UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE ENGENHARIA CÂMPUS DE ILHA SOLTEIRA LOUYNE VARINI SANTOS DOS ANJOS COMPLEXO CROSTA NEGRA EM SERINGUEIRA: INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA E PERÍODO DE MOLHAMENTO NO DESENVOLVIMENTO DA DOENÇA EM FOLÍOLOS DE SERINGUEIRA. Ilha Solteira 2023 Campus de Ilha Solteira PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA LOUYNE VARINI SANTOS DOS ANJOS COMPLEXO CROSTA NEGRA EM SERINGUEIRA: INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA E PERÍODO DE MOLHAMENTO NO DESENVOLVIMENTO DA DOENÇA EM FOLÍOLOS DE SERINGUEIRA. Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira – Unesp como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Agronomia. Especialidade: Sistemas de Produção. Ana Carolina Firmino Orientador Ilha Solteira 2023 DEDICATÓRIA Dedico este trabalho aos meus pais Claudio Varino dos Anjos, Silvana Monteiro dos Santos dos Anjos, ao meu irmão Luis Claudio Varini dos Anjos e a minha orientadora Ana Carolina Firmino, todos vocês serão para sempre lembrados pois fizeram parte da minha formação. Muito obrigada. AGRADECIMENTOS A minha orientadora Ana Carolina Firmino, pelos ensinamentos, orientação e confiança, fundamentais para o meu aperfeiçoamento pessoal e profissional; Aos meus pais Silvana e Claudio e ao meu irmão, pelo amor e apoio em todos os sentidos; Aos meus colegas de laboratório Izabela Ponso Magalhaes, Marcela Eloi Gomes, Thais Lopes de Oliveira e Jhonata Marcos; Aos professores Prof. Dr. Evandro Pereira Prado, Profª Dra Pâmela Gomes Nakada Freitas, Prof. Associado Paulo Alexandre Monteiro de Figueiredo e Prof. Associado Diego Cunha Zied pela disponibilização de seus equipamentos para meus estudos; A todos os professores, técnicos e servidores da UNESP/FCAT - Dracena que disponibilizaram tempo e conhecimento para me ajudar na execução dos meus experimentos; Aos professores, técnicos e servidores da UNESP - Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira (FEIS/Unesp – Ilha Solteira), pelos ensinamentos e auxílios durante o mestrado. A todos que direta ou indiretamente, colaboraram com a realização deste trabalho. O meu muito obrigada!!! “O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001” A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), processo 2020/11518-4, pelo apoio financeiro. javascript:xajax_exibePagina(1160,%20'href');%20void(0) javascript:xajax_exibePagina(1561,%20'href');%20void(0) javascript:xajax_exibePagina(1561,%20'href');%20void(0) javascript:xajax_exibePagina(40,%20'href');%20void(0) javascript:xajax_exibePagina(1159,%20'href');%20void(0) javascript:xajax_exibePagina(1159,%20'href');%20void(0) “O futuro é construído pelas nossas decisões diárias, inconstantes e mutáveis, e cada evento influencia todos os outros”. Alvin Toffler RESUMO A crosta negra, causada por Rosenscheldiella heveae, tornou-se uma preocupação na produção da seringueira, pois avança rapidamente nas áreas de cultivo no Brasil, causando queda precoce das folhas e consequentemente reduzindo a produção de látex. Este trabalho teve como objetivo avaliar o desenvolvimento de R. heveae, em sua forma sexuada e assexuada (Cladosporium) em folíolos de seringueira do clone comercial RRIM600, sob influência de diferentes temperaturas e períodos de molhamento. Os experimentos realizados com esporos sexuais e assexuados foram montados separadamente. Em ambos os experimentos, os folíolos de seringueira foram previamente desinfestados superficialmente e inoculados com alíquotas contendo 30 μL de suspensão de esporos (105 conídios. mL-1). Após a inoculação dos esporos, os folíolos foram mantidos em câmara úmida a 10, 15, 20, 25, 30, 35 e 40±1 °C no escuro com período de molhamento de 4, 6, 12, 24, 48 e 72 horas. Os estudos foram avaliados por meio do microscópio eletrônico de varredura (MEV) para observação do desenvolvimento do fungo fora da folha e também verificou-se a colonização e reprodução do fungo na parte interna da folha por meio do microscópio eletrônico de luz. As imagens obtidas em MEV, observou-se que os esporos assexuados, Cladosporium, tem seu desenvolvimento rápido, pois 4 horas após a inoculação do fungo é possível verificar a germinação e penetração dos conídios nas temperaturas de 10 a 20 oC. Verificou-se nesta fase, nas temperaturas de 10 a 25 oC, a formação de fiálides, a partir de seis horas após a inoculação, indicando que o fungo já está em período reprodutivo. Na fase sexuada, R. heveae, em MEV, a partir das 4 horas após a inoculação, foi possível verificar a formação de pequenos protuberâncias, que devem ser o início da formação dos estromas, nas temperaturas entre 10 e 20 oC. Estas pontuações negras, nestas temperaturas, evoluem no decorrer dos períodos avaliados, para manchas negras protuberantes circulares, similares aos sintomas de crosta negra, com aparente formação de esporos sobre elas. Os dados obtidos a partir das analises em microscópio UV corroboram com o que foi observado em MEV, mostrando que o fungo tem bom desenvolvimento nas suas duas fases entre as temperaturas de 20 a 25 oC. Palavras-chave: Hevea brasiliensis; temperatura; molhamento; Rosenscheldiella heveae; Cladosporium Cladosporioides. ABSTRACT Black scab, caused by Rosenscheldiella heveae, has become a concern in rubber tree production, as it is rapidly advancing in growing areas in Brazil, causing early leaf fall and consequently reducing latex production. This work aimed to evaluate the development of R. heveae, in its sexual and asexual form (Cladosporium) in rubber tree leaflets from the commercial clone RRIM600, under the influence of different temperatures and wetting periods. Experiments performed with sexual and asexual spores were set up separately. In both experiments, the rubber tree leaflets were previously superficially disinfested and inoculated with aliquots containing 30 μL of spore suspension (105 conidia. mL-1). After inoculation of the spores, the leaflets were kept in a humid chamber at 10, 15, 20, 25, 30, 35 e 40±1 °C in the dark with wetting period of 4, 6, 12, 24, 48 e 72 hours. The studies were evaluated using a scanning electron microscope (SEM) for observing fungus development outside the leaf and it was also verified the colonization and reproduction of the fungus in the inner part of the leaf by means of the electronic light microscope. The images obtained in SEM, it was observed that the asexual spores, Cladosporium, has a fast development, because 4 hours after the fungus inoculation it is possible to verify the germination and penetration of the conidia