UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA TESTES DE PUNTURA E DE CONTATO NA AVALIAÇÃO DA REAÇÃO ADVERSA A ALIMENTOS EM CÃES COM DERMATITE ATÓPICA NA REGIÃO DE BOTUCATU JULIANA THEODORO DE SOUZA ANGERAMI BOTUCATU 2024 ii UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA TESTES DE PUNTURA E DE CONTATO NA AVALIAÇÃO DA REAÇÃO ADVERSA A ALIMENTOS EM CÃES COM DERMATITE ATÓPICA NA REGIÃO DE BOTUCATU JULIANA THEODORO DE SOUZA ANGERAMI Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista para obtenção do título de Mestra em Medicina Veterinária. Orientador: Prof. Ass. Dr. Luiz Henrique de Araújo Machado Coorientador: Prof. Dr. Marconi Rodrigues de Farias BOTUCATU 2024 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSANGELA APARECIDA LOBO-CRB 8/7500 Angerami, Juliana Theodoro de Souza. Testes de puntura e de contato na avaliação da reação adversa a alimentos em cães com dermatite atópica na região de Botucatu / Juliana Theodoro de Souza Angerami. - Botucatu, 2024 Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Orientador: Luiz Henrique de Araújo Machado Coorientador: Marconi de Rodrigues Farias Capes: 50501062 1. Dieta. 2. Hipersensibilidade alimentar. 3. Alergia. 4. Dermatite atópica. 5. Análise de sensibilidade. 6. Dermatologia veterinária. Palavras-chave: Dieta de exclusão alimentar; Hipersensibilidade alimentar; Testes alérgicos alimentares; Trofoalérgenos. iv Nome da autora: Juliana Theodoro De Souza Angerami Título: TESTES DE PUNTURA E DE CONTATO NA AVALIAÇÃO DA REAÇÃO ADVERSA A ALIMENTOS EM CÃES COM DERMATITE ATÓPICA NA REGIÃO DE BOTUCATU COMISSÃO EXAMINADORA ____________________________________ Prof. Dr. Luiz Henrique de Araújo Machado Professor Orientador Departamento de Clínica Veterinária FMVZ – UNESP – Botucatu. ____________________________________ Profa. Ass. Dra. Maria Lúcia Gomes Lourenço Membro Departamento de Clínica Veterinária FMVZ - UNESP – Botucatu. ____________________________________ M.V. Dr. Claudio Nazarethian Rossi Membro CEVA Saúde Animal, Anclivepa, Dermatovet, Qualittas Botucatu, 30 de Abril de 2024. v AGRADECIMENTOS Muitas pessoas colaboraram para que esse sonho se realizasse. Em primeiro lugar gostaria de agradecer ao meu orientador, prof. Luiz Henrique, por ter me acolhido, conduzido com paciência e serenidade essa minha caminhada; à profa. Maria Lúcia pelo carinho que sempre teve comigo. Minhas colegas de mestrado e agora amigas do coração, Victória, Daniele e Amanda, sem elas esse projeto não seria possível. Meu pai, Gabriel, meu filho, Rafael e meu avô Paulo que ficaram nos “bastidores”, pelo apoio e compreensão nas minhas ausências e como suporte no dia a dia. Às mulheres da minha vida, minha mãe, Dinda e minha avó, Jacyra (já ausentes), minha prima, Jade e minhas amigas que formam minha rede de apoio para todos os momentos, me incentivando, me acolhendo nas adversidades da vida e me inspirando. À todos da FMVZ, UNESP Botucatu que, apesar de não ser minha faculdade de graduação, é onde sempre me senti verdadeiramente “em casa”. E por fim aos tutores e aos meus queridos pacientes, pela confiança, espero poder retribuir com ciência a ajuda de vocês. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. This study was financed in part by the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Finance Code 001. vi Dedico este trabalho à memória da minha mãe. vii LISTA DE TABELAS TABELA 1 - Análise de concordância Kappa de Cohen entre os testes de puntura e de contato ......................................................................................................32 viii LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 - Topografia lesional da dermatite atópica .......................................16 FIGURA 2 - Bandeja com os extratos alimentares e ambientais para o teste de puntura ..............................................................................................................23 FIGURA 3 - Extratos recém administrados através dos puntores de ponta múltipla (nota-se a marcação da pele em forma de estrela comprovando que a puntura foi bem sucedida) ..............................................................................................24 FIGURA 4 - Demarcação com caneta dermográfica para a medição das pápulas ..........................................................................................................................25 FIGURA 5 - À esquerda, gabarito vazado para auxiliar na leitura do teste de contato alérgico e à direita, contensores com os alimentos a serem testados ..26 FIGURA 6 - Contensores preparados com extratos alimentares aderidos à lateral do tórax .............................................................................................................27 FIGURA 7 - Região testada, 48 horas após retirada do adesivo para o teste de contato. As setas indicam reações positivas .....................................................28 FIGURA 8 - Representação gráfica das porcentagem de cães por raças com DAC e RAA ................................................................................................................29 FIGURA 9 - Demonstração gráfica das reações ao teste de puntura a alimentos em cães com DAC e RAA em porcentagem .....................................................30 FIGURA 10 - Demonstração gráfica do número de reações aos alimentos testados no Teste de Contato Alérgico em porcentagem .................................31 ix SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ...............................................................................................13 2 REVISÃO DE LITERATURA ..........................................................................14 2.1. DERMATITE ATÓPICA CANINA ...............................................................14 2.2. FISIOPATOLOGIA DA DAC .......................................................................17 2.3. REAÇÕES ADVERSAS A ALIMENTOS ....................................................17 3 OBJETIVOS ...................................................................................................20 3.1. OBJETIVO GERAL ....................................................................................20 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................20 4 MATERIAL E MÉTODOS ...............................................................................21 4.1. COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS (CEUA), FMVZ – UNESP BOTUCATU ......................................................................................................21 4.2. LOCAL E PERÍODO DE REALIZAÇÃO .....................................................21 4.3. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO ......................................................................21 4.4. CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO .....................................................................22 4.5. SELEÇÃO DOS ALIMENTOS TESTADOS ................................................22 4.6. TESTE DE PUNTURA (PRICK TEST) .......................................................22 4.7. TESTE DE CONTATO ALÉRGICO (PATCH TEST) ..................................25 5 RESULTADOS ...............................................................................................29 5.1. TESTE DE PUNTURA ...............................................................................30 5.2. TESTE DE CONTATO ...............................................................................31 6 DISCUSSÃO ..................................................................................................33 7 CONCLUSÃO ................................................................................................36 x LISTA DE ABREVIATURAS DAC - Dermatite Atópica Canina RAA - Reações Adversas a Alimentos HA - Hipersensibilidade Alimentar IA- Intolerância Alimentar IgE - Imunoglobulina E Th - Célula T helper IL - Interleucina 11 ANGERAMI, J. T. S. Testes de puntura e de contato na avaliação da reação adversa a alimentos em cães com dermatite atópica na região de Botucatu. Botucatu, 2024. 53p. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista. RESUMO Dermatite atópica canina é uma doença crônica, inflamatória, pruriginosa, geneticamente predisposta que apresenta sinais clínicos característicos, geralmente associada à produção de Imunoglobulinas da classe IgE contra antígenos ambientais e/ou alimentares. O diagnóstico é clínico e deve ser considerado o histórico do animal, as características e localizações das lesões, sendo importante a utilização de exames para descartar a possibilidade de outras doenças pruriginosas. Para pacientes que apresentam reação adversa a alimentos, pode-se dispor dos testes de puntura e de contato com o objetivo de selecionar alimentos para o auxílio na formulação de dietas restritivas. O objetivo deste trabalho foi avaliar e comparar os resultados dos testes alimentares de puntura e de contato. Foram selecionados trinta e oito animais atópicos, realizado o teste de puntura e o teste de contato. O primeiro teste teve sua leitura feita após quinze minutos e o segundo, quarenta e oito horas após sua aplicação. As proteínas causaram mais reatividade em relação aos carboidratos nos animais testados e, em ambos os testes, as proteínas de frango e bovina foram as que mais causaram sensibilização nos cães. Levando em consideração a literatura que demonstra a necessidade da utilização de proteínas originais para o teste de exclusão alimentar e posterior desafio, e o alto valor preditivo negativo de ambos os testes, comprova-se dessa forma a importância do uso associado dos testes de puntura e de contato para a identificação dos ingredientes a serem utilizados, agilizando-se o diagnóstico, tratamento e melhoria da qualidade de vida dos cães e seus tutores. Palavras-chave: trofoalérgenos, hipersensibilidade alimentar, testes alérgicos alimentares, dieta de exclusão alimentar. 12 ANGERAMI J. T. S. Prick and patch tests to evaluate adverse reactions to foods in dogs with atopic dermatitis in the Botucatu region. Botucatu, 2024. 53p. Dissertation (Veterinary Medicine Master’s) – Faculty of Veterinary Medicine and Animal Science, Botucatu Campus, São Paulo State University. ABSTRACT Canine atopic dermatitis is a chronic, inflammatory, pruritic, genetically predisposed disease that presents characteristic clinical signs, generally associated with the production of IgE class immunoglobulins against environmental and/or food antigens. The diagnosis is clinical and the animal's history, characteristics and locations of the lesions must be considered, and it is important to use tests to rule out the possibility of other pruritic diseases. For patients who have an adverse reaction to foods, prick and contact tests may be available with the aim of selecting foods to help formulate restrictive diets. The objective of this work was to evaluate and compare the results of food prick and contact tests. Thirty-eight atopic animals were selected and the puncture test and contact test were performed. The first test was read after fifteen minutes and the second, forty-eight hours after its application. Proteins caused more reactivity in relation to carbohydrates in the animals tested and, in both tests, chicken and beef proteins were the ones that caused the most sensitization in dogs. Taking into account the literature that demonstrates the need to use original proteins for the food exclusion test and subsequent challenge, and the high negative predictive value of both tests, this proves the importance of the associated use of prick and contact point to identify the ingredients to be used, speeding up diagnosis, treatment and improving the quality of life of dogs and their owners. Keywords: trophoallergens, food hypersensitivity, food allergy tests, food exclusion diet. 13 1 INTRODUÇÃO Atualmente a dermatite atópica é uma das doenças pruriginosas alérgicas que mais acomete os cães, estima-se que sua morbidade varie de 10 a 15% (Hillier et al., 2001; Hensel et al., 2015). Ela pode ser desencadeada por alérgenos ambientais e/ou alimentares, visto que até 25% dos animais que têm dermatite atópica, possuem também reações adversas a alimentos (RAA) (Chesney, 2002; Picco et al., 2008; Proverbio et al., 2010) e aproximadamente 50 a 60% dos cães com enteropatias crônicas respondem a mudanças na dieta (Allenspach et al., 2016; Volkmann et al., 2017). Considerando-se a dermatite atópica canina (DAC) uma doença sem cura, apenas controlável, progressiva e multifatorial, nota-se que tais animais padecem sobremaneira com prurido intenso, grave e perene, além de infecções por microrganismos patogênicos e otites severas (Hillier et al., 2001; Halliwell, 2006), quadro que diminui, em muito a qualidade de vida do cão e de seu tutor. Por esse motivo se faz necessário o entendimento das suas causas, manifestações, formas de diagnóstico e tratamentos adequados e seguros. 14 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1. DERMATITE ATÓPICA CANINA A DAC é uma doença tegumentar comum, inflamatória, pruriginosa, geneticamente predisposta e crônica, possui sinais clínicos característicos e perenes, que sofrem exacerbações sazonais. Na maior parte das vezes a DAC está associada à produção de IgE contra alérgenos ambientais e sua prevalência estimada nos cães está entre 10 a 15% (Hillier et al., 2001; Halliwell, 2006). No entanto, as RAA também são associadas à DAC no cão, já que tanto a ingestão de alimentos quanto o contato a alérgenos ambientais podem desencadear exacerbações da DAC (Pucheu-Haston et al., 2015). Nos cães com DAC, as RAA podem ocorrer em até 30% (Roudebush et al. 2010, Bhagat et al., 2017). A formação de IgE alérgeno-específica, não é pré-requisito para o seu desenvolvimento, já que a DAC é uma doença multifatorial que envolve defeitos de barreira cutânea, desregulação imunológica, disbiose e sensibilização alérgica (Nuttall et al., 2013; Marcella et al., 2011, 2017). Cães atópicos apresentam os primeiros sinais clínicos ainda filhotes, entre os seis meses e os três anos de idade e aqueles cuja indução se dá por sensibilização a alimentos são estimados entre 38% a 48% e manifestam os primeiros sinais antes de um ano de vida (Griffin & Deboer, 2001; Hill et al., 2004, Picco et al. 2008). Uma classificação que leva em consideração os fatores extrínsecos divide a DAC em stricto sensu, referindo-se aos cães que são sensibilizados especificamente à alérgenos ambientais, latu sensu, que são aqueles animais polissensibilizados tanto a alimentos quanto a alérgenos ambientais e simili, cujos pacientes possuem eczema atópico porém sem a produção de IgE alérgeno específica (Pucheu-Haston et al., 2015). As apresentações clínicas variam conforme a genética (predisposição racial), estágio da doença (aguda ou crônica), infecções secundárias (bactérias e leveduras) e extensão das lesões (localizadas ou generalizadas) (Hensel et al., 2015). A predisposição genética varia conforme a localização geográfica, no Reino Unido o risco do Labrador e do Golden Retriever de desenvolver DAC foi 15 de quase 50% devido à sua origem. Porém as raças: Pastor Alemão, Boxer, West White Highlander Terrier, Bulldog Francês, Bull Terrier, Cocker Spaniel Americano, Springer Spaniel Inglês, Poodle, Shih tzu, Shar Pei, Dachshunds, Collies, Schnauzer Miniatura, Lhasa Apso, Pug e Rhodesian também apresentam grande predisposição (Picco, 2008; Jaeger, 2010; Nuttal, 2013). No Brasil, além dos mestiços, as raças mais acometidas são os Poodles, Yorkshire Terrier, Lhasa Apso, Chow-Chow, Beagle, Labrador, Schnauzer e Shih Tzu (Alves et al., 2018). O prurido alesional é o principal sinal clínico inicial (inclui coçar, lamber, esfregar, balançar a cabeça, correr e mordiscar), seguido de eritema, podendo levar a alopecia auto induzida, escoriações e infecções secundárias por bactérias e leveduras, com pápulas, pústulas e crostas na doença aguda. Em estágios mais crônicos, ocorrem lesões cutâneas secundárias devido ao auto traumatismo, inflamação crônica e infecções. Lesões cutâneas secundárias típicas são escoriações, alopecia, liquenificação, hiperpigmentação, formação de crostas e seborreia (Olivry el al., 2010). As regiões mais comumente afetadas são: face, região côncava do pavilhão auricular, ventre, axilas, região inguinal, área perineal, extremidades distais e flexuras dos membros (Jaeger et al., 2009; Hensel et al., 2015; Mueller et al., 2018) (Figura 1). 