UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” – CAMPUS BOTUCATU ARTHUR PADIAL DA MOTA EUTROFIZAÇÃO E DIVERSIDADE DA FAUNA EM ESTUÁRIOS: Uma Investigação Combinada de DNA Ambiental e Parâmetros Limnológicos Botucatu - SP 2024 Arthur Padial da Mota EUTROFIZAÇÃO E DIVERSIDADE DA FAUNA EM ESTUÁRIOS: Uma Investigação Combinada de DNA ambiental e Parâmetros Limnológicos Trabalho de Conclusão de Curso, apresentado ao Instituto de Biociências de Botucatu, da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – Campus de Botucatu, como parte das exigências para a obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas. Orientador: Prof. Dr. Danillo Pinhal Coorientadora: Dra. Talita Aleixo Nakajima Botucatu - SP 2024 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: MARIA CAROLINA A. CRUZ E SANTOS-CRB 8/10188 Mota, Arthur Padial. Eutrofização e diversidade da fauna em estuários : uma investigação combinada de DNA ambiental e parâmetros limnológicos / Arthur Padial Mota. - Botucatu, 2024 Trabalho de conclusão de curso (bacharelado - Ciências Biológicas) - Universidade Estadual Paulista (UNESP), Instituto de Biociências, Botucatu Orientador: Danillo Pinhal Coorientador: Talita Aleixo Nakajima Capes: 20204000 1. DNA Ambiental. 2. Estuários. 3. Eutrofização. Palavras-chave: DNA ambiental; Estuários; Eutrofização. Agradecimentos Agradeço primeiramente aos meus pais Adriana e Ivaldo, por sempre acreditarem em mim, possibilitar que eu siga meus sonhos e me apoiar em todos os momentos. Agradeço ao meu orientador Prof. Dr. Danillo Pinhal, minha coorientadora Dra. Talita Aleixo Nakajima e todos os colegas do Laboratório Genômica e Evolução Molecular e colaboradores pela oportunidade de trabalhar juntos, por toda a ajuda e ensinamentos neste período. Ao Instituto de Biociências de Botucatu e ao Departamento de Ciências Químicas e Biológicas agradeço por todo suporte e infraestrutura. Agradeço a agência de fomento Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa de Iniciação Científica (Processo: 2023/07311-3) e pelo apoio à realização deste trabalho. Por fim, agradeço a todas as pessoas incríveis que cruzei o caminho durante a graduação, e agradeço também todas as amizades do Grupo de Estudos de Evolução e da República Monte Olimpo. Sumário 1. Introdução 8 2. Material e Métodos 12 3. Resultados 19 4. Discussão 26 5. Conclusão 28 6. Referências 28 6 Resumo Nas últimas décadas, os ecossistemas costeiros, que caracteristicamente apresentam vasta riqueza de espécies, vêm sofrendo com diversas mudanças ambientais devido à ação antrópica, levando à perda de biodiversidade. Nesse contexto, o amplo levantamento de espécies que habitam essas áreas de transição entre rios e mares é um passo fundamental para sua preservação. Contudo, em se tratando de ambientes marinhos e costeiros, os métodos tradicionais para estudo da composição da fauna demandam alto custo, além das dificuldades para coleta dos animais e seu caráter invasivo. O DNA ambiental (eDNA) surge então como uma alternativa mais eficiente, principalmente associado ao sequenciamento em larga escala (eDNA metabarcoding) para a identificação de amplo espectro da fauna aquática. No entanto, as metodologias e estratégias para inventário da fauna baseadas em eDNA frequentemente necessitam de aprimoramento e padronização de acordo com o contexto ambiental estudado. No presente trabalho buscou-se caracterizar regiões estuarinas sujeitas a diferentes níveis de ocupação antrópica quanto a variáveis limnológicas, assim como testar e otimizar metodologia baseada na análise do eDNA para estudo da biodiversidade de peixes. Para isso, amostras independentes de água para as análises genéticas e das variáveis ambientais foram coletadas ao longo de transecto nos estuários do Rio Juqueriquerê, em Caraguatatuba, e do Rio Escuro, em Ubatuba, áreas de maior e menor ocupação antrópica, respectivamente. Métodos de filtração de alta sensibilidade foram empregados para isolar quantificar e avaliar a qualidade do eDNA recuperado. Para identificação molecular dos peixes, fragmento do gene ribossomal 12S (12S rRNA) do DNA mitocondrial foi amplificado por PCR. Paralelamente, analisamos diversos parâmetros limnológicos de interesse, 7 incluindo clorofila a, fósforo total e sólidos totais, além de outras variáveis medidas com sonda multiparâmetro. Os resultados mostram que o estuário do rio Juquriquerê apresentou elevada eutrofização em relação a região estuarina do rio Escuro, bem como níveis significativamente inferiores de oxigênio dissolvido e níveis mais elevados de fósforo e clorofila a, variáveis