos. Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi isolar e identificar cepas de Lactobacillus spp. da cavidade bucal de indivíduos livres 17 de cárie e avaliar sua ação probiótica sobre C. albicans por meio de estudos in vitro e in vivo. 18 2 PROPOSIÇÃO 2.1 Objetivo geral Isolar e identificar cepas de Lactobacillus spp. da cavidade bucal de indivíduos saudáveis livres de cárie e avaliar sua ação probiótica sobre C. albicans por meio de estudos in vitro e in vivo. 2.1.1 Objetivos específicos a) Isolar e identificar cepas de Lactobacillus da cavidade bucal de indivíduos saudáveis; b) Verificar a ação antifúngica dessas cepas sob C. albicans quanto à formação de biofilme e filamentação in vitro; c) Selecionar as cepas de Lactobacillus com maior capacidade de inibição contra C. albicans; d) Estudar a interação das cepas selecionadas com C. albicans em modelos de infecção experimental de G. mellonella e C. elegans; e) Avaliar os efeitos dessas cepas sobre a expressão dos genes EFG1, HWP1, ALS3 e CPH1 de C. albicans em modelos de biofilme in vitro. 19 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Seleção de Pacientes Esse trabalho foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos do Instituto de Ciência e Tecnologia da Universidade Estadual Paulista (Unesp) Campus de São José dos Campos e aprovado sob número de parecer 560.479 (ANEXO A). Todos os indivíduos foram informados da pesquisa e os que concordaram em participar assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (ANEXO B). Foram selecionados 41 indivíduos livres de cárie entre os alunos de graduação e pós-graduação do curso de Odontologia do Instituto de Ciência e Tecnologia da Universidade Estadual Paulista (Unesp) de São José dos Campos. Foram incluídos no estudo, indivíduos maiores de 18 anos de idade, sem distinção de sexo ou raça, sem lesões de cáries e apresentando os elementos dentários hígidos. Os indivíduos foram excluídos quando apresentaram qualquer lesão de cárie, restaurações ou ausência de elementos dentários, pois a presença de alguma dessas situações pode alterar a microbiota bucal. 3.2 Coleta Microbiológica das Amostras Amostras da saliva foram coletadas por meio de enxágue bucal com solução fisiológica tamponada com tampão fosfato (PBS) por 1 minuto. A seguir, as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 5000 rpm e o sobrenadante foi descartado. Foi adicionado 2,5 mL de PBS com o pellet e a partir dessa suspensão foram realizadas diluições seriadas e alíquotas de 0,1 mL semeadas em duplicata em pour plate em ágar Rogosa SL (Difco, Detroit, MI, EUA) por 4 dias a 37°C sob condições de microaerofilia (5% de CO2). Após o crescimento, colônias discóides sugestivas de Lactobacillus analisadas pela morfologia e coloração de Gram foram semeadas em 20 tubos de ensaio contendo ágar Man-Rogosa-Shape (MRS) (Difco, Detroit, MI, EUA) para obtenção da cultura pura e realização dos testes de identificação bioquímica. Além disso, para a confirmação por identificação molecular, essas cepas foram semeadas em Caldo Infuso Cérebro-Coração (BHI) e estocadas a -80°C. 3.3 Identificação das amostras e seleção das cepas de Lactobacillus A identificação bioquímica foi realizada pelo sistema API 50 CHL (Bio Merieux, Saint-Vulbas, França) seguindo as recomendações do fabricante. As cepas identificadas como Lactobacillus foram submetidas à Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) utilizando iniciadores da região ribossomal conforme descrito por Song et al. (2000). Os produtos amplificados foram submetidos ao sequenciamento automático, confirmando assim a identificação bioquímica das espécies de Lactobacillus. Após os testes de identificação bioquímico e genético das espécies, todas as cepas identificadas como Lactobacillus foram submetidas aos ensaios in vitro para avaliar a sua ação probiótica em biofilmes e filamentação de C. albicans. E, posteriormente foram selecionadas as cepas que obtiveram maior redução na viabilidade de C. albicans para realização dos testes in vivo e de expressão gênica. 3.4 Cepas de Micro-organismos Foram utilizadas as cepas clínicas identificadas do gênero Lactobacillus e as cepas de Candida albicans (ATCC 18804 e MLR 62). A cepa ATCC 18804 foi mantida em freezer a -80ºC no Laboratório de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Ciência e Tecnologia de São José dos Campos/UNESP e a cepa MLR 62 foi mantida em freezer a -80ºC no Laboratório de Doenças Infecciosas do Rhode Island Hospital, da Brown University. Para ativação desses micro-organismos, as cepas de C. albicans foram cultivadas em ágar Sabouraud Dextrose (Himedia Laboratories, 21 Munbai, Índia) por 48 horas a 37ºC e as cepas de Lactobacillus foram cultivadas em ágar Man, Rogosa e Sharpe (MRS) (Difco, Detroid, MI, EUA) por 48 h a 37°C sob condições de microaerofilia (5% de CO2). 3.5 Interação de C. albicans e Lactobacillus spp. em modelos de estudo in vitro Nesta primeira etapa do estudo in vitro da interação entre C. albicans e Lactobacillus, foram avaliados os efeitos de todas as cepas identificadas como Lactobacillus sobre a formação de biofilme e filamentação por C. albicans para escolha das cepas com maior efeito antifúngico. Nestes dois testes, foram avaliados os efeitos diretos das células de Lactobacillus sobre C. albicans (n=10), os efeitos indiretos de Lactobacillus sobre C. albicans (n=10), utilizando apenas o sobrenadante da cultura de Lactobacillus, além dos grupos controles com caldo MRS sobre C. albicans (n=10) e somente PBS com C. albicans (n=10), totalizando 80 ensaios por cepa de Lactobacillus, sendo 40 ensaios para o estudo em biofilme e 40 ensaios para a filamentação. Todos os ensaios realizados e número de cepas usados em cada teste estão demonstrados na Figura 1. Figura 1 – Design do estudo: distribuição dos ensaios realizados. Fonte: Elaborada pelo autor. 22 3.5.1 Estudo dos efeitos de Lactobacillus sobre biofilmes de C. albicans por meio da contagem de UFC/mL 3.5.1.1 Preparo da suspensão padronizada de C. albicans e Lactobacillus C. albicans foi cultivada a 37°C por 18 h em caldo Yeast Nitrogen Base (YNB- Difco, Detroit, MI, EUA) suplementado com glicose na concentração de 100 mM. Lactobacillus spp. foram cultivados em caldo MRS (Difco, Detroid, MI, EUA) a 37°C por 24 horas sob condições de microaerofilia (5% de CO2). Posteriormente, as células microbianas foram centrifugadas (2000 xg por 10 min), o sobrenadante foi desprezado e o sedimento foi suspenso em 6 mL de solução fisiológica tamponada com fosfato (PBS). A contagem do número de células da suspensão foi realizada através de espectrofotômetro (B582, Micronal, São Paulo, SP, Brasil) a uma concentração de 107 micro-organismos/mL para as cepas de C. albicans e Lactobacillus. 3.5.1.2 Preparo do sobrenadante da cultura de Lactobacillus Para o preparo do sobrenadante de Lactobacillus, a cepa foi incubada em caldo MRS a 37ºC por 24 horas sob condições de microaerofilia (5% de CO2). Após este período foi realizada a suspensão padronizada de 107 células por mL conforme descrito anteriormente. Um volume de 1 mL da suspensão padronizada foi transferido para um tubo falcon contendo 6 mL de caldo MRS e incubados novamente a 37ºC por 24 horas em estufa bacteriológica sob condições de microaerofilia (5% de CO2). Após este período, o caldo foi centifugado (2000 xg por 10 min) e filtrado em membrana com poros de diâmetro de 0,22 µm (MFS, Dublin, EUA). 23 3.5.1.3 Formação dos biofilmes de C. albicans Para a formação dos biofilmes foi utilizada a metodologia descrita por Thein et al. (2006) com algumas modificações. Os biofilmes foram formados no fundo da placa de microtitulação de 96 poços de fundo chato (Costar Corning, New York, NY, EUA). Para isso, inicialmente foram inoculados 100 µL da suspensão padronizada de C. albicans (107 células/mL). A placa foi incubada em agitação a 75 rpm (Quimis, Diadema, São Paulo, SP, Brasil) a 37ºC por 90 minutos para promover a adesão inicial dos micro-organismos. Após a fase de adesão, a suspensão de células foi aspirada e cada poço foi lavado duas vezes com PBS para remover as células não aderidas. Em cada poço da placa de 96 poços, foi inoculado 50 µL da suspensão padronizada de Lactobacillus ou 50 µL do sobrenadante da cultura de Lactobacillus. No grupo controle, foi inoculado 50 µL de PBS. Para a promoção do crescimento do biofilme, 50 µL de YNB acrescido de 100 mM de glicose e 50 µL de caldo BHI foram adicionados a cada poço. O caldo foi trocado a cada 24 horas. As placas foram tampadas e incubadas a 37°C em estufa de incubação com agitação de 75 rpm por 48 horas. 