UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA” FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS – DEPTO DE ALIMENTOS E NUTRIÇÃO DOUTORADO EM CIÊNCIAS NUTRICIONAIS “EFEITO COMBINADO DE POLIMORFISMOS NOS GENES DO METABOLISMO LIPÍDICO (LIPC, APOA1 E APOE) E ESTILO DE VIDA SOBRE OS FATORES DE RISCO PARA DOENÇAS CRÔNICAS EM ADOLESCENTES.” EMILIA ALONSO BALTHAZAR Araraquara – SP 2012 EMILIA ALONSO BALTHAZAR “EFEITO COMBINADO DE POLIMORFISMOS NOS GENES DO METABOLISMO LIPÍDICO (LIPC, APOA1 E APOE) E ESTILO DE VIDA SOBRE OS FATORES DE RISCO PARA DOENÇAS CRÔNICAS EM ADOLESCENTES.” Tese apresentada ao programa de pós- graduação em Alimentos e Nutrição da Faculdade de ciências farmacêuticas de Araraquara Unesp, para a obtenção do título de doutor(a) em ciências nutricionais Orientador (a): Profª Dra. Maria Rita M. de Oliveira Co-orientador (a): Profª Dra. Rozangela Verlengia Araraquara – SP 2012 (verso) COMISSÃO EXAMINADORA -------------------------------------------- Profa. Dra Maria Rita Marques de Oliveira (Orientadora) -------------------------------------------- Profa. Dra Thaís Borges César (Membro) -------------------------------------------- Profa. Dra Aureluce Demonte (Membro) -------------------------------------------- Profa. Dra Carla Cristina Enes (Membro) -------------------------------------------- Profa. Dra Glenda Nicioli da Silva (Membro) Araraquara, 15 de junho de 2012 ‘LEARN AND LIVE’ Dedicatória: À DEUS, Pela força de seguir em frente. Aos Meus pais, Maria Lucia e Balthazar, por sempre acreditarem em mim, mesmo quando eu duvidava. Eu só tenho a agradecer! AGRADECIMENTO ESPECIALAL À minha família: Minha irmã Ieda, meu cunhado Diego, meu sobrinho Thiago, minha tia Eliana e avó Iracema, pela força e paciência nos momentos em que tive que dedicar toda a minha atenção á pesquisa. Ao meu namorado, Pedro Paulo: Pelo carinho, compreensão e risadas durante esses quatro anos de doutorado. Eu só tenho a agradecer por vocês existirem em minha vida... AGRADECIMENTO À minha orientadora Prof Dr. Maria Rita, pelos ensinamentos e inspiração para seguir em frente na área da pesquisa. À minha co-orientadora Prof Dr. Rozangela pela orientação durante as etapas da pesquisa do doutorado. À banca de defesa de tese e de qualificação: Prof Dr. Anderson Navarro, Prof. Dr Glenda Nicioli da Silva, Prof. Dr. Carla Cristina Enes, Prof. Dr.Thais Borges César e Prof. Dr Aureluce Demonte pelas relevantes orientações. À Prof Dr. Betzabeth Slater pela oportunidade de desenvolver a pesquisa junto com a sua equipe. À Prof Dr. Daisy de Favero Salvadori pela oportunidade de desenvolver os experimentos de genética no seu laboratório de Toxicogenômica & Nutrigenômica. À Equipe do laboratório da Prof Daisy, principalmente, pela Glenda Nicioli da Silva, João Paulo de Castro Marcondes, Danielle Cristina de Almeida e Elaine Aparecida de Camargo, pela paciência e orientação durante o desenvolvimento do meu experimento. Ao Professor José Silvio Govone pela orientação estatística. Às orientadas da Prof (a) Maria Rita pelas risadas e fofocas que surgiam quando ficávamos acampadas na casa da Maria Rita. Não irei colocar nomes para não desfazer de ninguém. À Ana Cristina Silva Rebelo, Vandeni Kunz, Marina Donato Crepaldi e Marco Carneiro Cordeiro pelas risadas no laboratório de Performance. À UNESP-Fcfar, pela oportunidade de realização deste trabalho. Às secretárias da PG: Cláudia, Sônia, Laura, Márcia, Ângela, Daniela e Joice pela atenção e competência. Aos voluntários e aos pais dos voluntários, pela disponibilidade e colaboração, parte essencial do trabalho. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa. Por esses motivos expressos aqui, os meus mais sinceros agradecimentos! MUITO OBRIGADA ☺!!!!!!! SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS................................................................ X LISTA DE FIGURAS............................................................................ XI LISTA DE TABELAS............................................................................ XII RESUMO............................................................................................... XIII ABSTRACT........................................................................................... XIV CAPÍTULO I......................................................................................... 15 1.INTRODUÇÃO.................................................................................. 16 2. REVISÃO DA LITERATURA........................................................... 18 2.1. DOENÇAS CRÔNICAS NÃO TRANSMISSÍVEIS (DCNT).............................. 18 2.2. METABOLISMO LIPIDICO.............................................................................. 19 2.2.1 Lipoproteínas................................................................................................ 19 2.2.2 Transporte de lipídios para os tecidos...................................................... 20 2.2.2.1 Apolipoproteína E (ApoE)............................................................................ 21 2.2.3 Transporte reverso do colesterol............................................................... 22 2.2.3.1 Lipoproteína de alta densidade (HDL)........................................................ 22 2.2.3.2 Apolipoproteína A1 (ApoA1)....................................................................... 23 2.2.3.3 Lipase hepática (HL)................................................................................... 24 2.3. SINDROME METABÓLICA OU SÍNDROME DA RESISTÊNCIA À INSULINA............................................................................................................... 25 2.4. FATORES DIETÉTICOS.................................................................................. 26 2.5. ATIVIDADE FÍSICA......................................................................................... 30 2.6. FATORES GENÉTICOS X ESTILO DE VIDA................................................. 31 2.7. FATORES GENÉTICOS.................................................................................. 31 2.7.1 O Gene da Lípase Hepática (LIPC)............................................................. 31 2.7.2 O Gene da Apolipoproteína A1 (ApoA1).................................................... 33 2.7.3 O Gene da Apolipoproteína E (ApoE)......................................................... 35 2.8. ESTUDOS EM PIRACICABA COM ESCOLARES......................................... 37 3. OBJETIVOS.................................................................................................... 38 3.1. OBJETIVO GERAL.......................................................................................... 38 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................................ 38 REFERÊNCIAS................................................................................... 39 CAPÍTULO II - POLIMORFISMO (-514CT) DO GENE DA LIPASE HEPÁTICA POTENCIALIZA EFEITOS DO PESO CORPORAL E ADIPOSIDADE ABDOMINAL SOBRE TRIGLICERÍDEOS E RESISTÊNCIA A INSULINA ENTRE ADOLESCENTES................................................................................ 55 Resumo................................................................................................ 56 Introdução........................................................................................... 57 Casuística e métodos......................................................................... 58 Resultados........................................................................................... 63 Discussão............................................................................................ 66 Referências.......................................................................................... 70 CAPÍTULO III - Efeito combinado do polimorfismo T84C ApoA1 e estilo de vida sobre os fatores de risco para doença cardiovascular em adolescentes...................................................... 76 Resumo................................................................................................ 77 Introdução........................................................................................... 78 Casuística e métodos......................................................................... 79 Resultados........................................................................................... 83 Discussão............................................................................................ 87 Conclusão........................................................................................... 91 Agradecimentos.................................................................................. 91 Referências.......................................................................................... 