diretamente relacionadas com a eutrofização de ambientes aquáticos. Indicando maior deterioração do ambiente, comprovando o contraste das regiões e a influência da antropização sobre as variáveis ambientais da água. Para a obtenção de eDNA a metodologia associada a coleta com os filtros Sterivex™ se mostram mais eficientes do que os de nitrocelulose, nos permitindo o adequando isolamento do material genético após a extração e sucesso na amplificação por PCR do gene 12s rRNA de peixes. Dificuldades foram encontradas principalmente em relação a filtragem da água, em que por vezes os filtros entupiam durante o processo e para a adequada amplificação do eDNA dos filtros de nitrocelulose, que pode ter interferência de inibidores. De modo geral, concluímos que a análise do eDNA tem potencial para ser utilizada como estratégia para inventário de fauna nesses locais, a partir do estabelecimento de metodologia adequada, principalmente nas etapas cruciais de filtragem, extração e amplificação. Associado a análises da qualidade da água e possíveis impactos ambientais nesses ambientes o eDNA se torna uma ferramenta que possibilita diversos trabalhos futuros voltados à conservação da biodiversidade de regiões estuarinas. 8 Introdução A costa brasileira é a maior da América do Sul, com 7.491km de extensão, apresentando uma grande biodiversidade de fauna e flora, com um total de 9.103 espécies já identificadas, das quais diversas são endêmicas do Brasil (Miloslavich et al., 2011). Dentro deste cenário, o litoral de São Paulo se mostra um alvo importante para estudos de conservação, uma vez que abriga 30% da fauna de peixes conhecida do Brasil, sendo cerca de 65% formada por espécies marinhas ou estuarinas, das quais 10% são endêmicas (MENEZES, 2011). São Paulo possui aproximadamente 600 espécies de peixes descritas e uniformemente distribuídas em sua faixa costeira (Buckup, 2003; Menezes, 2011; Naércio; Menezes). Entretanto, a diversidade biológica essencial para a manutenção da saúde dos ecossistemas costeiros está em declínio acentuado, em escala global, devido às mudanças climáticas e ações antrópicas negativas, afetando assim, as condições dos oceanos e o equilíbrio da sua biota (Butchart et al., 2010; Canonico et al., 2019). No estado de São Paulo, um dos economicamente mais desenvolvidos do país, o litoral caracterizado por ecossistemas frágeis de manguezais e estuários é sobreposto pela alta industrialização e alta densidade populacional, evidenciando grande intervenção antrópica nos ecossistemas cada vez mais degradados (Carmona; Gherardi; Tessler, 2006; Furlan; Bonotto; Gumiere, 2011). Portanto, nota-se a importância de trabalhos que auxiliem no inventário da biodiversidade e caracterização de regiões de interesse para a preservação. Um dos principais riscos para ambientes aquático, principalmente rios e lagos, é a eutrofização, causada pelo aumento da quantidade de nutrientes, majoritariamente fósforo e nitrogênio, consequentemente aumentando sua produtividade e causando mudanças nas comunidades aquáticas e parâmetros físico-químicos dos corpos d’água (Esteves, 2006). A eutrofização afeta diversos rios do litoral de São Paulo, em diferentes graus a depender do uso da terra e urbanização ao redor dos mesmos (Braga et al., 2000; Cunha et al., 2010). O Índice de Estado Trófico (IET), proposto por Carlson e modificado para 9 ambientes tropicais/subtropicais, fornece, principalmente, informação a respeito do nível de eutrofização decorrente da quantidade de nutrientes na água, classificando os corpos d’água de ultraoligotróficos (menor nível de nutrientes na água) até hipereutrófico (maior nível de nutrientes na água) (Pomari et al., 2018). Nas regiões costeiras encontram-se os estuários, caracterizados como locais onde a água doce de rios desagua e há intrusão de água salgada marinha. Este fenômeno cria uma gradual estratificação das características abióticas, que funciona como barreira para a distribuição da fauna, resultando no estabelecimento de diferentes comunidades animais (Barletta et al., 2017; Barletta; Lima, 2019). Isso torna cada ambiente costeiro ímpar e de suma importância, considerando a alta e variável produtividade biológica e o papel central que desempenham na ciclagem de nutrientes (Costanza et al., 1997; Vasconcelos et al., 2015). Contudo, os ambientes estuarinos vêm sendo amplamente degradados devido ao desmatamento e à conversão de paisagens naturais pela expansão urbana, agrícola e industrial. Conjuntamente, essas intervenções têm impactado negativamente a saúde dos ecossistemas costeiros e provocado o