RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 04/01/2020. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JÚLIO DE MESQUITA FILHO" Faculdade de Ciências Farmacêuticas Campus de Araraquara Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas Avaliação da eficácia e da citotoxicidade in vitro do ácido ursólico e sua incorporação em emulsão cosmética Fernanda Cardoso Colombo Araraquara - SP 2018 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JULIO DE MESQUITA FILHO" Faculdade de Ciências Farmacêuticas Campus de Araraquara Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas Avaliação da eficácia e da citotoxicidade in vitro do ácido ursólico e sua incorporação em emulsão cosmética Fernanda Cardoso Colombo Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Farmacêuticas, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Área de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos, para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Marcos Antonio Corrêa Araraquara - SP 2018 Colombo, Fernanda Cardoso C718a Avaliação da eficácia e da citotoxicidade in vitro do ácido ursólico e sua incorporação em emulsão cosmética / Fernanda Cardoso Colombo. – Araraquara, 2018. 123 f. : il. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas. Área de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos. Orientador: Marcos Antonio Corrêa. 1. Ácido ursólico (AU). 2. Antioxidante. 3. Despigmentante. 4. Antimicrobiana. 5. Citotóxico. 6. CLAE. I. Corrêa, Marcos Antonio, orient. II. Título. Ficha Catalográfica Elaborada por Diretoria Técnica de Biblioteca e Documentação Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP – Campus de Araraquara CAPES: 40300005 FernandaCardosoColombo SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 16 2. REVISÃO DA LITERATURA .............................................................................. 20 3. OBJETIVOS ....................................................................................................... 40 3.1. Objetivo geral ............................................................................................... 40 3.2. Objetivos específicos ................................................................................... 40 4. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 41 4.1. MATERIAL ................................................................................................... 41 4.2. MÉTODOS ................................................................................................... 43 4.2.1. Caracterização de MPAU ...................................................................... 44 4.2.2. Avaliação da eficácia e da citotoxicidade “in vitro” do AU ...................... 45 4.2.3. Preparo das emulsões ........................................................................... 55 4.2.4. Desenvolvimento e validação de metodologia analítica para quantificação de AU em emulsão ............................................................................................. 56 4.2.5. Avaliação da estabilidade das emulsões ............................................... 63 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 65 5.1. Caracterização de MPAU ............................................................................. 65 5.1.1. Identificação qualitativa do AU por espectroscopia na região IV ........... 65 5.1.2. Avaliação da solubilidade do AU ........................................................... 67 5.2. Avaliação da eficácia e da citotoxicidade “in vitro” do AU ............................ 68 5.2.1. Avaliação da atividade antioxidante ....................................................... 68 5.2.2. Avaliação da atividade despigmentante ................................................ 72 5.2.3. Avaliação da atividade antimicrobiana ................................................... 75 5.2.4. Avaliação do potencial citotóxico ........................................................... 79 5.3. Preparo das emulsões ................................................................................. 81 FernandaCardosoColombo 5.4. Desenvolvimento e validação de metodologia analítica para quantificação de AU em emulsão ..................................................................................................... 85 5.4.1. Desenvolvimento de metodologia analítica por CLAE ........................... 85 5.4.2. Validação da metodologia desenvolvida ................................................ 90 5.5. Avaliação da estabilidade das emulsões .................................................... 100 5.5.1. Teste de centrifugação ........................................................................ 101 5.5.2. Aspecto, cor e odor .............................................................................. 