91 CAPÍTULO IV - PRESENÇA DO ALELO APOE4 NOS ADOLESCENTES CONFERE FATOR DE RISCO PARA DOENÇAS CRÔNICAS QUE PODE SER MODIFICADO PELA ALIMENTAÇÃO................................................................................... 96 Resumo................................................................................................ 97 Conhecimentos básicos..................................................................... 98 Métodos................................................................................................ 99 Resultados........................................................................................... 104 Discussão............................................................................................ 107 Conclusões.......................................................................................... 111 Conflitos de interesse........................................................................ 111 Contribuições de autores................................................................... 111 Agradecimentos.................................................................................. 111 Referências.......................................................................................... 111 CAPÍTULO V – CONCLUSÕES.......................................................... 117 APÊNDICES......................................................................................... 121 APÊNDICE 1......................................................................................... 122 APÊNDICE 2......................................................................................... 129 ANEXO.................................................................................................. 131 X LISTA DE ABREVIATURA ABCA1 ATP-binding cassete protein, subfamília A1’ AGL Ácido graxo livre Apo Apolipoproteína ApoA1 Apolipoproteína A1 ApoA2 Apolipoproteína A1 ApoB Apolipoproteína B ApoB100 Apolipoproteína B100 ApoD Apolipoproteína D ApoE Apolipoproteína E CE Colesterol esterificado CL Colesterol livre CETP Proteína transportadora de colesterol éster DCV Doença cardiovascular HAS Hipertensão arterial sistêmica HDL-C Colesterol de lipoproteínas de alta densidade HL Lípase Hepática HSPG Proteoglicanas de heparan sulfato IDL Lipoproteínas de densidade intermediária LCAT Lecitina-colesterol acil transferase LDL-C Colesterol de lipoproteínas de baixa densidade LLP Lípase lipoprotéica LIPC Gene da lípase hepática MUFA Ácido graxo monoinsaturado NCEP National Cholesterol Education Program PLTP Proteína da transferência de fosfolipídio PUFA Ácido graxo poliinsaturado Qm Quilomícrons SFA Ácido graxo saturado SRB1 Scavenger receptor B1 TAF Ácido graxo trans TRC Transporte reverso do colesterol XI LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO I Figura 1. Localização do gene LIPC..................................................... 32 Figura 2. Localização do gene ApoA1.................................................. 34 Figura 3. Localização do gene ApoE.................................................... 35 CAPÍTULO II Figura 1. Influência da presença de sobrepeso na concentração sérica de TG em adolescentes de acordo com a distribuição de genótipos do polimorfismo -514CT no gene LIPC................................ 65 Figura 2. Influência da presença de cintura de risco para doença crônica metabólica na concentração sérica de TG em adolescentes de acordo com a distribuição de genótipos do polimorfismo -514CT no gene LIPC......................................................................................... 65 Figura 3. Influência da concentração de TG no índice de resistência à insulina do polimorfismo -514CT no gene LIPC................................ 66 CAPÍTULO III Figura 1. Resposta ao consumo proporcional de macronutrientes da dieta em adolescentes de acordo a frequência genotípica do polimorfismo T84C APOA1................................................................... 84 Figura 2. Influência da atividade física na concentração da glicemia e triglicérides em adolescentes de acordo com os genótipos do polimorfismo T84C APOA1................................................................... 86 CAPÍTULO IV Figura 1. Influência do consumo de ácido graxo poliinsaturada em percentual energético na concentração de CT, LDL-C, em adolescentes de acordo com a distribuição de genótipos da mutação missense do gene ApoE........................................................................ 105 FIGURA 2. Influência do consumo de alimentos gordurosos (a), ácido graxos total (b) e saturado(c) e carboidrato (d) segundo proporção percentual energética no percentil de pressão arterial, em adolescentes de acordo com a distribuição de genótipos da mutação missense do gene ApoE........................................................................ 106 XII LISTA DE TABELAS CAPÍTULO II Tabela 1. Características bioquímicas, antropométricas, dietéticas segundo a distribuição genotípica para o polimorfismo -C514T no gene LIPC............................................................................................. 63 CAPÍTULO III Tabela 1. Características antropométricas, bioquímicas e dietéticas de adolescentes de acordo com o polimorfismo T84C ApoA1, em Piracicaba-SP, 2009.............................................................................. 83 Tabela 2. Influência do consumo de alimentos na concentração de lipídios séricos em adolescentes de acordo a frequência genotípica do polimorfismo T84C ApoA1.................................................................................................... 85 CAPÍTULO IV Tabela 1. Comparação do perfil lipídico, glicêmico e insulínico entre adolescenntes portadores do alelo E2, E4 e genótipo E3E3 da mutação missense do gene da ApoE...................................................................................................... 104 XIII RESUMO Introdução: A interação entre gene e meio ambiente tem sido apontada como responsável pelo aumento das doenças crônicas metabólicas, cujos fatores de risco vêm se manifestando nas populações humanas, em idades cada vez mais precoces. Objetivo: Analisar os efeitos dos polimorfismos -514C/T no gene da LIPC e CT84 no gene da ApoA1, bem como da mutação missense no gene da ApoE sobre os fatores de risco para doenças crônicas, numa amostra de adolescentes, de um município do interior do Estado de São Paulo, Brasil. Metodologia: Foi realizado um estudo transversal com 214 adolescentes de ambos os sexos com idade mínima de 10 anos. Na coleta de dados foram incluídos: questionário de freqüência alimentar e de atividades físicas especifico para adolescentes, antropometria, aferição da pressão arterial, dosagens bioquímicas (insulina, glicose, colesterol total e frações, triglicerídeos e Apoa1) e genotipagem por PCR-real time dos genes selecionados. Resultados: Os adolescentes portadores do alelo raro para o polimorfismo - 514CT do gene LIPC apresentaram maior prevalência de síndrome metabólica. Em relação ao polimorfismo TC84 da ApoA1, os adolescentes com o genótipo TT apresentaram maior prevalência de hipertrigliceridemia e se encontraram mal adaptados à prática de atividade física e consumo de carboidrato. Analisando a mutação missense do gene da ApoE foi verificado que os adolescentes portadores do alelo ApoE4 apresentaram maior prevalência de fatores de risco para doenças crônicas e eram beneficiados pelo consumo de gordura em substituições aos carboidratos. Conclusão: Recomendações dietéticas e prática de atividades físicas direcionadas ao perfil genético do adolescente poderão prevenir o desenvolvimento de fatores de risco metabólico e o aparecimento de doenças crônicas na vida adulta. Palavras-chave: Adolescentes, polimorfismos genéticos, doenças crônicas, consumo alimentar e atividade física. XIV ABSTRACT Introduction: The interactions between genes and environment has been identified as responsible for the increase of chronic metabolic diseases, in which risk factors are positioning themselves in human populations at earlier years of age. Objective: To analyze the effects of the polymorphisms - 514CT LIPC gene and CT84 ApoA1 gene, as well as, missense mutation ApoE gene on the outcome of risk factors for chronic diseases in a sample of adolescents from a city in the state of Sao Paulo, Brazil. Methods: It was conducted a cross-sectional study in 214 adolescents of both sexes with a minimum of 10 years of age. The data collection included: food frequency and physical activity questionnaire, anthropometry, blood pressure, biochemical measurements (insulin, glucose, Total cholesterol and fractions, triglycerides e Apoa1) and genotyping of the selected genes by PCR-real time. Results: The adolescents with the rare allele for the -514CT LIPC polymorphism had higher prevalence of metabolic syndrome. Regarding TC84 ApoA1 polymorphism, the adolescent’s carriers of the TT genotype had higher prevalence of hypertriglyceridemia and found themselves ill- suited to the practice of physical activity and carbohydrate consumption. Analyzing the missense mutation of the ApoE gene it was found that adolescents with the ApoE4 allele had a higher prevalence of risk factors for chronic diseases and were benefited by the consumption of fat to carbohydrate substitutions. Conclusion: A dietary and physical activity treatment targeted to the genetic profile of the adolescent may prevent the development of metabolic risk factors and the onset of chronic diseases in adulthood. Key words: Adolescents, genetic polymorphisms, chronic diseases, dietary intake and physical activity. 