16 A- Eritema em região perianal B- Eritema e feotriquia em região periocular e face, blefarite C- Eczema em face côncava do pavilhão auditivo D- Eritema em dígitos e interdígitos E- Eritema em região abdominal e inguinal F- Eritema em região cervical ventral D- Extremidades dos membros e interdígitos E- Eritema em abdômem e região inguinal F- Eritema em pescoçol ventral FIGURA 1 - Topografia lesional da dermatite atópica Fonte: Arquivo pessoal. Serviço de dermatologia- FMVZ- UNESP- Botucatu O diagnóstico é clínico, inexistindo sinais típicos patognomônicos e se dá através do histórico, manifestações clínicas, exclusão de outras dermatopatias pruriginosas infectoparasitárias e alérgicas (Nuttall et al.,2019) e presença de ao menos 5 dos 8 critérios estabelecidos por Favrot et al., 2010: 1. Início dos sinais clínicos entre seis meses e três anos de idade; 2. Redução do prurido após uso de corticosteróides; 3. Cão domiciliado; 4. Presença de otite externa; 5. Interdígitos afetados; 6. Prurido primário; 7. Bordas das orelhas não afetadas; 8. Região dorso-lombar não afetada. 17 Esses critérios podem ser aplicados tanto à DAC stricto sensu quanto à latu sensu. No estudo publicado em 2010, Favrot e colaboradores confirmaram que ambas as condições são clinicamente indistinguíveis (Hillier & Griffin, 2001; Picco et al., 2008). 2.2. FISIOPATOLOGIA DA DAC A fisiopatologia da DAC é complexa e multifatorial. Envolve falha de barreira cutânea devido a diminuição dos lipídios no extrato córneo (principalmente de ceramidas), falha na expressão da filagrina, facilitando a penetração microbiana, desenvolvimento de disbioses e perda hídrica transepidérmica, além de uma resposta inflamatória e imunogênica anormais (Santoro et al., 2015; Nuttall et al., 2019). Após penetração do antígeno, este é captado pela célula de Langerhans epitelial e por ela carreado até o linfonodo regional onde é apresentado para a célula Th0. Esta, por sua vez, sob influência da IL-4 sofre transformação em Th2 (Sehra et al., 2016). Portanto, na fase aguda da doença ocorre um predomínio de resposta Th2 com o envolvimento de citocinas como IL-4, IL-5, IL-6, IL- 13 e IL-31 (Marsella et al., 2012; Olivry et al., 2015). As citocinas IL-4, IL-13 e IL-31, desempenham um papel fundamental no desenvolvimento e progressão da DAC. A IL-4 e IL-13 estimulam as células B a produzir IgE. A IL-31 é a principal citocina pruritogênica na DAC (Pucheu- haston; 2015). No entanto, conforme ocorre a progressão de doença e sua consequente cronicidade, acontece uma alteração da resposta imunológica para células Th1, Th17 e Th22, além de resposta Th2 e consequente amplificação da inflamação (Olivry et al., 2015). 2.3. REAÇÕES ADVERSAS A ALIMENTOS RAA ocorrem em certos indivíduos que reagem de maneira anormal a compostos dietéticos inofensivos. Ela pode ser imunomediada, com a aparticipação de IgE como na hipersensibilidade alimentar (HA), ou não imunológica como na intolerância alimentar (IA) quando o cão não é capaz de 18 digerir ou absorver o alimento. Há ainda, as reações alimentares metabólicas, farmacológicas, tóxicas ou idiossincráticas (Jackson, 2003; Gaschen et al., 2011; Mueller et al., 2018). A IA é uma reação não imunomediada, ocorrendo nos casos em que há dificuldade de digestão ou de absorção ou ainda irritabilidade no sistema digestivo levando a sintomas como vômito e diarreia, porém, dificilmente desencadeia quadros cutâneos ( Gaschen et al., 2011). Por sua vez, a HA é uma reação imunomediada específica, que ocorre após exposição a um alimento, inclui a hipersensibilidade mediada por IgE, não mediada por IgE ou a combinação de ambas (Burks et al., 2012; Bhagat et al., 2017). Na maior parte das vezes, a HA é causada por uma reação imunológica tipo I, ou seja, mediada por IgE, sendo essa, imediata. No entanto, as reações tipo III e tipo IV, mediadas por células, também são relatadas (Mueller et al., 2020). Os cães com DAC que apresentam-se responsivos a alimentos podem ser clinicamente indistinguíveis de cães com DAC responsivos apenas a alérgenos ambientais (Favrot et al., 2010), porém, a presença de sinais gastrointestinais, como diarreia, vômito, tenesmo, fezes moles, flatulência e aumento do número de evacuações é mais tipicamente observada na DAC canina induzida por alimentos. Pacientes com fístula perianal também foram associados com HA (Picco et al., 2008; Favrot et al., 2010; Proverbio et al., 2010; Hensel et al., 2015). Além disso, cães com HA tendem a apresentar sintomas perenes de prurido crônico e grave, não responsivos a glicocorticóides e em 47% dos casos, o prurido pode ser sua única manifestação. Estes, podem apresentar também 3 vezes mais otites quando comparados àqueles reativos apenas a alérgenos ambientais (Picco et al., 2008; Favrot et al., 2010; Proverbio et al., 2010). Em cães, os antígenos alimentares são glicoproteínas hidrossolúveis, termoestáveis, de peso molecular entre 10 kDa e 70 kDa, resistentes a enzimas digestórias, os mais comumente identificados são carne bovina, laticínios, frango, ovo, soja, cordeiro, peixe, trigo e arroz (Taylor et al., 1987; Mueller et al., 2020). O diagnóstico de HA é feito por meio de dieta de exclusão de seis a oito 19 semanas, seguida do desafio alimentar. A dieta é elaborada com proteínas e carboidratos originais (que nunca foram ingeridos pelo cão) por meio de alimentação caseira ou ração comercial hidrolizada, os ingredientes que farão parte da dieta de exclusão podem ser triados através do histórico do animal ou, ainda, por meio de testes alérgicos. Os testes de puntura e de contato com antígenos alimentares têm sido recomendados como auxílio na escolha dos ingredientes da dieta de eliminação, apesar de trabalhosos e caros (Olivry et al., 2015; Mueller et al., 2018). A duração ideal de uma dieta de exclusão é controversa. A maior parte dos cães submetidos à dieta de exclusão apresentam melhora entre seis a oito semanas, caso não haja melhora dentro desse espaço de tempo, pode-se considerar que o animal não possui RAA, haja vista a dificuldade que a maioria dos tutores têm em manter uma dieta de exclusão por mais tempo. Se, no entanto, alguma melhora foi observada, então, pode ser necessário continuar o estudo por até doze semanas. Em seguida, o alimento suspeito de desencadear a HA é oferecido por até duas semanas, observando-se a piora do prurido caso o cão seja alérgico (Olivry et al., 2015; Mueller, 2018; ). Em humanos, o teste de puntura tem sido largamente utilizado como primeira abordagem na pesquisa de IgE específica naqueles quadros mediados por IgE ou mistos e tem importante papel na escolha dos alimentos para as provas de restrição e provocação oral (Solé et al., 2018). Exames alternativos como os de sangue, soro, saliva e pelos foram considerados insatisfatórios (Mueller, 2018). O teste sanguíneo de pesquisa de IgE sérica específica para alimentos foi considerado um indicador de hipersensibilidade relevante, entretanto não é possível identificar correlação confiável entre concentrações séricas de IgE com a exposição clínica aos respectivos alérgenos agressores (Mueller e Olivry, 2017). Como a RAA em cães com dermatite atópica tem componente mediado por células, trabalhos que avaliem os testes de contato alérgico para alimentos em cães com prurido crônico foram recentemente desenvolvidos e demonstraram que este não pode ser utilizado no diagnóstico da RAA, porém, pelo seu alto valor preditivo negativo, pode ser indicado na seleção de dietas restritivas (Johansen et al., 2017; Possebom et al., 2019). 20 3 OBJETIVOS 3.1. OBJETIVO GERAL O objetivo do presente estudo foi avaliar os testes alérgicos cutâneos, de puntura e de contato, para alérgenos alimentares. 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS − Verificar a diferença entre os testes de puntura e de contato em relação à presença de reações cutâneas alérgicas contra alimentos em animais previamente diagnosticados com DAC; − Demonstrar quais são os alimentos que mais causam reações alérgicas nos cães na região de Botucatu. 21 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1. COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS (CEUA), FMVZ – UNESP BOTUCATU O presente estudo foi submetido à apreciação CEUA da FMVZ-UNESP Botucatu/SP e aprovado sob protocolo número 0079/2022 (Anexo 1). 4.2. LOCAL E PERÍODO DE REALIZAÇÃO Os trinta e oito cães diagnosticados com DAC, que participaram do estudo aqui descrito foram triados a partir da rotina do Serviço de Dermatologia Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) da Universidade Estadual Paulista (UNESP), Campus Botucatu, e da clínica veterinária “Dinda”, localizada na cidade de Bauru, no período de maio/2022 a outubro/2023. 4.3. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO Foram admitidos no estudo, cães com diagnóstico clínico de DAC, com faixa etária entre um e sete anos de idade, sem preferências quanto à raça e sexo. Todos os cães apresentavam prurido crônico, primário, perene, de intenso a grave e se enquadravam em pelo menos cinco dos oito “critérios de Favrot” (Favrot et al., 2010). Todos estavam com controle de ectoparasitas atualizado e passaram por descarte de doenças pruriginosas que pudessem se assemelhar ou se sobrepor a DAC. Esta triagem prévia foi realizada por meio de diversos exames dermatológicos, tais como exame citopatológico de pele e cerúmen, cultura fúngica e histopatológico. Dermatopatias pruriginosas de origem parasitária foram descartadas por meio de exame parasitológico por raspado cutâneo. Todos os animais triados para o estudo foram submetidos a testes alérgicos de puntura e de contato para alimentos e, para serem incluídos, deveriam apresentar reação positiva no mínimo a um alimento em ao menos um dos testes. Os pacientes com infecções tegumentares secundárias (bacteriana ou 22 fúngica) foram adequadamente tratados com terapia tópica e/ou sistêmica a depender de cada caso e somente foram submetidos à realização dos testes após a determinação da higidez cutânea. Fármacos que interferem nos resultados dos exames foram descontinuados, tais como anti-histamínicos orais (7 dias), glicocorticóides de curta duração e tópicos (14 dias), glicocorticóides injetáveis de longa duração (28 dias), maleato de oclacitinib oral (3 dias), lokivetmab e ciclosporina não tiveram seu uso descontinuado. Os cães com temperamento agitado ou agressivo, que não permitiram a contenção manual para a realização do teste, foram submetidos a sedação com administração intravenosa de dexmedetomidina. 4.4. CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO Não fizeram parte do experimento cães impossibilitados de descontinuar o uso de medicação antihistamínica e glicocorticóide, fêmeas em período de estro, gestação ou lactação, cães que apresentavam infecções tegumentares (bacterianas ou fúngicas) não responsivas ao tratamento prévio, cães com controle de ectoparasitas desatualizado e com o fenótipo da doença atópica crônica, ou seja, que se apresentavam clinicamente com lignificação, hiperpigmentação e disqueratose. 4.5. SELEÇÃO DOS ALIMENTOS TESTADOS A seleção dos alimentos submetidos aos testes foi feita baseada nos ingredientes mais utilizados na formulação da maior parte das rações comercializadas no Brasil. Todos os animais triados para o estudo foram submetidos a testes alérgicos de puntura e de contato para alimentos. 4.6. TESTE DE PUNTURA (PRICK TEST) Para os testes de puntura foi realizada tricotomia com lâmina número 23 40 na região torácica lateral, de aproximadamente 15 cm por 8 cm, previamente higienizada com solução de clorexidine aquoso 0,2% e foram demarcados com pincel marcador permanente, pontos com 1,5cm equidistantes entre si. Como controle negativo foi utilizada solução salina e para o controle positivo, histamina na concentração de 10mg/ml. Os extratos alimentares testados foram à base de proteínas bovina, de frango, pescado, ovo, leite, soja, trigo, além de arroz, batata inglesa e mandioca, manipulados pelo Laboratório Veterinary Allergenics (Laboratório de Antígenos, Rio de Janeiro, Brasil) (Figura 2). As punturas foram feitas com o uso de puntores de ponta múltipla (UnitestR), um para cada extrato, pressionando sua ponta contra a superfície da pele por cinco segundos para que o extrato fosse inoculado trans epidermicamente (Figura 3). FIGURA 2 - Bandeja com os extratos alimentares e ambientais para o teste de puntura Fonte: Victória Gardinal Mazziero. Serviço de dermatologia veterinária, FMVZ- UNESP- 24 Botucatu. A leitura do teste foi realizada após quinze minutos da puntura fazendo- se a marcação das pápulas com pincel permanente e em seguida a mensuração com paquímetro digital dos diâmetros maior e seu perpendicular e então feita a média entre eles (Figuras 4 e 5). A reação foi considerada positiva quando as pápulas apresentavam 3mm de diâmetro acima do diâmetro do teste negativo, excluindo-se assim, a possibilidade de a reação ser causada pela irritação da puntura. FIGURA 3 - Extratos recém administrados através dos puntores de ponta múltipla (nota-se a marcação da pele em forma de estrela comprovando que a puntura foi bem sucedida) Fonte: arquivo pessoal. Serviço de dermatologia da FMVZ- UNESP- Botucatu. 25 FIGURA 4 - Demarcação com caneta dermográfica para a medição das pápulas Fonte: arquivo pessoal. Serviço de dermatologia, FMVZ- UNESP- Botucatu. 4.7. TESTE DE CONTATO ALÉRGICO (PATCH TEST) Os extratos para o teste de contato alérgico foram elaborados a partir dos seguintes alimentos: carnes cruas de bovino, suíno, frango, peixe, leite, ovo cru de galinha inteiro (clara e gema), soja, farinha de trigo, farinha de arroz, farinha de milho, batata inglesa cozida e mandioca cozida. Os alimentos foram adquiridos em supermercado, processados em um processador de alimentos (Mini Processador, 300ml, UniHome), pesados com balança digital, 500 mg de alimento e homogeneizados com 0,2 ml de petrolato (vaselina semi-sólida) (Johansen et al., 2017). Em seguida, todos os extratos foram dispostos em poços individuais de 8 mm em contensores hipoalergênicos para teste de contato alérgico (Alergochambers NeoflexR, São Paulo, Brasil), mantendo sempre um poço preenchido somente com petrolato para o controle negativo (Figura 6). 26 FIGURA 5 - À esquerda, gabarito vazado para auxiliar na leitura do teste de contato alérgico e à direita, contensores com os alimentos a serem testados Fonte: arquivo pessoal. Serviço de dermatologia veterinária FMVZ- UNESP- Botucatu. Para aplicação do teste de contato alérgico, os cães foram submetidos a tricotomia na região torácica contralateral ao teste de puntura, de aproximadamente 15 cm por 8cm com lâmina de tosa número 40 e feita a higienização do local com solução de clorexidina aquosa 0,2%. Os adesivos contendo os poços foram fixados na área delineada e, para minimizar o risco de movimentação, os animais foram envolvidos com uma atadura elástica e, logo após, vestidos com roupa cirúrgica (Figuras 7, 8, 9 e 10). 27 FIGURA 6 - Contensores preparados com extratos alimentares aderidos à lateral do tórax Fonte: arquivo pessoal. Após quarenta e oito horas, o adesivo com os contensores foram removidos e a pele do local testado foi limpa para a retirada dos extratos que por ventura ficaram aderidos. A presença de eritema, pápulas, placas eritematosas e ou microvesículas foram consideradas reações positivas, como estabelecido por Johansen et al., 2017 (Figura 11). 28 FIGURA 7 - Região testada, 48 horas após retirada do adesivo para o teste de contato. As setas indicam reações positivas Fonte: Arquivo pessoal. Serviço de dermatologia, FMVZ- UNESP- Botucatu. 29 5 RESULTADOS Foram selecionados sessenta e sete cães de tutores atendidos pelo serviço de dermatologia do Hospital Veterinário da FMVZ Unesp - Botucatu, diagnosticados com DAC que participaram dos testes alérgicos (puntura e/ou contato). Destes, vinte e sete não apresentaram reação a alérgenos alimentares em nenhum dos testes ou não faziam parte da faixa etária exigida e foram excluídos do estudo. Dois dos animais testados retiraram o adesivo com os contensores antes da leitura e, portanto, foram também excluídos. Portanto, fizeram parte do estudo trinta e oito cães que apresentaram resultados positivos a pelo menos um alimento em ao menos u m dos testes, destes, 7 6 % eram fêmeas e 24% eram machos, a média foi de 3,8 anos, sendo que a idade mínima definida para a participação no estudo foi de 1 ano e a máxima de 7 anos. Com relação às raças, 21% eram mestiços; 19% eram da raça Lhasa Apso; 13% Shih tzu; 11% Yorkshire; 5% eram das raças Buldogue Francês, Buldogue Inglês e Dachshund. As raças, American Bully, Border Collie, Bull Terrier, Golden Retriever, Labrador, Maltês terrier, Pastor Suíço Branco e Pinscher miniatura, foram representadas por 2% cada (Figura 12). FIGURA 8 - Representação gráfica das porcentagem de cães por raças com 30 DAC e RAA Entre os cães testados, 26% deles alimentavam-se exclusivamente de ração comum; 16% comiam ração hidrolisada hipoalergênica; 8% ingeriam alimentação caseira e 50% consumiam além da ração, petiscos diversos como biscoitos caninos, frutas e comida caseira. Dos trinta e oito cães participantes, 8% apresentavam sintomas gastrointestinais intermitentes e a otite foi relatada em 55% deles. 