3.5.1.4 Determinação do número de UFC/mL O biofilme formado no fundo da placa de microtitulação de 96 poços (Costar Corning, Nova Iorque, NY, EUA) foi raspado com um palito de madeira estéril. A seguir, foi aspirado 100 µL de cada poço e transferido para um tubo falcon contendo 9,9 mL de solução fisiológica tampão fosfato (PBS). Os tubos foram homegeneizados por 30 segundos utilizando-se homogeneizador ultra-sônico (Sonoplus HD 2200 - Bandelin Eletronic, Berlin, Alemanha) com potência de 50 W, para desagregar o biofilme. A partir da solução obtida foram realizadas diluições seriadas, das quais alíquotas de 100 µL foram semeadas em placas de ágar Sabouraud dextrose com cloranfenicol. As placas de ágar Sabouraud dextrose foram 24 incubadas em estufa a 37ºC por 48 horas. Após este período, as colônias foram contadas para o cálculo de UFC/mL. 3.5.2 Estudo dos efeitos de Lactobacillus sobre a filamentação de C. albicans Para a realização desse experimento, após o crescimento em caldo, as cepas de Lactobacillus e C. albicans foram centrifugadas para o preparo de suspensões padronizadas de 107 células por mL conforme descrito no item 3.5.1.1. Foi preparado também o sobrenadante da cultura de Lactobacillus de acordo com o item 3.5.1.2. Em uma placa de cultura de células de 24 poços (Costar Corning, Nova Iorque, NY, EUA) foi adicionado 1 mL de água destilada suplementada com 10% de soro fetal bovino e 100 μL da suspensão padronizada de C. albicans. A seguir, em cada poço foi colocado 50 μL da suspensão padronizada de Lactobacillus ou 50 μL do sobrenadante da cultura de Lactobacillus. Nos grupos controle, foram colocados em cada poço 50 μL de PBS ou 50 μL de caldo MRS dependendo do grupo experimental. As placas contendo os inóculos foram incubadas a 37ºC em estufa bacteriológica na presença de 5% de CO2. Após 24 horas, 50 μL do inóculo contido em cada poço da placa de cultura de células de 24 poços (Costar Corning, Nova Iorque, NY, EUA) foi disperso sobre lâminas de vidro com os campos previamente demarcados no verso da lâmina. O material sobre a lâmina foi recoberto por lamínula e as lâminas de microscopia observadas em microscópio óptico com aumento de 40x. Foram realizados 10 ensaios para cada grupo experimental. Os ensaios foram repetidos pelo menos duas vezes em momentos distintos. As imagens foram analisadas sob o aspecto morfológico e quantitativo. Para quantificação das hifas presentes, foram analisados 10 campos microscópios em cada lâmina, sendo que foi padronizado o ponto médio de cada campo para a análise. Em cada campo microscópio foi atribuído um escore, de acordo com o número de hifas presente, atribuindo-se os seguintes escores: 0, ausência de hifas; 1, de 1 a 15; 2, de 16 a 30 e 3, mais de 30. Analisando a UFC/mL e a filamentação de C. albicans foram selecionadas as cepas de Lactobacillus que obtiveram maior potencial de inibição frente às células 25 de C. albicans. A partir desse momento todos os ensaios foram realizados utilizando apenas as cepas de Lactobacillus com maior ação inibitória contra C. albicans. 3.5.3 Estudo dos efeitos de Lactobacillus sobre biofilmes de C. albicans pela quantificação da biomassa total Após a formação do biofilme conforme descrito acima no item 3.5.1.3, a biomassa total foi quantificada pelo método colorimétrico de Cristal de Violeta (CV) descrito por Peeters et al. (2008) com modificações. Para fixação dos biofilmes, 100 μL de metanol foi adicionado (Sigma-Aldrich, São Paulo, SP, Brasil) por 15 minutos. Os sobrenadantes foram removidos e as placas foram secas overnight em temperatura ambiente. Então 100 μL de uma solução a 1% de CV foi adicionado nos poços. Após 20 minutos, o excesso de CV foi removido por lavagem com tampão PBS. Por fim, foram adicionados 150 μL de ácido acético a 33% (Sigma-Aldrich, São Paulo, SP, Brasil) nos poços para a liberação do corante e leitura da absorbância a 540 nm. Todos os passos foram realizados a temperatura ambiente. O ensaio de CV foi realizado em dois experimentos independentes com dez biofilmes por grupo. 3.5.4 Estudo dos efeitos de Lactobacillus sobre biofilmes de C. albicans pela análise de Microscopia Eletrônica de Varredura Discos de resina acrílica medindo 10 mm de diâmetro e 2 mm de espessura foram utilizados em placas de 24 poços para a formação dos biofilmes como previamente detalhado no item 3.5.1.3. Após a formação dos biofilmes, os corpos de prova foram fixados com 1 mL de glutaraldeído a 2,5% por 1 hora. Os espécimes foram desidratados com lavagens crescentes com etanol (10, 25, 50, 75 e 90%) por 20 minutos cada lavagem seguida pela imersão em álcool absoluto por 1 hora. As placas foram mantidas a 37°C por 24 horas para permitir a completa secagem dos espécimes. 26 Após a secagem, os espécimes foram transferidos para stubs de alumínio e cobertos com ouro por 160 segundos a 40 mA (Denton Vacuum Desk II, Moorestown, NJ, EUA). Os biofilmes formados foram examinados e fotografados pelo microscópio JEOL JSM5600 (JEOL Inc, Peabody, MA, EUA) pertencente a este instituto. Dois experimentos foram realizados em tempos diferentes com três biofilmes por grupo. 3.5.5 Avaliação da expressão dos genes alvos EFG1, HWP1, ALS3 e CPH1 de C. albicans nos biofilmes mistos com Lactobacillus Amostras dos biofilmes de C. albicans formados conforme item 3.5.1.3 foram submetidos à avaliação da expressão dos genes EFG1, HWP1, ALS3 e CPH1, em relação aos genes de referência (RPP2B, RIP1, LSC2, PMA). Foi realizada a avaliação dos genes alvos de C. albicans quando associado às cepas de Lactobacillus e somente C. albicans que foi utilizado como controle. As sequências dos iniciadores foram confirmadas no site do NCBI/ Gene Bank. 3.5.5.1 Extração de RNA A extração de RNA foi realizada utilizando-se o Trizol (Ambion, Inc, AM1926, Waltham, MA, EUA). Após a extração, a concentração de RNA foi quantificada pelo aparelho Nanodrop 2000c UV- Vis Spectrophotometer (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante, e os tubos armazenados no freezer a -80°C. O RNA total extraído foi tratado com DNase I, Amplification Grade (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) para que o DNA contaminante fosse removido, evitando assim, um aumento superestimado da expressão gênica. 27 3.5.5.2 Transcrição Reversa (RT-PCR) O RNA total após o tratamento com DNAse foi transcrito para cDNA utilizando o Kit SuperScript™ III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), onde 1 μg de RNA foi adicionado a um microtubo de 200 μL contendo 10 μL de mix RT (2X), 2 μL de Enzima mix e água ultra pura Depec para um volume final de 20 μL. Esta mistura foi incubada em termociclador (Mastercycler-Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) com o ciclo de: 20 minutos a 25ºC, 50ºC por 30 minutos e 85ºC por 5 minutos. Transcorrido esse ciclo, os tubos foram colocados no gelo e foi adicionado 1 μL de RNAse H e incubados por mais 30 minutos a 37ºC. O novo cDNA obtido foi armazenado a -20°C. 3.5.5.3 Reação em cadeia da Polimerase (PCR) em tempo real Os produtos da RT- PCR foram amplificados para a quantificação relativa da expressão dos genes citados acima. As reações de quantificação foram realizadas de acordo com as condições e parâmetros previamente descritos para cada um dos genes alvo. A expressão genética é apresentada como o ratio da concentração dos genes alvo, em relação à concentração do gene normalizador e representam a expressão média obtida de reações distintas de PCR em Tempo Real. Neste trabalho foram testados três genes normalizadores, sendo que, o gene normalizador escolhido teve que apresentar um Ct (cicle threshold - ou limiar) similar aos genes alvos analisados. O Ct é o ponto correspondente ao número de ciclos a partir do qual a amplificação atinge um dado limiar que permite a análise quantitativa da expressão do gene alvo avaliado. As