15 CAPÍTULO I 16 1. INTRODUÇÃO ______________________________________________________ O deciframento de identidades genéticas indivíduais têm potencial de ampliar radicalmente muitas das estratégias utilizadas na melhoria da população (CHÁVES; DE CHÁVES, 2003). A obesidade, uma doença de múltiplos determinantes genéticos, apresenta- se atualmente como um grande problema de saúde e tem afetado o ser humano em todos os seus estágios de vida, o que iclui a infância e a adolescência (RANKINEN et al, 2006). A infância e a adolescência são consideradas períodos críticos para o desenvolvimento de fatores de risco para doenças a serem manifestadas na vida adulta (DIETZ, 1998). A genética não explica este crescente aumento da obesidade, já que desde o ínicio da humanidade a composição genética dos individuos modificou-se marginalmente. Porém os hábitos cotidianos dos indivíduos, que incluem consumo alimentar e atividade física, têm se modificado de forma marcante durante a história da humanidade e essas alterações parecem ter “despertado” a atuação de variavéis genéticas antes consideradas “adormecidas” (DARNTON-HILL et al, 2004). A obesidade não é apenas um problema estético e psicossocial. Esta desordem representa risco para o desenvolvimento de outras doenças metabólicas, como diabetes, hipertensão arterial e dislipidemias. O conjunto dessas doenças é normalmente precedido pela síndrome metabólica (SM), que envolve desordens do metabolismo da glicose e lipídico (GRUNDY, 2011). As alterações no metabolismo lipídico relacionadas ás triglicérides (TG), colesterol de lipoproteínas de alta densidade (HDL-C) e colesterol de lipoproteínas de baixa densidade (LDL-C) estão intimamente ligadas ao desenvolvimento dessas doenças crônicas metabólicas e a SM (NOCK; PILLAI, 2012). A apolipoproteína E (ApoE), a apolipoproteína A1 (ApoA1) e a lipase hepática (HL) são componentes importantes do metabolismo lipídico que interagem com essas lipoproteínas e lipídio (ORDOVAS, 2009). 17 A presença de polimorfismos nos genes que expressam essas proteínas tem modificado a concentração de lipoproteínas séricas e o risco de desenvolvimento de doenças crônicas metabólicas. Em Piracicaba-SP, local de desenvolvimento deste estudo, resultados de trabalho anterior revelaram elevada prevalência de alterações lipídicas, independentemente do estado nutricional, sugerindo que nesta população poderia estar ocorrendo a interação de fatores genéticos e ambientais na determinação das alterações encontradas, visto que a composição da dieta teve influência tanto na adiposidade corporal (BALTHAZAR, OLIVEIRA, 2011), quanto nos lipídeos séricos (BALTHAZAR, 2008), mas não o suficiente para explicar o fenômeno encontrado naqueles adolescentes. Assim sendo, o estudo teve como objetivo analisar os efeitos dos polimorfismos nos gene LIPC, ApoA1 e ApoE sobre os fatores de risco para doenças crônicas metabólicas, numa amostra de adolescentes, considerando também a influencia do consumo alimentar e atividade física na resposta destes polimorfismos. 18 2. REVISÃO DA LITERATURA 2.1 . DOENÇAS CRÔNICAS NÃO TRANSMISSÍVEIS (DCNT) As doenças cardiovasculares (DCV) estão entre as grandes preocupações de saúde pública nos países desenvolvidos e em desenvolvimento. No Brasil as DCV representam a principal causa de morte no país (MALTA et al, 2006), como em outros países da América Latina e do Caribe (PRAMPARO et al, 2006). As DCV geralmente estão associadas a um ou mais fatores de risco, que incluem aqueles não modificáveis: predisposição genética, sexo, idade e os modificáveis, como, obesidade, diabetes, hipertensão e dislipidemia (colesterol total e colesterol de lipoproteínas de baixa densidade (LDL-C) elevado, assim como baixo colesterol de lipoproteínas de alta densidade (HDL-C) (DE GODOY et al 2006; ORDOVAS, 2009). Estudos epidemiológicos têm mostrado uma maior prevalência de DCV em populações com altas concentrações sanguíneas de colesterol. O efeito do colesterol sanguíneo na formação do ateroma tem início precoce. Foi mostrado que as estrias gordurosas começam aparecer na aorta aos três anos de idade e, aos quinze anos comprometem 15% desta artéria e estas alterações tendem a permanecer na maioridade (FORTI et al, 1998). No Brasil em alguns estudos com números restritos de crianças e adolescentes se tem mostrado diversos tipos de dislipidemias. Na cidade de Florianópolis, uma pesquisa com 1009 crianças e adolescentes verificou que 23% da amostra apresentavam baixo nível de HDL-C e 25% apresentavam altos níveis de colesterol não HDL (GIULIANO et al, 2011). Em Itapetininga, cidade do interior do estado de São Paulo, uma pesquisa com uma amostra de 494 crianças e adolescentes verificou que 51% desses indivíduos apresentavam aumento no Colesterol, 40.5% aumento no LDL-C, 8,5% aumento no triglicérides (TG) e baixa concentração de HDL-C em 6,1% dessas crianças (PEREIRA et al, 2009). Em Belém do Pará, um estudo prospectivo e transversal com escolares na faixa etária entre 6 e 19 anos verificou que 41% da amostra apresentava algum tipo de dislipidemia, sendo as 19 alterações de HDL-C a de maior frequência (29,5%) seguidos pela alterações de TG (15,8%) (RIBAS; SILVA, 2009). Tradicionalmente, a redução dos riscos para as DCV costumam ser medidos a partir dos efeitos de determinada variável sobre os lipídios plasmáticos, mais especificamente sobre as concentrações de componentes das lipoproteínas, que são responsáveis pelo transporte e distribuição de lipídios pelo corpo (SOCIEDADE BRASILEIRA DE CARDIOLOGIA, 2007). 2.2. METABOLISMO LIPÍDICO 2.2.1 Lipoproteínas: As lipoproteínas são partículas globulares formadas a partir da combinação de lipídios e proteínas em proporções variadas. Os TG e os ésteres de colesterol são seus principais lipídios constituintes. Na superfície, que é hidrofóbica, encontram-se fosfolipídios, uma pequena quantidade de colesterol livre (CL) e proteínas chamadas apolipoproteínas (Apo) (BIGGERSTAFF; WOOTEN, 2004). As lipoproteínas são classificadas de acordo com a densidade, que é determinada pela quantidade de lipídios e proteínas contidas nas partículas. Quanto maior quantidade de proteínas maior será a densidade (SIKORSKI, 2006). As lipoproteínas são classificadas em: quilomícrons (Qm) - lipoproteína formada no intestino que transporta TG para os tecidos, ciclo exógeno - as lipoproteínas de muita baixa densidade (VLDL), as lipoproteínas de densidade intermediária (IDL), as LDL, a lipoproteína(a) (partícula semelhante a LDL que apresenta a Apo(a) e é considerada um marcador para DCV) e as HDL (SIKORSKI, 2006). 20 2.2.2 Transporte de lipídios para os tecidos Os TG da dieta transportados até o fígado pelos Qm ou aqueles produzidos endogenamente a partir de carboidratos e proteínas são os principais componentes das VLDL que são sintetizadas pelo fígado (RECKLESS; LAWRENCE, 2003). A principal Apo da VLDL é a ApoB100, responsável pela sua secreção, porém essa partícula apresenta também outras proteínas em sua estrutura, como, as ApoC (C1,C2,C3) e ApoE. (CHANDALIA; ABATE, 2003). A VLDL é liberada do fígado para os músculos e tecido adiposo, onde a ApoC2 ativa a Lípase Lipoprotéica (LLp) que hidrolisa os TG e libera ácidos graxos para armazenamento de gordura no tecido adiposo ou para serem oxidados na produção de energia pelos músculos e outros tecidos (KIRK, 2005). Com a depleção de TG e enriquecimento com colesterol esterificado (CE) é formados os remanescentes de VLDL que podem ser recicladas no fígado pela interação com o receptor hepático de LDL, em processo mediado pelas ApoB e ApoE (SIKORSKI et al, 2006, NAKAJIMA et al, 2011). Outro processo alternativo é a remodelação de VLDL remanescente em IDL e em seguida LDL a partir da Lípase hepática (HL) (SIKORSKI, 2006). A LDL é constituída de 20% de ApoB100, 9% de CL, 38% de CE e 7% de TG (SIKORSKI, 2006). A LDL é responsável pelo fornecimento de colesterol aos tecidos, usado na síntese e reparação da membrana celular e para processos como síntese de hormônios esteróides e vitamina D (SIKORSKI, 2006). As partículas de LDL permanecem por longo tempo no plasma, mas podem ser captadas pelo fígado, sendo esta a principal forma de controle das concentrações séricas de colesterol (TEERLINK et al, 2004). O aumento de colesterol exógeno leva a uma queda da expressão de receptores hepáticos para LDL, o que leva ao aumento do LDL-C no sangue, aumentando a possibilidade de que seja oxidado e, por consequência, promova a formação de placa aterosclerótica (DAVIGNON; GANZ, 2004). 