102 5.5.3. Determinação de pH ............................................................................ 105 5.5.4. Determinação da viscosidade .............................................................. 106 5.5.5. Determinação do teor de AU ............................................................... 108 6. CONCLUSÕES ................................................................................................ 110 7. REFERÊNCIAS ................................................................................................ 112 FernandaCardosoColombo RESUMO O aumento da preocupação com a estética e saúde corporal vem elevando a demanda por produtos cosméticos contendo ativos que previnam o envelhecimento e outras alterações cutâneas. O ácido ursólico (AU), ativo natural extraído de plantas como o alecrim e o manjericão, tem se demonstrado interessante para incorporação em cosméticos por possuir potencial antioxidante, despigmentante, propriedade antimicrobiana, entre outras. Este trabalho teve como objetivo avaliar a possibilidade da utilização do AU como um ativo cosmético multifuncional através da avaliação da eficácia e citotoxicidade in vitro do AU, bem como o preparo e avaliação de uma emulsão contendo o ativo. O potencial antioxidante do AU foi avaliado por meio de métodos de inibição de radicais como o 1,1-difenil-2-picrilhidrazila (DPPH•) e o 2,2 - azino bis-(3-ethylbenzothiazoline)-6-sulfonic acid (ABTS•+), tendo demonstrado atividade antioxidante, com IC50 de 235,61 µg/mL para técnica com DPPH• e 107,17 µg/mL para técnica com ABTS•+. A atividade despigmentante foi verificada através da inibição da enzima tirosinase, utilizando 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) como substrato, e apresentando como resultado um IC50 de 338,00 µg/mL. Para a avaliação da atividade antimicrobiana diversas cepas foram testadas a partir da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) pela técnica de diluição em microplacas, e da concentração bactericida mínima (CBM) pela replicação em placa de Petri, seguindo suplemento M100-S16 do CLSI. O AU demonstrou atividade antimicrobiana frente a cepa S.aureus com CIM de 25 μg/mL e CMB de 50 μg/mL; para S. epidermides com CIM de 25 μg/mL e CBM de 50 μg/mL; para E.coli, com CIM de 50 μg/mL e CBM de 50 μg/mL; a cepa P. aeruginosa revelou uma CIM de 25 μg/mL e CBM= 0. O potencial citotóxico in vitro foi avaliado através de técnica utilizando o corante 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)- (MTT) e queratinócitos humanos metabolicamente incompetentes, não tendo demonstrado citotoxicidade às células em uma concentração máxima de 50 µg/mL. Para incorporação em cosmético foi escolhida uma emulsão de alta estabilidade e como técnica de controle de qualidade do AU nessa emulsão foi desenvolvida e validada uma metodologia analítica por CLAE, utilizando os preceitos de química verde. Um estudo de estabilidade preliminar da emulsão preparada foi conduzido a fim de se avaliar a estabilidade do AU em uma emulsão estável frente a condições extremas, como temperaturas de 25, 40 e 5 ºC, luz indireta e ciclos de congelamento/ descongelamento. A emulsão preparada com AU demonstrou estabilidade para as características de pH e viscosidade, e com relação ao teor, foi mais estável a temperatura de 25 e 5 ºC. O AU, através dos ensaios in vitro realizados demonstrou caráter antioxidante, despigmentante e antimicrobiano, não sendo observada citotoxicidade às células utilizadas na faixa de concentração testada, além de ter demonstrado certa estabilidade na emulsão de escolha. Como pôde ser observado, este composto multifuncional demonstrou características in vitro de grande interesse para ser utilizado como ativo cosmético de uso tópico e possivelmente como um agente antimicrobiano, sendo assim necessário estudos mais aprofundados que possam garantir sua completa segurança e eficácia de uso. Palavras-chave: ácido ursólico (AU); antioxidante; despigmentante; antimicrobiana; citotóxico; CLAE. FernandaCardosoColombo ABSTRACT Increased concern with body esthetics and health has raised the demand for skin cosmetics containing actives that prevent aging and other skin changes. Ursolic acid (UA), a natural active extracted from plants as rosemary and basil, has shown an interesting compound for cosmetic incorporation, to possess antioxidant activity, depigmenting, antimicrobial property, among others. This study aimed to evaluate the possibility of using UA as a multifunctional cosmetic compound through the UA efficacy and cytotoxicity in vitro, and to prepare and evaluate an emulsion containing the substance. Antioxidant potential was tested using inhibition methods of radical 1,1- diphenyl-2-picrilhidrazila (DPPH•) and radical 2,2 -azinobis-(3-ethylbenzothiazoline)-6- sulfonic acid (ABTS•+) showing antioxidant activity, with IC50= 235,61 µg/mL for DPPH• technique and 107,17 