médias dos valores de Ct, medidas em triplicata, foram utilizadas para calcular a expressão dos genes alvo com normalização a um controle interno. Os resultados foram obtidos como valores relativos da expressão gênica (com base na fórmula 2-∆∆CT) em comparação a um alvo-interno de referência, previamente selecionado, e que resulta em valor 1. O método qRT-PCR avaliou a quantidade do produto cDNA na fase exponencial da 28 reação de amplificação. Para o sistema de detecção, foi utilizado o fluoróforo SYBR® Green (Kit Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix-UDG - Invitrogen) que seguirá a seguinte reação: em um microtubo de 200 μL, foi colocado 12,5 μL de Super mix Platinum SYBR Green, 1 μL de ROX (corante de referência), 10 μM de primer foward, 10 μM de primer reverse, solução de cDNA alvo e água dietil pirocarbonato para o volume final de 25 μL. Os microtubos foram incubados em um termociclador (LineGene K- Bioer Technology) com os seguintes ciclos: 50°C por 2 minutos, seguido de desnaturação inicial a 95°C por 2 minutos e mais 40 ciclos de 95°C por 15 segundos e 60°C por 30 segundos. A detecção da fluorescência, no fim da etapa de cada ciclo da PCR, permitiu a monitoração da quantidade crescente de cDNA amplificado, sendo os dados obtidos analisados no Software do equipamento de real-time. 3.6 Interação de C. albicans e Lactobacillus spp. em modelos de estudo in vivo Nesta etapa, estudos in vivo envolvendo a interação entre C. albicans e Lactobacillus, foram avaliados nos modelos invertebrados de G. mellonella e C. elegans. Em G. mellonella, foram realizados ensaios de sobrevivência, avaliação da carga fúngica na hemolinfa das larvas, contagem de hemócitos, análise da expressão gênica de peptídeos antifúngicos e por bioluminescência. No modelo de C. elegans, foi realizado o ensaio de sobrevivência e análise da filamentação in vivo. 3.6.1 Interação de Lactobacillus com C. albicans em modelo experimental de Galleria mellonella Para o estudo neste modelo invertebrado foram utilizadas as metodologias descritas por Mylonakis et al. (2005) e Vilela et al. (2015). Foram utilizadas larvas de G. mellonella em estágio final da fase larval com peso corporal de aproximadamente 29 de 330 ± 25 mg (Vanderhorst Wholesale, St. Marys, OH, EUA). Estas foram armazenadas no escuro e utilizadas em um prazo máximo de 7 dias. 3.6.1.2 Verificação da suscetibilidade de G. mellonella à infecção por Lactobacillus Antes do estudo da interação de C. albicans e Lactobacillus, foi realizada uma análise da suscetibilidade de G. mellonella à infecção por Lactobacillus para determinação da concentração sub-letal de Lactobacillus nesses insetos. Para isso, foram inoculadas em G. mellonella várias suspensões padronizadas de Lactobacillus nas concentrações entre 105 a 109 células/larva. Para cada concentração inoculada, foi utilizado um grupo de 16 larvas. As suspensões padronizadas de Lactobacillus foram preparadas de acordo com o item 3.5.1.1. Um inóculo de 10 µL de cada suspensão padronizada foi injetado em G. mellonella para determinação da curva de sobrevivência. 3.6.1.3 Efeitos de Lactobacillus na infecção por C. albicans em G. mellonella 3.6.1.4 Preparo da suspensão de C. albicans e Lactobacillus C. albicans foi cultivada a 37°C por 18 horas em caldo Yeast Peptone Dextrose (YPD- Difco, Detroit, MI, EUA). A seguir, as células foram centrifugadas a 2000 xg por 10 minutos, sendo o sobrenadante descartado. O depósito foi ressuspendido em PBS e homogeneizado em agitador de tubos por 30 segundos. Esta lavagem das células foi repetida por mais 2 vezes. As densidades celulares de C. albicans foram ajustadas em 108 células/mL por meio de hemocitômetro. A suspensão padronizada de Lactobacillus foi realizada conforme descrito no item 3.5.1.1 na concentração sub-letal determinada nesse estudo. 30 3.6.1.5 Injeção de micro-organismos em G. mellonella Um inóculo de 10 μL da suspensão padronizada de Lactobacillus foi injetado com auxílio de seringas de precisão (Hamilton Inc., Manitowoc, WI, EUA) na hemolinfa de cada larva através da última proleg esquerda. Após uma hora, dez microlitros da suspensão padronizada de C. albicans foi inoculado na última proleg direita. Para os grupos com infecção por um único micro-organismo, 10 μL da suspensão do micro-organismo foi inoculada na última proleg esquerda e o mesmo volume de PBS na última proleg direita. Para cada micro-organismo foi utilizada uma seringa Hamilton. Em todos os experimentos foi realizado um grupo inoculado apenas com PBS para acompanhar o estado de saúde das larvas de G. mellonella durante todo o experimento. 3.6.1.6 Determinação da curva de sobrevivência da G. mellonella Para determinação da curva de sobrevivência, nos grupos de interação as células de Lactobacillus foram injetadas na última proleg esquerda das larvas 1 hora antes da inoculação das células de C. albicans. Após a inoculação, as larvas foram armazenadas em placas de Petri e incubadas a 37ºC. O número de G. mellonella mortas foi anotado diariamente durante 7 dias. As larvas foram consideradas mortas quando não apresentarem nenhum movimento ao toque. A curva de morte e estimativa das diferenças na sobrevivência foi determinada pelo teste de Log-rank (Mantel-Cox). 3.6.1.7 Contagem de UFC/mL na hemolinfa de G. mellonella Para quantificar a presença de C. albicans na infecção em G. mellonella, foram realizados experimentos com a eutanásia de larvas nos tempos de 4, 8 e 24 31 horas após a infecção, nos seguintes grupos experimentais: Interação Lactobacillus e C. albicans e grupo controle com C. albicans e PBS. Para cada grupo e tempo foram utilizados quatro pools de 4 larvas para coletar hemolinfa suficiente e prosseguir com as diluições seriadas, totalizando 96 larvas infectadas para esse ensaio. Em cada tempo, as larvas foram cortadas com bisturi no sentido céfalo caudal e espremidas para retirada da hemolinfa que foi colocada em um microtubo. A partir do pool da hemolinfa das larvas, foram feitas diluições seriadas e semeadas em placas de Petri contendo ágar Sabouraud dextrose com cloranfenicol para C. albicans. As placas foram incubadas a 37ºC por 48 horas. Após este período, as colônias foram contadas para o cálculo de UFC/larva. 3.6.1.8 Determinação da Densidade Hemocitária Para este estudo foi utilizada a metodologia descrita por Mylonakis et al. (2005). Grupos de 16 larvas foram infectados para cada grupo experimental conforme descritos no item 3.7.4.3 e incubadas a 37°C durante 4, 8 e 24 horas. A hemolinfa de cada larva foi coletada separadamente em microtubos e diluída 1:10 em PBS e as células foram contadas utilizando hemocitômetro. Como o experimento foi realizado em triplicata, para cada grupo foram utilizadas 16 larvas, totalizando 144 larvas infectadas para todos os ensaios. 3.6.1.9 Efeitos de Lactobacillus na expressão dos genes de Gallerymicina e Galiomicina relacionados a peptídeos antifúngicos O RNA larval foi extraído usando TRIzol (Ambion, Inc., Carlsbad, CA, EUA) como recomendado pelo fabricante nos tempos 4, 8 e 24 horas após a injeção de Lactobacillus. No total, 2 mL de TRIzol foi adicionado em um tubo de 15 mL contendo o tecido larval congelado e homogeneizado e incubado em temperatura 32 ambiente por 10 minutos. Subsequentemente, 400 μL de clorofórmio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi adicionado e os tubos foram centrifugados a 12.000 xg por 15 minutos a 4°C. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e 1 mL de isopropanol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi adicionado. Após a centrifugação, o pellet obtido foi lavado com etanol a 70% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), centrifugado novamente e resuspenso em 50 μL de água livre de nuclease (Ambion Inc., Carlsbad, CA, EUA). A concentração, pureza e qualidade do RNA foram verificados utilizando o NanoVue Plus spectrophotometer (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA, EUA). O RNA extraído total (1 μg) foi transcrito em DNA complementar (cDNA) utilizando Verso cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, MA, EUA) de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. Os primers para os genes que codificam β-actina e Galiomicina foram desenhados pelo autor da tese. Os primers de Gallerymicina foram descritos e usados com indicado por Bergin et al. (2006) (Quadro 1). Os cDNAs transcritos foram amplificados e quantificados relativamente na expressão dos genes de Galiomicina e Gallerymicina em relação do gene de referência (β-actina). Quadro 1 – Primers usados para amplificar as regiões dos genes envolvidos na resposta imune de G. mellonella e um gene de referência Gene Sequência 5’-3’ Bp* Referência Galiomicina F TCCAGTCCGTTTTGTTGTTG 123 Este autor Galiomicina R CAGAGGTGTAATTCGTCGCA 123 Este autor Gallerymicina F GAAGATCGCTTTCATAGTCGC 175 Bergin et al., (2006) Gallerymicina R TACTCCTGCAGTTAGCAATGC 175 Bergin et al., (2006) β-actina F ACAGAGCGTGGCTACTCGTT 104 Este autor β-actina R GCCATCTCCTGCTCAAAGTC 104 Este autor F indica um primer forward. R indica um primer reverse. *Par de base (Tamanho do fragmento). Fonte: Elaborada pelo autor. 33 O método de qPCR foi aplicado para avaliar o cDNA na fase exponencial da reação de amplificação. O sistema de detecção, iTaq™ Universal SYBR® Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, CA, EUA), foi utilizado na seguinte reação: 5 μL de iTaq Universal SYBR Green (2x), 300 nM do primer forward, 300 nM primer reverse, 2 μL de cDNA (diluído 1:10) e 2 μL de água livre de nuclease (Ambion Inc., Carlsbad, CA, EUA) para obter um volume final de 10 μL em cada poço numa placa de 96 poços (Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, CA, EUA). Como controle negativo, todos os reagentes foram adicionados nos últimos poços das placas com exceção do cDNA e por fim as placas foram seladas utilizando um adesivo óptico (Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, CA, EUA). Subsequentemente, as placas foram lidas em um aparelho CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, CA, EUA). Os seguintes parâmetros foram utilizados 95°C por 2 minutos para uma denaturação inicial seguido de 40 ciclos de 95°C por 15 segundos e 60°C por 30 segundos. Após o fim do último ciclo, as amostras foram analisadas pela dissociação da curva de melting. O método 2- ΔΔCT foi utilizado para analisar as mudanças relativas na expressão dos genes no experimento de RT-PCR (Livak, Schmittgen, 2001). 3.6.1.10 Monitoramento da infecção experimental de C. albicans por análise de bioluminescência As larvas foram infectadas conforme o item 3.6.1.5. Após 4 e 8 horas de infecção por C. albicans, o monitoramento em tempo real da candidose experimental foi realizado utilizando o sistema de imagem IVIS® Lumina Series III (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA) para a obtenção das imagens bioluminescentes. Este aparelho detecta e quantifica a emissão dos fótons emitidos pela célula fúngica, em vermelho (maior captação de fotóns) e azul (menor captação). Neste ensaio, a infecção experimental por C. albicans foi realizada com a cepa MLR62 bioluminescente, que expressa constitutivamente a proteína fluorescente verde (GFP). Primeiramente foi obtido uma imagem em escala de cinza (sem bioluminescência) de cada placa para normalizar os dados, em seguida pela imagem bioluminescente da mesma placa, e 34 após isso o sinal bioluminescente foi quantificado com dados de calibração absoluta: fotón s-1 cm-2 sr-1, usando o software do IVIS. Nesse ensaio foi comparado o grupo controle de larvas infectadas por C. albicans com o grupo de larvas que receberam profilaticamente uma injeção de Lactobacillus. 3.6.2 Interação de Lactobacillus com C. albicans em modelo experimental de Caenorhabditis elegans Para os ensaios de C. elegans foram utilizadas as metodologias descritas por Oh et al. (2012) e Kim e Mylonakis (2012). Em todos os ensaios experimentais, foram induzidas infecções em C. elegans pela associação de Lactobacillus com C. albicans. Como controle, infecções monoespécies também foram induzidas nos nemátodos pela inoculação isolada de C. albicans ou Lactobacillus. 3.6.2.1 Condições de Manipulação e Cultivo de C. elegans Foi utilizada a cepa de C. elegans AU37 glp-4 (bn2); sek-1 (km4). Essa cepa é comumente usada para testes de virulência, pois a mutação glp-4 gera nematodos estéreis a 25°C, mantendo a amostra constante durante todo experimento. Entretanto, uma única mutação em glp-4 torna os ensaios muito longos devido a maior longevidade desses invertebrados, o que poderia gerar algumas variáveis deixando o resultado dos testes não confiáveis. Com isso, a mutação em sek-1 torna os testes viáveis, pois este gene codifica uma p38 MAPK importante para a resposta celular, tonando esses nemátodos mais sensíveis as infecções experimentais (Mylonakis et al., 2005). C. elegans foram cultivados em placas de Petri com meio de cultura de nemátodo (NGM) com Escherichia coli OP50 semeada previamente, a qual foi sua fonte de alimento. Este meio de cultura foi composto de 3 g de NaCl2, 2,5 g de peptona, 17 g de ágar, 1 mL de colesterol, 1 mL de CaCl2 1M, 1 mL de MgSO4 1 M e 35 25 mL de tampão KHPO4 para 1000mL de água destilada. Previamente a realização de cada ensaio, os nemátodos foram lavados 2 vezes com tampão M9, composto por 3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 5 g de NaCl e 1000 mL de água destilada. 3.6.2.2 Efeitos de Lactobacillus na infecção experimental por C. albicans em C. elegans - Ensaio de Sobrevivência Primeiramente, C. elegans foram cultivados em placas de NGM, com uma cultura prévia de 12 horas de E. coli OP50, por 60 horas a 25°C para atingir o estágio de desenvolvimento denominado “Young adults”, ideal para trabalhar com C. albicans nesse modelo invertebrado. Decorrido esse tempo, os nemátodos foram lavados 2 vezes com tampão M9 e 3 vezes com caldo S, composto de 5,85 g NaCl, 1 g K2HPO4, 6 g KH2PO4, 1 mL colesterol (5 mg/mL em etanol), para 1000 mL de água destilada, através de centrifugação (1100 rpm durante 30 segundos). A fim de estudar os efeitos de Lactobacillus na candidose experimental em C. elegans, as cepas de Lactobacillus foram cultivadas em caldo MRS (Difco, Detroit, MI, EUA) a 37°C por 18 horas. A seguir a cultura bacteriana foi centrifugada e lavada 2 vezes com o meio M9 afim de padronizar a suspensão em 109 UFC/mL. Um inóculo de 500 µL da suspensão padronizada de Lactobacillus foi espalhado sobre uma placa de NGM. Placas de NGM acrescidas com E. coli OP50 foram utilizadas como controle. Os nemátodos foram primeiramente infectados por Lactobacillus e após 2 horas por C. albicans. Desse modo, os nemátodos foram colocados em placas de ágar NGM previamente condicionadas com Lactobacillus e incubados a 25°C por 2 horas. Decorrido este período, os nemátodos foram lavados com tampão M9 e colocados em placas de Brain Heart Infusion (BHI – Difco, Detroit, MI, EUA) contendo C. albicans (25°C por 2 horas). A seguir, os nemátodos infectados foram transferidos para placas de cultura de células de 24 poços contendo 2 mL de meio liquído (80% de M9 e 20% de BHI). As placas foram seladas e incubadas a 25ºC por 8 dias. Os nemátodos foram observados diariamente em estereomicroscópio e foram considerados mortos quando não apresentarem nenhum movimento ao toque 36 por agulha de platina. Foram utilizados aproximadamente 50 nemátodos por grupo experimental. A curva de morte e estimativa das diferenças na sobrevivência foi determinada pelo teste de Log-rank (Mantel-Cox). 3.6.2.3 Estudo da filamentação de C. albicans em C. elegans tratados com Lactobacillus Primeiramente os nemátodos de C. elegans foram infectados por Lactobacillus por um período de 4 horas a 25ºC e posteriormente, foi realizado infecção de C. elegans por C. albicans. Para isso, os nemátodos foram colocados para se alimentarem do crescimento de C. albicans na superfície do ágar BHI (Difco, Detroit, MI, EUA) contendo kanamicina (45 μg/mL), ampicilina (100 μg/mL) e estreptomicina (100 μg/mL), sendo incubados a 25°C por 4 horas. A seguir, os nemátodos foram lavados com Tampão M9 e transferidos por pipetagem (aproximadamente 50 nemátodos) para cada poço das placas de cultura de células de 6 poços (Costar Corning, Nova Iorque, NY, EUA) contendo 2 mL de meio liquído (80% de M9 e 20% de BHI). As placas foram incubadas a 25°C e analisadas após 60 horas para observação de nemátodos com filamentos de C. albicans. Essa análise foi feita em estereomicroscópio (Nikon SMZ645, Tóquio, Japão), procurando- se observar uma ruptura na cutícula do nemátodo pela filamentação de C. albicans no aumento de 50x. Foram comparadas as diferenças na filamentação dos nemátodos entre os grupos com infecções entre Lactobacillus e C. albicans e infecções somente com C. albicans. 