21 2.2.2.1 Apolipoproteína E (ApoE) A ApoE é uma glicoproteína componente estrutural da maioria das classes das partículas de lipoproteínas circulantes (GOLLEDGE et al., 2010; BURMAN et al, 2009). A maior parte da ApoE é sintetizada pelo fígado, sendo a outra parte sintetizada por diversos tecidos (glândulas adrenais, ovários, pulmões, tecido adiposo, rins) (MINIHANE et al, 2007). A ApoE humana é formada por uma única cadeia polipeptídica de 299 resíduos de aminoácidos com uma massa molecular de 34,2 kDa. Na ApoE existem dois domínios dobrados independentes: O N - terminal e o C-terminal (SAITO et al, 2004). O domínio N - terminal é responsável pela ligação da ApoE ao receptor de LDL e o domínio C - terminal possui alta afinidade com os lipídios e é responsável pela mediação da ligação da ApoE à superfície das partículas de apolipoproteína (SAITO et al, 2004). A ApoE possui funções importantes no metabolismo das lipoproteínas, como: co-fator na síntese de VLDL, participa da hidrólise dos remanescentes de VLDL para a produção de LDL, é responsável pela captação das lipoproteínas pelo fígado e sítios periféricos, já que é um ligante de alta afinidade para o receptor que media a remoção dos remanescentes das lipoproteínas (DO et al, 2009; MINIHANE et al, 2007). A ApoE parece estar associada com variações nas concentrações de lipoproteínas séricas em adultos (SMART et al., 2010) e com o desenvolvimento e progressão da aterosclerose (GOLLEDGE et al, 2010). 22 2.2.3 Transporte reverso do colesterol 2.2.3.1 Lipoproteína de alta densidade – HDL A HDL tem origem no fígado a partir da síntese de ApoA1 e ApoA2, podendo ApoA1 também originar-se no intestino (LUND-KATZ et al, 2003). A HDL nascente, contendo apenas ApoA1 e fosfolipídio, é instável e pronta para adquirir lipídeos, o que ocorre ao interagir com células periféricas, como os macrófagos prontos para doar CL (BARTER et al, 2004; SINGH et al, 2007; GERMAN et al 2006). Esse processo é mediado pela ‘ATP-binding cassete protein, subfamília A1’ (ABCA1), que promove a solubilização desses lipídios. A ApoA1 é a principal apolipoproteína das HDL, mas essas partículas podem também conter ApoA2, ApoC, ApoD e ApoE. Esta lipoproteína é a de maior densidade (1,06 – 1,20 gmL-1) e de menor diâmetro (10nm) (LUND-KATZ et al, 2003). As HDL formam um grupo de partículas com variadas densidades, entre as quais predominam as partículas maduras, esféricas, menos densas e ricas em CE, as frações de HDL3 e HDL2. Em menor quantidade, encontram-se as partículas de muito alta densidade, incluindo as pré- -HDL, das quais depende a eficiência da HDL na remoção do colesterol dos tecidos periféricos (LUND- KATZ et al, 2003; SIKORSKI, 2006). Ao processo de remoção do colesterol dos tecidos periféricos e das lipoproteínas ricas em colesterol pelas HDL é dado o nome de transporte reverso do colesterol (TRC). Além da ABCA1, nesse processo então envolvidas a enzima lecitina-colesterol acil transferase (LCAT), a proteína transportadora de colesterol ester (CETP) e a PLTP (proteína da transferência de fosfolipídio). Pela ação da LCAT há esterificação do colesterol livre no interior das partículas atua sua maturação, na forma de HDL2, passando antes pelo formato de HDL3, uma partícula menor e mais densa (BARTER et al., 2003; WANG; BRIGGS, 2004). Pela mediação da CETP e da PLTP, o CE e os fosfolipídios são exportados das HDL para lipoproteínas que contém ApoB, enquanto as HDL recebem TG dessas mesmas. 23 O enriquecimento das partículas de HDL2 com TG torna a partícula substrato para a lípase endotelial e para a HL, esta ultima é uma enzima aderida ao endotélio dos vasos hepáticos (EISENBERG, 1984; VON ECKARDSTEIN et al, 2001; SANTAMARINA et al, 2004). A ação da HL e das proteínas de transferência formam partículas de HDL pobres em lipídeos, convertendo novamente a HDL2 à HDL3, que retorna ao ciclo de remoção tecidual. No fígado, o ‘Scavenger receptor B1’ (SR-B1) media a absorção seletiva de ésteres de colesterol da HDL para o fígado e órgãos esteroidogênicos. (BURTIS et al, 1999; PROCASKA, 2008; SILVA , 2007). 2.2.3.2 Apolipoproteína A1 (ApoA1) A ApoA1 é a apolipoproteína que possui um principal papel na inicialização do TRC (REICHL; MILLER, 1989). A produção e o catabolismo desta apolipoproteína irão determinar a concentração plasmática do HDL-C (BOLANOS-GARCIA; MIGUEL, 2003). A ApoA1 é sintetizada no fígado e, em menor quantidade, no intestino; sua forma humana consiste de 243 resíduos de aminoácidos e massa molecular de 28kDa (BOLANOS-GARCIA; MIGUEL, 2003). A ApoA1 é dividida em dois domínios: Um domínio N-terminal (resíduos 1-43) e um domínio C-terminal (resíduos 44-243) (SAITO et al, 2004). A -hélice do terminal C é o segmento mais apolar da molécula apoA-I humana e, presumidamente, esta é responsável pelo estímulo do efluxo do colesterol (SAITO et al, 2004). Um estudo realizado por Lyssenko et al. (2012) indicou que tanto a taxa de efluxo de colesterol e os tamanhos das HDL são sensíveis a hidrofobicidade da hélice da ApoA1 (LYSSENKO et al, 2012). A ApoA1media três passos no TRC: (1) a formação da HDL nascente a partir de colesterol livre (CL) e fosfolipídios pela ação da ABCA1; (2) a conversão de CL nas partículas de HDL em CE por atuar como co-fator na associação de HDL com a enzima LCAT e; (3) a transferência de CE e CL da HDL para o fígado por atuar como um ligante para o SR-BI localizado na superfície dos hepatócitos (BOLANOS-GARCIA; MIGUEL, 2003; SAITO et al, 2004). 24 A molabilidade e a instabilidade da ApoA1 torna a apta para se ligar a várias partículas lipídicas e formar partículas de HDL de diversos tamanhos (BOLANOS-GARCIA; MIGUEL, 2003; SAITO et al, 2004). Vários estudos epidemiológicos e clínicos revelaram associação entre as baixas concentrações plasmáticas de HDL-C e de ApoA1 e o aumento do risco de infarto do miocárdio. (SOCIEDADE BRASILEIRA DE CARDIOLOGIA, 2007). 2.2.3.3 Lípase Hepática (HL) A HL é uma glicoproteína membro da superfamília lípase (ISAACS et al, 2004). Esta enzima é sintetizada e secretada principalmente pelo fígado e em menor quantidade na glândula adrenal e ovário (SANTAMARINA-FOJO et al, 1998). Nesta enzima são encontrados dois domínios: o domínio N-terminal que contém uma tríade catalítica (Aspartato – Histidina - Serina) e o domínio C- terminal, onde é localizado o mais importante sítio de ligação aos lipídios (SANTAMARINA-FOJO et al, 1998). A HL é encontrada ligada às proteoglicanas de heparan sulfato (HSPG), na superfície dos hepatócitos e células endoteliais podendo ser liberada na corrente sanguínea pela heparina e HDL (JI et al, 1998). A HL possui um importante papel no metabolismo e modelação de lipoproteínas pró e anti aterogênicas, sendo considerada por alguns autores como fator de risco e por outros como proteção para DCV (ISAACS et al, 2004). A HL funciona tanto como hidrolase de acilglicerol, hidrolisando TG dos remanescentes de Qm, IDL, LDL e HDL e fosfolipase de HDL2 (JANSEN et al, 2002). Quanto maior a atividade da HL maior a formação de LDL pequenas e densas (CARR et al, 2001). A HL também pode facilitar o processo do TRC, pois ao mediar à conversão de HDL2 rica em TG em HDL3 pobre em TG libera ApoA1 e HDL pobre em lipídios que retornam ao periférico para recomeçar o ciclo do TRC (HILL; MCQUEEN, 1997) . A função da HL não é apenas atribuída à atividade lipolítica, mas devido a sua habilidade de se ligar ao HSPG ela facilita a captação de lipoproteínas pelo fígado, incluindo os remanescentes de Qm, beta-VLDL, LDL como também HDL (SANTAMARINA-FOJO et al, 1998). 