at temperatures from 10 to 20 °C. It was verified in this phase, at temperatures from 10 to 25 °C, the formation of phialides, from six hours after inoculation, indicating that the fungus is already in the reproductive period. In the sexual phase, R. heveae, in SEM, from four hours after inoculation, it was possible to verify the formation of small protuberances, which must be the beginning of the formation of stromas, at temperatures between 10 and 20 °C. These black dots, at these temperatures, evolve over the periods evaluated, to circular protuberant black spots, similar to the symptoms of black crust, with apparent formation of spores on them. The data obtained from the UV microscope analyzes corroborate with what was observed in SEM, showing that the fungus has good development in its two phases between temperatures of 20 to 25 °C. Keywords: Hevea brasiliensis; temperature; wetness; Rosenscheldiella heveae; Cladosporium Cladosporioides. LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Sintomas de crosta negra em folhas de seringueira, na face adaxial (A) e abaxial (B) ... ............................................................................................................. 26 Figura 2 – Ascósporos de R. heveae liberados pelo estroma que foram coletados para obtenção dos isolados....................................................................................... 26 Figura 3 – Colônias assexuada de R. heveae em meio de cultura BDA. ................. 27 Figura 4 – Inoculação dos folíolos de seringueira com a suspensão de esporos ..... 27 Figura 5 – Desenvolvimento do Cladosporium na superfície de folhas de seringueira em microscópio eletrônico de varredura, com 4, 6 e 12 horas de período de molhamento submetidos a diferentes temperaturas ................... .............................. 31 Figura 6 – Formação de fiálides de 12 horas a 15oC após a inoculação a partir da inoculação de esporos de Cladosporium e formação de novos esporos a partir delas (A) e elevação da superfície das folhas infectadas com possível início de formação de estromas (B). ........................................................................................................ 32 Figura 7 – Desenvolvimento do Cladosporium na superfície de folhas de seringueira em microscópio eletrônico de varredura, com 24, 48 e 72 horas de período de molhamento submetidos a diferentes temperaturas.......... ........................................ 34 Figura 8 – Reprodução intensa do fungo na superfície de folhas de seringueira 72 horas após a inoculação a 20oC (A) e colonização e reprodução na folha pelo fungo abaixo da crosta negra (B). ....................................................................................... 35 Figura 9 – Desenvolvimento dos ascósporos na superfície de folhas de seringueira em microscópio eletrônico de varredura, com 4, 6 e 12 horas de período de molhamento submetidos diferentes temperaturas.......... ........................................... 37 Figura 10 – Desenvolvimento dos ascósporos na superfície de folhas de seringueira em microscópio eletrônico de varredura, com 24, 48 e 72 horas de período de molhamento submetidos a diferentes temperaturas.......... ........................................ 38 Figura 11 – Manchas similares a crosta negra, com características circulares, após 4 horas de período de molhamento submetidos as temperaturas de 25 °C. ................ 39 Figura 12 – Observação da formação de conídios 24 horas após a inoculação a a 20oC na superfície de folha de seringueira inoculadas com ascósporos (A e B). ..... 40 Figura 13 – Observação de ascósporos 48 horas após a inoculação a 20oC na superfície de folha de seringueira inoculadas (A e B). .............................................. 41 Figura 14 – (A) Desenvolvimento de esporos assexuados na superfície de folhas de seringueira em UV a 25 °C submetidos a diferentes períodos de molhamento (B) Desenvolvimento de esporos sexuados na superfície de folhas de seringueira em UV a 25 °C submetidos a diferentes períodos de molhamento.......................................42 Figura 15 – Porcentagem média de área foliar das amostras inoculadas sob período de molhamento de 72 horas após a inoculação.........................................................44 Figura 16 – Porcentagem média de área foliar das amostras inoculadas na temperatura de 25 °C.................................................................................................45 LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Porcentagem média de área foliar das amostras inoculadas por esporos sexuados sob diferentes condições ambientais ...................................................... 443 Tabela 2 – Porcentagem média de área foliar das amostras inoculadas por esporos assexuados sob diferentes condições ambientais .................................................... 43 LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS °C Graus Celsius BDA Batata-dextrose-ágar g Gramas M Molar MEV Microscópio de Varredura mL Mililitros mm Milímetro pH Potencial hidrogeniônico ppm Partes por milhão USD Dólares UV Ultravioleta UR Umidade Relativa Vol Volume μL Microlitro SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO .................................................................................................. 16 2 OBJETIVOS ..................................................................................................... 18 2.1 Objetivo geral ................................................................................................... 18 2.2 Objetivo específico ........................................................................................... 18 3 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................ 19 3.1 Produção de látex ............................................................................................. 19 3.2 A seringueira ..................................................................................................... 20 3.3 Ocorrência da crosta negra .............................................................................. 20 3.4 Sintomas da crosta negra ................................................................................. 21 3.5 Etiologia da crosta negra: P. huberie e R. heveae ............................................ 22 3.6 Ambiente e patógeno ........................................................................................ 23 4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................. 25 4.1 Obtenção de esporos sexuados e isolamento da fase sexuada de R. heveae . 