declínio de suas funções. Estuários, têm o agravante de, muitas vezes, estarem associados a áreas de manguezais, locais ricos em endemismo e que provêm serviços ecossistêmicos essenciais ao funcionarem como berçários de diversas espécies de peixes e invertebrados e fornecerem alimento para comunidades costeiras (Barbier et al., 2011; Vasconcelos et al., 2015). Apesar do contexto e grande apelo à conservação, estudos sobre a biodiversidade estuarina são ainda incompletos e relativamente recentes (últimos 40 anos), expondo assim a necessidade de esforços em pesquisas que fomentem o maior reconhecimento e viabilizem programas de monitoramento, manejo e conservação destes ecossistemas (Barletta; Lima, 2019). Porém, para realizar o monitoramento e o inventário de espécies, as técnicas tradicionalmente utilizadas demandam muito tempo, dinheiro e recursos humanos, como nos inventários visuais submarinos, o que pode limitar ou dificultar a obtenção de dados (Gold et al., 2021). Estas técnicas são consideradas invasivas, pois envolvem captura e/ou coleta de tecido do animal, podendo causar estresse para o indivíduo ou levantar debates éticos sobre o 10 manejo e a morte dos animais, fatores que são ainda mais determinantes em se tratando de espécies ameaçadas de extinção (Robbins, 2006; Rosati et al., 2016; Drinkwater; Robinson; Hart, 2019; Veilleux; Misutka; Glover, 2021). Nas últimas décadas ferramentas de biologia molecular vêm sendo utilizadas para auxiliar na identificação de espécies, por exemplo a técnica do DNA barcoding que utiliza primers universais para amplificação e sequenciamento de regiões de genes mitocondriais, como Citocromo oxidase I (cox1 ou COI) ou 12S rRNA (Holmes; Steinke; Ward, 2009; Miya et al., 2015). Porém, apesar de sua reconhecida utilidade na ciência forense, esta técnica traz como limitação a obrigatoriedade de amostragem tecidual dos organismos. Neste contexto, o DNA ambiental (eDNA) surgiu como potencial ferramenta para complementar ou mesmo substituir técnicas tradicionais de inventário de fauna, trazendo benefícios tais como menor invasividade, maior detectabilidade, melhor cobertura espacial e temporal e até mesmo informações metabólicas dos organismos (Veilleux; Misutka; Glover, 2021; Yates; Derry; Cristescu, 2021). O eDNA refere-se a todo DNA encontrado no ambiente, sendo ele originário de micro ou macro organismos (Minamoto, 2022). Em ambientes aquáticos ele pode ser encontrado em três estados: (i) em forma livre dissolvido na água, (ii) ligado a material particulado ou (iii) dentro de organelas, células, partes de tecidos ou vesículas extracelulares, podendo então ser filtrado e isolado para análise (Cristescu, 2019; Minamoto, 2022). A detecção do eDNA, tendo o biomonitoramento aquático como principal objetivo, abrange diferentes níveis de sensibilidade e dois métodos principais são aplicados. A metodologia pode ser direcionada para a investigação de uma única espécie, por exemplo utilizando primers espécie específicos (Ficetola et al., 2008) ou para investigar múltiplas espécies simultaneamente a partir de primers universais. Esta segunda abordagem focada na detecção de amplo espectro de espécies é conhecida como eDNA metabarcoding, e envolve o uso do sequenciamento de nova geração para se determinar a composição de toda uma comunidade (Miya et al., 2015; Ficetola; Manenti; Taberlet, 2019;). O primeiro trabalho envolvendo o uso de eDNA foi desenvolvido por Ficetola e colaboradores (2008) para a detecção de espécies em ambientes 11 aquáticos. Neste estudo o grupo utilizou a técnica para a detecção da rã-touro- americana (Lithobates catesbeianus), uma espécie invasora em várias localidades nos diferentes continentes. Desde então, diversos estudos aplicando essa técnica em ambientes aquáticos vêm sendo desenvolvidos. Além da detecção de espécies invasoras, trabalhos com esses métodos foram realizados para estudar a dinâmica sazonal de comunidades em ecossistemas marinhos, avaliar o impacto antrópico em ecossistemas costeiros, detectar espécies em ambientes terrestres e monitorar a presença de espécies ameaçadas nesses ambientes (DiBattista et al., 2020; Lynggaard et al., 2022; Sevellec et al., 2021; Veilleux; Misutka; Glover, 2021; Budd et al., 2023). No cenário brasileiro, estudos com eDNA começaram recentemente, como por exemplo pelo uso do eDNA metabarcoding no monitoramento espacial e temporal da comunidade de peixes neotropicais do rio Jequitinhonha. Este estudo contribuiu para aumentar o conhecimento a respeito da, ainda relativamente pouco estudada, ictiofauna neotropical (Sales et al., 