25 2.3. Síndrome metabólica ou síndrome de resistência à insulina: A dislipidemia, obesidade, hipertensão arterial sistêmica (HAS) e diabetes mellitus são causadas por fatores de risco resultantes de mudança de hábitos de vida e se encontram patogenicamente interligadas, sendo essa associação caracterizada pelo termo de síndrome metabólica ou síndrome de resistência à insulina (GRUNDY, 2011). O acúmulo de gordura intra-abdominal aumenta a atividade lipolítica celular, ocorrendo maior liberação de ácidos graxos livres (AGL) na veia porta. Os AGL em excesso contribuem para maior liberação hepática de VLDL e diminuição da extração hepática de insulina (BOSELLO; ZAMBONI, 2000; OLIVEIRA et al, 2004). A resistência à insulina também pode aumentar a produção de VLDL por duas vias: (1) Redução da mediação da insulina na supressão da lípase hormônio-sensível (enzima responsável pela quebra de triglicérides em glicerol e ácidos graxos nos adipócitos); (2) Diminuição da degradação da ApoB (ADELI et al, 2001). Maior liberação e maior tempo de permanência da VLDL na circulação levam à redução das concentrações e do tamanho da HDL e aumento da formação de LDL menores e mais densas. Isso, uma vez que o CETP facilita a troca de triglicérides (por colesterol) da VLDL para as partículas de HDL e LDL, aumentando a ação da HL nestas lipoproteínas, formando HDL menores que são mais facilmente eliminadas pelo rim e LDL menores mais densas que são consideradas bem mais aterogênicas (BLACKBURN; BELVIS, 2004; OLIVEIRA et al, 2004; BAYS et al, 2005). A HAS desenvolve-se pelas mesmas vias da dislipidemia, com o aumento de ácidos graxos liberados pelo tecido adiposo e inibição da produção de óxido nítrico endotelial, um potente vasodilatador (CARVALHO et al, 2006). Ao mesmo tempo é estimulada a geração de ânions super-óxidos por células endoteliais e vasculares, contribuindo para a diminuição da biodisponibilidade de óxido nítrico (CARVALHO et al, 2006). 26 2.4. FATORES DIETÉTICOS A dieta é um importante fator de modulação das lipoproteínas plasmáticas, sendo considerado pelo National Cholesterol Education Program (NCEP) um dos primeiros tratamentos para a redução do colesterol sérico elevado (NATIONAL CHOLESTEROL EDUCATION PROGRAM, 2002). Pelo NCEP, os componentes essenciais para a mudança da dieta incluem a redução do ácido graxo saturado (SFA) (< 7% do total de energia) e do colesterol dietético (< 200mg/dia), uma vez que esses lipídios são os responsáveis pelo aumento do LDL-C (NATIONAL CHOLESTEROL EDUCATION PROGRAM, 2002). Os SFA não apresentam na sua estrutura dupla ligação entre os átomos de carbono tornando o saturado de hidrogênio, reduzindo assim a velocidade de eliminação do colesterol sérico, facilitando a sua deposição nos vasos (CHUN- LAN et al, 1992). Na dieta ocidental o acido palmítico (C16:0) é o mais importante SFA, sendo seguido pelo ácido esteárico (C18:0), mirístico (C14:0), láurico (C12:0) e aqueles de cadeias médias e curtas (C10:0 ou menos - MCFA) (VIANNI; BRAZ FILHO, 1995). No geral 1% de aumento no total de energia da dieta proveniente de SFA, aumenta em 2% o LDL-C (MENSINK; KATAN, 1992). Concomitante, também é verificado aumento na concentração de HDL-C e TG, quando comparado a substituição de carboidrato (MENSINK et al, 2003). Porém, nem todos os SFA se comportam da mesma maneira, o ácido láurico e o mirístico são os que têm maior potencial para aumentar a concentração do colesterol total e de LDL, como também do HDL (MENSINK et al, 2003). Porém o ácido láurico tem um maior efeito sobre o HDL em comparação ao mirístico. Em relação ao ácido graxo palmítico, alguns estudos indicam que este ácido graxo é menos aterogênico que o láurico e o mirístico (SUNDRAM et al, 1994; MENSINK et al, 2003), apesar de não confirmado em todos os estudos (ZOCH et al 1994; BERRY, 2009). O ácido esteárico apesar de ser classificado como SFA possui um efeito muito diferente dos demais ácidos dessa categoria (HUNTER et al, 2010). Em 27 alguns estudos foi verificado que ele possui um pequeno efeito sobre a concentração do LDL-C ou tende a diminuir a concentração desta lipoproteína quando comparado a outros SFA, o mesmo foi verificado com a concentração de HDL-C (ARO et al, 1997; SNOOK et al, 1999; BECKER et al, 1999). Gorduras naturalmente ricas em ácido esteárico incluem o óleo de noz de Karité, manteiga de cacau, manteiga, banha de porco e sebo bovino (HUNTER et al, 2010). Os ácidos graxos trans (TAF) aumentam a quantidade de LDL-C tanto quanto o SFA, as recomendações brasileiras indicam um consumo abaixo de 1% do total de caloria (Sociedade Brasileira de Cardiologia, 2007). Os TAF são ácidos graxos insaturados que contém uma ou mais ligações duplas de etileno na configuração geométrica trans, ou seja, os átomos de hidrogênio estão em lados oposto da cadeia de carbono (LARQUÉ et al, 2001). Esse ácido pode ser encontrado naturalmente na gordura animal, mas também pode ser produzido nas indústrias pelo processo de hidrogenação catalítica de óleos vegetais (MICHA; MOZAFFARIAN, 2008). Esses ácidos graxos são encontrados em bolachas, biscoitos, pães, sorvetes, alimentos fritos em gordura hidrogenada, entre outros (STACHOWSKA et al, 2006). Além da redução do SFA, TAF e colesterol dietético, outros macronutrientes também devem ser considerados para que se tenha uma dieta saudável: ácido graxo monoinsaturado (MUFA) ( 20% da energia consumida), ácido graxo poliinsaturado ( 10% da energia), gordura total (25 a 35% da energia) carboidrato (50 a 60% de energia), proteínas ( 15% da energia) e fibras dietéticas (20 a 30g por dia) (NATIONAL CHOLESTEROL EDUCATION PROGRAM, 2002). Os MUFA, como o próprio nome sugere, apresentam apenas uma única dupla ligação na cadeia de carbono (BRONDZ, 2005). Esta dupla ligação está posicionada no nono átomo de carbono, contando a partir do final da metila (ômega) da cadeia de ácidos graxos (BRONDZ, 2005). O mais comum MUFA da dieta é o ácido oléico (C18:1), mas também são encontrados o palmitoléico (C16:1), o ácido miristoléico (C14:1), ácido gadoléico 28 (C20:1) e o ácido erúcico (C22:1) (MINISTRY OF AGRICULTURE, FISHERIES AND FOODS, 1998). Uma dieta rica em MUFA tem resultado em diminuição das concentrações plasmáticas de LDL-C, enquanto mantém ou aumenta as concentrações de HDL-C e diminui o TG (GILLINGHAM et al, 2011). Em todos os estudos consultados foi confirmada a necessidade de substituir a energia de SFA por ácidos graxos insaturados, mas ainda é incerto se a troca deve ser por MUFA ou ácidos graxos poli-insaturados (PUFA), existe quem defenda a troca por MUFA, porém para alguns essa decisão é precipitada (GUSTAFSSON et al, 1992; FANG-HSUEAN et al, 2010). Num estudo de revisão Truswell et al. (1998) analisaram as diferenças entre os vários tipos de óleos dietéticos ricos em MUFA (óleo de oliva, canola, girassol e cártamo). Foi verificado que com o consumo de óleo de oliva a concentração de LDL-C foi maior que com o consumo dos demais óleos (TRUSWELL; CHOUDHURY, 1998). O óleo de oliva é o que apresenta maior quantidade de MUFA, o óleo de canola apresenta maior quantidade de PUFA em relação ao óleo de oliva, o óleo de cártamo apresenta maior quantidade de PUFA e menor quantidade de SFA em relação ao óleo de oliva e por ultimo o óleo de girassol apresenta menor quantidade de SFA (TRUSWELL; CHOUDHURY, 1998). Deste modo pode se avaliar que a melhora nas concentrações de LDL-C nesses óleos ricos em MUFA, não seja realmente por causa desse ácido graxo e sim por outros componentes (TRUSWELL; CHOUDHURY, 1998). Deve-se lembrar de que o MUFA ganhou atenção devido à dieta mediterrânea, indivíduos que consumiam essa dieta apresentavam menor risco de DCV, nesta dieta o óleo de oliva é a fonte predominante de gordura, mas esses indivíduos também consomem uma menor quantidade de SFA e uma maior quantidade de peixes, grãos, frutas, legumes (SOFI et al, 2008). Portanto o efeito benéfico pode não estar apenas relacionado ao consumo de óleo de oliva e sim a outros componentes presentes na dieta mediterrânea. O PUFA apresenta dois ou mais duplas ligações cis, com a posição da primeira dupla ligação no átomo de carbono seis a partir do final da metila da molécula. O ômega n-6 (Linoléico) é o PUFA predominante na dieta e é 29 encontrado nas castanhas, sementes e nos óleos vegetais, como os de milho e soja. O ômega n-3 (Linolênico) é encontrado nos peixes, principalmente savelha, salmão, atum e anchova (MEYER et al, 2003). As dietas ricas em PUFA tendem a diminuir as concentrações colesterol em todas as lipoproteínas (MATA et al,1998; ORDOVAS et al, 2006). Vários ensaios clínicos controlados têm comparado o efeito de PUFA, ao substituir os SFA e se tem verificado que essa substituição tem reduzido os riscos de DCV, devido ao balanço entre ácidos graxos ômega-3 e 6 na resposta inflamatória (RUXTON et al, 2004; KAPOOR et al, 2006 ). Nas diretrizes do NCEP para a dieta, também foca-se a quantidade total de gordura a ser consumida, porém isto é apenas realizado para evitar um excesso no consumo de SFA. Muitos também substituem SFA por carboidrato, apesar de haver uma queda de LDL-C, a quantidade de TG e HDL-C, respectivamente, aumenta e diminui (NATIONAL CHOLESTEROL EDUCATION PROGRAM, 2002). Além de sofrer influências de macronutrientes, o risco para DCV pode estar associado aos padrões dietéticos (U.S. DEPARTMENT OF AGRICULTURE AND U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, 2000; KRAUSS et al, 2000). Em muitos estudos têm se verificado que um padrão dietético que privilegia um consumo de legumes, leguminosas, frutas, grãos protege contra doenças metabólicas (KOLETZKO; TOSCHKE, 2010; AOUNALLAH-SKHIRI et al, 2011; BALTHAZAR; OLIVEIRA, 2011). Este padrão dietético parece estar relacionado ao aumento de nutrientes antioxidantes, acido fólico, fibras dietéticas, vitaminas do complexo B, entre outros micronutrientes (NATIONAL CHOLESTEROL EDUCATION PROGRAM, 2002). 