25 4.2 Avaliação do desenvolvimento de R. heveae em folíolos de seringueira sob influência de diferentes temperaturas e períodos de molhamento. ........................... 27 4.2.1. Preparação e avaliação de amostras em microscópio eletrônico de varredura (MEV) ........................................................................................................................ 28 4.2.2 Preparação e avaliação de amostras em microscopia de luz ultravioleta (UV)............................................................................................................................28 4.3 Análise de dados .............................................................................................. 29 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 30 5.1 Avaliação da penetração e desenvolvimento de R. heveae na forma assexuada (Cladosporium) em folíolos de seringueira sob influência de diferentes temperaturas em MEV..................................................................................................................... 30 5.2 Avaliação da penetração e desenvolvimento de R. heveae na forma sexuada (ascósporos) em folíolos de seringueira sob influência de diferentes temperaturas em MEV..................................................................................................................... 36 5.3 Avaliação de amostras em microscopia de luz ultravioleta (UV) ....................... 42 6 CONCLUSÃO ................................................................................................... 46 REFERÊNCIAS ................................................................................................ 47 16 1 INTRODUÇÃO A seringueira (Hevea brasiliensis) é nativa da região amazônica, pertence à família Euphorbiaceae. Esta planta tem grande importância econômica devido ao látex, fonte para a produção de borracha natural (ALVARENGA; CARMO, 2008). Em relação à produção mundial de borracha natural, a região da Ásia-Pacífico produz 91,2%, a África 6,8% e América Central e América do Sul produzem 2,0% (IRSG, 2019). A produção brasileira de borracha natural produz apenas um terço da demanda nacional pelo produto, existindo a necessidade de importação, resultando em reflexos negativos na balança comercial do país (SIERRA-HAYER, 2014). No Brasil, a seringueira é cultivada em 17 estados, que compreende a região Norte até o norte do Estado do Paraná (GASPAROTTO et al., 2012). No ano de 2021, o Brasil produziu 399.751 toneladas de borracha, com 176.373 hectares de área colhida e o valor de produção foi de R$ 1.495.091,00 sendo o estado de São Paulo o maior produtor (IBGE, 2021). Os problemas fitossanitários são um fator limitante para o cultivo da seringueira no Brasil. Dentre as doenças foliares de maior importância da seringueira situa-se o mal-das-folhas, a antracnose, o oídio e a mancha areolada, causadas por Pseudocercospora, Colletotrichum ssp., Oidium heveae e Rhizoctonia solani, respectivamente (FURTADO et al., 2016). A crosta negra também é uma doença que causa danos as folhas de seringueira, no entanto sempre foi considerada de pouca importância (GASPAROTTO et al., 2012; FURTADO et al., 2016). Porém, com a expansão dos seringais para diversas regiões com diferentes condições ambientais, a ocorrência da crosta negra cresceu passando a causar prejuízos em razão à queda precoce das folhas (GONÇALVES; GOES, 2017). Pesquisas envolvendo o clone IAN717 com sete anos de idade, na região de Manaus (AM), mostram que a crosta negra completa seu ciclo de dois a três meses após a troca de folhas da planta e que ela também pode provocar uma desfolha em épocas chuvosas, o que leva a planta a emitir novas folhas em épocas com condições favoráveis para o desenvolvimento de outras doenças como o mal-das- folhas e antracnose (GASPAROTO et al., 2012). Esta doença pode ser provocada por dois fungos que podem ocorrer de forma isolada ou em conjunto. O primeiro a fungo a ser associado à crosta negra na cultura 17 da seringueira foi Phyllachora huberi em 1899 na região amazônica. Em 1990 Rosenscheldiella heveae, foi associado a esta mesma doença, porém neste caso foi encontrado sua possível forma assexuada, Cladosporium (JUNQUEIRA; BEZERRA, 1990; GONÇALVES; GOES, 2017). Sabendo que o ambiente tem influência sobre o desenvolvimento de qualquer doença e devido a escassez de trabalhos na literatura sobre as condições ambientais que favorecem a infecção e o desenvolvimento da crosta negra, o presente estudo teve como objetivo avaliar a influência da temperatura e período de molhamento na germinação, penetração, colonização e reprodução de R. heveae em folíolos de seringueira. 18 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral Avaliar a influência da temperatura e período de molhamento no desenvolvimento de R. heveae, na sua forma sexuada e assexuada, Cladosporium, em folíolos de seringueira. 2.2 Objetivo específico Analisar, por meio de diferentes técnicas de microscopia, as etapas da germinação, penetração, colonização e reprodução de R. heveae, na sua forma sexuada e assexuada, em folíolos de seringueira do clone RRIM600, sob efeito de diferentes temperaturas e períodos de molhamento. 19 3 REVISÃO DE LITERATURA 3.1 Produção de látex A previsão é que o mercado global de borracha natural alcance USD 33,87 bilhões até 2027, segundo o relatório da Reports and Data (REPORTS AND DATA, 2020). Os países asiáticos são responsáveis por grande parte da produção mundial, que corresponde a 83%, do total produzido, sendo Tailândia, Indonésia e Malásia os principais produtores mundiais de borracha natural (BLAGODATSKY et al., 2016). A seringueira possui grande importância econômica como matéria-prima para a produção e extração de borracha natural (FURTADO; GASPAROTTO; PEREIRA, 2016). Ela é derivada da coagulação do látex, um composto coloidal constituído por partículas de borracha (30-40%) e meio aquoso (60-70%) (HWEE, 2014). O meio aquoso é formado por compostos inorgânicos, proteínas, carboidratos solúveis, ácidos orgânicos, aminoácidos, bases nitrogenadas e organelas (JACOB et al., 1993). O látex da seringueira é o conteúdo citoplasmático de células vegetais altamente especializadas, que são os laticíferos (HABIB; ISMAIL, 2021). Em H. brasiliensis, os laticíferos agem como dutos no vaso do floema e são a área primária para a síntese de borracha (HABIB; ISMAIL, 2021). Diversas susbstâncias presente no latéx podem ser tóxicos para herbívoros e os insetos podem ficar presos nessa substância, o que pode conferir como um mecanismo de