5.1. TESTE DE PUNTURA As proteínas que mais apresentaram reação no teste de puntura (Prick Test) foram frango em 71% animais, seguido da carne bovina em 68% dos indivíduos, ovo e soja em 66% dos animais, seguidos de carne suína em 58%, leite em 55% e, por fim o peixe em 52% dos indivíduos. Com relação à resposta aos carboidratos no teste de puntura, a batata foi a que mais resultou positivos com 68% animais. Trigo, arroz e mandioca foram positivos em 58% dos animais testados. FIGURA 9 - Demonstração gráfica das reações ao teste de puntura a alimentos em cães com DAC e RAA em porcentagem 31 5.2. TESTE DE CONTATO Com relação ao teste de contato, as proteínas que mais causaram reação também foram a de frango com 90% dos animais, seguida da carne bovina com 82%. Soja e carne suína foram positivas em 79% dos animais , ovo em 71%, peixe com 68% e leite com 66% dos animais. Dentre os carboidratos, os que tiveram mais respostas positivas no teste de contato foram o milho com 74% de positivos, seguido da mandioca e arroz com 66% cada, a batata com 47% e o trigo com 42% de animais reativos (Tabelas 3 e 4) (Figuras 14 e 15). FIGURA 10 - Demonstração gráfica do número de reações aos alimentos testados no Teste de Contato Alérgico em porcentagem Foi utilizada a análise de concordância Kappa de Cohen para avaliar a correlação entre os testes de puntura e de contato. O nível de rejeição foi fixado em 5% por Fleiss (1981) e para a interpretação do valor de kappa, baseou-se nos critérios de Landis e Koch (1977) (Tabela 5). 32 TABELA 1 - Análise de concordância Kappa de Cohen entre os testes de puntura e de contato Concordância Kappa P Replicabilidade Porco 0,5789 0,0732 0,3057 Fraca Vaca 0,7105 0,2455 0,0536 Fraca Soja 0,7632 0,4203 0,0031 Boa Peixe 0,5526 0,0300 0,4255 Fraca Frango 0,6579 -0,0249 0,4270 Fraca Ovo 0,5789 0,0288 0,4291 Fraca Leite 0,4211 -0,1977 0,1059 Fraca Trigo 0,5263 0,0757 0,3119 Fraca Arroz 0,5526 0,0583 0,3577 Fraca Batata 0,4737 -0,0326 0,4127 Fraca Mandioca 0,5000 -0,0525 0,3714 Fraca As proteínas apresentaram mais reações que os carboidratos em ambos os testes. Dentre os 38 cães, 95% manifestaram resultados positivos em ambos os testes de puntura e de contato alérgico. 33 6 DISCUSSÃO O fato de a maioria dos cães selecionados com dermatite atópica serem fêmeas (76%) pode ser explicado pela maior prevalência do gênero na rotina de atendimento. Outros estudos também evidenciaram a prevalência de fêmeas, Alves et al., 2018 e Neto, A. S., 2012 encontraram a porcentagem de 66,6% de fêmeas em seus estudos, Vandressem, 2014, encontrou 79% de fêmeas. Entretanto, alguns trabalhos também brasileiros, diferem desses resultados como Diogo et al. (2014), e Farias (2007) que concluíram que não há predisposição sexual na incidência de DAC. Com relação às raças, os mestiços e os cães da raça Lhasa Apso representaram a maioria nesse estudo, seguidos do Shih tzu, Yorkshire Terrier, Bulldog Inglês, Bulldog Francês, Dachshund e com um representante cada apareceram as raças American Bully, Border Collie, Bull Terrier, Golden Retriever, Labrador, Maltês, Pastor Suíço Branco e Pinscher Miniatura, corroborando em partes com o estudo de Alves et al. (2018) que revelou que as raças mais acometidas foram os mestiços seguidos de Poodle, Yorkshire Terrier, Lhasa Apso, Chow-Chow e Beagle. Um estudo multicêntrico, analisou a predisposição racial entre três continentes e concluiu que a mesma pode mudar conforme a localização geográfica e, ainda, pode ser diferente na mesma região, porém, em momentos diferentes, o que pode ser explicado pelo fator cultural regional, levando os tutores a se interessarem mais por algumas raças que por outras em diferentes momentos (Jaeger et al.,2009). O fato de a maior parte dos cães terem como alimentação regular ração associada a petiscos nos faz prever que muitos já terão desenvolvido sensibilidade a um grande número de proteínas já que as rações em sua maioria são produzidas com uma variável gama de ingredientes diferentes, por consequência, esses cães desde tenra idade entram contato e podem sensibilizar-se a múltiplos alérgenos alimentares. Isso dificulta ainda mais a tarefa de seleção de ingredientes originais apenas pelo histórico alimentar do animal. Dos trinta e oito cães participantes, 8% apresentavam diarreia intermitente e a otite foi relatada em 55% deles, corroborando com a literatura 34 que demonstra que metade dos cães acometidos por DAC com RAA apresentam otite externa e esse pode ser, inclusive, o único sinal. A doença otológica associada a desordens gastrointestinais, principalmente diarréia, representam de 6 a 44% dos sinais nesses pacientes (Picco et al., 2008; Proverbio et al., 2010; Volkmann et al., 2010; Johansen et al., 2017; Miller et al., 2018). A justificativa se dá devido à predisposição genética com relação à disfunção de barreiras cutânea e intestinal associada ao sistema imunológico hiperativo e às disbioses manifestadas pelos animais atópicos (Craven et al., 2004; Xavier e Podolsky, 2007; VazquezBaeza et al., 2016). RAA representa a causa mais frequente de diarreia crônica primária em cães e, aproximadamente 50 a 60% dos caninos com enteropatias crônicas respondem à mudança dietética (Allenspach et al., 2016; Volkmann et al., 2017; Miller, 2018). Demonstrou-se que os alimentos mais comumente causadores de reações são a carne bovina, derivados lácteos, frango e o trigo (Roudebush, 2013; Mueller et al., 2016). No presente estudo foi observado que os alimentos que reagiram em maior número foram também as proteínas, o que corrobora com a tese de que são os alimentos que mais causam sensibilidade alimentar nos cães (Taylor et al., 1987; Muller et al.,2020). Mais de 94% dos cães estudados obtiveram resultados positivos em ambos os testes. Isso justifica a informação de que animais que apresentam RAA manifestam prurido grave e perene ( Hillier, 2001; Halliwell, 2006; Hensel, 2015), visto que no teste de puntura, após inoculação do alérgeno no animal previamente sensibilizado, imediatamente IgE específicas pré formadas ligadas aos receptores das membranas dos mastócitos, promovem a degranulação e liberação de citocinas inflamatórias como IL-4 e IL-13 responsáveis pelo prurido. Por outro lado, concomitantemente inicia-se a reação celular causada por linfócitos T sensibilizados horas após o evento. As citocinas liberadas dos linfócitos T ativados incluem vários fatores que afetam a atividade de macrófagos, neutrófilos e células linfóides (Hill et al., 2004). Portanto, ao ser exposto ao alérgeno alimentar através das refeições regulares, o estímulo constante e a presença dos dois mecanismos perpetua o prurido fazendo com que ele se manifeste de forma grave e perene. Tanto no teste de puntura quanto no teste de contato, a proteína que mais 35 apresentou reação nos animais foi a de frango, o que pode ser explicado pelo fato do Brasil ser um país que produz proteína aviária em larga escala, tornando essa a de maior abundância na formulação das rações comerciais atuais, provavelmente o que faz com que os cães sejam expostos de forma precoce e contínua a esta proteína, favorecendo sua sensibilização e desenvolvimento de hipersensibilidade alimentar. O mesmo raciocínio se dá quando levamos em consideração que a segunda proteína mais reativa, tanto no teste de puntura quanto no de contato foi a carne bovina corroborando com a tese de Rodebush (2013) e Muller (2020). No caso dos derivados lácteos que aparecem dentre as proteínas mais causadoras de RAA nesses mesmos estudos citados, no presente trabalho o leite apresentou reação em 55% no teste de puntura e 66% no de contato, confirmando serem esses, alimentos muito reativos em animais com DAC. O índice kappa demonstrou que os testes de puntura e de contato, apresentaram fraco índice de concordância, confirmando estudo feito por Possebom et al., 2022, o que se justifica pelo fato de que cada teste identifica um mecanismo imunológico diferente. Enquanto o teste de puntura identifica aqueles alimentos que apresentam reação imunológica imediata ou tipo I (humoral), o teste de contato detecta alimentos que estimulam a resposta celular (reação imunológica dos tipos III e IV). Estudo recente demonstrou sensibilidade de 80%, especificidade de 66,7%, valor preditivo positivo de 66,7% e um valor preditivo negativo de 80% quando ambos os testes são combinados (Possebom et al., 2022), confirmando a ideia de que a associação entre os testes torna a escolha dos alimentos mais ágil e prática. 