2021). Os exemplos de uso de eDNA em estuários são encontrados em grupos de pesquisa em diversos países no mundo. Nos Estados Unidos destacam-se trabalhos com peixes de estuários próximos a centros urbanos, o estuário do rio Hudson (Stoeckle; Soboleva; Charloppowers, 2017) e o estuário de São Francisco (Nagarajan et al., 2022). Kume e colaboradores aplicaram a técnica de eDNA metabarcoding em 25 estuários do arquipélago japonês, detectando espécies raras, ameaçadas e invasoras da ictiofauna, e a influência de fatores ambientais como latitude, correntes oceânicas e modificações artificiais desses locais afetam a estrutura da comunidade de peixes dos estuários (Ahn et al., 2020; Kume et al., 2021). Na Ásia outros trabalhos de inventário da ictiofauna foram realizados na China no estuário de Yangtze (Jiang et al., 2023; Zhang et al., 2019) e no estuário de Merbok da península da Malásia, com mais de 1400 espécies marinhas identificadas e que está associado a grande área de manguezal (Zainal Abidin et al., 2022). Na América do Sul, Polanco e colaboradores avaliaram o potencial do uso de eDNA metabarcoding para monitorar a fauna e, além de peixes, o grupo identificou anfíbios, répteis, aves e mamíferos terrestres que habitam os entornos do estuário do rio Don Diego (Polanco et al., 2021). 12 As pesquisas com DNA metabarcoding avançaram muito na última década, contudo ainda restam inúmeras lacunas de conhecimento sobre a biodiversidade que podem ser preenchidas a partir de novas investigações, especialmente em ecossistemas costeiros na região Neotropical. Ainda faltam trabalhos que correlacionem a antropização com a diversidade encontrada através do eDNA, portanto, o objetivo deste trabalho foi aprimorar a metodologia de DNA metabarcoding, melhor compreender sobre limitações e possíveis aplicações, contribuir para a descoberta da biodiversidade estuarina paulista e monitoramento da ictiofauna em ecossistemas costeiros, e avaliar o impacto potencial das condições ambientais de rios com diferentes níveis de antropização sobre a biodiversidade local. Material e Métodos Coleta das amostras de água As amostras foram coletadas em agosto de 2023, em duas localidades: o estuário rio Escuro junto ao mangue da Praia Dura, em Ubatuba, SP (23°29'24"S 45°09'57"W) (Figura 1), e o estuário do rio Juqueriquerê em Caraguatatuba, SP (23°42'11"S 45°26'10"W) (Figura 2). Figura 1. Encontro do rio Escuro com o mar na Praia Dura (Ubatuba, SP). 13 Figura 2. Trecho do rio Juqueriqurê que atravessa a cidade de Caraguatatuba/SP. Em cada um dos pontos estabelecidos nos dois estuários, foi coletado o volume de 1 L de água a 1 m de profundidade. A amostragem foi realizada sequencialmente ponto a ponto e em sentido contrário ao da correnteza para evitar contaminação com material biológico do próprio pesquisador coletor. No total foram 15 pontos de coleta no rio Escuro (Figura 3) e 12 pontos no rio Juqueriquerê (Figura 4), seguindo o gradiente de salinidade ao longo do estuário. As amostras de água foram coletadas utilizando uma garrafa plástica de 1L, previamente esterilizada por lavagem sequencial em álcool 70%, água sanitária e água destilada, seguindo metodologia de Abidin e colaboradores (Abidin et al., 2022). Todo o material utilizado para a amostragem, além dos próprios frascos, foi esterilizado adotando-se o mesmo procedimento de lavagem. A cada ponto de coleta foram utilizados pares novos de luvas descartáveis para manuseio de cada amostra individual. Posteriormente, as garrafas com água amostrada foram armazenadas em isopor imersas em gelo (0ºC) até a etapa seguinte de filtragem. 14 Figura 3. Pontos de coleta selecionados no rio Escuro. Os pontos em amarelo (RE M) indicam a porção externa (prevalência de água marinha) do estuário, os pontos em vermelho (RE T) indicam a porção de transição e os pontos em azul (RE R) indicam a porção interna do estuário (prevalência de água doce do rio). Figura 4. Pontos de coleta selecionados no rio Juqueriquerê. Os pontos em amarelo (JQ M) indicam a porção externa (prevalência de água marinha) do estuário, os pontos em vermelho (JQ T) indicam a porção de transição e os pontos em azul (JQ R) indicam a porção interna do estuário (prevalência de água doce do rio). 