defesa para a planta, ele também fecha as feridas da árvore, o que evita a infecção por patógenos (KONNO, 2011). A demanda por borracha seca natural é elevada em todo mundo, por ser de origem de fonte renovável além de possuir grande área de aplicação, como em produtos cirurgicos, produção de pneus e entre outros (SILVA et al., 2021). Sua estrutura possui diversos atributos, como alta resiliência, elasticidade, resistência à abrasão e ao impaco, alta resistência a ruptura e menor aquecimento interno por esforço mecânico, essas características não podem ser alcançados em polímeros formados artificialmente a partir de combustíveis fósseis (FURTADO; GASPAROTTO; PEREIRA, 2016). https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1878535221001192#b0240 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1878535221001192#b0240 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1878535221001192#b0055 https://link.springer.com/article/10.1007/s10265-020-01231-x#auth-Mohd_Afiq_Hazlami-Habib https://link.springer.com/article/10.1007/s10265-020-01231-x#auth-Mohd_Nazri-Ismail https://link.springer.com/article/10.1007/s10265-020-01231-x#auth-Mohd_Afiq_Hazlami-Habib https://link.springer.com/article/10.1007/s10265-020-01231-x#auth-Mohd_Nazri-Ismail 20 3.2 A seringueira Apesar da Amazônia ser o centro de origem da seringueira, a cultura apresenta elevada adaptalidade a diversos ambientes (BEVENUTO et al., 2021). No início dos anos de 1900 ela foi introduzida no Sri Lanka, Singapura e Malásia (GASPAROTTO et al., 2012). O clima desses territórios é muito parecido ao da região amazônica no Brasil, mas as doenças presente na América Latina está ausente nos países asiáticos, resultando em alta produtividade nessa região (GASPAROTTO et al., 2012). A seringueira ocorre entre as latitudes de 3° Norte e 15° Sul do continente americano. Comercialmente, as áreas de produção abragem as latitudes de 24° Norte na China até 25° Sul no litoral do estado de São Paulo e norte do Paraná (GASPAROTTO et al., 2012). No gênero Heveae as espécies conhecidas são: H. brasiliensis, H. guianensis, H. benthamiana, H. nítida, H. rigidifolia, H. camporum, H. sipruceana, H. microphylla, H. camargoana, H. paludosa e H. pauciflora (SECCO, 2008). Destas, a de maior importância econômica é a H. brasiliensis, por possuir maior capacidade produtiva e variabilidade genética de resistência ao P. cercospora (GASPAROTTO et al., 2012). A partir do terceiro ano de idade, a seringueira passa por um período de senescência (amarelecimento) e queda das folhas, seguida de um novo enfolhamento após duas a seis semanas (GASPAROTTO et al., 2012). A senescência ocorre no início da estação da seca, a duração, intensidade e velocidade da senescência muda de acordo com a espécie e com o clone (FURTADO, 1996). O período de reenfolhameno dos seringais, é o momento mais importante para a fitopatologia, já que que nessa fase a cultura apresenta folíolos de coloração antociânica intensa, em que ocorre a maior parte dos ataques das doenças foliares (GASPAROTTO et al., 1997). 3.3 Ocorrência da crosta negra Essa doença já foi identificada na Venezuela, Trinidad, Colômbia, Bolívia, Peru e Suriname (STERLING; RODRIGUEZ, 2018). No Brasil, ocorre no Acre, 21 Amapá, Amazonas, Pará, Rondônia e Mato Grosso (GASPAROTTO et al., 2012). No entanto, em 2011 a crosta negra foi relatada em São Paulo, na Região de Tupã. Em seguida, no ano de 2012, ela foi identificada na região de Votuporanga e em 2017, diversas áreas, em diferentes regiões foram atacadas pela doença (GONÇALVES E GOES, 2017). Em 2017 foram relatados casos em: Palestina, Olímpia, Barretos, Colômbia, Colina, Guaraci, Guaíra, São José do Rio Preto, Paulo de Faria, Tanabi, Bebedouro, Bálsamo, José Bonifácio, Ipiguá, Mirassolândia, Mendonça (GONÇALVES E GOES, 2017). O aumento da incidência da crosta negra em seringais comerciais também vem sendo relatado em outros países, como na Colômbia, em especial na região de Caquetá (STERLING; RODRIGUEZ, 2018). O desenvolvimento da doença e do patógeno está diretamente ligado à fenologia da seringueira, afetando a folhagem madura (GASPAROTTO et al., 2012). Antes da expansão do plantio de seringueiras, a queda das folhas com sintomas de crosta negra, no período após o reeenfolhamento, era associada a senescência natural da planta, descartando a relação com o patógeno (GASPAROTTO et al., 2012). Porém, após a década de 1980, com a ampliação do cultivo da seringueira, explorando diferentes condições ecológicas, o fungo se disseminou e os sintomas observados no campo se tornaram mais frequentes (GASPAROTTO et al., 2012). 3.4 Sintomas da crosta negra As infecções de P. huberi e R. heveae acontecem em folíolos jovens, porém a doença se desenvolve de forma lenta, assim seus sintomas são observados em folhas com mais de um mês de idade (GASPAROTO et al., 2012). Os sintomas na face adaxial ou superior do limbo da folha são áreas amareladas e manchas necróticas que correspondem as placas circulares negras na parte abaxial ou inferior da folha, coincidente com as incrustações estromáticas do fungo, sendo estes os sintomas e sinais característicos desta doença (GASPAROTO et al., 2012; SANTOS et al., 2016). No período de desfolha, o fungo sobrevive como estroma (massa de hifas de aspecto firme, pode ter ou não a presença de tecido hospedeiro, com o objetivo de abrigar ou dar origem as estruturas reprodutivas) nas folhas que caem no chão. Os estromas por sua vez dão origem aos ascósporos, que se tornam a principal fonte 22 de inoculação para o microorganismo começar o ciclo novamente nas folhas recém- formadas (MASSOLA JÚNIOR, 2019; GASPAROTO et al., 2012). A presença de crosta negra em seringueira também facilita a entrada de outros patógenos como Colletotrichum, já que com o decorrer do tempo, as placas negras ressecam, ocasionando a ruptura do tecido foliar (PEARCE et al., 1999; GASPAROTO et al., 2012), agravando desta maneira a situação sanitária da cultura. 