30 2.5. ATIVIDADE FÍSICA A atividade física é definida por qualquer movimento que seja resultado de contração muscular voluntária que leve a um gasto energético acima do repouso. Por exemplo, andar, dançar, correr, pedalar, subir escadas, jardinar ou nadar (MATSUDO et al, 2006). A atividade física é um importante determinante das características físicas de adultos e adolescentes. A falta de atividade física associada com o excesso de consumo de alimentos densamente energéticos pode resultar em doenças crônicas, como obesidade, dislipidemias entre outras (FONSECA et al, 1998). A inatividade física está associada com risco aumentado para DCVs. Por outro lado, a prática de atividade física modifica favoravelmente vários fatores de risco, como, redução de LDL-C e TG, aumento do HDL-C e melhora da sensibilidade à insulina e HAS. Evidências de vários estudos observacionais têm observado a associação de atividade física com diminuição de risco para DCVs (PAFFENBARGER et al, 1993 HASKELL et al, 1994). A inatividade física, que é caracterizada pela falta de atividade física do dia a dia (ocupação e transporte) e aumento das atividades sedentárias (uso de computador e televisão), reduz o gasto calórico e esta redução contribui para o desenvolvimento da obesidade (HOPIN, 2005). Os mecanismos pelos quais a inatividade física aumenta o risco para DCVs provavelmente são multifatoriais. Alterações lipídicas podem estar associadas a este ganho de peso, porém esse mecanismo ainda é controverso (RAITAKARI et al, 1997). Estudos de intervenção evidenciam a melhora de perfil lipídico e de lipoproteínas com a atividade física. Esse efeito é independente de sexo, peso corporal e adoção da dieta, porém pode ser dependente do grau de tolerância à glicose (LAMPMAN; SCHTEINGART, 1991; DURSTINE; HASKELL, 1994). 31 2.6. FATORES GENÉTICOS X ESTILO DE VIDA A identidade genética, que pode ser definida como uma combinação única de variantes comuns de milhares de genes polimórficos que regem vias metabólicas e endócrinas (metabolismo lipídico, metabolismo energético, função cardíaca, metabolismo da glicose, entre outras), interage com fatores ambientais (DARNTON-HILL et al, 2004). A dieta é um dos mais importantes fatores que influencia a resposta dos genes e que modula diversas doenças com patogênese multifatorial (ORDOVAS, 2009). A gordura dietética é um importante macronutriente para o crescimento e desenvolvimento do organismo (JUMP; CLARKE, 1999). Além do seu papel de fonte energética e o seu efeito na composição das membranas biológicas, a gordura dietética tem um profundo efeito na expressão gênica, levando a mudanças no metabolismo, crescimento e diferenciação celular (JUMP; CLARKE, 1999). A atividade física, como já mencionada, possui um importante papel no gasto energético total diário, contribuindo para a regulação do peso corporal. A atividade física parece diminuir a expressão de genes relacionados com a síntese de ácido graxo e redução de liopogênese (FIEBIG et al, 1999). Portanto, pode diminuir os efeitos de genes relacionados à obesidade (CHANOCK et al, 2007) e consequentemente fatores de risco para DCV. Nesta revisão focaremos na interação dos fatores genéticos com os dietéticos na resposta do metabolismo lipídico. Serão analisados os polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) do gene da ApoA1, da LIPC (Lípase hepática) e da ApoE (mutação missense). 2.7. FATORES GENÉTICOS 2.7.1 O Gene da Lípase Hepática (LIPC) O gene humano da lípase hepática (LIPC), localizado no cromossomo 15q21-q23 com um tamanho de fragmento >120kb de DNA, codifica uma proteína de 449 aminoácidos, a HL (CARR et al, 2001). 32 Figura 1. Localização do gene LIPC Fonte: Genetic Home Reference, 2012 Tem se verificado que quanto maior a expressão da HL, menor a concentração de HDL e quanto menor a expressão da HL maior a concentração de HDL (ISAACS et al, 2004). Notavelmente, a variação alélica do gene LIPC é responsável pela variabilidade da concentração plasmática de colesterol de HDL (CARR et al, 2001; ISAACS et al, 2004; GÓMES et al, 2005; JI et al, 2002; ORDOVAS et al, 2002; SOMEKAWA et al., 2002; ZAMBON et al, 2001; ZHANG et al, 2005; YAMAKAWA-KOBAYASHI et al, 2002). Na região 5'-flanqueadora do gene LIPC são verificados 4 polimorfismos relacionados ao sitio de transcrição e que apresentam-se em total linkage disequilibrium (desequilíbrio de ligação), encontrando-se associados à baixa atividade da HL e maior concentração de HDL-C (GUERRA et al, 1997). Neste trabalho focou-se numa substituição comum de C (citocina) por T (timina) na posição -514 (rs1800588) da região promotora do gene LIPC. O alelo T está associado com a queda da atividade da HL, aumento da concentração de partículas de HDL, aumento da subfração de grandes HDL e grande flutuabilidade das partículas de LDL; ao contrário do alelo C que se apresenta associado ao aumento da concentração de LDL pequenas e densas (ISAACS et al, 2004; CARR et al, 2001). Em um estudo de meta-análise a partir de 25 publicações, em torno de 24 mil indivíduos analisados, encontrou-se significativo aumento da média de HDL-C no grupo com genótipo CT em torno de 0,04 mmol/L (1,54 mg/dl) e no grupo TT o aumento foi de 0,09mmol/L (3,47mg/dL), comparados ao grupo CC (ISAACS et al, 2004). 33 Em estudos experimentais, nos quais foi investigada a associação do polimorfismo -514CT com o consumo de ácidos graxos foi mostrado que as concentrações dos lipídios plasmáticos se alteram de acordo com o tipo de ácidos graxo consumido e com a presença de alelos T e C no gene da LIPC. No Framingham Study verificou-se que a presença do genótipo TT poderia prejudicar o funcionamento normal do metabolismo lipídico, quando dietas ricas em gorduras de origem animal fossem consumidas, pois quando o consumo de gordura era maior que 30% da energia proveniente da dieta em indivíduos com genótipo TT, as concentrações de HDL-C foram baixas. Estas relações foram verificadas com as gorduras saturadas e monoinsaturadas, mas não com as gorduras poliinsaturadas (ORDOVAS et al, 2002). No estudo de Gómes et al. (2005) foi verificado que a concentração de glicose plasmática foi significativamente maior em homens que carregavam o alelo T após o consumo de uma dieta rica em gorduras saturadas, do que após um consumo de uma dieta rica em carboidratos ou de uma dieta mediterrânea (GÓMES et al, 2005). Numa pesquisa realizada com homens diabéticos, o alelo T foi associado com alta concentração de HDL-C apenas em homens que não apresentavam excesso de peso e que consumiam uma alta quantidade de gordura saturada (ZHANG et al, 2005). 2.7.2 O Gene da Apolipoproteína A1 (ApoA1) O gene da ApoA1 está localizada na região 23 do braço longo do cromossomo 11 (11q23) e esta região é conhecida por influenciar os parâmetros lipídicos em humanos, sendo que mutações nesta região cromossômica têm sido associadas a grave hipertrigliceridemia, evidenciada há mais de 15 anos (GROENENDIJIK et al., 2001a). 34 Figura 2. Localização do gene ApoA1 Fonte: Genetic Home Reference, 2012 A diminuição das concentrações de HDL-C e ApoA1 tem sido associada a diferentes mutações no gene da ApoA1 (FRANÇA et al, 2005; HONG et al, 1997; ROMA et al,1990 SINGH et al, 2007). Os polimorfismos da ApoA1 são muito estudados e tem se verificado a influência destes na concentração de HDL-C e TG (ORDOVAS et al, 2002; FRANÇA et al, 2005; SINGH et al, 2007; GROENENDIJK et al, 2001b; SHIOJI et al, 2004). Além disso, tem se constatado uma associação desses polimorfismos com as DCVs (SHIOJI et al, 2004; DAWAR et al, 2010). O polimorfismo T84C HaeIII ApoA1 (rs5070) localizado na região intrônica 2 foi um dos mais recentes descobertos no gene APOA1 e este polimorfismo encontrou-se associado com hipertrigliceridemia (GROENEDJKI et al, 2001b, YAMADA et al, 2007; SHIOJI et al, 2004,) e HDL-C abaixo do normal (SHIOJI et al, 2004). A expressão genética da ApoA1, tem visto ser influenciada pelo consumo dietético de ácidos graxos essenciais como os PUFA n-3 e n-6 (Omega 3 e Omega 6) (ORDOVAS, 2006). No geral, estes estudos estavam relacionados aos polimorfismos -75GA (rs670) e +83CT MspI (rs5069) (MATA et al, 1998; ORDOVAS et al, 2002). Foi identificado apenas um estudo que relacionou a interação de consumo alimentar com o polimorfismo T84C ApoA1 e este não verificou nenhuma associação (RUAÑO et al, 2006a). Pesquisadores têm utilizado polimorfismos da ApoA1 para predizer o efeito dos exercícios no perfil das lipoproteínas (GÓMEZ-GALLEGO et al, 2010; RUAÑO et al, 2006b). Em um estudo, pesquisadores verificaram que o 35 polimorfismo -75GA apresentou-se associado com elevação do HDL-C em resposta ao exercício regular (Ruaño et al, 2006b). 