3.7 Forma de análise dos resultados Os ensaios in vitro com os biofilmes de C. albicans (Contagem de UFC/mL; Análise da biomassa total), a comparação da expressão gênica dos genes de virulência de C. albicans, a contagem do número de Candida na hemolinfa das 37 larvas (UFC/larvas) e a filamentação de C. elegans foram analisados pelo teste t de student. Os escores obtidos no ensaio de filamentação in vitro foram comparados utilizando os testes Kruskal-Wallis e Dunn. As curvas de sobrevivência de G. mellonella e C. elegans foram analisadas pelo teste de Kaplan-Meier. A contagem de hemócitos e a expressão gênica dos peptídeos antifúngicos produzidos por G. mellonella foram analisadas pelo teste de ANOVA e Tukey. Todos os testes estatísticos foram realizados no programa GraphPad Prism statistical software (GraphPad Software, Inc., California, CA, EUA) e um p valor ≤ 0,05 foi considerado significante. 38 4 RESULTADO 4.1 Coleta e identificação das amostras de Lactobacillus Foram coletadas amostras do lavado bucal de 41 indivíduos livres de cárie e semeados em pour plate em ágar Rogosa, no entanto somente 66% (27) dos participantes possuíram crescimento sugestivo de Lactobacillus nas placas (Figura 2). O crescimento das colônias de Lactobacillus no meio de cultura está demonstrado na Figura 3. Figura 2 – Prevalência de Lactobacillus spp. da cavidade bucal de indivíduos livres de cárie Fonte: Elaborada pelo autor. 39 Figura 3 – Crescimento de colônias sugestivas de Lactobacillus em pour plate em ágar Rogosa Fonte: Elaborada pelo autor. A partir do crescimento das colônias discóides nas placas de ágar Rogosa, foram obtidas culturas puras, totalizando 45 isolados. Foi realizada a análise da morfologia pela coloração de GRAM para todos os isolados. Entretanto somente 30 dos isolados foram identificados pelo sistema API 50 CHL e pela PCR pois eram bacilos Gram-positivos, incluindo as seguintes espécies: 23 isolados clínicos de Lactobacillus paracasei, 5 de Lactobacillus rhamnosus e 2 amostras de Lactobacillus fermentum. A distribuição das espécies identificadas está demonstrada na Figura 4. 40 Figura 4 – Distribuição das espécies de Lactobacillus dos 30 isolados clínicos identificados por biologia molecular Fonte: Elaborada pelo autor. Os ensaios realizados para a identificação bioquímica pelo sistema API 50 CHL estão ilustrados na Figura 5. Figura 5 – Leitura das galerias do API 50 CHL: Coloração azul – negativo; Coloração amarela: positivo Fonte: Elaborada pelo autor. 41 As provas de identificação molecular pela técnica de PCR estão representadas, respectivamente, nas Figuras 6 e 7. Figura 6 – Gel de agarose a 2% em 0,5x TBE corado por brometo de etídio Legenda: PCR multiplex para identificação de Lactobacillus spp. Fragmento de 400 pb obtido para as espécies de L. paracasei e L. rhamnosus e de 350 pb para as espécies L. plantarum e L. fermentum. Can. 1- marcador de peso molecular Ladder 100 pb (M); Can. 2- amostra 1.1; Can. 3- amostra 3.1; Can. 4- amostra 4.2; Can. 5- amostra 5.2; Can. 6- amostra 6.2; Can. 7- amostra 7.5; Can. 8- amostra 8.4; Can. 9 amostra 10.5; Can. 10- amostra 11.6; Can. 11- amostra 13.1; Can. 12- amostra 14.5; Can 13- amostra 15.8; Can 14- Lpa- L. paracasei ATCC; Can. 15- Lpla- L. plantarum ATCC; Can. 16- CN- Controle negativo. Fonte: Elaborada pelo autor. M 1.1 3.1 4.2 5.2 6.2 7.5 8.4 10.5 11.6 13.1 14.5 15.8 Lpa Lpla CN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 42 Figura 7 - Gel de agarose à 2% em 0,5x TBE corado por brometo de etídio Legenda: PCR multiplex específico para identificação das espécies de L. paracasei e L. rhamnosus com os fragmentos de 312 pb e 113 pb, respectivamente. Can. 1- marcador de peso molecular Ladder 100pb (M). Amostras identificadas como L. paracasei - Can. 2- amostra 1.1 Can. 3- amostra 3.1; Can. 4- amostra 4.2; Can. 6- amostra 6.2; Can. 7- amostra 7.5; Can. 8- amostra 8.4; Can. 9- amostra 10.5; Can. 10- amostra 11.6; Can. 12- amostra 15.8; Amostras identificadas como L. rhamnosus - Can. 5- amostra 5.2; Can. 11- amostra 13.1; Can. 13- amostra 19.9; Can. 14- L. rhamnosus ATCC (113pb); Can. 15- L. paracasei ATCC (312pb); Can. 16- CN- Controle negativo. Fonte: Elaborada pelo autor. 4.2 Estudo dos efeitos de Lactobacillus sobre biofilmes de C. albicans por meio da contagem de UFC/mL Após o isolamento e identificação de todos os isolados, foi estudada a interação de C. albicans e Lactobacillus spp. em modelos de estudo in vitro (biofilme e filamentação) e selecionadas as amostras clínicas de Lactobacillus que obtiveram melhor ação inibitória contra C. albicans para a realização dos ensaios de expressão gênica, a análise da biomassa e por MEV. Primeiramente, foi realizado o estudo da formação do biofilme de C. albicans associado com as células de Lactobacillus (efeito direto) ou seu sobrenadante (efeito indireto) e foi verificado uma redução na contagem de UFC/mL de C. albicans diferente para cada espécie e amostra clínica testada. A redução da UFC/mL de C. albicans para o grupo célula variou entre 0,72 M 1.1 3.1 4.2 5.2 6.2 7.5 8.4 10.5 11.6 13.1 15.8 19.9 Lr Lp CN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 43 Log a 0,01 Log e para o grupo sobrenadante foi de 0,68 Log a 0,06 Log (Tabela 1). Para comprovar se a composição do caldo MRS da cultura de Lactobacillus poderia ter ação sobre C. albicans e, portanto, interferir no experimento com o sobrenadante da cultura de Lactobacillus, foi realizado junto com os grupos acima mais um grupo, o grupo controle C. albicans e caldo MRS. Os resultados demonstraram que a utilização apenas do caldo MRS em substituição ao sobrenadante não promoveu inibição na contagem de UFC/ mL (Log) de C. albicans para todas as amostras clínicas estudadas. Tabela 1- Média do número de UFC/mL (log10) obtidas a partir da contagem de C. albicans nos biofilmes do Grupo Controle C. albicans e PBS, Grupo Controle C. albicans e caldo MRS, Grupo Interação C. albicans e célula de Lactobacillus e Grupo Interação C. albicans e sobrenadante da cultura de Lactobacillus (continua) Amostra C. albicans e PBS (n=10) C. albicans e MRS (n=10) C. albicans e célula de Lactobacillus (n=10) C. albicans e sobrenadante de Lactobacillus (n=10) Valor de p* 1.1 7,79 7,74 7,77 7,78 0,8900 3.1 7,79 7,74 7,58 7,62 0,0100 4.2 7,76 7,79 7,48 7,44 0,0001 5.2 7,69 7,62 7,26 7,27 0,0001 6.2 7,79 7,74 7,79 7,73 0,7100 7.5 7,67 7,65 7,37 7,26 0,0001 8.4 7,67 7,57 7,57 7,47 0,2490 10.5 7,67 7,57 7,45 7,51 0,0130 11.6 7,76 7,79 7,63 7,57 0,0300 13.1 7,69 7,62 7,40 7,30 0,0001 14.5 7,67 7,57 7,40 7,26 0,0700 15.8 7,67 7,57 7,52 7,42 0,0063 16.4 7,67 7,57 7,37 7,31 0,0006 17.1 7,67 7,61 7,42 7,54 0,0040 44 Tabela 1- Média do número de UFC/mL (log10) obtidos a partir da contagem de C. albicans nos biofilmes do Grupo Controle C. albicans e PBS, Grupo Controle C. albicans e caldo MRS, Grupo Interação C. albicans e célula de Lactobacillus e Grupo Interação C. albicans e sobrenadante da cultura de Lactobacillus (conclusão) Amostra C. albicans e PBS (n=10) C. albicans e MRS (n=10) C. albicans e célula de Lactobacillus (n=10) C. albicans e sobrenadante de Lactobacillus (n=10) Valor de p* 19.3 7,71 7,69 7,37 7,33 0,0001 19.9 7,72 7,69 7,17 7,05 0,0001 20.3 7,69 7,69 7,37 7,48 0,0001 20.4 7,71 7,69 7,25 7,12 0,0001 21.4 7,76 7,79 7,54 7,65 0,0100 23.4 7,76 7,79 7,51 7,47 0,0001 24.1 7,67 7,61 7,41 7,53 0,0060 25.4 7,67 7,57 7,38 7,33 0,0003 26.1 7,72 7,69 7,24 7,18 0,0001 27.1 7,72 7,69 7,21 7,04 0,0001 28.4 7,72 7,69 7,00 7,09 0,0001 30.1 7,79 7,74 7,51 7,48 0,0001 31.4 7,71 7,69 7,45 7,27 0,0006 36.4 7,67 7,57 7,40 7,52 0,0173 37.1 7,67 7,61 7,45 7,48 0,0080 39.2 7,67 7,61 7,66 7,61 0,8250 *Valor de p obtido na comparação do grupo controle C. albicans e PBS, grupo controle C. albicans e MRS, Interação C. albicans e célula de Lactobacillus e Interação C. albicans e sobrenadante da cultura de Lactobacillus (Teste ANOVA, p ≤ 0,05) Fonte: Elaborada pelo autor. O percentual de redução da UFC/mL de C. albicans para os grupos célula e sobrenadante comparado com o grupo controle (PBS) foi calculado para todos isolados clínicos conforme mostrado na Figura 8. Com a finalidade de tornar mais didático a escolha das cepas que obtiveram maior redução contra C. albicans na 45 formação de biofilme as amostras foram colocadas no gráfico em ordem crescente de redução de C. albicans (Figura 8). Figura 8 – Percentual de redução expresso em valores médios (UFC/mL) mostrando a viabilidade de C. albicans submetidas aos grupos célula e sobrenadante da cultura de Lactobacillus spp. em relação ao grupo controle Fonte: Elaborada pelo autor. Analisando a figura acima (Figura 8) podemos verificar que os isolados clínicos que tiveram melhor ação inibitória contra C. albicans foram: 28.4 (redução de 78,6% para o grupo célula e 73,54% para grupo sobrenadante), 25.4 (72,37%, 75,28%), 5.2 (69%, 59,50%), 19.9 (67,22%, 77,48%), 26.1 (66,80%, 68,58%), 27.1 (66,75%, 77,78%), 20.4 (64,60%, 71,82%), 16.4 (53,46%, 56,37%), 19.3 (53%, 58%) e 20.3 (52,31%, 32,53%) para os grupos célula e sobrenadante respectivamente. Podemos verificar também que das 10 cepas com maior ação inibitória contra C. albicans, 60% foram da espécie L. paracasei mostrando um possível potencial probiótico dessa espécie. 46 4.3 Estudo dos efeitos de Lactobacillus sobre a filamentação de C. albicans A análise da filamentação in vitro foi visualizada em microscopia óptica com aumento de 40x após a incubação de C. albicans por 24 horas em condições de microaerofilia (5% de CO2). A presença de hifas de C. albicans nos diferentes grupos experimentais foi analisada quanto aos aspectos morfológicos e quantitativos. Quanto à morfologia, analisando as imagens de alguns isolados podemos perceber que o grupo controle C. albicans e PBS e o grupo interação C. albicans e célula de Lactobacillus apresentaram morfologia semelhante com maior número de hifas em detrimento a presença de leveduras ou pseudohifas (Figura 9A e 9B). Já no grupo interação C. albicans e sobrenadante de Lactobacillus, verificou-se a presença de várias leveduras e um número reduzido de hifas comparado ao grupo controle C. albicans e PBS (Figura 9C). Figura 9- Microscopia óptica da filamentação de C. albicans in vitro Legenda: A) Grupo controle C. albicans e PBS; B) Grupo interação C. albicans e célula de Lactobacillus. C) Grupo interação C. albicans e sobrenadante de Lactobacillus; Verificam-se nas imagens A e B morfologia semelhante com presença predominante de hifas e na imagem C presença de hifas e leveduras, aumento original: 40x. Fonte: Elaborada pelo autor. 47 Para verificar se a composição do caldo MRS mesmo sem a presença dos produtos obtidos a partir do crescimento bacteriano teria algum efeito sobre o aspecto morfológico da filamentação de C. albicans in vitro, foi realizado junto com o experimento comparando com grupo controle C. albicans e PBS um o grupo controle C. albicans e caldo MRS. Os resultados demonstraram que não houve diferença entre os grupos controle mostrando que o caldo MRS não altera a morfologia de C. albicans (Tabela 2). No geral, no estudo da filamentação in vitro de C. albicans associado com as células de Lactobacillus (efeito direto) ou seu sobrenadante (efeito indireto) foi verificado que 82% (23) dos isolados conseguiram reduzir a quantidade de hifas de C. albicans de forma variável de acordo com a espécie e amostra clínica testada conforme mostrado na figura 10. Tabela 2- Mediana obtida a partir da contagem do número de hifas de C. albicans presentes após 24 horas da indução da filamentação in vitro (continua) Amostra C. albicans e PBS (n=10) C. albicans e MRS (n=10) C. albicans e célula de Lactobacillus (n=10) C. albicans e sobrenadante de Lactobacillus (n=10) Valor de p* 1.1 3 3 2 2 0,1359 3.1 3 3 2 2 0,2164 4.2 3 3 2 2 0,1033 5.2 3 3 1 1 0,0010 6.2 3 3 2 3 0,6632 7.5 3 3 3 2 0,0627 8.4 3 3 2 3 0,2102 10.5 3 3 3 3 0,8243 11.6 3 3 3 2 0,6632 13.1 3 3 2 2 0,0010 14.5 3 3 3 2 0,1860 15.8 3 3 2 2 0,0478 16.4 3 3 2 2 0,0478 48 Tabela 2- Mediana obtida a partir da contagem do número de hifas de C. albicans presentes após 24 horas da indução da filamentação in vitro (conclusão) Amostra C. albicans e PBS (n=10) C. albicans e MRS (n=10) C. albicans e célula de Lactobacillus (n=10) C. albicans e sobrenadante de Lactobacillus (n=10) Valor de p* 17.1 3 3 3 3 0,4900 19.3 3 3 2 2 0,0090 19.9 3 3 1 1 0,0030 20.3 3 3 2 2 0,0488 20.4 3 3 2 2 0,0297 21.4 3 3 3 3 0,8904 23.4 3 3 2 2 0,4888 24.1 3 3 2 3 0,6632 25.4 3 3 2 2 0,0111 26.1 3 3 2 2 0,0988 27.1 3 3 1 1 0,0018 28.4 3 3 1 1 0,0080 30.1 3 3 1 2 0,0072 31.4 3 3 2 2 0,2839 36.4 3 3 3 2 0,2102 37.1 3 3 2 2 0,0478 39.2 3 3 3 3 0,4983 *Valor de p obtido na comparação do grupo controle C. albicans e PBS, grupo controle C .albicans e MRS, Interação C. albicans e célula de Lactobacillus e Interação C. albicans e sobrenadante da cultura de Lactobacillus (Teste KRUSKAL-WALLIS, p ≤ 0,05) Fonte: Elaborada pelo autor. 49 Figura 10 – Quantificação de hifas no teste de filamentação de C. albicans in vitro. Fonte: Elaborada pelo autor. Analisando a figura 10 podemos verificar que os isolados clínicos que tiveram melhor ação inibitória contra formação de hifas de C. albicans (escore 1 para ambos os grupos interação quando comparados ao grupo controle) foram: 5.2, 19.9, 27.1, 28.4 e 30.1. Já as cepas 25.4, 20.4, 26.1, 19.3 e 16.4 obtiveram escore 2 para ambos os grupos interação quando comparados ao grupo controle. Com esses resultados verificamos que das cepas com maior ação inibitória contra hifas de C. albicans, 60% foram L. paracasei concordando com os resultados encontrados no estudo do biofilme. Com a finalidade de elucidar a interferência dos isolados clínicos de Lactobacillus na formação do biofilme de C. albicans, nós realizamos ensaios de quantificação da biomassa total, microscopia eletrônica de varredura e qPCR para avaliar o nível de expressão de genes relacionados a formação de biofilme, filamentação e adesão. Para os próximos ensaios utilizamos as cepas L. paracasei 28.4, L. rhamnosus 5.2 e L. fermentum 20.4, essa escolha foi baseada nos isolados clínicos com maior capacidade de redução da UFC/mL do biofilme de C. albicans de cada espécie identificada, conforme demonstrado na Figura 8. 50 4.4 Análise dos efeitos diretos de L. rhamnosus 5.2, L. fermentum 20.3 e L. paracasei 28.4 em biofilmes C. albicans Esses três isolados reduziram significativamente a UFC/mL de C. albicans, com 0,72 Log de redução para 28.4 (p=0.0001), 0,5 Log para 5.2 (p=0.0001) e 0,45 Log para 20.4 (p=0.0001). O grupo com o sobrenadante de Lactobacillus reduziu a UFC de C. albicans em 0,66 Log para a amostra 28.4 (p=0.0001), 0,44 Log para 5.2 (p=0.0001) e 0,6 Log para 20.4 (p=0.0001) (Figura 11). Figura 11 – Contagem de UFC/mL de C. albicans em biofilmes formados in vitro. Legenda: Média e desvio padrão do número da UFC/mL (Log) de C. albicans no biofilme do grupo controle (C. albicans + PBS) e nos grupos com células de Lactobacillus ou seu sobrenadante. A. Interação de C. abicans e células de Lactobacillus. Houve diferença estatisticamente significante entre todos grupos analisados (p=0.0001); B. Interação de C. abicans e sobrenadante de Lactobacillus. Houve diferença estatisticamente significante entre todos os grupos analisados (p=0.0001); O teste utilizado foi o t-student. Fonte: Elaborada pelo autor. 51 Com a finalidade de quantificar a biomassa total do biofilme, nós também realizamos o ensaio colorimétrico com o Cristal Violeta para avaliar se os Lactobacillus podem afetar a estrutura do biofilme de C. albicans. Os biofilmes formados por C. albicans e células de Lactobacillus (Grupo interação) exibiram uma redução significante na biomassa comparado com o grupo controle formado apenas por C. albicans. Em relação aos efeitos indiretos dos Lactobacillus, a presença do seu sobrenadante também reduziu a biomassa total (Figura 12). Esses resultados sugerem que essas bactérias interferem com o aumento da biomassa do biofilme de Candida. Figura 12 – Avaliação da biomassa formada pelos biofilmes de C. albicans Legenda: Média e desvio padrão do valor de absorbância dos biofilmes do grupo controle (C. albicans + PBS) e nos grupos com células de Lactobacillus ou seu sobrenadante. A. Interação de C. abicans e células de Lactobacillus. B. Interação de C. abicans e sobrenadante de Lactobacillus. O teste utilizado foi o t-student. Fonte: Elaborada pelo autor. 