3.5 Etiologia da crosta negra: P. huberi e R. heveae O fungo P. huberi pertence a família Phyllachoraceae composta por fungos biotróficos (PEARCE et al., 1999). O número de gêneros reconhecidos nessa família é muito discutido, sendo que atualmente, Phyllachoraceae contém 59 gêneros (MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2015, MARDONES et al., 2017). Esse fungo pertence a ordem Phyllachorales, este grupo possui peritécios de parede fina, que ficam imersos no tecido do hospedeiro e unidos sob placas estromática, normalmente negra, achatada, nomeada clípeo (MASSOLA JÚNIOR, 2019). As espécies de fungos que compreendem a esta família foram documentadas a partir do isolamento de uma variedade de espécies de plantas e pressupõe que estes isolados sejam hospedeiros específicos (CANNON 1997; PEARCE et al., 1999; PEARCE et al., 2000). Atualmente, Phyllachora é reconhecido como o maior gênero desta família, com cerca de 1500 epítetos de espécies (MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2015; INDEX FUNGORUM, 2016). Várias espécies de Phyllachora recebeu nomes a partir da associação de hospedeiros e isso pode não refletir o número efetivo de espécies. Além disso, a maior parte dos estudos que foram realizados para identificação das espécies deste gênero foram embaseada em dados morfológicos, o que pode ter levado a alguma confusão taxonômica, assim muitos dos grupos de espécies são polifiléticas (SANTOS et al., 2016). As espécies de Phyllachora por terem sido identificadas com base na morfologia, como consequência acabou gerando escassas informações genéticas sobre este fungo, o que levou a existência poucas sequências presentes no GenBank para estudos comparativos, sendo que a maior parte das espécies estudadas possuem apenas dados da região ITS (DAYARATHNE et al., 2017). A região ITS está posicionada entre os genes 18SrDNA e 28SrDNA e é possível ser amplificada por oligonucleotídeos iniciadores específicos (HILLIS; DIXON, 1991). 23 Enquanto as regiões dos genes ribossomais são muito conservadas dentro da espécie, já as regiões dos espaçadores ITS, por evoluirem mais rápido, pode ter uma variação intraespecifica na sequência de bases e no comprimento (MENEZES et al., 2010), sendo assim muito usadas para taxonomia de espécies e gêneros (GOMES et al., 2002). Isso revela a instabilidade taxonômica ainda presente na família Phyllachoraceae. A espécie de fungo R. heveae pertence ao gênero Rosenscheldiella que é membro da família Mycosphaerellaceae e pertence a ordem Capnodiales (MASSOLA JÚNIOR, 2019; WIJAYAWARDENE et al., 2014). No Brasil, o patógeno de maior relevância na família Mycosphaerellaceae, é o Pseudocercospora, agente causal do mal-das-folhas em seringueira (MASSOLA JÚNIOR, 2019). Os integrantes desta família tem a capacidade de colonizar vários nichos e variam no estilo de vida, podendo ser de patógenos a endófitos, sapróbios e epífitas (VIDEIRA et al., 2017). Com o objetivo de facilitar invasão no hospedeiro, algumas espécies de fungos dessa família são conhecidas por produzir toxinas, que suprimem as respostas de defesa do hospedeiro, facilitando seu desenvolvimento biotrófico (BRADSHAW; ZHANG, 2006; CHEN et al., 2007; De WIT 2016). Bem como o família Phyllachoraceae, a família Mycosphaerellaceae tem grupos polifiléticos, umas vez que a identificação dos indivíduos era baseada em conhecimentos morfológicos. Esses fungos compões um grupo heterogêneo muito grande para os quais os trabalhos existentes precisam ser revisados e as espécies redefinidas se necessário (BRAUN et. al., 2015; VIDEIRA et al., 2017), assim como o fungo R. heveae, que foi caracterizado no Brasil 30 anos atrás associado a crosta negra (JUNQUEIRA; BEZERRA, 1990). Com base no levantamento realizado de espécies de fungos associados a crosta negra de seringueira no estado de São Paulo entre os anos de 2021 a 2022, R. heveae vem predominando, principalmente sua forma assexuada, Cladosporium sp. (GOMES, 2023). 3.6 Ambiente e patógeno O surgimento e evolução de uma doença são produtos da interação entre planta suscetível, patógeno e ambiente favorável (VELÁSQUEZ; CASTROVERDE; YANG HE, 2018). Porém, desses três fratores, apenas o ambiente possui alterações constantes no decorrer do ciclo de um cultura, isso porque a agressividade do 24 patógeno e a suscescibilidade do hospedeiro variam muito pouco nesse pequeno espaço de tempo (BEDENDO; AMORIM; MATTOS JÚNIOR, 2019). Para cada patógeno existe uma condição ambiental ótima para o seu crescimento e reprodução, quanto mais a condições ambientais desviarem do “ótimo para o patógeno”, menor será os sintomas da doença na planta (VELÁSQUEZ; CASTROVERDE; YANG HE, 2018). A umidade possui um papel importante sobre os diversos agentes infecciosos que afetam as plantas. Na forma de chuva, orvalho ou irrigação, a água modifica a umidade do ar e solo, podendo favorecer ou prejudicar o desenvolvimento de fungos, bactérias e nematoides (BEDENDO; AMORIM; MATTOS JÚNIOR, 2019). A água, em forma de orvalho é fundamental no processo de infecção, ela é indispensável na germinação e penetração da maioria dos esporos de fungos (SILVEIRA et al., 2001). Grande parte dos patógenos de clima tropical e subtropical tem a capacidade de se desenvolver em um amplo espectro de temperatura, porém, temperaturas muito elevadas podem ocasionar o dessecamento de células bacterianas e estruturas fúngicas na fonte de inóculo (BEDENDO; AMORIM; MATTOS JÚNIOR, 2019). Além disso, para os fitopatógenos existe uma temperatura máxima e mínima, no qual conseguem sobrevivem, porém são incapazes de se desenvolver (VALE; ZAMBOLIM, 1996). Dessa forma, certas doenças são mais severas em baixas temperaturas e outras em altas temperaturas, ainda que o agente causal consiga se desenvolver com uma ampla faixa de temperatura (ESCANFERLA, 2007). Por esse motivo, tanto a temperatura como outros fatores ambientais, podem agir sobre o patógeno ou sobre o hospedeiro, ou na interação patógeno-hospedeiro (ESCANFERLA, 2007). Trabalhos referentes à influência do ambiente em relação ao Pseudocercospora contribuíram com o zoneamento climático para a implantação da cultura da seringueira no Brasil com o objetivo de fugir das condições propicias para ocorrência do mal-das-folhas, o que contribuiu para a região sudeste se destacar na implantação de seringais e produção de borracha natural (PINHEIRO et al., 2002; GASPAROTTO et al., 2012). 