µg/mL to ABTS•+ method. The depigmenting activity was given by inhibition of the enzyme tyrosinase with3,4- dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) substrate and show IC50 de 338,00 µg/mL. For evaluation of antimicrobial activity, many strains were tested from the minimum inhibitory concentration (MIC) determined by dilution method on microplates, and minimum bactericidal concentration (MBC) by Petri dish replication, following M100-S16 supplement CLSI. The UA demonstrated antimicrobial activity, with a MIC to S. aureus strain of 25 μg/mL and MBC of 50 μg/mL; to S. epidermides a MIC of 25 μg/mL and MBC of 50 μg/mL; to E. coli a MIC of 50 μg/mL and MBC of 50 μg/mL; the P. aeruginosa strain revealed a MIC of 25 μg/mL and MBC= 0. The cytotoxicity in vitro was determined for metabolically incompetent human keratinocytes ability reduce 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H- tetrazolium bromide (MTT) and as result the UA didn’t present cellular cytotoxicity in a maximum concentration of 50 µg/mL. To cosmetic incorporation, a high stability emulsion was choice and as quality control technique of UA in this emulsion, an analytical methodology for HPLC was developed and validated, using green chemistry precepts. To evaluate the emulsion, a preliminary stability study was conducted, for the purpose evaluate the stability of UA in a stable emulsion, front of extreme conditions as 25, 40 e 5 ºC temperatures, indirect light and freezing/ thawing cycles. The emulsion containing UA demonstrated stability for the pH and viscosity characteristics, and about content, was more stable with 25 and 5 ºC. The UA, through in vitro assays performed demonstrated antioxidant, depigmenting and antimicrobial character, no cytotoxicity was observed in the used cells in the concentration range tested, besides showing some stability in the emulsion of choice. As noted, this multifunctional compound demonstrated in vitro characteristics of great interest for use as topical cosmetic active and possibly as an antimicrobial agent, thus further studies are needed to ensure its complete safety and efficacy of use. Keywords: ursolic acid (UA), antioxidant, tyrosinase, antimicrobial, cytotoxic, HPLC. FernandaCardosoColombo LISTA DE FIGURAS Figura 1. Estrutura do AU e do AO. .......................................................................... 26 Figura 2. Radical DPPH• e sua forma reduzida. ....................................................... 30 Figura 3. Cascata de reações na produção dos pigmentos melânicos .................... 32 Figura 4. Espectrofotômetro de absorção na região IV Vertex 70- Bruker ............... 44 Figura 5. Esquema do preparo das microplacas para determinação da CIM ........... 51 Figura 6. Preparo das amostras finais do ensaio com MTT. .................................... 53 Figura 7. Esquema da montagem das placas para o ensaio com MTT .................... 54 Figura 8. Cromatógrafo Líquido Perkin Elmer Flexar ............................................... 57 Figura 9. Espectro de absorção IV de PDAU ........................................................... 65 Figura 10. Espectro de absorção IV de MPAU ......................................................... 66 Figura 11. Sobreposição dos espectros IV de PDAU e MPAU ................................. 67 Figura 12. Tubos reacionais do AU frente ao DPPH• ............................................... 69 Figura 13. Curva analítica do AU para a porcentagem de inibição de DPPH• .......... 69 Figura 14. Curva analítica do AA para a porcentagem de inibição de DPPH• .......... 70 Figura 15. Tubos reacionais do AU frente ao ABTS•+ ............................................... 71 Figura 16. Curva analítica do AU para porcentagem de inibição do ABTS•+ ............ 71 Figura 17. Curva analítica do AA para porcentagem de inibição do ABTS•+ ............ 72 Figura 18.Placa reacional do ensaio com tirosinase e AU ....................................... 73 Figura 19. Curva analítica do AU para porcentagem de inibição da tirosinase ........ 74 Figura 20. Curva analítica do AA para porcentagem de inibição da tirosinase ........ 74 Figura 21. Ensaio de CIM em microplaca (a) e CBM em placa de Petri (b) do AU frente à cepa S. aureus. ...................................................................................................... 77 Figura 22. Ensaio de CIM em microplaca (a) e CBM em placa de Petri (b) do AU frente à cepa S. epidermides. .............................................................................................. 77 Figura 23. Ensaio de CIM em microplaca (a) e CBM em placa de Petri (b) do AU frente à cepa E. coli. ............................................................................................................ 