36 7 CONCLUSÃO Os alimentos que mais causam reações positivas nos testes de puntura e de contatos são as proteínas. Na região de Botucatu, mais especificamente, os cães apresentaram mais reações positivas às proteínas de frango e de bovino. A dieta de eliminação seguida do teste de provocação alimentar são necessários para a confirmação da HA e posterior decisão de qual alimento fará parte da alimentação regular do cão alérgico. A literatura indica que a dieta de eliminação seja composta de uma proteína e um carboidrato aos quais o cão nunca tenha tido contato. Entretanto, as rações comerciais são compostas de uma vasta gama de ingredientes, com proteínas e carboidratos de várias origens e tipos diferentes numa mesma formulação, consequentemente, a dificuldade para se selecionar um alimento original (ainda não consumido pelo cão) é imensa. A associação entre os testes de puntura e de contato apresentam alta sensibilidade e alto valor preditivo negativo (Possebom et al., 2022), o presente estudo demonstrou ainda baixa concordância entre si concluindo que os testes são complementares e úteis para que se faça a seleção dos alimentos. É nesse contexto que se sugere a importância dos testes alérgicos associados, os quais auxiliam os veterinários na escolha do alimento que será utilizado na dieta de eliminação caso seja feita a opção pelo uso da dieta caseira. 37 REFERÊNCIAS ALLENSPACH, K.; CULVERWELL, C.; CHAN, D. Long-term outcome in dogs with chronic enteropathies: 203 cases. Vet Rec, v. 178, n. 15, p. 368, 2016. ALVES, B. H.; VIANA, J. 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" Protocolo CEUA 0079/2022, a ser conduzido por Juliana Theodoro de Souza Angerami, responsável/orientador Luíz Henrique de Araújo Machado, para fins de pesquisa científica/ensino - encontra-se de acordo com os preceitos da Lei nº 11.794, de 08 de outubro de 2008, do Decreto nº 6.899, de 15 de julho de 2009, e com as normas editadas pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal - CONCEA. Finalidade PESQUISA CIENTÍFICA Vigência do projeto 02/05/2022 a 01/03/2024 Nome Comum / Espécie / Linhagem CANINA / CANIS LUPUS FAMILIARIS / canis Familiares Raça INDEPENDE DA RAÇA Nº de animais machos 0 Nº de animais fêmeas 0 Nº de animais sexo indefinido 50 Peso médio de animais machos 0 Peso médio de animais fêmeas 0 Peso médio de animais sexo indefinido 1 A 40KG Idade 3 ano(s) e 0 mes(es) e 0 dia(s). Procedência cães atendidos no hospital veterinário Projeto de Pesquisa aprovado em reunião da CEUA em 17/04/2022 41 Presidente da CEUA da FMVZ, UNESP - Campus de Botucatu Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Seção Técnica Acadêmica Rua Prof. Dr. Walter Mauricio Corrêa, s/n UNESP - Campus de Botucatu/SP - Cep 18618-681 (14) 3880-2176 - patrizia@fmvz.unesp.br - www.fmvz.unesp.br JULIANY GOMES QUITZAN mailto:patrizia@fmvz.unesp.br http://www.fmvz.unesp.br/ 42 APÊNDICE A ARTIGO CIENTÍFICO *Trabalho a ser enviado para a revista Veterinary Dermatology TESTES DE PUNTURA E DE CONTATO NA AVALIAÇÃO DA REAÇÃO ADVERSA 1 A ALIMENTOS EM CÃES COM DERMATITE ATÓPICA NA REGIÃO DE 2 BOTUCATU 3 4 Juliana Theodoro de Souza Angeramia, Victória Gardinal Mazzieroa, Amanda 5 Stefaniszena, Marconi Rodrigues Fariasb, Maria Lúcia Gomes Lourençoa, Luiz 6 Henrique de Araújo Machadoa 7 8 a Department of Veterinary Clinic, School of Veterinary Medicine and Animal Science, 9 São Paulo State University (UNESP), Botucatu, Brazil. 10 11 b Departamento de Clínica Médica Veterinária, Faculdade Pontifícia Universidade 12 Católica do Paraná (PUCPR), Curitiba, Brasil. 13 14 15 Resumo 16 17 Atualmente a dermatite atópica é uma das doenças pruriginosas alérgicas que mais 18 acomete os cães, estima-se que sua morbidade varie de 10 a 15% (1,2). Ela pode ser 19 desencadeada por alérgenos ambientais e/ou alimentares, sendo que até 25% dos 20 animais que têm dermatite atópica possuem também reação adversa a alimentos (3, 21 4, 5). O objetivo do presente estudo foi avaliar os testes alérgicos cutâneos, de puntura 22 e de contato, para alérgenos alimentares em cães previamente diagnosticados com 23 dermatite atópica e demonstrar quais são os alimentos que mais causam reações 24 alérgicas nos cães na região de Botucatu. Trinta e oito cães com diagnóstico clínico 25 de dermatite atópica, foram submetidos a testes alérgicos de puntura e de contato 26 para alimentos. As proteínas apresentaram mais reações que os carboidratos em 27 ambos os testes e as que mais reagiram foram o frango e a carne bovina. A literatura 28 indica que a dieta de eliminação seja composta de uma proteína e de um carboidrato 29 aos quais o cão nunca tenha tido contato. O presente estudo demonstrou baixa 30 concordância entre si podendo-se concluir que são complementares e úteis para que 31 se faça a seleção dos alimentos. É nesse contexto que se sugere a importância dos 32 testes alérgicos associados, os quais auxiliam os veterinários na escolha do alimento 33 que será utilizado na dieta de eliminação. Portanto, a utilização dos testes de puntura 34 e de contato conjuntamente, diminui o tempo gasto e facilita a escolha dos alimentos 35 utilizados nas dietas de eliminação e restrição alimentar sendo, dessa forma, de 36 grande importância na melhoria da qualidade de vida de pacientes e tutor. 37 38 Palavras-chaves: Dermatite atópica, reação adversa a alimentos, testes alérgicos 39 cutâneos. 40 43 Introdução 41 42 A Dermatite Atópica Canina (DAC) é uma doença tegumentar comum, inflamatória, 43 pruriginosa, geneticamente predisposta e crônica que possui sinais clínicos 44 característicos, perenes, que sofrem exacerbações sazonais. Na maior parte das 45 vezes a DAC está associada à produção de IgE contra alérgenos ambientais e sua 46 prevalência estimada nos cães está entre 10 a 15% (1,2). No entanto, as reações 47 adversas a alimentos (RAA) também são associadas à DAC no cão, já que tanto a 48 ingestão de alimentos quanto o contato com alérgenos ambientais podem 49 desencadear exacerbações da DAC (3,4,5). A formação de IgE alérgeno-específica, 50 não é pré- requisito para o seu desenvolvimento, já que a DAC é uma doença 51 multifatorial que envolve defeitos de barreira cutânea, desregulação imunológica, 52 disbiose e sensibilização alérgica (6,7).Cães atópicos apresentam os primeiros 53 sinais clínicos ainda filhotes, entre os seis meses e os três anos de idade e aqueles 54 cuja indução se dá por sensibilização a alimentos são estimados entre 38% a 48% e 55 a manifestam antes do primeiro ano de vida (8,9,10).Uma classificação que leva em 56 consideração os fatores extrínsecos divide a DAC em stricto sensu referindo-se aos 57 cães que são sensibilizados especificamente à alérgenos ambientais, latu sensu, 58 que são aqueles animais polissensibilizados tanto a alimentos quanto a alérgenos 59 ambientais e simili, cujos pacientes possuem eczema atópico porém sem a produção 60 de IgE alérgeno especÌfica (5). As apresentações clínicas variam conforme a 61 genética (predisposição racial), estágio da doença (aguda ou crônica), infecções 62 secundárias (bactérias e leveduras) e extensão das lesões (localizadas ou 63 generalizadas) (11). O prurido alesional é o principal sinal clínico inicial, seguido de 64 eritema, podendo levar a alopecia auto-induzida, escoriações e infecções 65 secundárias por bactérias e leveduras, com pápulas, pústulas e crostas na doença 66 aguda. Em estágios mais crônicos, ocorrem lesões cutâneas secundárias devido ao 67 auto traumatismo. As regiões mais comumente afetadas são: face, região côncava 68 do pavilhão auricular, ventre, axilas, região inguinal, área perineal, extremidades 69 distais e flexuras dos membros (11,12,13). O diagnóstico é clínico, inexistindo sinais 70 típicos patognomônicos e se dá através do histórico, sinais clínicos, exclusão de 71 outras dermatopatias pruriginosas infectoparasitárias e alérgicas e presença de ao 72 menos 5 dos 8 critérios estabelecidos por Favrot (7,13). 