15 Cada amostra de água das localidades foi submetida ao processo de filtragem para isolamento dos ácidos nucléicos em até 12 horas após a coleta. Para o procedimento foram utilizadas unidades de filtro Sterivex™ (poro 0.22 μm; Millipore, USA) ou membrana de nitrocelulose de 47mm de diâmetro (poro 0.22 μm; Millipore, USA). A filtragem com as membranas de nitrocelulose foi realizada com o auxílio de uma bomba de vácuo acoplada a um sistema de vidrarias para permitir a passagem da água pelo filtro (Figura 5). A partir deste método foi possível filtrar aproximadamente 1L de cada amostra. Após a filtragem todas as membranas foram envolvidas em papel moeda e armazenadas individualmente em saco plástico estéril com esferas de sílica, sendo preservadas em gelo. Posteriormente, permaneceram armazenadas em freezer (-20ºC) até a realização do procedimento de extração. Figura 5. Processo de filtragem da água com auxílio de bomba a vácuo através da membrana de nitrocelulose. Para o procedimento com os filtros Sterivex™ a água foi filtrada com o uso de uma seringa com saída do tipo luer-lock, com capacidade de acoplamento ao filtro (Figura 6). O volume filtrado variou entre 170 e 550 mL, sendo esta 16 diferença de volume decorrente do esgotamento variável do filtro devido à alta concentração de sedimentos em determinadas porções d’água. As amostras foram preservadas em 700ul de RNA/DNA Shield™ (Zymo Research Corp., Freiburg, Alemanha), adicionado no interior da capsula do filtro, e armazenadas em gelo até o laboratório, onde foram mantidas em freezer a -20 °C até a extração. Figura 6. Processo de filtragem da água com uso de seringa através da membrana dos filtros Sterivex™ realizada durante a coleta de campo. As 12 amostras do rio Juqueriquerê foram filtradas com Sterivex™, enquanto no rio Escuro 4 amostras foram filtradas com Sterivex™ e as demais com filtros de nitrocelulose. Coleta de dados de variáveis ambientais Em cada rio foram definidos nove pontos, sendo três representativos de cada trecho do estuário (rio, transição rio-mar, mar), em que foi realizada a medição dos parâmetros físico-químicos da água com uma sonda multiparâmetros HORIBA modelo U-52, previamente calibrada, incluindo temperatura (°C), pH, potencial de óxido redução (mV), condutividade elétrica (μS/cm), turbidez (NTU), oxigênio dissolvido (mg/L e % saturação) e sólidos 17 totais dissolvidos (g/L). Amostras de água (sub superfície) também foram coletadas nos mesmos pontos para análise em laboratório da concentração de fósforo total (mg/L), clorofila a (µg/L) e sólidos totais (mg/L). Na análise de fósforo total as amostras foram digeridas (Valderrama, 1981) e quantificadas através de técnicas de espectrometria (Strickland & Parsons, 1960; APHA, 2017) e o valor final de concentração foi obtido através da comparação com uma curva padrão de concentração do próprio laboratório. Os sólidos totais foram analisados a partir dos resíduos sólidos remanescentes, após a completa evaporação da água presente em 200 mL de amostra seca em estufa a 100 °C (APHA, 2017). A concentração de clorofila foi determinada seguindo protocolo de filtragem a vácuo das amostras através de membranas Millipore AP40. A quantidade de água variou de 0,5 a 1L, a depender da presença de material particulado na amostra de água. Posteriormente, foi extraído o pigmento retido no filtro com acetona 90% à frio e maceração manual. Após centrifugação, foram feitas leituras no espectrofotômetro nos comprimentos de onda de 636nm e 750nm, para subsequente cálculo da concentração (APHA, 2017). A partir dessas métricas calculamos o Índice de Estado Trófico modificado para regiões tropicais/subtropicais, baseado nas fórmulas 10*(6-((-0,7- 0,6*(LN(F3))/LN(2))))- 20 para clorofila e 10*(6-((0,42-0,36*(LN(F4))/LN(2))))-20 para fósforo em ambientes lóticos (Mercante; Tucci-Moura, 1999) (Relatório de Qualidade das Águas Interiores do Estado de São Paulo (Apêndice D) (https://cetesb.sp.gov.br/aguasinteriores/wpcontent/uploads/sites/12/2019/10/p %C3%A Andice-D_-%C3%8Dndices-de-Qualidade-das-%C3%81guas.pdf) (acesso em 10/12/2023). Os dados entre as áreas foram comparados utilizando a análise de Teste T ou seu equivalente não paramétrico, teste de Mann- Whitney. Todas as análises estatísticas foram realizadas em R v. 3.6.0. Extração de DNA A extração do eDNA contido nas membranas de nitrocelulose se deu da seguinte maneira: com tesoura e pinça devidamente esterilizadas inserimos a membrana em microtubo de 1,5 mL, onde cortamos em pequenos fragmentos e foram adicionados 80 µL de proteinase K e 750 µL de lysis buffer (Kit 18 NucleoSpin® Tissue, Macherey Nagel, USA). As amostras foram então incubadas overnight a 56°C e após esta etapa a extração seguiu mediante o protocolo do fabricante do Kit NucleoSpin® Tissue (Macherey Nagel, USA). Para a extração do eDNA dos filtros Sterivex™, cada um deles foi disposto verticalmente com o orifício maior voltado para baixo e apoiado em um microtubo