77 Figura 24. Ensaio de CIM em microplaca (a) e CBM em placa de Petri (b) do AU frente a cepa P. aeruginosa. ............................................................................................... 78 Figura 25. Placa reacional do ensaio de citotoxicidade com MTT ............................ 80 Figura 26. Emulsões preparadas sem AU (EM-BS) e com AU (EM-AU) .................. 83 FernandaCardosoColombo Figura 27. Características microscópicas de EM-BS (a) e EM-AU (b). .................... 84 Figura 28. Estrutura química do Poliacrilato de Sódio. ............................................. 84 Figura 29. Espectro UV de MPAU. ........................................................................... 86 Figura 30. Espectro UV de PDAU. ........................................................................... 86 Figura 31. Teste de concentrações .......................................................................... 87 Figura 32. Comparação dos cromatogramas das amostras de PDAU e MPAU ....... 88 Figura 33. Cromatograma final de MPAU 600 µg/mL ............................................... 89 Figura 34. Curva analítica final de linearidade.......................................................... 91 Figura 35. Gráfico de dispersão de resíduos ............................................................ 92 Figura 36. Cromatogramas sobrepostos das SPcb, SPd e SAm .............................. 95 Figura 37. Cromatogramas da solução de MPAU frente à solução de HCl .............. 96 Figura 38. Cromatogramass da solução de MPAU frente à solução de NaOH ........ 96 Figura 39. Cromatogramas da solução de MPAU frente à solução de H2O2 ............ 97 Figura 40. Cromatogramas da solução de MPAU frente à solução de H2O a 80 ºC . 97 Figura 41. Cromatogramas da solução de MPAU frente à solução de luz UV ......... 98 Figura 42. Emulsões submetidas à centrifugação a 3000 rpm. .............................. 101 Figura 43. Comparativo de aspecto e cor de EM-BS e EM-AU em T3 e T15 a 25 ºC ................................................................................................................................ 102 Figura 44. Comparativo de aspecto e cor de EM-BS e EM-AU em T3 e T15 a 40 ºC ................................................................................................................................ 103 Figura 45. Comparativo de aspecto e cor de EM-BS e EM-AU em T3 e T15 em luz indireta .................................................................................................................... 103 Figura 46. Comparativo de aspecto e cor de EM-BS e EM-AU em T3 e T15 em 5 ºC ................................................................................................................................ 104 Figura 47. Aspecto e cor de EM-BS e EM-AU em T12 no ciclo de congelamento/descongelamento ............................................................................. 104 Figura 48. Valores de pH da EM-BS obtidos na estabilidade preliminar ................ 105 Figura 49. Valores de pH da EM-AU obtidos na estabilidade preliminar ................ 106 Figura 50. Valores de viscosidade da EM-BS obtidos na estabilidade preliminar .. 107 Figura 51. Valores de viscosidade da EM-AU obtidos na estabilidade preliminar .. 107 Figura 52. Valores de teor de EM-AU ao longo dos 15 dias de experimento ......... 108 FernandaCardosoColombo LISTA DE TABELAS Tabela 1. Composição dos tubos reacionais para ensaio com o radical DPPH• ....... 46 Tabela 2. Composição dos tubos reacionais para ensaio com ABTS•+ .................... 47 Tabela 3. Composição dos poços reacionais do ensaio com tirosinase. .................. 49 Tabela 4. Fórmula da emulsão utilizada ................................................................... 55 Tabela 5. Preparo das soluções diluídas para análise da exatidão. ......................... 62 Tabela 6. Concentração de AU nos poços reacionais do ensaio antimicrobiano...... 76 Tabela 7. Concentração de AU nos poços reacionais do ensaio com MTT ............. 80 Tabela 8. Resultados obtidos para conformidade do sistema................................... 90 Tabela 9. Análise de variância dos valores obtidos na linearidade ........................... 92 Tabela 10. Teste t homocedástico para análise da precisão entre analistas ............ 94 Tabela 11. Resultado final para exatidão .................................................................. 99 Tabela 12. Resultados obtidos no parâmetro de robustez ...................................... 100 Tabela 13. Média e desvio padrão das concentrações (µg/mL) de AU na EM-AU no início, meio e fim do estudo de estabilidade preliminar, frente às condições submetidas ................................................................................................................................ 109 FernandaCardosoColombo LISTA DE QUADROS Quadro 1. Exemplos de estudos em diversas áreas utilizando AU. ......................... 