73 74 Fisiopatologia da DAC 75 76 A fisiopatologia da DAC é complexa e multifatorial. Envolve falha de barreira 77 cutânea devido a diminuição dos lipídios no extrato córneo (principalmente de 78 ceramidas); falha na expressão da filagrina, facilitando a penetração microbiana; 79 desenvolvimento de disbioses e a perda hídrica transepidérmica, além de uma 80 resposta inflamatória e imunogênica anormal (7,11). Após penetração do antígeno 81 microbiano, este é captado pela célula de Langerhans epitelial e por ela carreado até 82 o linfonodo regional onde é apresentado para a célula Th0. Esta, por sua vez, sob 83 influência da IL-4 sofre transformação em Th2 (14). Portanto, na fase aguda da 84 doença ocorre um predomínio de resposta Th2 com o envolvimento de citocinas 85 como IL-4, IL-5, IL-6, IL- 13 e IL-31 (6,15). As citocinas IL-4, IL-13 e IL-31, 86 desempenham um papel fundamental no desenvolvimento e progressão da DAC. IL-87 4 e IL-13 estimulam as células B a produzir IgE e IL-31 é a principal citocina 88 pruritogênica na DAC (5). No entanto, conforme ocorre a progressão da doença e 89 sua consequente cronicidade, acontece uma alteração da resposta imunológica para 90 44 células Th1, Th17 e Th22, além de Th2 e consequente piora da inflamação (15). 91 Hipersensibilidade Alimentar (HA) é uma reação imunomediada, específica, que 92 ocorre após exposição a um alimento, inclui a hipersensibilidade mediada por IgE, 93 não mediada por IgE ou a combinação de ambas (16,17). Na maior parte das vezes, 94 a HA é causada por uma reação imunológica tipo I, imediata. No entanto as reações 95 tipo III e tipo IV, mediadas por células, também são relatadas (18,19). A presença de 96 sinais gastrointestinais, como diarreia, vômito, tenesmo, fezes moles, flatulência e 97 aumento do número de evacuações é mais tipicamente observada na DA induzida 98 por alimentos, pacientes com fístula perianal também foram associados com HA 99 (8,13,11,20). Além disso, cães com HA tendem a apresentar sintomas perenes de 100 prurido crônico e grave, normalmente pouco responsivos a glicocorticóides e em 101 47% dos casos, o prurido pode ser sua única manifestação. Estes, podem 102 manifestar também 3 vezes mais otites quando comparados àqueles reativos 103 apenas a alérgenos ambientais (8,13,20). Em cães, os antígenos alimentares mais 104 comumente identificados são carne bovina, laticínios, frango, ovo, soja, cordeiro, 105 peixe, trigo e arroz (21,18,19). O diagnóstico de HA é feito por meio de dieta de 106 exclusão de 6 a 8 semanas, seguida do desafio alimentar. A dieta é elaborada com 107 proteínas e carboidratos originais (que nunca foram ingeridos pelo cão) por meio de 108 alimentação caseira ou ração comercial hidrolizada, os ingredientes que farão parte 109 da dieta de exclusão podem ser triados através do histórico do animal ou, ainda, por 110 meio de testes alérgicos. Os testes de puntura e de contato com antígenos 111 alimentares têm sido recomendados como auxílio na escolha dos ingredientes da 112 dieta de eliminação (18,19,15, 22). Como HA em cães com dermatite atópica tem 113 componente mediado por células, trabalhos que avaliem os testes de contato 114 alérgico para alimentos em cães com prurido crônico foram desenvolvidos e 115 demonstraram que este não pode ser utilizado no diagnóstico da RAA, porém, pelo 116 seu alto valor preditivo negativo, pode ser indicado na seleção de dietas restritivas 117 (23,24). 118 119 Material e Métodos 120 121 Foram admitidos no estudo,trinta e oito cães com diagnóstico clínico de DA, com 122 faixa etária entre 1 e 7 anos de idade, com controle de ectoparasitas atualizado que 123 passaram por descarte de doenças pruriginosas que pudessem se assemelhar ou se 124 sobrepor a DAC. Todos os animais triados para o estudo foram submetidos a testes 125 alérgicos de puntura e de contato para alimentos e, para serem incluídos, deveriam 126 apresentar reação positiva no mínimo a um alimento em ao menos um dos 127 testes.Fármacos que interferem nos resultados dos exames foram descontinuados, 128 tais como anti-histamínicos orais (7 dias), glicocorticóides de curta duração e tópicos 129 (14 dias), glicocorticóides injetáveis de longa duração (28 dias), Maleato de 130 oclacitinib oral (2 dias), lokivetmab e ciclosporina não tiveram seu uso 131 descontinuado. A seleção dos alimentos submetidos aos testes foi feita baseada nos 132 ingredientes mais utilizados na formulação da maior parte das rações 133 comercializadas no Brasil. 134 135 Prick Test 136 137 Para os testes de puntura foi realizada tricotomia com lâmina número 40 na região 138 torácica lateral de aproximadamente 15cm por 8 cm, foram demarcados com pincel 139 marcador permanente pontos com 1,5cm equidistantes entre si. Como controle 140 45 negativo foi utilizada solução salina e o controle positivo, histamina (10mg/ml). Os 141 extratos alimentares testados foram a base de proteínas bovina, de frango, pescado, 142 ovo, leite, soja, trigo, além de arroz, batata inglesa e mandioca (Figura 1). As 143 punturas foram feitas com o uso de puntores de ponta múltipla, um para cada 144 extrato, pressionando sua ponta contra a superfície da pele por 5 segundos para que 145 o extrato fosse inoculado transepidermicamente (Figura 2). A leitura do teste foi146 realizada após 15 minutos, fazendo-se a marcação das pápulas com pincel147 permanente e em seguida a mensuração com paquímetro digital dos diâmetros148 maior e seu perpendicular e então feita a média entre eles (Figuras 3). A reação foi149 considerada positiva quando as pápulas apresentavam 3mm de diâmetro acima do150 diâmetro do teste negativo, excluindo-se assim, a possibilidade da reação ser151 causada pela irritação da puntura.152 153 Teste de Contato Alérgico (Patch Test) 154 155 Os extratos para o teste de contato alérgico foram elaborados a partir dos seguintes 156 alimentos: carnes cruas de bovino, suíno, frango, peixe, leite, ovo cru de galinha 157 inteiro (clara e gema), soja, farinha de trigo, farinha de arroz, farinha de milho, batata 158 inglesa cozida e mandioca cozida. Foram adquiridos em supermercado, 159 processados em um processador de alimentos, pesados com balança digital na 160 proporção de 500 mg de alimento para 0,2 ml de petrolato (24). Em seguida, todos 161 os extratos foram dispostos em poços individuais de 8 mm em contensores 162 hipoalergênicos para teste de contato alérgico, mantendo sempre um poço 163 preenchido somente com petrolato para o controle negativo (figura 4). Para 164 aplicação do teste, os cães foram submetidos a tricotomia na região lateral torácica 165 de aproximadamente 15 cm por 8cm com lâmina de tosa número 40. Os adesivos 166 contendo os poços foram fixados na área delineada e, para minimizar o risco de 167 movimentação, os animais foram envolvidos com uma atadura elástica e, logo após, 168 vestidos com roupa cirúrgica (figura 5). A leitura foi feita após 48 horas, a presença 169 de eritema, pápulas, placas eritematosas e ou microvesículas foram consideradas 170 reações positivas, como estabelecido por Johansen et al, 2017(Figura 6). 171 172 Resultados 173 174 Fizeram parte do estudo 38 cães que apresentaram resultados positivos a pelo 175 menos 1 alimento em ao menos 1 dos testes, destes, 76% eram fêmeas e 24% eram 176 machos, a média foi de 3,8 anos, sendo que a idade mínima definida para a 177 participação no estudo foi de 1 ano e a máxima de 7 anos. 21% eram mestiços; 18 178 % eram da raça Lhasa Apso; 13% eram Shih tzu; 10% Yorkshire Terrier; 5% eram 179 das raças Buldogue Francês, Buldogue Inglês e Teckel cada. As raças, American 180 Bully, Border Collie, Bull Terrier, Golden Retriever, Labrador, Maltês, Pastor Suíço 181 Branco e Pinscher Miniatura, foram representadas por 21 % cada (Figura 7). Entre 182 os cães testados, 26% deles alimentavam-se exclusivamente de ração comum; 16% 183 comiam ração hidrolisada hipoalergênica; 8% ingeriam alimentação caseira e 50% 184 consumiam além da ração, petiscos diversos como biscoitos caninos, frutas e 185 comida caseira. Do total, 8% apresentavam sintomas gastrointestinais intermitentes 186 e otite foi relatada em 55% dos cães participantes. As proteínas que mais 187 apresentaram reação no teste de puntura foram o frango, 71% de animais 188 responsivos, seguido da carne bovina com 68% de indivíduos, ovo e soja 189 representaram 66% de animais cada, seguidos de carne suína com 58%; leite, 55% 190 46 e, por fim, o peixe com 53% de indivíduos.Com relação à resposta de carboidratos 191 no teste de puntura, a batata foi a que mais resultou positivos com 68% de animais. 192 Trigo, arroz e mandioca foram positivos em 58% dos animais testados. Com relação 193 ao teste de contato, as proteínas que mais causaram reação também foram a de 194 frango com 90%, seguida da carne bovina com 82% de animais. Soja e a carne 195 suína foram positivas em 79% de animais, ovo em 71%, peixe com 68% e leite com 196 66%. Dentre os carboidratos, os que tiveram mais respostas positivas no teste de 197 contato foram o milho com 74%; seguido da mandioca e arroz com 66% cada; a 198 batata com 47% e o trigo com 42% de animais reativos. 