de 1,5 mL, sendo colocados nesta conformação, da maneira mais estável possível, dentro de um tubo falcon de 50mL. Os tubos falcon foram centrifugados por 1 min a 1500g permitindo que o conteúdo de RNA/DNA Shield juntamente com o DNA contido no filtro escorresse para o microtubo. Na etapa seguinte, foi adicionado 180 µL de lysis buffer e 25 µL de proteinase K (Kit NucleoSpin® Tissue, Macherey Nagel, USA), as amostras foram então incubadas overnight a 56°C. Os passos seguintes da extração seguiram de acordo com protocolo estabelecido pelo fabricante no Kit NucleoSpin® Tissue (Macherey Nagel, USA). Todo o DNA extraído foi quantificado por fluorometria através do Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity (HS) (Life Technologies, EUA). PCR (Polymerase Chain Reaction) Os amplicons foram gerados a partir do gene 12S rRNA através da amplificação via PCR utilizando os primers universais de peixe, MiFish-U e Mish- E2 (Miya et al., 2015), com os extensores para sequenciamento IIlumina. A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada em um volume total de 25 µl consistindo em 7,3 µl de água ultrapura, 2,5 µl 10 PCR buffer, 0,75 µl de dNTPs (10 mM), 0,75 µl de cada primer (10 µM), 0,1 µl de Taq polimerase e 1 µl de eDNA. As reações de amplificação serão realizadas com desnaturação inicial a 94ºC por 2 minutos, seguida de 35 ciclos de desnaturação a 95ºC por 30 segundos, anelamento a 53,8ºC por 30 segundos e extensão a 72ºC por 30 segundos, mantendo ao final em 4ºC. Tabela 1. Lista de primers utilizados para amplicação do gene 12 rRNA do DNA mitocondrial. Primer Sequência 19 MiFish U F + Adaptador 5’ TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG‐ GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC 3’ MiFish U R + Adaptador 5’ GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG‐ CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG 3’ MiFish E2 F + Adaptador 5’ TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG‐ RGTTGGTAAATCTCGTGCCAGC 3’ MiFish E2 R + Adaptador 5’ GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG‐ GCATAGTGGGGTATCTA ATCCTAGTTTG 3’ Resultados Variáveis ambientais Partindo das medições in situ nos pontos de coleta, bem como de análises posteriores em laboratório, obteve-se dados das seguintes variáveis ambientais de interesse: temperatura (°C), pH, ORP (mV), condutividade (mS/cm), turbidez (NTU), oxigênio dissolvido (mg/L e % de saturação), sólidos totais dissolvidos (g/L), sólidos totais (mg/L), clorofila a (ug/L) e fósforo total (mg/L). Os dados, com sua média e desvio padrão, para o trecho de cada rio, são apresentados na Tabela 2. Tabela 2. Valores (média e desvio padrão entre os pontos) das variáveis limnológicas medidas nos trechos de rio, transição e mar nos estuários associados ao rio Escuro e ao rio Juqueriquerê. Rio Escuro Rio Juqueriquerê Rio Transição Mar Rio Transição Mar Temperatura 21,15± 24,82± 25,21± 22,47± 22,25± 23,41± (°C) 0,69 0,12 0,07 0,09 0,15 0,03 Salinidade (%) 0,24± 2,48± 2,42± 0,003± 0,32± 2,52± 0,11 0,03 0,006 0,006 0,035 0,02 20 pH 7,25± 8,59± 8,74± 8,40± 7,30± 8,69± 0,55 0,07 0,01 0,87 0,27 0,02 ORP (mV) 115± 230,67± 208,67± 187,67 228,33± 212,33± 54,15 4,73 5,03 ± 18,58 11,72 44,41 Condutividade 4,56± 38,97± 38,07± 0,10± 5,85± 39,63± (mS/cm) 1,98 0,47 0,06 0,03 0,58 0,76 Turbidez (NTU) 0,57± 2,23± 4,4± 8,93± 5,37± 80,3± 0,98 0,35 1,77 0,46 0,35 18,15 OD (mg/L) 6,01± 6,09± 6,10± 4,31± 4,29± 4,78± 0,55 0,47 0,46 0,63 0,24 0,30 OD (%) 70,17± 86,37± 86,60± 50,97± 51,37 66,43± 5,26 6,67 6,58 7,51 2,69± 4,39 TDS (g/L) 2,89± 1,22 23,80± 0,26 23,27± 0,06 0,06± 0,02 3,68± 0,36 24,17± 0,45 Sólidos totais (mg/L) 3143,33 ± 717,42 36837,33± 874,13 36347,00 ± 528,36 74,67± 10,68 4544,00± 202,72 10457,50± 9874,25 Clorofila a (ug/L) 0,16± 0,07 1,76± 0,11 1,61± 0,17 25,31± 14,24 2,99± 0,82 9,87± 6,57 Fósforo total (mg/L) 12,24± 0,95 19,49± 1,25 28,65± 6,25 44,01± 16,92 71,48± 4,59 66,69± 10,02 Os testes estatísticos para análise das variáveis ambientais entre os estuários indicaram diferença significativa entre os valores de turbidez (W = 3, p = 0.001073), oxigênio dissolvido (t = 7.7886, df = 15.995, p < 0.0001), oxigênio dissolvido em % de saturação (t = 5.6295, df = 15.86, p < 0.0001), clorofila (W = 0, p = 0.00004066) e fósforo (W = 2, p = 0.0001645). Estes resultados, que indicam pior qualidade de água no estuário do rio Juqueriquerê, comparado ao estuário do rio Escuro, são apresentados graficamente abaixo (Figuras 7, 8, 9, 10 e 11) 21 Figura 7. Boxplots dos valores de turbidez (NTU) no estuário do rio Escuro e do rio Juqueriquerê, os quais apresentam diferença estatatística significativa através do teste de Mann-Whitney (p = 0.001073). Figura 8. Boxplots dos valores de oxigênio dissolvido (mg/L) no estuário do rio Escuro e do rio Juqueriquerê, os quais apresentam diferença estatatística significativa através do Teste T (p < 0.0001). 