28 Quadro 2. Estudos envolvendo metodologias por CLAE para AU. ........................... 38 Quadro 3. Significado dos termos descritivos de solubilidade .................................. 45 Quadro 4. Solubilidade do AU frente a solventes diversos ....................................... 67 Quadro 5. Análise detalhada da emulsão utilizada ................................................... 82 Quadro 6. Características físico-químicas das emulsões obtidas ............................ 83 FernandaCardosoColombo LISTA DE ABREVIATURAS AA- Ácido ascórbico ABTS•+- 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) AC- Ácido Cafeico ANVISA- Agência Nacional de Vigilância Sanitária AO- Ácido oleanólico AU- Ácido Ursólico BPF- Boas práticas de fabricação CG- Cromatografia gasosa CIM- Concentração Inibitória Mínima CLAE- Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CBM- Concentração Bactericida Mínima DMSO- dimetilsulfóxido DMEM- Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DPPH•- 2,2-difenil-1-picrilhidrazil DPR- Desvio padrão relativo EDTA- Ácido etilenodiamino tetra-acético EM-AU- Emulsão contendo ácido ursólico EM-BS- Emulsão base F calc. - Valor calculado do teste estatístico F tab. - Valor tabelado do teste estatístico IC50- Concentração inibitória de 50% IV- Infravermelho HaCat- Queratinócitos humanos metabolicamente incompetentes LD- Limite de detecção L- Dopa - 3,4- Dihydroxy-L-phenylalanine LQ- Limite de quantificação MPAU- Matéria-prima ácido ursólico MTT- 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide O/A- Óleo/água FernandaCardosoColombo OMS- Organização Mundial da Saúde PBS- Phosphate Buffer Saline PDAU- Padrão ácido ursólico RMN- Ressonância Magnética Nuclear SAm- Solução amostra SPcb- Solução placebo SPd- Solução padrão TSA- Triptona de Soja TSB- Tripticaseína Soja UV-VIS- Ultravioleta visível FernandaCardosoColombo Dedicatória Dedico este trabalho a todas as pessoas que de alguma forma estiveram envolvidas para que fosse possível seu desenvolvimento e conclusão. Assim, esta dedicatória vai para Deus, para toda minha família e amigos. Sem a amizade, tantos ensinamentos, carinho e força de vocês, eu não teria conseguido. Portanto, vocês são completamente merecedores desta dedicatória. Muito obrigada por estarem ao meu lado e fazerem parte dessa curta, porém grandiosa experiência da minha vida. FernandaCardosoColombo Agradecimentos Ao meu orientador, professor Doutor Marcos Antonio Corrêa, por ter confiado a mim o desenvolvimento de um de seus projetos e me aceitado como sua primeira orientanda de mestrado, por sempre ter me incentivado, se mostrado solicito e compreensivo, pela paciência, amizade e por ter me mostrado caminhos mais leves e tranquilos, tanto profissionais quanto pessoais, enfim por todos os enormes ensinamentos da pessoa grandiosa que é. À colaboradora e amiga Ms. Caroline Magnani Spagnol, por sempre ter estado disposta a me auxiliar em todo o desenvolvimento deste trabalho de forma integral e dedicada, pela amizade nos momentos de alegria e nos momentos de dificuldades, pela paciência e compreensão. À professora Dra. Vera Lucia Borges Isaac, ao professor Dr. André Gonzaga dos Santos e à professora Dra. Hérida Regina Nunes Salgado por todo o auxílio dado em partes importantes do desenvolvimento deste trabalho. Aos professores: Prof. Dr. Jean Leandro dos Santos, Prof.ª Dra. Regina Cicarelli e Prof.ª Dra. Juliana Álvares Duarte Bonini Campos por compartilharem seus conhecimentos e equipamentos no decorrer deste trabalho. Aos amigos que fiz na universidade durante todo o meu tempo de mestrado, e que sempre me auxiliaram de alguma forma, seja com conhecimento, troca de experiências, auxílio nos experimentos, conversas amigas nos momentos difíceis, e que além de tudo dividiram comigo os momentos de felicidade, conquistas e anseios: Bia Leone, Carol Kogawa, Dani Marcato, Alessandra Custódio, Gabi Prado, Gabi Almeida, Wagner, Isa Freitas, Ana Carolina, Ilza, Claudia, Jussara, Mari, Mateus, Caio, Vinícius, Fátima, Bia, entre outros. À minha família, por ter me dado todo suporte, apoio e incentivo, mesmo sem entender meus desejos e objetivos, e em especial à minha mãe Célia e meu pai Sérgio, que sempre acreditaram e investiram parte de seus sonhos em mim, estiveram FernandaCardosoColombo ao meu lado e me deram toda e a melhor base e educação para que eu me tornasse quem sou hoje, motivo pelo o qual se tornou possível o desenvolvimento e conclusão deste trabalho. Agradeço imensamente à Deus por ter permitido vocês como minha família. Ao meu companheiro de vida, Carlos, por toda dedicação, amor e carinho, paciência, os mais sábios conselhos, apoio incondicional em todos os momentos e por estar sempre ao meu lado nos momentos difíceis de ansiedade e angústia e nos momentos de felicidade e