Pedido nacional de Invenção, Modelo de Utilidade, Certificado de Adição de Invenção e entrada na fase nacional do PCT 29409161903379015 27/11/2019 870190124110 15:35 Número do Processo: BR 10 2019 025014 3 Dados do Depositante (71) Depositante 1 de 1 Nome ou Razão Social: UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO Tipo de Pessoa: Pessoa Jurídica CPF/CNPJ: 48031918000124 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Jurídica: Instituição de Ensino e Pesquisa Endereço: Rua Quirino de Andrade, 215 Cidade: São Paulo Estado: SP CEP: 01049-010 País: Brasil Telefone: 11 56270217 Fax: 11 56270103 Email: auin@unesp.br Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 27/11/2019 às 15:35, Petição 870190124110 Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 1/42 Dados do Pedido Natureza Patente: 10 - Patente de Invenção (PI) Título da Invenção ou Modelo de Utilidade (54): PROCESSO DE OBTENÇÃO DE OLIGOSSACARÍDEOS E LIGNINA A PARTIR DE SUBPRODUTO DE EUCALYPTUS E O USO DOS MESMOS Resumo: A presente invenção refere-se ao processo de obtenção de xilo- oligossacarídeos (XOS), celo-oligossacarídeos (COS) e lignina a partir do subproduto de Eucalyptus gerado no processamento de cavacos de madeira do setor celulósico. O pré-tratamento hidrotérmico do subproduto de Eucalyptus promoveu a formação de um hidrolisado hemicelulósico rico em XOS (fração solúvel), gerando uma fração sólida rica em lignina e celulose (fração insolúvel). Assim, a fração rica em lignina e celulose (fração insolúvel) pós- tratamento hidrotérmico foi submetida à uma etapa de extração alcalina removendo-se parcialmente as frações de hemicelulose e lignina, no entanto, a celulose não foi removida, porém a mesma tonou-se mais acessível em resposta à hidrólise enzimática. O subproduto pós-tratamento hidrotérmico seguido de extração alcalina foi hidrolisado enzimaticamente com endoglucanases promovendo à formação de um hidrolisado celulósico rico em COS (fração solúvel), gerando um resíduo final do bioprocesso rico em lignina (fração insolúvel). Os XOS e COS produzidos podem ser utilizados para a formulação de diversos bioprodutos de interesse comercial. O resíduo final do bioprocesso rico em lignina pode ser aplicado para cogeração de energia. 1Figura a publicar: Dados do Procurador Nome ou Razão Social: Renan Padron Almeida Procurador: Numero OAB: Numero API: CPF/CNPJ: 33778301896 Endereço: Rua Joaquim Antunes 819 Cidade: São Paulo Estado: SP CEP: 05415012 Telefone: 1156270570 Fax: Email: renan.padron@unesp.br Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 27/11/2019 às 15:35, Petição 870190124110 Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 2/42 Dados do Inventor (72) Inventor 1 de 4 Nome: FERNANDO MASARIN CPF: 28153027808 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Professor do ensino superior Endereço: Rodovia Araraquara Jaú, Km 01 - s/n - Campos Ville Cidade: Araraquara Estado: SP CEP: 14800-901 País: BRASIL Telefone: Fax: Email: Inventor 2 de 4 Nome: FLÁVIA SANCHEZ PENALVA PINTO NETO CPF: 60988126168 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Outros trabalhadores de serviços diversos Endereço: Rua Jesus Antônio Tilelli, 184 Cidade: Bebedouro Estado: SP CEP: 14711-620 País: BRASIL Telefone: Fax: Email: Inventor 3 de 4 Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 27/11/2019 às 15:35, Petição 870190124110 Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 3/42 Nome: RUBENS MONTI CPF: 98207202815 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Professor do ensino superior Endereço: Rodovia Araraquara Jaú, Km 01 - s/n - Campos Ville Cidade: Araraquara Estado: SP CEP: 14800-901 País: BRASIL Telefone: Fax: Email: Inventor 4 de 4 Nome: SAMUEL CONCEIÇÃO DE OLIVEIRA CPF: 09217947890 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Professor do ensino superior Endereço: Rodovia Araraquara Jaú, Km 01 - s/n - Campos Ville Cidade: Araraquara Estado: SP CEP: 