25 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Obtenção de esporos sexuados e isolamento da fase sexuada de R. heveae Foi utilizado esporos de R. heveae, na sua forma sexuada e assexuada (que corresponde ao fungo Cladosporium sp.) (JUNQUEIRA; BEZERRA, 1990, GOMES, 2023). Os materiais foliares utilizados foram provenientes do clone de seringueira RRIM 600, coletadas em um plantio comercial, localizado na cidade de Campina Verde - MG, com sintomas e estromas típicos do fungo. Um estudo prévio indica que neste local foi encontrada a espécie R. heveae, e que sua forma assexuada corresponde a C. cladosporioides (Gomes, 2023). Para a obtenção de esporos sexuados (ascósporos) e isolamento da fase assexuada do fungo R. heveae (Cladosporium sp.) foi realizada a metodologia descrita por Junqueira e Bezerra (1990) e Gasparotto et al. (2012). Para isso, folhas de seringueira contendo sintomas de crosta negra (Figura 1), foram desinfestadas superficialmente, pela submersão por um minuto em álcool (70%), seguido da submersão por 2 minutos em solução de hipoclorito de sódio (2%), lavados em água autoclavada estéril e secos em papel toalha estéril no interior de câmera de fluxo laminar. Após estas etapas, as folhas desinfestadas foram colocadas em câmara úmida formada em placas de Petri e colocadas a 15 °C por 12 horas. Após este período, devido as condições ambientais fornecidas, os estromas liberam os ascósporos, sob a forma de microgoticulas (Figura 2), sendo estas coletadas com o auxílio de uma agulha (sob condições assépticas) e depositadas em 1mL de água destilada esterilizada contendo clorafenicol a 50ppm. Posteriormente, a suspensão do fungo obtida foi usada de duas formas. A primeira, para montagem do experimento para verificar a germinação, penetração, colonização e reprodução do fungo nesta fase sob diferentes condições ambientais. A segunda forma de uso desta suspenção foi para isolamento da forma assexuada do fungo em meio de cultura. Para isso parte da suspenção obtida foi distribuída em placas contendo meio de cultura BDA (Difco ®), e posteriormente foram incubadas a 24 °C, sob fotoperíodo alternado de 12 horas de luz e escuro. Estes fungos são de crescimento lento e começam a se desenvolver na placa cerca de 8 dias após os procedimentos descritos (Figura 3). Neste caso, as colônias 26 obtidas, foram armazenados em ultra freezer a -80 °C para a manutenção do fungo se necessário. Figura 1: Sintomas de crosta negra em folhas de seringueira, na face adaxial (A) e abaxial (B) Fonte: Elaboração do próprio autor. Figura 2: Ascósporos de R. heveae liberados pelo estroma que foram coletados para obtenção dos isolados. Fonte: Elaboração do próprio autor. Estroma o 27 Figura 3: Colônias assexuada de R. heveae em meio de cultura BDA. Fonte: Elaboração do próprio autor. 4.2 Avaliação do desenvolvimento de R. heveae em folíolos de seringueira sob influência de diferentes temperaturas e períodos de molhamento. Folíolos destacados de seringueira dos clones RIMM 600, mantidas em casa de vegetação em vasos com idade um ano e previamente desinfestados superficialmente, foram inoculados com alíquotas contendo 30 μL de suspensão de esporos (105 conídios. mL-1) (Figura 4). A área inoculada foi demarcada com auxílio de adesivos plásticos. Como controle foram utilizados folíolos inoculados somente com água destilada autoclavada. Os experimentos realizados com esporos sexuais e assexuais foram montados separadamente. Figura 4: Inoculação dos folíolos de seringueira com a suspensão de esporos Fonte: Elaboração do próprio autor. 28 Após a inoculação dos esporos, os folíolos foram mantidos em câmara úmida a 10, 15, 20, 25, 30, 35 e 40±1 °C no escuro. Amostras circulares, com 5 mm de diâmetro, foram obtidas das áreas inoculadas em intervalos de tempo pré- determinados (4, 6, 12, 24, 48 e 72 horas) e fixadas em solução de “Karnovsky” (glutaraldeido 2,5%, paraformaldeído 2,0%, tampão fosfato 0,05M, pH 7,2). 4.2.1. Preparação e avaliação de amostras em microscópio eletrônico de varredura (MEV) O desenvolvimento do fungo em diferentes clones de folha de seringueira foi avaliado a partir de fragmentos foliares de aproximadamente 5 mm de diâmetro, coletados de cada clone e fixados em "Karnovsky" (glutaraldeído 2,5%, paraformaldeído 2,0% e tampão fosfato 0,05 M pH 7,2). por um período mínimo de 24 horas. Em seguida, as amostras foram retiradas do fixador, fragmentadas e transferidas para microtubos de 1,5 mL contendo tampão fosfato de sódio 0,05M por dez minutos. Posteriormente, as amostras foram desidratadas em série crescente de concentração de acetona (30, 50, 70, 90 e 100%) por 10 minutos cada e secas em aparelho de ponto crítico (Bal-Tec CPD 030). Após a secagem das amostras, as mesmas foram processadas conforme metodologia descrita por Firmino et al. (2022). Foram montados em stubs com fita dupla face de carbono e recobertos com ouro 20nm em aparelho Bal-Tec SCD 050 sputter coater, para análise em microscópio eletrônico de varredura (MEV) LEO435-VP, localizado no Centro de Microscopia Eletrônica da Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” (ESALQ), Universidade de São Paulo (USP), Piracicaba, Estado de São Paulo, Brasil. 4.2.2 Preparação e avaliação de amostras em microscopia de luz ultravioleta (UV) Para complementar o estudo, foi observado a colonização e reprodução do fungo na parte interna da folha através da técnica de luz ultravioleta, em microscópio de luz, localizado na Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP), Botucatu, Estado de São Paulo, Brasil. Ao final de cada intervalo de tempo predeterminado, amostras circulares de folhas que foram expostas a 25 °C (temperatura escolhida por proporcionar o melhor 29 desenvolvimento fúngico) foram coletadas e processadas de acordo com a metodologia descrita por Celio e Hausbeck (1997), modificada. Os discos de folha foram fixados, colocando-os em papel de filtro saturado com solução de formalina / álcool / ácido acético (1: 18: 1 vol / vol / vol) em uma placa de Petri de plástico selada com Parafilme por 2 horas. Após este período os discos foram clarificados por 42 a 48 horas em uma solução que consiste em hidrato de cloral (200 g), H2O (80 mL), etanol (250 mL) e quatro gotas de Tween- 20. A coloração em solução de lactofenol azul de algodão, foi substituído por Calcofluor White (Sigma®). Este reagente (aproximadamente 50 µL) foi colocado sobre as amostras que, após um minuto, foram lavadas em água destilada (duas vezes por 30 segundos) e montadas em água destilada para observação em microscópio de luz. 4.3. Análise de dados Para as imagens captadas em MEV, foi adotada uma metodologia descritiva, baseada na observação do desenvolvimento do fungo nas diferentes temperaturas e períodos de molhamento. A avaliação quantitativa da colonização e reprodução fúngica, com base nas estruturas produzidas pelo fungo (micélio e esporos) na parte interna da folha, foi realizada com o software Basic Intensity Quantification with ImageJ (LABNO, 2019) no caso de imagens capturadas sob um microscópio ultravioleta. A porcentagem média de área foliar afetada pelo fungo em cada condição ambiental testada foi analisada pelo software estatístico Sisvar (FERREIRA, 2011). Com base nestas analises foi encontrado o melhor período em que o fungo se desenvolveu e então foi realizada uma analise de regressão para encontrar a faixa de temperatura em que o fungo tem seu maior desenvolvimento, usando o software estatístico Sisvar (FERREIRA, 2011). 