conquista, me mostrando todo o lado mais leve e mais simples das coisas. Sou eternamente grata a você por tudo e à Deus por ter colocado você em meu caminho. Sem você não teria sido possível chegar até aqui. À família que a vida me deu, meus queridos amigos que sempre estiveram ao meu lado tornando meus dias mais felizes e minha jornada mais leve, em especial aos amigos da Casa de Fraternidade Chico Xavier sempre presentes e dispostos a me trazerem a paz e a alegria que eu precisava para me manter firme do início ao fim, à minha sogra Neusa por todo o auxílio e apoio, e aos meus queridos amigos de longa data que sempre fizeram questão de tornar meu caminho mais alegre e divertido, além de me ensinarem a ser alguém melhor a cada dia. Aos funcionários da Faculdade de Ciências Farmacêuticas que sempre se mostraram solícitos em ajudar no que fosse necessário. À secretaria de pós-graduação, em especial Cláudia, Aniele, Daniela e Christiane. Ao Curso de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara da UNESP. À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal Nível Superior) pelo apoio financeiro concedido. FernandaCardosoColombo “Nascestes no lar que precisavas, vestistes o corpo físico que merecias, moras onde melhor Deus te proporcionou, de acordo com o teu adiantamento. Possuis os recursos financeiros coerentes com as tuas necessidades, nem mais, nem menos, mas o justo para as tuas lutas terrenas. Teu ambiente de trabalho é o que elegeste espontaneamente para a tua realização. Teus parentes, teus amigos são almas que atraístes, com a tua própria afinidade. Portanto, teu destino está constantemente sob teu controle. Tu escolhes, recolhes, eleges, atrais, buscas, expulsas, modificas tudo aquilo que te rodeia a existência. Teus pensamentos e vontades são a chave de teus atos e atitudes. São as fontes de atração e repulsão na tua jornada e vivência. Não reclames nem te faças de vítima. Antes de tudo, analisa e observa. A mudança está nas tuas mãos. Reprograma a tua meta, busca o bem e viverás melhor. Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo, qualquer um pode começar agora e fazer um novo fim”. Francisco Cândido Xavier 16 FernandaCardosoColombo 1. INTRODUÇÃO O aumento da expectativa de vida começou a ganhar força em meados de 1950 e vem aumentando em todo o mundo, principalmente graças aos avanços na área da saúde. No entanto, para garantia da qualidade de vida, uma série de fatores deve ser levada em consideração, como o bem-estar físico, a boa saúde mental e a interação social do indivíduo. Para isso, é necessário considerar necessidades individuais, tais como autonomia, novos significados de vida e autoestima (KALACHE et al., 1987; CAMARANO et al., 2004; VERAS, 2009). Assim, a fim de garantir um corpo saudável e autossatisfação, uma crescente preocupação com a saúde e com a estética corporal tem aumentado a demanda por produtos cosméticos capazes de prevenir o envelhecimento cutâneo e o aparecimento de patologias, uma vez que, com o aumento de idade, fatores genéticos e hormonais podem reduzir a atividade plena do sistema imunológico, causando inúmeras alterações no tecido cutâneo, podendo resultar em uma pele fina e ressecada, com manchas, rugas e possíveis carcinomas. Dentre estes produtos, tem recebido considerável atenção e interesse pelo mercado, seja por forte apelo de “marketing” ou não, os que possuem ativos de origem vegetal e que, de certa forma, reforçam a crescente preocupação atual com a sustentabilidade. Por esse motivo, a pesquisa de novos ativos para incorporação em produtos de administração tópica torna-se de grande relevância (RESENDE, 2013). Além dos fatores intrínsecos do indivíduo, fatores externos como a radiação solar também podem acelerar o envelhecimento, ocasionando uma das mais pronunciadas alterações à pele, denominadas de fotoenvelhecimento, que ocorre principalmente pela ação dos raios UV, a partir da produção de espécies químicas altamente reativas e instáveis (formadas por um não-emparelhamento de elétrons), chamadas de radicais livres, que são capazes de ligar-se a diferentes classes de moléculas, como o DNA, promovendo assim danos a vários tipos celulares do organismo, inclusive os produtores de colágeno e elastina. Nesse contexto, os antioxidantes, que podem ser naturais, adquiridos na dieta, ou sintéticos, atuam combatendo essas espécies altamente reativas, auxiliando na prevenção de danos celulares (FERREIRA et al., 1997; BARREIROS et al., 2006; MONTAGNER et al., 2009). 