2.7.3 O Gene da Apolipoproteína E (ApoE) As concentrações de lipoproteínas são influenciadas por polimorfismos do gene da ApoE (GOLLEDGE et al, 2010). Devido a estas características, o gene apoE é a variante mais estudada em relação às doenças cardiovasculares (MINIHANE et al, 2007). O gene da ApoE localiza-se no cromossomo 19q13.2, com uma extensão de 3160 pares de bases, consiste de 4 exons e três introns (MINIHANE et al, 2007). O locus desse gene é polimórfico, sendo identificado até hoje oitenta e quatro variantes desse mesmo (LOVEGROVE; GITAU, 2008). Figura 3. Localização do gene ApoE Fonte: Genetic Home Reference, 2012 O polimorfismo mais conhecido e amplamente caracterizado é a mutação missense, que resulta em três isoformas alélicas: E2, E3, E4 (ou Ɛ2, Ɛ3 e Ɛ4) (LOVEGROVE; GITAU, 2008; IZZO, 2010) denotados como: ApoE*E2; ApoE*E3 e ApoE*E4. Estes alelos diferem entre si apenas pela troca de dois aminoácidos (arginina e cisteína) nas posições 112 (rs429358) e 158 (rs7412) (CLARK et al., 2009, TAYLOR et al, 2010 IZZO, 2010) No polimorfismo rs7412 o alelo de menor frequência é a timina e no polimorfismo rs429358 o alelo de menor frequência é a citosina. Numa troca de C por T na posição 158 (rs7412) e na posição 112 (rs429358) há formação do aminoácido cisteína e ao contrário (T por C) há formação de arginina. 36 O Alelo ApoE*E3 codifica a forma ancestral, na posição 112 há presença de uma cisteína e na posição 158 uma arginina, no alelo ApoE*E4 há presença de arginina na posição 112 e 158 e no alelo ApoE*E2 há presença de cisteína na posição 112 e 158 (LOVERGROVE; GITAU, 2008 ; IZZO, 2010). Os estudos in vitro revelam uma diferença funcional entre as isoformas E2, E3 e E4, de modo que, enquanto a ApoE3 e ApoE4 se ligam com afinidade semelhantes entre si aos receptores de LDL, a ApoE2 apresenta apenas 2% dessa afinidade de ligação (CLARK et al, 2009). Em indivíduos que apresentam o alelo E4 é verificada maior circulação de colesterol total e LDL-C e Apo B em comparação aos portadores de E2. LDL-C concentrações para portadores de E4 e E2 são na média 8.3% maiores e 14.2% menores, respectivamente, dos homozigotos para E3. A baixa concentração de LDL-C em indivíduos com E3/E2 e E2/E2 pode ser explicada por diversos mecanismos, como, aumento da remoção de LDL pelo receptor hepático, baixa conversão de VLDL para LDL (MINIHANE et al, 2007). No Reino Unido, em um estudo com crianças, verificou-se que a concentração de colesterol total e LDL-C aumentava com o número de alelos E4 e decaía com o número de alelos E2 (p<0,0001). Ao contrário, a concentração de HDL-C diminuía com o número de alelos E4 e aumentava com o número de alelos E2 (p<0,0001) (TAYLOR et al, 2010). Um estudo realizado no Canadá, com indivíduos chineses, europeus e sul- asiáticos verificou que o genótipo E4 estava associado com um aumento de LDL-C (p < 0.001), e uma diminuição de ApoA1 (< 0,001) e HDL-C (p = 0,005) (BURMAN et al, 2009). Em relação ao gene da ApoE, tem se verificado que este gene modifica a sua resposta no organismo de acordo com o conteúdo total de gordura e a composição de ácido graxo consumido na dieta (MINIHANE et al, 2007). Um estudo de revisão do gene ApoE realizado em 2006, verificou que no geral os portadores do alelo E4 eram mais responsivos a manipulação da gordura da dieta, principalmente manipulação de gordura saturada, monoinsaturada e poliinsaturada (MINIHANE et al, 2007). Um estudo de revisão brasileiro realizado em 2009 também verificou que os portadores do Alelo E4 do gene da ApoE eram mais responsivos à 37 modificações do conteúdo de gordura na dieta, enquanto que os portadores do alelo E2 eram mais responsivos ao conteúdo de carboidratos. Num estudo realizado no Reino Unido foi verificado que com o aumento da gordura saturada os portadores de E4 apresentavam maior quantidade de LDL-C (SCHUCH et al, 2010). 2.8. Estudos em Piracicaba com escolares Desde 2003 o nosso grupo de pesquisa, que inclui pesquisadores da UNIMEP e UNESP, em colaboração de pesquisadores da USP, vem realizando levantamentos sobre a prevalência de fatores de risco para DCNT em escolares do município de Piracicaba (OLIVEIRA et al, 2006). Em 2008, foram comparados os dados de fatores de risco modificáveis e não modificáveis entre escolares obesos e eutróficos (n=84). Apesar de encontrado um grande número de crianças com alteração no perfil lipídico, não foi possível explicar, principalmente, as alterações de HDL-C e LDL-C, já que não foram encontradas relação desse fenômeno com as variáveis analisadas (BALTHAZAR, 2008). Por esta razão, foi suposto que poderia haver outras variáveis, que não as que estavam sendo analisadas, influenciando essas alterações. Nesse sentido, começamos a levantar dados sobre alterações lipídicas e características genéticas e identificamos quatro polimorfismos genéticos, dois ligados as alterações da HDL-C (polimorfismos do gene LIPC e ApoA1) e dois ligados as alterações do CT e LDL-C que (polimorfismos do gene ApoE), os quais havia fundamento investigar, pois poderiam estar influenciando as alterações no perfil lipídico, o que resultou na hipótese do presente estudo. Diante dos dados apresentados, foram eleitos os polimorfismos nos genes LIPC (-514CT - rs1800588); ApoA1 (C84T rs5070) e ApoE (posições 112(rs429358) e 158 ( rs7412)) como variáveis a serem analisadas em associação com o perfil dos lipídeos séricos e fatores de estilo de vida, como fatores de risco ou proteção para as DCV. 38 3. OBJETIVO 3.1. OBJETIVO GERAL Analisar os efeitos dos polimorfismos -514CT no gene da LIPC e C84T no gene da ApoA1, bem como da mutação missense no gene da ApoE nos fatores de risco para doenças crônicas metabólicas, numa amostra de adolescentes, de um município do interior do Estado de São Paulo, Brasil. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS - Verificar se a presença dos polimorfismos genéticos altera as concentrações dos componentes das lipoproteínas (CT, HDL-C, LDL-C, TG, APO-A1), glicose e insulina plasmáticas. - Verificar se a presença dos polimorfismos genéticos altera a pressão arterial. - Verificar se a presença dos polimorfismos genéticos altera a composição corporal (IMC e circunferência de cintura). - Verificar se os componentes da dieta modificam as concentrações dos componentes das lipoproteínas, glicose e insulina plasmáticas de forma dependente aos polimorfismos genéticos. - Verificar se a prática de atividade física modifica as concentrações dos componentes das lipoproteínas, glicose e insulina plasmáticas de forma dependente aos polimorfismos genéticos. 39 REFERÊNCIA ADELI, K.; TAGHIBIGLOU, C.; IDERSTINE S.C.V; et al. 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A coleta de dados incluiu um questionário de frequência alimentar específico para adolescentes, antropometria, aferição da pressão arterial, dosagens bioquímicas e avaliação da presença de síndrome metabólica. A genotipagem das amostras foi realizada por PCR-real time. Resultados: Os adolescentes portadores do alelo T apresentaram maior prevalência de hipertrigliceridemia (15,6%), resistência à insulina pelo HOMA-IR (27,3%) e prevalência de SM (8,6%) em relação aos adolescentes portadores do genótipo CC (TG: 3,5%, p=0,004, ²=7,9; HOMA-IR:14,0%, p=0,020, ²=5,4; SM: 0%, p=0,008, ²=7). A presença de sobrepeso (p=0.008) e cintura de risco (p=0,020) nos adolescentes portadores do alelo T foi associada com concentração aumentada de TG. Por sua vez as concentrações aumentadas de TG nos adolescentes portadores do alelo T foi associada com o HOMA-IR (p=0,037). Conclusões Adolescentes portadores do alelo T apresentaram maior prevalência de hipertrigliceridemia e resistência à insulina, foram mais responsivos aos efeitos metabólicos do excesso de peso corporal e adiposidade abdominal, mas não responderam de forma diferenciada ao consumo alimentar. Palavra chave: Adolescentes, hipertrigliceridemia, resistência à insulina, síndrome metabólica, -514CT LIPC polimorfismo, obesidade. 