30 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 Avaliação da penetração e desenvolvimento de R. heveae na forma assexuada (Cladosporium) em folíolos de seringueira sob influência de diferentes temperaturas em MEV As figuras 5 e 3 mostram o progresso da doença iniciada por Cladosporium em diferentes temperaturas até 72 horas depois da inoculação. Observou-se que o Cladosporium teve um desenvolvimento rápido, pois 4 horas após a inoculação do fungo é possível verificar a germinação e penetração dos conídios nas temperaturas de 10 a 20oC (Figura 5A, 5B e 5C). Nas temperaturas de 25 e 30oC já é visto o desenvolvimento do micélio do fungo e o início da formação de uma crosta sob o ponto de inoculação (Figura 5D e 5E). Este início de crosta também é percebido a 35oC (Figura 5F). Aos 40oC não foi observado nenhuma germinação dos esporos (Figura 5G). Observando o desenvolvimento do fungo durante os períodos analisados, verifica-se na fase assexuada, nas temperaturas de 10 a 25oC a partir das seis horas ocorre formação de uma crosta que vai ficando mais escura com o passar do tempo (Figura 5H, 5I, 5J e 5K). Foi possível observar a formação de fiálides a partir de seis horas após a inoculação, indicando que o fungo já está em período reprodutivo (Figura 5P, 5R e 6A). A fiálide é uma célula conidiógena que tem a função de formar os conídios que são esporos assexuais (MASSOLA JÚNIOR, 2019). Com a figura 6B, verifica-se a presença do estroma sobre tecido degradado, as células do tecido estromático aparecem bem definidos com a forma arredondada. 31 Figura 5: Desenvolvimento do Cladosporium na superfície de folhas de seringueira em MEV, com 4, 6 e 12 horas de período de molhamento submetidos a diferentes temperaturas Fonte: Elaboração do próprio autor. A C B D O H P N G L I J K F M E Q R S T U 32 Figura 6: Formação de fiálides de 12 horas a 15oC após a inoculação a partir da inoculação de esporos de Cladosporium e formação de novos esporos a partir delas (A) e elevação da superfície das folhas infectadas com possível início de formação de estromas (B) Fonte: Elaboração do próprio autor. Vinte e quatro horas após a inoculação, na temperatura de 25oC foi possível observar a elevação de alguns pontos escuros, que acredita ser o início da formação dos estromas (Figura 7D). Com a observação das imagens, há indícios de que este fungo tem seu desenvolvimento afetado de modo negativo a 40oC (Figura 7G, 7N e Estroma A B Fiálides Esporo 33 7U), o que pode explicar a baixa quantidade de crosta negra encontrada em locais em que há seringais e possuem temperaturas medias elevadas. A formação de novas estruturas como fiálides e esporos é nítida 72 horas após a inoculação (Figura 7O, 7P, 7Q , 7R, 8A e 8B), o que pode indicar que o período de molhamento também tem influencia no desenvolvimento de R. heveae na fase assexuada. Sabendo-se que Colletotrichum de seringueira tem bom desenvolvimento nas faixas de temperatura estudas e que seu desenvolvimento é diretamente proporcional ao período de molhamento da folha (MAGALHAES et al., 2021), fica mais clara a importância de monitoramento da ocorrência da crosta negra no campo, pois como já foi comentado, suas lesões servem de aberturas para a entrada do Colletotrichum, o que pode agravar a situação sanitária da cultura e dificultar o controle destas doenças. Nas temperaturas entre 30 a 40oC o fungo vai diminuindo seu desenvolvimento, apesar de se observar a formação de placas escuras nos pontos de inoculação (Figura 7S, 7T e 7U). Dessa forma, observando de forma mais ampla, entende-se que haverá dificuldade na elabobarção de sistemas de previsão de doenças baseados apenas na variável temperatura (MORAES, 2009). 34 Figura 7: Desenvolvimento de Cladosporium na superfície de folhas de seringueira em MEV, com 24, 48 e 72 horas de período de molhamento submetidos a diferentes temperaturas Fonte: Elaboração do próprio autor. A H B O I C P R K D Q J E M F L S T U N G 35 Figura 8: Reprodução intensa do fungo na superfície de folhas de seringueira 72 horas após a inoculação a 20oC (A) e colonização e reprodução na folha pelo fungo abaixo da crosta negra (B) Fonte: Elaboração do próprio autor. A B Crosta negra Esporo Fiálides 36 5.2 Avaliação da penetração e desenvolvimento de R. heveae na forma sexuada (ascósporos) em folíolos de seringueira sob influência de diferentes temperaturas em MEV Nos folíolos que foram inoculados com os ascósporos, ou seja, com a forma sexuada do fungo, a partir de quatro horas após a inoculação, foi possível verificar a formação de pequenas protuberâncias, que devem ser o início da formação dos estromas, nas temperaturas entre 10 a 20oC (Figuras 9A, 9B e 9C). As células do tecido estromático encontram-se bem definidas, com a forma arredondada semelhantes aos estromas observados no desenvolvimento de Pseudocercospora em folhas de seringueira (SAMBUGARO, 2003). Ainda dentro do período a partir das quatro horas após a inoculação, é importante ressaltar que nas temperaturas entre 25 a 30 oC, já foi possível observar o desenvolvimento de manchas similares a crosta negra (Figura 9D), inclusive com características circulares e com inicio de formação de estromas, como é observado no campo. Estas formações de crostas circulares vão se tornando mais frequentes e maiores em área com o decorrer do tempo (Figura 11A e 11B). Na temperatura de 40oC o fungo tem um desenvolvimento mais lento, independente do período analisado (Figura 9N). No presente estudo a partir de seis horas após a inoculação, observou-se o início da formação de esporos e micélios sobre os estromas, que continuam se desenvolvendo no decorrer dos períodos avaliados, principalmente nas temperaturas de 20 a 30oC (Figura 12A e 12B). Nesta esporulação são encontrados conídios parecidos com Cladosporium com mais intensidade. Os ascósporos são visualizados com mais frequência a partir das 48 horas após a inoculação (Figura 10J, 13A e 13B). Esse comportamento assemelha-se ao que Gasparotto et al. (2012) descreve para Pseudocercospora ulei, os estromas formados no primeiro estádio, acomodam depressões espermáticas, parecidas a picnídios, conforme ocorre o avanço do desenvolvimento fungico, completando a ascogênese, maturação dos ascósporos. Esta semelhança no comportamento destes dois fungos, pode ser explicado pelo fato destes, pertencerem a mesma família, Mycosphaerellaceae. 