22 Figura 9. Boxplots dos valores de oxigênio dissolvido (%) no estuário do rio Escuro e do rio Juqueriquerê, os quais apresentam diferença estatatística significativa através do Teste T (p < 0.0001). Figura 10. Boxplots dos valores de clorofila a (ug/L) no estuário do rio Escuro e do rio Juqueriquerê, os quais apresentam diferença estatatística significativa através do teste de Mann- Whitney (p = 0.0004066). 23 Figura 11. Boxplots dos valores de fósforo total (mg/L) no estuário do rio Escuro e do rio Juqueriquerê, os quais apresentam diferença estatatística significativa através do teste de Mann- Whitney (p = 0.0001645). Índice de Estado Trófico (IET) Os resultados do IET demonstram que o rio Juqueriquerê apresentou maiores níveis de eutrofização do que o rio Escuro (Tabela 3). Enquanto o primeiro apresentou classificações de mesotrófico, eutrófico supereutrófico e hipereutrófico em alguns pontos, o segundo exibiu pontos mesotróficos, oligotróficos e ultraoligotróficos. 24 Tabela 3. Índice de Estado trófico (IET) calculado para os pontos de coleta de rio, transição e mar, delimitados para o estudo, nos estuários do rio Escuro e Juqueriquerê. DNA ambiental Após a extração de DNA das membranas, as concentrações de DNA encontradas variaram entre 0,615 e 5,10 ng/µL nas amostras do rio Escuro, e entre 3,80 e 9,70 ng/µL no rio Juquriquerê (Tabela 4 e 5). Tabela 4. Concentração das amostras de eDNA (ng/µL) do rio Escuro após a extração. Amostras eDNA rio Escuro Local de coleta Tipo de filtro Concentração (ng/µL) RE-01-R Rio Nitrocelulose 0,749 RE-02-R Rio Nitrocelulose 0,959 RE-03-R Rio Nitrocelulose 0,714 RE-04-R Rio Nitrocelulose 0,615 RE-05-R Rio Nitrocelulose 3,94 RE-06-T Transição Nitrocelulose 0,717 25 RE-07-T Transição Nitrocelulose 1,12 RE-08-T Transição Nitrocelulose 0,553 RE-09-T Transição Sterivex™ 3,11 RE-10-T Transição Sterivex™ 4,2 RE-11-M Mar Nitrocelulose 1,32 RE-12-M Mar Nitrocelulose 1,74 RE-13-M Mar Nitrocelulose 1,56 RE-14-M Mar Sterivex™ 3,74 RE-15-M Mar Sterivex™ 5,10 Tabela 5. Concentração das amostras de eDNA (ng/µL) do rio Juqueriquerê após a extração. Amostras eDNA rio Juqueriquerê Local de coleta Tipo de filtro Concentração (ng/µL) JQ-01-M Mar Sterivex™ 6,22 JQ-02-M Mar Sterivex™ 3,80 JQ-03-M Mar Sterivex™ 4,60 JQ-04-M Mar Sterivex™ 4,90 JQ-05-R Rio Sterivex™ 4,59 JQ-06-R Rio Sterivex™ 5,29 JQ-07-R Rio Sterivex™ 9,70 JQ-08-R Rio Sterivex™ 4,07 JQ-09-T Transição Sterivex™ 4,77 JQ-10-T Transição Sterivex™ 5,63 JQ-11-T Transição Sterivex™ 3,91 JQ-12-T Transição Sterivex™ 4,59 Na PCR apenas as amostras filtradas utilizando Sterivex™ foram as únicas amplificadas com sucesso, sendo possível verificarmos bandas em gel de agarose relativas a fragmentos do gene 12s rRNA de 250pb a 300pb, aproximadamente. 26 Discussão A qualidade da água e IET diferem entre estuários sob diferentes níveis de ocupação antrópica A hipótese do rio Juqueriquerê ser um rio mais eutrofizado do que o rio Escuro pode ser confirmado, tanto por apresentar maiores valores em variáveis ambientais importantes como clorofila a e fósforo, mas também pela sua classificação no Índice de Estado Trófico. Apesar de ambos os estuários apresentarem alguns pontos em que foram classificados como mesotrófico, os demais diferem. O rio Escuro apresenta pontos que foram classificados como ultraoligotróficos e oligotrófico, enquanto o rio Juqueriquerê tem pontos classificados como eutrófico, supereutrófico e até mesmo hipereutrófico. A presença de nutrientes em excesso nos rios pode ter diferentes origens, o fósforo, por exemplo, tem como suas principais fontes efluentes de esgoto e agricultura, tendo seu aumento diretamente relacionado com a urbanização (Pagliossa et al., 2005; Jarvie et al., 2006). Relacionado com o aumento de nutrientes em corpos d’água está a maior da presença de organismos autotróficos, com rápida proliferação de certas espécies de algas, refletindo diretamente os valores de clorofila a, ainda que em rios outros fatores como temperatura e períodos de chuva possam também ter influência nesse aumento (Dodds, 2006). Esse fenômeno pode justificar os maiores valores de clorofila a encontrados no rio Juqueriquerê, mais eutrofizado. Em relação ao oxigênio dissolvido o rio Escuro apresentou maiores valores que o rio Juqueriquerê, resultados que corroboram