17 FernandaCardosoColombo Outro composto importante na proteção da pele é a melanina, um pigmento produzido por células especializadas do corpo humano, os melanócitos, que confere fotoproteção contra danos causados pela radiação UV. Sua produção ocorre a partir de organelas específicas geradas pelo retículo endoplasmático dos melanócitos, os melanossomos, em cujo interior produz- se o pigmento. Tal produção é mediada pela tirosinase, uma enzima chave responsável por iniciar a cascata de processos na produção da melanina, uma vez que transforma tirosina em L-DOPA que dará continuidade ao restante da cascata. Porém, a produção exacerbada deste pigmento pode causar certos inconvenientes, como o aparecimento de manchas na pele (ANTELO et al., 2008; SPAGNOL, 2014). Alguns ativos naturais ainda pouco explorados comercialmente, têm sido estudados por apresentarem potencial atividade preventiva contra danos causados ao tecido cutâneo, destacando-se as atividades antioxidante, despigmentante, antineoplásica e anti-inflamatória. O AU, um composto triterpenóide pentacíclico é um deles, e pode ser encontrado em uma grande variedade de espécies vegetais, muitas delas de origem brasileira que possuem grande importância na medicina fitoterápica. Além de todas as atividades anteriormente citadas, também é reportado ao AU atividade antimicrobiana, tornando- o um ativo multifuncional de grande interesse para incorporação em produtos de administração tópica, uma vez que pode contribuir para a prevenção de danos diversos causados à pele e atuar, ao mesmo tempo, como um conservante antimicrobiano (LIU, 1995; FRIGHETTO et al., 2005; SILVA et al., 2008; ELOY et al., 2012). Os produtos cosméticos, segundo a RDC Nº 7 da ANVISA de 2015, podem ser classificados em produtos de grau 1 e grau 2, sendo considerados os produtos de grau 2 como “produtos de higiene pessoal, cosméticos e perfumes (...) que possuem indicações específicas, cujas características exigem comprovação de segurança e/ou eficácia, bem como informações e cuidados, modo e restrições de uso”, ou seja, produtos cosméticos que apresentam substâncias ativas em suas formulações, e, por esse motivo, seu desenvolvimento e produção requerem altos padrões de qualidade para garantir eficácia e segurança ao consumidor. De um modo geral, um dos aspectos inerentes à segurança do consumidor, diz respeito à presença de um adequado sistema conservante (incluindo conservantes antimicrobianos), já que as 18 FernandaCardosoColombo matérias primas utilizadas podem oferecer um ambiente adequado à proliferação de microrganismos que podem prejudicar a qualidade do produto, podendo ser responsáveis por sua deterioração, baixa eficácia e possíveis danos à saúde do consumidor. A atividade antimicrobiana do AU foi avaliada em alguns estudos que comprovaram um potencial antimicótico e um amplo espectro contra bactérias, principalmente as gram-positivas, podendo dessa forma, sugerir estudos mais aprofundados do AU como um possível conservante antimicrobiano (AMARAL, 2010; BRASIL, 2015; JESUS et al., 2015). A fim de avaliar a segurança de um novo ativo em estudo, também devem ser realizados ensaios de toxicidade. O potencial citotóxico de um composto pode ser traduzido como a capacidade de gerar apoptose em uma célula. No caso do AU consiste na indução da apoptose de células tumorais sem afetar as células normais, além de prevenir a transformação de células normais em cancerígenas. O mecanismo dessa citotoxicidade ainda não foi completamente esclarecido, mas sabe-se que pode estar relacionado com a habilidade do AU em inibir a replicação do DNA, à medida que inibe suas enzimas metabólicas (DALLA VECHIA et al., 2009; RESENDE, 2013). Para a escolha da veiculação de ativos no desenvolvimento de novos produtos cosméticos grau 2, existem atualmente no mercado os mais variados tipos de cosméticos para a pele, sendo que as emulsões são uma das formas mais antigas e utilizadas graças às vantagens que possui, como facilidade de aplicação e preparo, possibilidade de utilização de categorias diversas de matérias-primas e obtenção de produtos de baixo custo. Estes sistemas emulsionados são definidos como sistemas dispersos formados pela junção de dois líquidos imiscíveis, em que um se apresenta como disperso e outro como dispersante e, devido às suas grandes vantagens citadas e a possibilidade de veiculação de compostos ativos em suas fórmulas, são amplamente escolhidas para o desenvolvimento de novos produtos, principalmente aqueles com maior estabilidade (CORRÊA et al., 2012). Uma questão importante no que diz respeito à garantia da qualidade de produtos é o emprego de técnicas analíticas qualitativas e quantitativas. A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é um dos métodos mais utilizados, e consiste em uma técnica de separação analítica que permite a realização de testes qualitativos e quantitativos de amostras de diversas naturezas. O desenvolvimento e 19 FernandaCardosoColombo a validação de novas metodologias (para essa e outras técnicas) exigem diversas etapas, e uma delas é a escolha dos materiais a serem utilizados, mediante as condições adotadas. Como nos últimos tempos, as mudanças climáticas