14800-901 País: BRASIL Telefone: Fax: Email: NomeTipo Anexo Procuração Proc e Posse 07-2018.pdf Comprovante de pagamento de GRU 200 Comprovante GRU 29 379015.pdf Relatório Descritivo Relatório.pdf Reivindicação Reivindicações.pdf Desenho Figuras.pdf Resumo Resumo.pdf Documentos anexados Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 27/11/2019 às 15:35, Petição 870190124110 Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 4/42 Acesso ao Patrimônio Genético Declaração Negativa de Acesso - Declaro que o objeto do presente pedido de patente de invenção não foi obtido em decorrência de acesso à amostra de componente do Patrimônio Genético Brasileiro, o acesso foi realizado antes de 30 de junho de 2000, ou não se aplica. Declaro, sob as penas da lei, que todas as informações acima prestadas são completas e verdadeiras. Declaração de veracidade Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 27/11/2019 às 15:35, Petição 870190124110 Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 5/42 Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 6/42 Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 7/42 Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 8/42 Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 9/42 Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 10/42 Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 11/42 17/04/2019 Internet Banking https://www.santandernetibe.com.br/Paginas/Compromissos/COMPROMISSOS_DETALHE_SEG_VIA.asp?txtEntidade=0033&txtCentroAlta=023… 1/1 FUNDACAO PARA O DESENVOLVIMENTO DA UNESP Agência: 0239 Conta Corrente: 13-002549-6 DETALHE DO COMPROMISSO Convênio: 0033-0239-004900019792 Conta de Débito: 0239-000430023105 Tipo de Pagamento: BLQ Outros Código de Barras: 00190000090294091619603379015179278760000007000 No. compromisso banco: 1030412000100032 No. compromisso cliente: 379015/DS1 101009853 Nome/Razão Social do Beneficiário Original: INPI - INST. NACIONAL DE PROPR Nome/Razão Social do Pagador Efetivo: FUNDACAO PARA O DESENVOLVIMENT CPF/CNPJ do Pagador Efetivo: 57.394.652/0001-75 Valor Nominal: 70,00 Desc./Abat.: 0,00 Juros: 0,00 Data de Vencimento: 25/04/2019 Data de Pagamento: 15/04/2019 Situação: Efetivado No. Lista de Débito: No. Protocolo: PGTFORNB15042019900137963 Autenticação: 11CBC4E9E7FF8A87D8005B6 Valor a Pagar: 70,00 Central de Atendimento Santander Empresarial Das 8h às 20h, de segunda a sexta-feira, exceto feriados. 4004-2125 (Regiões Metropolitanas) 0800 726 2125 (Demais Localidades) 0800 723 5007 (Pessoas com deficiência auditiva ou de fala) SAC - Atendimento 24h por dia, todos os dias. 0800 762 7777 0800 771 0401 (Pessoas com deficiência auditiva ou de fala) Ouvidoria - Das 9h às 18h, de segunda a sexta-feira, exceto feriado. 0800 726 0322 0800 771 0301 (Pessoas com deficiência auditiva ou de fala) Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 12/42 javascript:window.close(); javascript:onPrint() 1/22 PROCESSO DE OBTENÇÃO DE OLIGOSSACARÍDEOS E LIGNINA A PARTIR DE SUBPRODUTO DE EUCALYPTUS E O USO DOS MESMOS CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção se insere no campo da Engenharia, Química e Farmácia, mais especificamente na área de Bioprocessos, uma vez que se refere ao processo de obtenção de oligossacarídeos e lignina a partir de subproduto de Eucalyptus oriundo do processamento de cavacos de madeira no setor celulósico. Os oligossacarídeos poderão ser aplicados nos setores de alimentos funcionais, nutracêuticos, química fina, farmacologia, dentre outros. A lignina poderá ser aplicada para cogeração de energia no setor celulósico e nos setores de química e de construção civil. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [002] A madeira proveniente de Eucalyptus representa a principal fonte de fibras nos países da América do Sul para a produção de celulose e papel. O Brasil ocupa lugar de destaque na fabricação mundial de celulose de fibra curta de Eucalyptus. No ano de 2018 a produção brasileira de celulose foi de 10,4 milhões de toneladas. A indústria de celulose gera aproximadamente 0,27 toneladas de subprodutos sólidos para cada tonelada de celulose produzida. A geração de grandes quantidades de subprodutos no setor celulósico desencadeou estudos estratégicos sobre a utilização desses materiais como matéria prima para à produção de novos bioprodutos que contenham alto valor agregado. [003] Os materiais lignocelulósicos representam uma fonte de matéria prima pouca explorada e aproveitada. Seu uso está baseado principalmente na produção de celulose, Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 13/42 2/22 carvão vegetal e cogeração de energia. Considerando o grande volume de subprodutos gerados no setor celulósico, há recentemente um forte interesse do presente setor em proporcionar um melhor aproveitamento desses materiais visando à produção de bioprodutos de interesse comercial. [004] O processamento de toras de Eucalyptus no setor celulósico gera grandes quantidades de subprodutos, um exemplo é uma serragem (aqui denominada de subproduto de Eucalyptus), que é exclusivamente oxidada para cogeração de energia. O presente subproduto de Eucalyptus contêm mais de 60% de celulose e hemicelulose e essas frações contém baixa eficiência energética em sua queima sendo uma alternativa o uso delas para produção de bioprodutos de maior valor agregado. Dentre muitas aplicações biotecnológicas, a hemicelulose e a celulose do subproduto podem ser convertidas em bioprodutos à base de xilo-oligossacarídeos (XOS) e celo-oligossacarídeos (COS) para fins terapêuticos, nutricionais e analíticos. A busca por um estilo de vida saudável através de cuidados com a alimentação tem impulsionado o interesse por ingredientes de alimentos nutracêuticos, ou seja, aqueles que auxiliam o bom funcionamento do organismo. Entre esses componentes destacam-se os XOS e os COS, os quais são constituídos principalmente por unidades de xilose e glicose, respectivamente, sendo responsáveis por diversos efeitos benéficos relacionados à saúde, tais como a prevenção de cáries, a diminuição de níveis séricos de colesterol e o estímulo do crescimento de bifidobactérias no trato gastrointestinal. Os efeitos benéficos dos XOS à saúde estão relacionados às propriedades físico-químicas, por Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 14/42 3/22 serem moderadamente doces, estáveis em uma ampla faixa de pH e temperatura e conferirem características organolépticas aos alimentos, enquanto os COS são importantes para o crescimento de bactérias endógenas tais como Lactobacillus e Bifidobacterium, melhorando a microflora intestinal. Além do efeito prebiótico, os XOS têm apresentado uma variedade de aplicações, tais como, antioxidantes, antialérgicos e na prevenção de anemia e arteriosclerose. [005] Considerando que as operações de fracionamento dos materiais lignocelulósicos contribuem para o alto custo do processo, a auto-hidrólise ou pré-tratamento hidrotérmico de madeira de Eucalyptus (especificamente o subproduto gerado na etapa de obtenção de cavacos de Eucalyptus) seria uma alternativa para a produção de XOS. Considerando que após o pré-tratamento hidrotérmico a fração insolúvel será rica em celulose e lignina, uma alternativa para o aproveitamento desta fração seria a hidrólise enzimática com celulases comerciais visando à produção de COS. Os XOS e COS contêm um alto valor agregado (em média U$$ 22-50 dólares por quilo de produto, dependendo pureza) quando comparado a biocombustíveis, polpa de celulose e energia elétrica, sendo uma alternativa de produção promissora no setor celulósico. [006] A proposta de produzir XOS e COS dentro de uma fábrica de celulose baseia-se no fato de que esses bioprodutos são potencialmente de maior valor agregado quando comparado à polpa de celulose e energia elétrica. Uma indústria de celulose processa em média em torno de 2000 toneladas.dia -1 