52 Os biofilmes formados in vitro também foram avaliados pelo MEV, nos quais foram observados um biofilme maduro nos discos de resina acrílica após 48 horas. As células de C. albicans observadas nos biofilmes sofreram variações morfológicas conforme o grupo experimental avaliado. Nos biofilmes controle formados apenas por C. albicans e PBS, foi observado grande quantidade de leveduras e hifas (Figura 13A). Nos biofilmes mistos com células de Lactobacillus, verificou-se aderência das células bacterianas nas leveduras e redução de hifas (Figura 13B, 13C, 13D). Já o sobrenadante de Lactobacillus causou redução de leveduras no biofilme de C. albicans, não formação de hifas e alteração na morfologia das células fúngicas, sugerindo que o sobrenadante pode afetar a viabilidade das leveduras no biofilme (Figura 14). As imagens do MEV estão de acordo com os resultados obtidos na contagem de UFC/mL e da quantificação de biomassa total mostrando que esses três isolados de Lactobacillus possuem potencial antifúngico. 53 Figura 13 - Microscopia eletrônica de biofilmes formados in vitro Legenda: A. Grupo controle de C. albicans + PBS: Verifica-se a presença de inúmeras leveduras, hifas e pseudohifas; B. Grupo interação C. albicans + células de L. rhamnosus 5.2; C. Grupo interação C. albicans + células de L. fermentum 20.4; D. Grupo interação C. albicans + células de L. paracasei 28.4; Em todos o biofilmes mistos é possível observar redução das leveduras e hifas de C. albicans e íntima interação entre C. albicans e as células de Lactobacillus. Aumento original: 4000x. Fonte: Elaborada pelo autor. 54 Figura 14 - Microscopia eletrônica de biofilmes formados in vitro Legenda: A. Grupo controle de C. albicans + PBS: Verifica-se a presença de inúmeras leveduras, hifas e pseudohifas; B. Grupo interação C. albicans + sobrenadante de L. rhamnosus 5.2; C. Grupo interação C. albicans + sobrenadante de L. fermentum 20.4; D. Grupo interação C. albicans + sobrenadante de L. paracasei 28.4; Em todos os biofilmes tratados com sobrenadante observa-se redução das leveduras e hifas de C. albicans e alteração na morfologia das leveduras. Aumento original: 4000x. Fonte: Elaborada pelo autor. 55 4.5 Interferência de L. rhamnosus 5.2, L. fermentum 20.3 e L. paracasei 28.4 nos genes de virulência de C. albicans Com a finalidade de elucidar a interferência dos isolados clínicos de Lactobacillus na formação do biofilme de C. albicans, nós utilizamos a qPCR para avaliar o nível de expressão de genes relacionados a formação de biofilme, filamentação e adesão. As amostras dos biofilmes de C. albicans associados aos isolados 28.4, 5.2 e 20.4 foram formados conforme item 3.5.1.3 para avaliação da expressão dos genes EFG1, HWP1, CPH1 e ALS3, em relação aos genes de referência de C. albicans (RPP2B, RIP1 e LSC2). Após a formação, todos os biofilmes obtidos (grupo controle de C. albicans e as associações com Lactobacillus) foram submetidos à extração do RNA total e quantificados na concentração de ng/ µL pelo aparelho Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA). A quantidade obtida e a pureza das amostras, a relação 260/280 nm foram maiores que 1,80, sendo assim, adequadas para o processo de transcrição reversa como indicado no Quadro 2. Quadro 2 - Concentração e grau de pureza obtida de RNA após a extração dos biofilmes (continua) Amostra do biofilme Concentração ng/ µL 260/280 nm 260/230 nm C. albicans + PBS 2377,5 2,11 2,08 C. albicans + PBS 4844,1 2,12 1,96 C. albicans + PBS 1617,8 2,02 1,83 28.4 + C. albicans (célula) 988,4 2,01 0,74 28.4 + C. albicans (célula) 1012,1 2,04 0,91 28.4 + C. albicans (célula) 1435,8 2,09 1,61 28.4 + C. albicans (sobrenadante) 713,6 2,08 1,60 28.4 + C. albicans (sobrenadante) 703,7 2,00 1,18 28.4 + C. albicans (sobrenadante) 1.702,1 2,08 1,52 56 Quadro 2 - Concentração e grau de pureza obtida de RNA após a extração dos biofilmes (conclusão) Amostra do biofilme Concentração ng/ µL 260/280 nm 260/230 nm 5.2 + C. albicans (célula) 886,8 2,12 1,75 5.2 + C. albicans (célula) 705,6 2,10 1,29 5.2 + C. albicans (célula) 540,4 1,94 0,78 5.2 + C. albicans (sobrenadante) 411,5 1,93 0,89 5.2 + C. albicans (sobrenadante) 846,1 2,12 1,97 5.2 + C. albicans (sobrenadante) 1.339,0 1,97 1,03 20.4 + C. albicans (célula) 1186,9 2,05 1,54 20.4 + C. albicans (célula) 1633,2 2,13 1,96 20.4 + C. albicans (célula) 918,3 1,98 0,71 20.4 + C. albicans (sobrenadante) 1830,6 2,07 1,90 20.4 + C. albicans (sobrenadante) 1609,1 2,12 1,96 20.4 + C. albicans (sobrenadante) 530,6 2,0 1,24 * Todos os experimentos foram realizados em triplicatas Para a realização da curva padrão de cDNA, foram preparadas diluições seriadas do cDNA (1:5) com a massa inicial de 300 ng do grupo controle, que neste estudo se refere a C. albicans + PBS. Cada diluição foi feita em triplicata para cada iniciador testado e a concentração ideal deste, foi padronizada em 300 mM. A massa de 300 ng de cDNA foi padronizada para todas as amostras pois obteve-se melhor amplificação. Todos os iniciadores utilizados neste experimento apresentaram uma eficiência de entre 90 e 110%. Procurou-se observar em todas as curvas, eficiência ±100%, Slope ±-3,32, coeficiente de correlação ≥ 0,99. Esses dados estão apresentados no Quadro 3. 57 Quadro 3 - Valores de Slope, correlação e eficiência da amostra C. albicans ATCC 18804 Iniciador Slope Correlação (R2) Eficiência RPP2B -3,32 0,991 100% RIP1 - 3,32 0,998 100% LSC2 -3,45 0,995 92,3% PMA1 3,25 0,998 103% EFG1 -3,44 0,993 95,4% ALS3 - 3,23 0,992 101,94% HWP1 -3,42 0,992 96% CPH1 -3,34 0,995 98% Fonte: Elaborada pelo autor. O próximo passo foi a seleção do controle endógeno (gene de referência), que é utilizado para normalizar diferenças na quantidade de cDNA que é colocado nos poços de reação da PCR, e os níveis de expressão do controle endógeno devem ser semelhantes em todas as amostras do estudo. Essa análise foi realizada pelo website http://www.leonxie.com, no qual este avalia por quatro métodos diferentes: Delta CT, BestKeeper, NormFinder e Genorm. Após avaliação pelos quatro métodos, Delta CT, BestKeeper, NormFinder e Genorm, o website http://www.leonxie.com recomendou o gene RPP2B para realizar a quantificação relativa (Figura 15). 58 Figura 15 – Seleção do melhor gene de referência (RPP2B, PMA, LSC2 e RIP1) pelo website (http://www.leonxie.com) Fonte: Elaborada pelo autor e pelo site http://www.leonxie.com. Os resultados da quantificação relativa representam a variação no nível de expressão dos genes alvos entre os biofilmes mistos de C. albicans e células ou sobrenadante de Lactobacillus em relação a amostra calibradora (C. albicans + PBS). Todas as reações foram feitas em triplicata. Os resultados foram obtidos como valores relativos da expressão gênica (com base na fórmula 2 -CT ) em comparação a um alvo-interno de referência, previamente selecionado, e que resulta em valor 1. O experimento foi realizado pelo aparelho StepOnePlus™ System (Life Technologies, Carlsbad, California, EUA) que já calculou a quantificação relativa na base Log. Expressão relativa dos genes alvos em biofilmes formados pela associação de C. albicans e as diferentes espécies de Lactobacillus estão demonstradas abaixo (Figura 16). http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/en/US/adirect/lt?cmd=catProductDetail&productID=4376600 59 Figura 16 – Quantificação relativa de ALS3, HWP1, CPH1 e EFG1 em biofilmes monotípicos e mistos de C. albicans associados com células de Lactobacillus e seu sobrenadante Legenda: A. Biofilmes de C. albicans associados com L. rhamnosus 5.2; B. Biofilmes de C. albicans associados com L. fermentum 20.4; C. Biofilmes de C. albicans associados com L. paracasei 28.4. Gene de adesão (ALS3), genes de biofilmes (CPH1 e EFG1) e gene de filamentação (HPW1): Cada grupo avaliado foi normalizado e comparado com C. albicans +PBS (controle). Os valores foram expressos em média e desvio padrão. Teste t de Student foi utilizado para comparar a expressão dos genes entre os grupos estudados (p ≤ 0.05). Fonte: Elaborada pelo autor. 