ocorridas têm gerado preocupação no mundo todo, uma mudança de postura e de pensamento neste quesito tem trazido alterações significantes, principalmente para a indústria. Assim, os conceitos de sustentabilidade e química verde vêm ganhando bastante força no desenvolvimento de novos produtos e novas metodologias analíticas, uma vez que esses conceitos incluem redução da emissão de poluentes para o meio ambiente, maior segurança ao operador e menor custo (RIBANI et al., 2004; ALVES et al., 2010; ÇELIK et al., 2017; HAO et al., 2017). Ainda que o AU seja um composto natural e que apresente propriedades muito interessantes para incorporação em cosmético, é um ativo pouco explorado neste sentido no mercado e há poucos estudos que mostram a eficácia desse ácido incorporado a uma preparação com característica e apelo cosmético. Deste modo, este trabalho procurou avaliar a possibilidade da utilização do AU como um ativo cosmético multifuncional, explorando as possíveis atividades antioxidante, despigmentante e antimicrobiana. Além disso, propôs-se avaliar seu comportamento em relação à um dos quesitos de segurança, a partir do modelo de citotoxicidade in vitro realizado com cultura de células, e a avaliação de seu comportamento frente a incorporação em uma emulsão. 110 FernandaCardosoColombo 6. CONCLUSÕES ✓ O controle de qualidade da MP avaliada forneceu dados que proporcionaram confiabilidade à amostra. Porém através do ensaio de solubilidade foi possível perceber a dificuldade de solubilização que o AU apresenta, principalmente em água, o que acaba limitando a escolha dos materiais a serem utilizados e dos ensaios a serem realizados. Sendo assim, torna-se necessário o estudo de mecanismos que facilitem a solubilização do AU; ✓ A avaliação da eficácia do AU com relação à atividade antioxidante, despigmentante e antimicrobiana foi comprovada através dos ensaios empregados, tendo o AU apresentado uma boa atividade frente a todos os testes, principalmente no antimicrobiano, em que demonstrou um forte potencial para inibição e morte celular, o que reforça a ideia de um ativo bastante interessante, com características multifuncionais para prevenção de alterações indesejadas na pele e como um possível agente antimicrobiano de formulações, a ser mais explorado na área cosmética; ✓ Apesar do AU exigir uma concentração mais alta que o AA para inibição de 50% dos compostos nos ensaios realizados para atividade antioxidante e despigmentante, ele apresenta a vantagem de possuir atividade antimicrobiana e diversas outras reportadas em literatura, como atividade anti-inflamatória e antineoplásica, o que o tornam um ativo multifuncional interessante para a pesquisa e desenvolvimento de novos produtos multifuncionais. Além disso, sua associação com outros ativos antioxidantes e despigmentantes poderia aumentar a potência dos mesmos; ✓ Em concentrações até 50 µg/mL o AU não demonstrou citotoxicidade, porém é necessário o desenvolvimento de mecanismos que melhorem sua solubilidade, a fim de que se possa aumentar a concentração para o teste até a obtenção da máxima concentração em que não se observa citotoxicidade; ✓ A metodologia desenvolvida e validada apresentou a vantagem de, além de empregar preceitos de química verde, utilizando solventes menos tóxicos em comparação com as metodologias encontradas em literatura, ter apresentado um tempo de retenção menor do que os encontrados em literatura; 111 FernandaCardosoColombo ✓ A emulsão preparada com AU revelou poucas diferenças nas características físico-químicas como aspecto, pH e viscosidade comparada com a emulsão preparada sem AU; ✓ O estudo de estabilidade preliminar da emulsão contendo AU demonstrou que as características de pH e viscosidade da emulsão se mantém estáveis quando submetida a condições extremas. Porém o teor de AU é alterado, sofrendo decaimento, principalmente em temperaturas elevadas, indicando que alguns cuidados devem ser tomados quanto a temperatura de armazenamento de um produto acabado. 112 FernandaCardosoColombo 7. REFERÊNCIAS ALIGIANNIS, N.; KALPOUTZAKIS, E.; MITAKU, S.; CHINOU, I.B. Composition and antimicrobial activity of the essential oils of two Origanum species. J. Agric. Food Chem., v.49, p.4168-4170, 2001. ALMEIDA, M.G.J.; CHIARI, B.G.; CORREA, M.A.; MAN CHIN, C.; ISAAC, V.L.B. Validation of an alternative analytical method for the quantification of antioxidant activity in plant extracts. Acta Farm. Bonaer., v. 32, p. 90-95, 2013. ALMEIDA, J.R.G.S.; ARAÚJO, C.S.; PESSOA, C.; COSTA, M.P.; PACHECO, A.G.M. Atividade antioxidante, citotóxica e antimicrobiana de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae). Rev. Bras. Frutic., v.36, p.258-264, 2014. ALVARADO, H.L.; ABREGO, G.; SOUTO, E.B.; GARDUÑO- RAMIREZ, M.L.; CLARES, B.; GARCIA, M.L.; CALPENA, A.C. 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