57 Introdução A presença da obesidade na população infantil representa um desafio aos profissionais de saúde, demandando por melhores estratégias de tratamento e prevenção, uma vez que as consequências metabólicas do excesso de adiposidade corporal vêm se manifestando em crianças e adolescentes. Apesar de a obesidade ser considerada fator de risco para síndrome metabólica (SM), sua presença não prediz o surgimento dessa síndrome [1]. Indicando a interação de outros fatores nesse processo, entre os quais pode ser citado o perfil genético do indivíduo. A predisposição genética associada aos efeitos da alimentação sobre fatores de risco metabólicos associa a adiposidade corporal à maioria das doenças crônicas, dentre as quais se destaca a dislipidemia [2]. Polimorfismos relacionados com o gene da Lípase hepática (LIPC) têm sido muito estudados, já que esta enzima possui papel importante no metabolismo e modelação de lipoproteínas pró e antiaterogênicas [3,4], sendo considerada por alguns autores fator de risco e por outros de proteção para doença cardiovascular (DCV) [5,6]. A lipase hepática humana (HL) é codificada pelo gene LIPC que se encontra localizado no cromossomo 15q21-q23 com um tamanho de fragmento >120kb de DNA. Variações alélicas do gene da HL podem resultar em variação na concentração plasmática de colesterol de HDL [6-10]. Neste trabalho focou-se numa substituição comum de C (citocina) por T (timina) na posição -514 (rs1800588) da região promotora do gene LIPC. O alelo T deste polimorfismo de nucleotídeo único foi encontrado associado à queda da atividade da HL e ao aumento da concentração das partículas de HDL, com aumento da subfração das grandes HDL [7]. Porém, também foi verificada concentração aumentada de TG e resistência a insulina [11-13] associadas ao alelo T, que caracterizam a SM. O consumo alimentar, principalmente de gordura total e ácidos graxos, tem sido associado com alterações na resposta do polimorfismo -514CT do gene LIPC sobre as concentrações de lipoproteínas séricas, modificando riscos metabólicos para doenças crônicas [5,7,9]. 58 Embora a associação do polimorfismo -514CT do gene LIPC com alterações do metabolismo lipídico e com a adiposidade corporal estejam bem estabelecidas, [14, 15, 16] a interação entre as alterações como lipoproteínas séricas, a adiposidade corporal e o consumo de alimentos sob efeito do polimorfismo -514CT do gene LIPC ainda não foi examinada. Desta forma, este trabalho foi proposto considerando que a análise dessas interações poderia elucidar aspectos relevantes para o desenvolvimento de SM e doenças cardiovasculares em adolescentes. O nosso objetivo foi verificar o efeito do polimorfismo -514CT do gene da lipase hepática (LIPC) em interação com o estado nutricional e consumo alimentar sobre os fatores de risco para a síndrome metabólica em uma amostra de adolescentes de um município do estado de São Paulo, Brasil. Casuística e Métodos Participantes Este trabalho vincula-se a um projeto mãe: “Fatores determinantes do risco de obesidade em adolescentes de escolas públicas de Piracicaba: estudo transversal como primeira etapa de um estudo de coorte” financiada pela FAPESP (Proc. n 2006/61085-0). Neste estudo foram abrangidos por sorteio 488 escolares da quinta série do ensino fundamental de 26 escolas que representam as prevalências de excesso de peso entre 20% e 32%, erro tipo I de 5% e erro tipo II de 10% de 48 escolas do ensino fundamental público presentes em Piracicaba na época do estudo, inclusive zona rural. Dentre esses 488 escolares foram recrutados 214 adolescentes para participar da análise das dosagens bioquímicas e genotipagem. Nestes que participaram da análise foram genotipados o polimorfismo LIPC rs1800588 na faixa entre 10 e 15 anos de idade (11± 0,9anos). Era necessário um numero amostral mínimo de 210 adolescentes, considerando o valor da menor frequência genotípica para o polimorfismo em avaliação em descendentes europeus (0.26) e a prevalência de alterações no perfil lipídico (0.35) para crianças em 2008 no Brasil, com margem de erro de 10%, poder de 80% e nível de significância de 5%. 59 O projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Saúde Pública da Universidade de São Paulo (n 1633), conforme a resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde/Ministério da Saúde. Participaram da pesquisa apenas os adolescentes cujos responsáveis legais concordaram e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido e estavam presentes durante a coleta de sangue. Foram excluídos do estudo adolescentes que durante a coleta apresentavam febre, gripe e resfriado ou que na semana anterior e ou na semana de coleta estavam fazendo uso de algum medicamento que poderia alterar o perfil lipídico do voluntário. Os sujeitos da pesquisa não foram divididos pela cor da pele, pois como indicado por Pena et al. [17], mais de 60% da herança genética dos brasileiros é européia e esta apresenta fraca associação com a cor da pele [17]. As entrevistas com os escolares foram realizadas entre os meses de março e maio de 2009 nas próprias unidades de ensino. As coletas de sangue foram realizadas ou no laboratório de análises sanguíneas ou na própria escola quando está era longe do laboratório. Medidas antropométricas e bioquímicas O peso corporal foi obtido em balança eletrônica, do tipo plataforma, marca Tanita® com capacidade de 150 kg. A estatura foi aferida com o auxílio de um estadiômetro rígido, com escala em milímetros, da marca Alturaexata®. Essas medidas foram aferidas em duplicata, obtendo-se assim um valor médio. A partir destas medidas foi possível obter o índice de massa corporal (IMC) que foi utilizado para classificar o estado nutricional dos voluntários, tomando como referência a população e os pontos de corte propostos pelo World Health Organization [18]. A circunferência de cintura foi aferida segundo o procedimento proposto por Callaway et al. (1988) [19]. A circunferência da cintura foi classificada em percentil e quando esta se apresentava acima do percentil 90 era considerada uma medida de risco para DCV. Para essa classificação foi utilizada a população de referência do estudo de McCarthey et al( 2001) [20]. Para a realização das medidas antropométricas foi seguido os procedimentos padronizados por LOHMAN et al. (1988) [21]. 60 O sangue foi coletado após 12 horas de jejum durante a noite. A glicose plasmática foi analisada pelo método enzimático - método slein (Advia chemistry Direct, Siemens, São Paulo, SP, Brasil). A insulina foi dosada pela reação quimioluminescente (Advia centaur , Siemens, São Paulo, SP, Brasil). O índice HOMA-IR foi calculado utilizando-se o programa HOMA calculator versão 2.2.2 (University of Oxford, Oxford, Reino Unido). As alterações de resistência a insulina foram diagnosticadas pelo ponto de corte de 3,16, definida por Keskin et al. [22]. O TG e o colesterol total e de HDL foram analisados pelo método enzimático (Advia chemistry Direct, Siemens, São Paulo, SP, Brasil). O colesterol de Lipoproteína de baixa densidade (LDL-C) foi analisado pelo calculo de Friedwald et al.[23], já que todos os valores de TG estavam abaixo de 400mg/dL. Foram utilizados os critérios do I Guideline for Preventing Atherosclerosis in Childhood and Adolescence [24] para classificar as alterações do perfil lipídico. As concentrações alteradas de CT, LDL-C e TG foram consideradas iguais ou acima de limítrofes. As concentrações alteradas de HDL-C foram aqueles considerados valores iguais ou abaixo do desejável. A ApoA1 foi analisada por imunoturbidimetria (Advia chemistry Direct, Siemens, São Paulo, SP, Brasil). Pressão arterial A pressão arterial (PA) foi aferida após pelo menos cinco minutos de repouso, a PA foi aferida em duplicata com intervalo de 1 a 2 minutos entre as medidas, segundo as recomendações das V diretrizes brasileiras de Hipertensão arterial [25]. A pressão arterial foi aferida por um monitor de pressão digital, marca Omron Healthcare® (HEM-742) previamente validado [26]. Para a classificação da pressão arterial, os valores encontrados foram comparados com valores de referência The Fourth Report on the Diagnosis, Evaluation, and Treatment of High Blood pressure in children and adolescents [27]. A presença de hipertensão foi verificada para analisar a presença de SM. 61 Síndrome metabólica A prevalência de SM foi avaliada nos adolescentes de acordo com o critério adotado pelo International Diabetes Federation para crianças maiores de 10 anos [28]. Consumo Alimentar O consumo alimentar foi avaliado por um questionário de frequência alimentar simplificado para adolescentes (QFASA). O QFASA partiu da reformulação de um questionário de frequência alimentar para adolescentes que foi validado [29] e calibrado [30] em escolares de Piracicaba. O QFASA sofreu redução de quase 40 alimentos a partir da seleção de itens mais consumidos observados nos recordatórios de 24h do estudo de calibração[30]. Este questionário é composto por categorias de frequência e 58 itens alimentares referentes a um período de três meses anteriores. Para auxílio foi utilizado um material fotográfico com fotos de diferentes utensílios e alimentos, com auxílio de um netbook. A quantidade de alimento consumido foi anotada em medidas caseiras, transformadas em gramas e convertidas em número de porções de alimentos, de acordo com o equivalente energético dos grupos alimentares. Para