de cavacos de Eucalyptus, sendo que em Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 15/42 4/22 torno de 200 toneladas.dia -1 da biomassa não é utilizada para produção de polpa de celulose (gerando o subproduto de Eucalyptus) sendo conduzidas a etapas de oxidação para cogeração de energia. Desta forma, O subproduto do processamento de cavacos de Eucalyptus seria uma boa alternativa para à produção de XOS e COS, assim, aproveitando de uma forma mais adequada essa biomassa, pois a hemicelulose e a celulose tem baixo aproveitamento de energia em sua queima. Desta forma, a proposta seria produzir XOS com a fração hemicelulósica gerando uma fração rica em lignina e celulose que seria posteriormente aproveitada para produção de COS. Por fim, o “resíduo final do bioprocesso” enriquecido em lignina poderia ser aplicado para cogeração de energia, pois a lignina tem um alto aproveitamento na geração de energia em sua queima. [007] Dentro do âmbito do conceito apresentado a presente invenção propôs avaliar a produção de XOS, COS e lignina a partir de um subproduto de Eucalyptus oriundo do processamento de cavacos de Eucalyptus do setor celulósico utilizando-se uma metodologia simples e considerada “verde” (ambientalmente correta), de maneira reprodutível, possibilitando ainda a reutilização de todas frações geradas no bioprocesso. ESTADO DA TÉCNICA [008] O documento PI8405929 descreve o processo para preparação de produtos que contêm oligossacarídeos a partir de biomassa lignocelulósica, bem como o uso do mesmo. O presente processo envolve a hidrólise parcial da biomassa lignocelulósica com ácido clorídrico, gerando uma solução aquosa contendo oligossacarídeos. O documento Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 16/42 5/22 BR112014012982-7B1 descreve um método para produção de oligossacarídeos, monossacarídeos e furfurais a partir de biomassa lignocelulósica. O presente processo é conduzido de forma contínua em duas etapas de hidrólise, como se segue: (a) hidrólise primária, onde são produzidos principalmente oligossacarídeos e monossacarídeos. (b) hidrólise secundária, onde o hidrolisado obtido na hidrólise primária é submetido a hidrólise secundária e produzidos os furfurais. O documento BR112018069862-8A2 descreve um método para produção de XOS a partir de hidrólise enzimática de biomassa lignocelulósica (contendo xilana e celulose). O método é conveniente devido à alta eficiência na formação de XOS em virtude da prevenção da hidrólise dos XOS em xilose, pois o preparado enzimático aplicado na hidrólise da biomassa lignocelulósica é livre de atividade de β-xilosidases. O documento BR1120150148018A2 descreve um processo de obtenção de oligossacarídeos a partir de biomassa lignocelulósica compreendendo as seguintes etapas: (a) Pré-tratamento da biomassa em reator; (b) obtenção de uma suspensão contendo a biomassa lignocelulósica previamente pré-tratada; (c) hidrólise enzimática com celulases da suspensão contendo a biomassa lignocelulósica previamente pré-tratada; (d) redução do teor de água no hidrolisado enzimático obtido na etapa “c”; (e)incubação do hidrolisado obtido na etapa “d” e obtenção de hidrolisado contendo oligossacarídeos. O documento PI1014812-4A2 descreve um processo que visa a produção de álcool a partir de material celulósico, onde o material é submetido a hidrólise ácida para obter um hidrolisado aquoso contendo oligossacarídeos. O hidrolisado Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 17/42 6/22 é removido pelo método de extração com solvente orgânico em sistema de contrafluxo, gerando uma solução contendo oligossacarídeos. [009] A presente invenção prevê avaliar a produção de xilo-oligossacarídeos (XOS), celo-oligossacarídeos (COS) e lignina a partir de subproduto de Eucalyptus oriundo do processamento de cavacos do setor celulósico. Os XOS serão obtidos via pré-tratamento hidrotérmico do subproduto de Eucalyptus. Após o pré-tratamento