60 Em associação com as células de Lactobacillus ou seu sobrenadante todos os genes alvos foram regulados negativamente com valores significantes comparados com o gene de referência. Em relação ao gene ALS3, foi verificado uma diminuição na sua expressão de 100 vezes (p=0.0001) com associação com as células de 28.4 (16 vezes menos expresso para seu sobrenadante), 6-fold decrease (p=0.0001) para associação com as células de 5.2 (3-fold decrease para seu sobrenadante) e 20-fold decrease (p=0.0001) para a associação com as células de 20.4 (33-fold decrease para seu sobrenadante). Para o gene CPH1 foi verificado uma diminuição na sua expressão em 5 vezes (p=0.0001) quando associado com as células de 28.4 (2 vezes menos expresso para seu sobrenadante, 2-fold decrease (p=0.0001) com a associação com as células de 5.2 (1.5-fold decrease para seu sobrenadante) e 2-fold decrease (p=0.0001) para associação com 20.4 (3-fold decrease para o grupo com seu sobrenadante). Em relação a quantificação relativa com gene EFG1 foi observado 6-fold decrease (p=0.0001) para associação com as células de 28.4 (1.5-fold decrease para seu sobrenadante), 1.5-fold decrease (p=0.0029) na associação com 5.2 (1.2- fold decrease para o sobrenadante) e 1.7-fold decrease (p=0.0017) na associação com 20.4 (3.8-fold decrease para o grupo sobrenadante). Para o gene HWP1 verificou-se uma menor expressão de 333 vezes para a associação com 28.4 (20- fold decrease para o sobrenadante), 5.5-fold decrease (p=0.0001) na associação com 5.2 (3-fold decrease para seu sobrenadante) e 3.7-fold decrease (p=0.0001) associados com 20.4 (6.6-fold decrease para seu sobrenadante). 4.6 Efeitos de Lactobacillus na candidose experimental em G. mellonella Baseado nos resultados in vitro, expandimos este estudo para os modelos de G. mellonella e C. elegans afim de verificar a habilidade de algum isolado possuir ação imunomodulatória. Primeiramente foi avaliado a capacidade de Lactobacillus em prolongar a sobrevivência das larvas de G. mellonella após a infecção por C. albicans. A suscetibilidade das larvas aos isolados de Lactobacillus foi avaliada anteriormente ao estudo da candidose experimental. Nós testamos as 61 concentrações entre 105-109 célula/larva e apenas nas duas concentrações mais altas foi observado morte de algumas larvas (Figura 17, 18 e 19). Figura 17 – Suscetibilidade de G. mellonella aos isolados de Lactobacillus. Legenda: Concentrações seriadas de Lactobacillus foram injetadas para observar a longevidade dos animais. Fonte: Elaborada pelo autor. 62 Figura 18 – Suscetibilidade de G. mellonella aos isolados de Lactobacillus Legenda: Concentrações seriadas de Lactobacillus foram injetadas para observar a longevidade dos animais. Fonte: Elaborada pelo autor. 63 Figura 19 – Suscetibilidade de G. mellonella aos isolados de Lactobacillus Legenda: Concentrações seriadas de Lactobacillus foram injetadas para observar a longevidade dos animais. Fonte: Elaborada pelo autor. 64 De acordo com os resultados acima, a concentração de 106 UFC/larva foi adotada para estudar os efeitos dos isolados de Lactobacillus na candidose experimental. Nós realizamos um screening com todos os isolados para determinar se algum deles poderia afetar a infecção letal por C. albicans. No grupo controle infectado apenas com C. albicans, 100% dos animais morreram em até 24 horas pós infecção. Quando as larvas receberam injeções de Lactobacillus profilaticamente a infecção por C. albicans a sobrevivência das larvas foi alterada conforme o isolado, mostrando que o resultado foi cepa dependente. Mais especificamente, entre os nove isolados analisados seis foram capazes de prolongar a sobrevida das larvas infectadas com C. albicans e o grupo tratado profilaticamente com L. paracasei 28.4 teve a maior taxa de sobrevivência (27%) comparado com os outros isolados (6 a 19%) (Tabela 3) (Figura 20, 21 e 22). Baseado nesses resultados, esse isolado foi selecionado para todos os ensaios subsequentes. Tabela 3- Efeitos de Lactobacillus na candidose experimental baseado na análise de sobrevivência das larvas de G. mellonella Isolado Sobrevida após 120 h (%) 20.4 – L. fermentum 0 20.3 – L. paracasei 12 26.1 – L. paracasei 19 27.1 – L. paracasei 6 28.4 – L. paracasei 27 30.1 – L. paracasei 0 5.2 – L. rhamnosus 14 19.3 – L. rhamnosus 0 19.9 – L. rhamnosus 14 Fonte: Elaborada pelo autor. 65 Figura 20 –Lactobacillus prolonga a sobrevida de G. mellonella infectada por C. albicans Legenda: Houve diferença estatisticamente significante entre os grupos “Lactobacillus + C. albicans” e “PBS + C. albicans”. A. p=0,0097; B. p=0,0013; C. p=0,0044; Kaplan-Meier teste, p≤ 0.05. Fonte: Elaborada pelo autor. 66 Figura 21 –Lactobacillus prolonga a sobrevida de G. mellonella infectada por C. albicans Legenda: Houve diferença estatisticamente significante entre os grupos “Lactobacillus + C. albicans” e “PBS + C. albicans”. A. p=0,0001; B. p=0,0245; C. p=0,0001; Kaplan-Meier teste, p≤ 0.05. Fonte: Elaborada pelo autor. 67 Figura 22 –Lactobacillus prolonga a sobrevida de G. mellonella infectada por C. albicans Legenda: Houve diferença estatisticamente significante entre os grupos “Lactobacillus + C. albicans” e “PBS + C. albicans”. A. p=0,0075; B. p=0,0003; C. p=0,0733; Kaplan-Meier test, p≤ 0.05. Fonte: Elaborada pelo autor. 68 Com a finalidade de determinar se diferentes concentrações de L. paracasei 28.4 pode influenciar na taxa de sobrevivência das larvas infectadas por C. albicans, injetou-se profilaticamente concentrações de 105-107 células/larva de L. paracasei e após 1 hora os animais receberam injeção de C. albicans. Nós observamos uma dose dependência em relação a taxa da sobrevida das larvas, no qual os grupos que receberam o inoculo de 107 células de L. paracasei alcançaram uma taxa maior de sobrevivência em relação as outras concentrações menores testadas (105 e 106 células/larva) (Figura 23). Também observou uma menor melanização das larvas inoculadas profilaticamente com L. paracasei e posteriormente infectadas por C. albicans comparado ao grupo controle de C. albicans (Figura 24). Figura 23 –L. paracasei 28.4 prolonga a sobrevida de G. mellonella infectada por C. albicans Legenda: Curva de sobrevivência com diferentes concentrações de L. paracasei: diferenças significantes foram observadas para os grupos 105 células de 28.4 + Candida (p=0,0166), 106 células de 28.4 + Candida (p=0,0003) e 107 células de 28.4 + Candida (p=0,0001) em relação com o grupo controle (PBS + 106 células de Candida). Fonte: Elaborada pelo autor. 69 Figura 24 – Análise do processo de melanização após 24 horas do tratamento profilático com L. paracasei e infecção com C. albicans Legenda: Grupos: 1 – PBS + PBS; 2 – PBS + C. albicans; 3 – L. paracasei + PBS; 4 – L. paracasei + C. albicans. Fonte: Elaborada pelo autor. Além disso foi avaliado se a sobrevida de G. mellonella poderia influenciada pela injeção de “heat-killed L. paracasei 28.4”. Nesse experimento foram utilizados os mesmos grupos descritos com as células vivas de L. paracasei 28.4, sendo substituído a injeção de células vivas por “heat-killed L. paracasei 28.4”. Interessantemente, “heat-killed L. paracasei” não promoveu proteção profilática e consequentemente não aumentou a sobrevida das larvas infectadas com C. albicans. Esses dados indicam que a ação probiótica é consequência da bactéria viva e não morta (Figura 25). 70 Figura 25 – Taxa de sobrevida das larvas tratadas com “Heat-killed L. paracasei 28.4” Legenda: Não foi observado diferença estatisticamente significante para os grupos 105 células de HK28.4 + Candida (p=1,000), 106 células de HK28.4 + Candida (p=1,000) e 107 células de HK28.4 + Candida (p=0,0733) quando comparados com o grupo controle PBS + C. albicans. Kaplan-Meier teste, p≤ 0,05. Fonte: Elaborada pelo autor. Para investigar os mecanismos imunes associados com o efeito preventivo de L. paracasei na infecção por C. albicans, nós quantificamos o número de hemócitos na hemolinfa das larvas após 4, 8 e 24 horas após injeção de C. albicans. Como a maior taxa de sobrevida dos animais foi alcançada com a co