com os dados anteriores a respeito da eutrofização, pois um dos efeitos desse processo é a diminuição dos níveis de oxigênio devido a decomposição dos detritos orgânicos (Esteves, 1998). Quanto aos maiores valores de turbidez no rio Juqueriquerê, dado que os maior valor de turbidez foi encontrado na porção classificada como “mar”, podem estar relacionados com a obra de construção de molhes na foz do rio, próxima a obra, aumentando a quantidade de detritos na água. 27 Obtenção de DNA ambiental nos estuários As concentrações de eDNA obtidas nas amostras após extração estão dentro, ou próximo, dos valores descritos na literatura, Majaneva e colaboradores (2018) descreve concentrações para amostras de rio entre 0.9 e 6.9 ng µL−1, no entanto faltam informações nas publicações respeito da concentração ideal de DNA para as etapas seguintes. No nosso trabalho, contudo, o mais determinante para o sucesso da etapa seguinte de amplificação parece estar mais relacionado com o tipo de filtro utilizado. Apenas as amostras filtradas em Sterivex™ foram amplificadas, ainda que o mesmo protocolo tenha sido adotado para a PCR em todas as amostras. Potenciais causas da não amplificação das amostras dos filtros de nitrocelulose, incluem (i) o material do filtro em si não reteve os ácidos nucléicos devidamente aderidos; (ii) a forma de preservação utilizada em isopor em gelo pode não ter evitado a degradação do DNA; (iii) ou o protocolo de extração não foi adequado para recuperar o DNA aderido aos filtros. Porém esta metodologia foi baseada e seguiu estritamente protocolos encontrados na literatura que utilizaram o mesmo tipo de membrana de nitrocelulose ou MCE e forma de preservação das amostras (Lacoursiere -roussel et al., 2016; Hinlo et al., 2017; Majaneva et al., 2018; Kumar et al., 2019). A única mudança no presente estudo foi o uso do kit de extração NucleoSpin® Tissue (Macherey-Nagel) que difere de outros utilizados na literatura, porém esta etapa não é padronizada na literatura, os kits utilizados variam, apesar de alguns serem mais comumente escolhidos. (Rees et al., 2014; Tsuji et al., 2019). Um dos responsáveis pela dificuldade de amplificação pode ser a presença de inibidores de PCR nas amostras, que não foram devidamente removidos durante a extração, os inibidores são compostos, como ácido húmico e ácido tânico, que interferem nos mecanismos de amplificação da PCR, e podem estar presentes nas amostras de eDNA (Jane et al., 2014; Hunter et al., 2019). Entretanto, a metodologia estabelecida com os filtros Sterivex™ se mostrou efetiva para obtenção de eDNA de peixes em estuário, interessante de se destacar, tendo em vista as diferentes e variáveis metodologias encontradas 28 na literatura. Acrescentando informações para o debate a respeito de qual filtro é capaz de fornecer melhores resultados, como outros estudos já buscaram responder anteriormente (Minamoto et al., 2016; Capo et al., 2019) muitas vezes com falta de descrição detalhada do protocolo, portanto se torna interessante que os estudos com eDNA se esforcem para reportar da melhor maneira possível seus métodos (Bunholi et al., 2023). Conclusão Com os resultados obtidos neste estudo, podemos concluir que os estuários no litoral de São Paulo merecem atenção quanto a sua conservação, sendo políticas públicas necessárias para mitigar a eutrofização de rios como o Juqueriquerê, próximo de centros urbanos e de grande importância para a comunidade local. O DNA ambiental se mostra uma ferramenta capaz de ser utilizada nesses ambientes, podendo contribuir para o monitoramento de fauna aquática. Neste trabalho infelizmente não foi possível realizar a etapa final de sequenciamento e identificação das espécies presentes nos estuários, no entanto o grupo de pesquisa tem perojetos em paraleloque planejam fazer essas análises que poderão contribuir e enriquecer os resultados obtidos. No entanto, dentro do cenário brasileiro, em que poucos trabalhos foram realizados utilizando eDNA, especialmente em estuários do litoral de São Paulo, as descobertas iniciais e metodologias estabelecidas podem ser úteis para trabalhos futuros. Contribuindo para o avanço do conhecimento sobre eDNA e conservação de ecossistemas costeiros brasileiros. Referências AHN, H. et al. Evaluation of fish biodiversity in estuaries using environmental DNA metabarcoding. PLOS ONE, v. 15, n. 10, p. e0231127, 6 out. 2020. APHA. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. Washington DC: American Public Health Association, 23rd ed., 2017. BARBIER, E. B. et al. 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