199 200 Discussão 201 202 O fato de a maioria dos cães selecionados com dermatite atópica serem fêmeas 203 (73%) pode ser explicado pela maior prevalência do gênero na nossa rotina de 204 atendimento. Outros estudos também evidenciaram a prevalência de fêmeas, onde 205 encontraram entre 67% e 79% de fêmeas (25,26). Entretanto, alguns trabalhos 206 também brasileiros, diferem desses resultados e concluíram que não há 207 predisposição sexual na incidência de DAC (27,28). Com relação às raças, os 208 mestiços e os cães da raça Lhasa Apso representaram a maioria nesse estudo, 209 seguidos do Shih-Tzu, Yorkshire, Buldogue Inglês, Buldogue Francês, Teckel e com 210 1 representante cada apareceram as raças American Bully, Border Collie, Bull 211 Terrier, Golden Retriever, Labrador, Maltês, Pastor Suíço e Pinscher, corroborando 212 em partes com o estudo que revelou que as raças mais acometidas foram os 213 mestiços, poodle, yorkshire, lhasa-apso, chow-chow, beagle, labrador, schnauzer e 214 shih-tzu, segundo estudo de caso que levou em consideração 33 cães atópicos no 215 Brasil (29). Num estudo multicêntrico, foi analisada a predisposição racial entre três 216 continentes e concluiu que a mesma pode mudar conforme a localização geográfica 217 e, ainda, pode ser diferente na mesma região, porém, em momentos diferentes (12). 218 O fato de que a maior parte dos cães terem como alimentação ração mais petiscos 219 nos faz prever que muitos já terão desenvolvido sensibilidade a um grande número 220 de proteínas já que as rações em sua maioria são produzidas com uma variável 221 gama de ingredientes de diferentes origens o que faz com que esses cães desde 222 tenra idade tenham contato e desenvolvam alergia alimentar múltipla. Isso dificulta 223 ainda mais a seleção de ingredientes ditos originais apenas pelo histórico alimentar 224 do animal. Dos 38 cães participantes, 8% apresentavam diarréia intermitente e otite 225 foi relatada em 55% dos cães participantes, corroborando com a literatura que 226 demonstra que metade dos cães acometidos de DA com HA apresentam otite 227 externa e esse pode ser, inclusive, o único sinal. A otite externa associada a 228 sintomas gastrointestinais, principalmente diarréia, representam de 6 a 44% dos 229 atópicos (8,22,24,30,31). A possível explicação se dá pela predisposição genética de 230 possuírem disfunção de barreiras cutânea e intestinal, sistema imunológico 231 hiperreativo e disbioses (4,6,11,13,22). Estudos demonstraram que os alimentos 232 mais comumente causadores de reações são a carne bovina, derivados lácteos, 233 frango e o trigo (3,18). No presente trabalho foi observado que os alimentos que 234 reagiram em maior número foram as proteínas, o que corrobora com a tese de que 235 são os alimentos que mais causam sensibilidade alimentar nos cães (21,22,23,24). 236 Tanto no teste de puntura quanto no teste de contato, a proteína que mais 237 apresentou reação nos animais foi a de frango, o que pode ser explicado pelo fato 238 de o Brasil ser um país que produz proteína aviária em larga escala, tornando essa a 239 de maior abundância na formulação das rações comerciais atuais, provavelmente o 240 47 que faz com que os cães sejam expostos de forma precoce e contínua a esta 241 proteína, favorecendo sua sensibilização e desenvolvimento de hipersensibilidade 242 alimentar. O mesmo raciocínio se dá quando levamos em consideração que a 243 segunda proteína mais reativa tanto no teste de puntura quanto no de contato foi a 244 carne bovina corroborando com a literatura (3,18). No caso dos derivados lácteos 245 que aparecem dentre as proteínas mais causadoras de RAA nesses mesmos 246 estudos citados, no presente trabalho o leite apresentou reação em 55% no teste de 247 puntura e 66% no de contato, confirmando serem alimentos muito reativos. O índice 248 kappa demonstrou que os testes de puntura e de contato, apresentaram fraco índice 249 de concordância, pelo fato de que cada teste identifica um mecanismo imunológico 250 diferente (Tabela 1). Enquanto o teste de puntura indentifica aqueles alimentos que 251 apresentam reação imunológica imediata ou tipo I (humoral), o teste de contato 252 detecta alimentos que estimulam a resposta celular (reação imunológica do tipo III e 253 IV). 254 255 Conclusão 256 257 Os alimentos que mais causaram reações positivas nos testes de puntura e de 258 contatos foram as proteínas. Na região de Botucatu, mais especificamente, os cães 259 apresentaram mais reações positivas às proteínas de frango e de bovino. A dieta de 260 eliminação seguida do teste de provocação alimentar são necessários para a 261 confirmação da HA e posterior decisão de qual alimento fará parte da alimentação 262 regular do cão alérgico. A literatura indica que a dieta de eliminação seja composta 263 de uma proteína e um carboidrato aos quais o cão nunca tenha tido contato. 264 Entretanto as rações comerciais são compostas de uma vasta gama de ingredientes, 265 com proteínas e carboidratos de várias origens e tipos diferentes numa mesma 266 formulação, consequentemente, a dificuldade para se selecionar um alimento 267 original (ainda não consumido pelo cão) é imensa. É nesse contexto que 268 comprovamos a importância dos testes alérgicos de puntura e de contato associados 269 para agilizar e facilitar a escolha dos alimentos utilizados nas dietas de eliminação e 270 restrição alimentar. A associação entre os testes de puntura e de contato 271 apresentam alta sensibilidade e alto valor preditivo negativo (23), o presente estudo 272 demonstrou ainda, baixa concordância entre si concluindo que os testes são 273 complementares e úteis para que se faça a seleção dos alimentos. É nesse contexto 274 que se sugere a importância dos testes alérgicos associados, os quais auxiliam os 275 veterinários na escolha do alimento que será utilizado na dieta de eliminação caso 276 seja feita a opção pelo uso da dieta caseira. 277 Portanto, a utilização dos testes de puntura e de contato associados, diminui o 278 tempo gasto e facilita a escolha dos alimentos utilizados nas dietas de eliminação e 279 restrição alimentar sendo, dessa forma, de grande importância na melhoria da 280 qualidade de vida de pacientes e tutor. 281 48 REFERÊNCIAS 1- Hillier, A.; DeBoer, D.J.; 2001. The ACVD task force on canine atopic dermatitis. (XVII): intradermal testing. 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Journal of veterinary internal medicine, v. 31, n. 4, p. 1043-1055, 2017. 50 FIGURA 1 - Bandeja com os extratos alimentares e ambientais para o prick test Fonte: Victória Gardinal Mazziero. Serviço de dermatologia veterinária da FMVZ- UNESP- Botucatu. FIGURA 2 - Extratos recém administrados através dos puntores de ponta múltipla (nota-se a marcação da pele em forma de estrela comprovando que a puntura foi bem sucedida) Fonte: Arquivo pessoal. Serviço de dermatologia veterinária. FMVZ-UNESP- Botucatu 51 FIGURA 3 - Demarcação com caneta dermográfica para a medição das pápulas Fonte: Arquivo pessoal. Departamento de dermatologia veterinária, FMVZ- UNESP- Botucatu FIGURA 4 - À esquerda, gabarito vazado para auxiliar na leitura do teste de contato alérgico e à direita, contensores com os alimentos a serem testados Fonte: arquivo pessoal. Departamento de dermatologia veterinária, FMVZ- UNESP- Botucatu. 52 FIGURA 5 - Contensores preparados com extratos alimentares aderidos à lateral do tórax Fonte: Arquivo pessoal. FIGURA 6 - Região testada, 48 horas após retirada do adesivo para o teste de contato. As setas indicam as reações positivas Fonte: Arquivo pessoal. 53 FIGURA 7 - Representação gráfica das porcentagem de cães por raças com DAC e RAA TABELA 1- Teste de concordância Kappa entre os testes de puntura e de contato alérgicos por alimento Concordância Kappa P Replicabilidade Porco 0,5789 0,0732 0,3057 Fraca Vaca 0,7105 0,2455 0,0536 Fraca Soja 0,7632 0,4203 0,0031 Boa Peixe 0,5526 0,0300 0,4255 Fraca Frango 0,6579 -0,0249 0,4270 Fraca Ovo 0,5789 0,0288 0,4291 Fraca Leite 0,4211 -0,1977 0,1059 Fraca Trigo 0,5263 0,0757 0,3119 Fraca Arroz 0,5526 0,0583 0,3577 Fraca Batata 0,4737 -0,0326 0,4127 Fraca Mandioca 0,5000 -0,0525 0,3714 Fraca aa2384eae2c1bc65b94616135d8ecb70b6c71a2f2cd33fe2b53885f68ea8166e.pdf f36e4c4c24538e1adb86dfb9b58e3a1439e9e0cc70330026d8f7da75228dc753.pdf aa2384eae2c1bc65b94616135d8ecb70b6c71a2f2cd33fe2b53885f68ea8166e.pdf