37 Figura 9: Desenvolvimento dos ascósporos na superfície de folhas de seringueira em MEV com 4, 6 e 12 horas de período de molhamento submetidos a diferentes temperaturas Fonte: Elaboração do próprio autor. A B O H P I C Q J K R L E S F M T G N U D 38 Figura 10: Desenvolvimento dos ascósporos na superfície de folhas de seringueira em MEV com 24, 48 e 72 horas de período de molhamento submetidos a diferentes temperaturas Fonte: Elaboração do próprio autor. H A O B P C I J Q D K R S L F E M T U N G 39 Figura 11: Manchas similares a crosta negra, com características circulares, após 4 horas de período de molhamento submetidos as temperaturas de 25 °C Fonte: Elaboração do próprio autor. A B 40 Figura 12: Observação da formação de conídios 24 horas após a inoculação a 20oC na superfície de folha de seringueira inoculadas com ascósporos (A e B) Fonte: Elaboração do próprio autor. A B Esporo Micélio Estroma 41 Figura 13: Observação de ascósporos 48 horas após a inoculação a 20oC na superfície de folha de seringueira inoculadas (A e B) Fonte: Elaboração do próprio autor. Os resultados obtidos a partir da inoculação de ascósporos indicam que os diferentes sintomas observados no campo são decorrentes da fase em que este fungo se encontra no campo, onde se percebe a formação de placas mais arredondadas, como pontos escuros sem nenhuma ou pouca elevação com o desenvolvimento do fungo no caso de esporos assexuados e de sintomas de crostas em círculos com estromas, que parece ser desenvolvida por infecções iniciadas por A B Ascósporo Ascósporo 42 ascósporos. Estas observações microscópicas corroboram com as observações realizadas por Gomes (2023) nos testes de patogenicidade realizado com diferentes isolados de Cladosporium, obtidos de estromas de folhas coletadas em diferentes locais. 5.3 Avaliação de amostras em microscopia de luz ultravioleta (UV) Conforme a figura 14 observou-se que à medida que aumentou o período de molhamento teve um acréscimo na produção de estruturas fungicas, principalmente próximo das nervuras foliares, nas amostras tratadas com esporos assexuados e sexuados. Figura 14: (A) Desenvolvimento de esporos assexuados na superfície de folhas de seringueira em UV a 25 °C submetidos a diferentes períodos de molhamento (B) Desenvolvimento de esporos sexuados na superfície de folhas de seringueira em UV a 25 °C submetidos a diferentes períodos de molhamento Fonte: Elaboração do próprio autor. Conforme pode ser visto nas tabelas 1 e 2, os dados de porcentagem de área foliar afetadas pelo fungo, visualizados em microscópio UV, corroboram com as informações descritas anteriormente com base nas imagens de MEV. Fica claro que 43 o fungo tem bom desenvolvimento em 25 °C (Figura 15), sendo crescente a partir dos 10 oC, e passando a ser afetado negativamente a partir dos 35 oC. Este comportamento é muito parecido entre as duas fases do fungo, porém, vale ressaltar que como nas observações em MEV, as imagens em microscópio UV permitiram verificar que as amostras tratadas com os esporos referentes a fase assexuada do fungo apresentam maiores áreas foliares atacadas (Figura15). Tabela 1: Porcentagem média de área foliar das amostras inoculadas por esporos sexuados sob diferentes condições ambientais Tempo de molhamento (Horas) Temperatura (oC) 10 15 20 25 30 35 40 4 4,67 BC a 4,37 B a 6,3 D a 6,19 D a 6,64 D a 5,24 C a 1,56 A a 6 6,67 B a 8,15 C b 10,2 D b 12,1 E b 11,8 DE bc 7,54 BC ab 3,2 A a 12 8,46 AB a 9,38 B b 15,6 C b 15,4 C b 14,62 C c 14,8 C b 6,3 A bc 24 19,76 B b 18,39 B c 26,0 ED c 34,03 E cd 28,9 D d 18,7 B bc 12,7 A c 48 20,63 B b 24,66 C d 41,21 DE d 43,62 E d 42,5 E e 22,5 BC c 16,12 A cd 72 33,11 B c 38,77 B e 44,23 C e 49,7 D d 50,84 D f 30,4 BC d 22,0 A d CV 28,7* Os valores médios seguidos pela mesma letra maiúscula não diferem na linha e de pela mesma letra minúsculas na coluna .*CV: Coeficiente de variação. Teste de Tukey, a 5% de probabilidade, p>0,05. Fonte: Elaboração do próprio autor. Tabela 2: Porcentagem média de área foliar das amostras inoculadas por esporos assexuados sob diferentes condições ambientais Tempo de molhamento (Horas) Temperatura (oC) 10 15 20 25 30 35 40 4 12,1 D a 10,53 C a 12,8 D a 16,19 E a 10,31 C a 4,0 A a 3,0 A a 6 14,34 C ab 12,34 BC a 21,11 D b 24,81 D bc 13,7 C a 9,0 B ab 6,64 A a 12 16,67 A ab 22,03 CD b 23,81 D b 33,62 E c 17,98 B bc 18,25 B b 16,2 A b 24 18,1 A b 29,07 B cd 29,31 B c 41,27 C d 20,5 AB c 18,77 A b 19,55 A bc 48 30,12 B c 39,45 D d 38,68 D e 56,24 E de 35,34 C d 34,08 C c 23,0 A c 72 45,00 B d 55,67 D e 63,24 E f 64,3 E e 68,0 E e 51,87 CD d 33,54 A d CV 32,4* Os valores médios seguidos pela mesma letra maiúscula não diferem na linha e de pela mesma letra minúsculas na coluna .*CV: Coeficiente de variação. Teste de Tukey, a 5% de probabilidade, p>0,05. Fonte: Elaboração do próprio autor. 44 Figura 15: Porcentagem média de área foliar das amostras inoculadas sob período de molhamento de 72 horas após a inoculação Fonte: Elaboração do próprio autor. Quanto maior é o período de molhamento maior é a porcentagem de área forliar atacada (Figura 16). Para ocorrer a infecção de Pseudocercospora em seringueira precisa de no mínimo 10 horas consecultivas com UR >90% acima de 20°C (GASPAROTO et al., 2012), já para R. heveae esse processo é mais rápido, com 10 horas de período de molhamento a 25 °C já se inicia a infecção (Figura 16). y = -0.0937x2 + 4.3527x - 2.9436 R² = 0.9093 y = -0.1235x2 + 5.9012x - 3.4814 R² = 0.9445 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 10 15 20 25 30 35 40 45 % d e ár ea f o lia r d o en te temperatura (oC) sexuados assexuada Polinômio (sexuados) Polinômio (assexuada) 45 Figura 16: Porcentagem média de área foliar das amostras inoculadas na temperatura de 25oC Fonte: Elaboração do próprio autor. y = -0.0111x2 + 1.455x + 2.0423 R² = 0.98 y = -0.0089x2 + 1.3081x + 15.451 R² = 0.9766 0 10 20 30 40 50 60 70 0 10 20 30 40 50 60 70 80 % d e ár ea f o lia r d o en te horas de molhamento após a inoculação sexuados assexuada Polinômio (sexuados) Polinômio (assexuada) 46 6 CONCLUSÃO Atravez das técnicas de microscopia utilizadas no trabalho foi possível verificar que:  O desenvolvimento do fungo, tanto na fase sexuada, R. heveae, como na sua fase assexuada, Cladosporium, é afetado pela temperarura, uma vez que seu desenvolvimento é maior nas faixas de temperatura entre 20 a 25oC.  Quanto maior o período de molhamento, melhor é o desenvolvimento do fungo.  Essas observações iniciais melhoram o entendimento do ciclo do fungo, visto que há poucas informações sobre essa doença em seringueira. 47 REFERÊNCIAS ALVARENGA, A. 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