hidrotérmico serão obtidas duas frações, como se segue: fração solúvel rica em XOS (hidrolisado hemicelulósico) e uma fração sólida rica em celulose e lignina. A fração sólida rica em celulose e lignina será submetida a uma etapa de extração alcalina e posteriormente hidrolisada enzimaticamente com endoglucanases visando à produção de COS. Assim, ao final do bioprocesso serão geradas três frações, como se segue: fração solúvel do pré-tratamento hidrotérmico (hidrolisado hemicelulósico rico em XOS), fração solúvel da hidrólise enzimática da celulose (hidrolisado celulósico rico em COS) e uma fração insolúvel rica em lignina (“resíduo final do bioprocesso”). [010] Desta forma, as tecnologias descritas no estado da técnica tratam-se de tecnologias diversas e que não prejudicam os requisitos de novidade e atividade inventiva da presente invenção. Objetivos e vantagens da invenção [011] A presente invenção tem por objetivo o desenvolvimento de um bioprocesso de aproveitamento residual integral do processamento de cavacos de Eucalyptus para a produção de XOS, COS e lignina, evitando, assim, o Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 18/42 7/22 acúmulo do subproduto na fábrica, além de obter bioprodutos de interesse comercial com alto valor agregado. [012] Os XOS e COS produzidos podem ser aplicados em bioprocessos visando à formulação dos seguintes bioprodutos: nutracêuticos, alimentos funcionais (utilização de XOS e COS na formulação de alimentos), biofármacos, química fina, dentre outros. A lignina poderá ser aplicada para cogeração de energia, na formulação de aglutinantes naturais, adesivos, compósitos, fibra de carbono, dentre outros. [013] Desta forma, além de não acumular o subproduto na fábrica, a empresa poderá ter um aumento na sua eficiência de produção de outros bioprodutos de interesse comercial (alto valor agregado). [014] Devido ao bioprocesso utilizar água de forma controlada e o subproduto de Eucalyptus como matéria prima, o processo é considerado ambientalmente correto (“verde”) BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO [015] A presente invenção refere-se ao bioprocesso de obtenção de xilo-oligossacarídeos (XOS), celo- oligossacarídeos (COS) e lignina a partir de subproduto de Eucalyptus gerado no processamento de cavacos de madeira do setor celulósico. [016] O processamento de cavacos de madeira de Eucalyptus conduz à formação de um subproduto que é rico em polissacarídeos e lignina. Esse subproduto é pré-tratado hidrotermicamente gerando uma fração solúvel rica em XOS (hidrolisado hemicelulósico) e uma fração sólida, rica em celulose e lignina. A fração sólida rica em celulose e lignina é hidrolisada enzimaticamente por endoglucanases Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 19/42 8/22 comerciais gerando uma fração solúvel rica em COS (hidrolisado celulósico) e uma fração sólida rica em lignina (“resíduo final do bioprocesso”). [017] Os XOS e COS podem ser úteis para formulação de diversos bioprodutos. Algumas aplicações dos XOS e COS podem ser destacadas nos seguintes setores produtivos: nutracêutico, alimentos funcionais, biofármacos, química fina, dentre outros. [018] A lignina pode ser utilizada para cogeração de energia. Outras possibilidades de aplicações desta fração podem ser destacadas, como se segue: produção de aglutinantes naturais, adesivos, compósitos, fibra de carbono, dentre outros. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [019] A Figura 1 apresenta o fluxograma geral das etapas do bioprocesso da invenção. [020] A Figura 2 apresenta as imagens das seguintes frações: (a) Subproduto de Eucalyptus não tratado (material original). (b) Subproduto de Eucalyptus pós-tratamento hidrotérmico (fração sólida). (c) Hidrolisado hemicelulósico rico em xilo-oligossacarídeos (XOS) pós- tratamento hidrotérmico do subproduto de Eucalyptus (fração líquida). [021] A Figura 3 apresenta os teores de xilo- oligossacarídeos (XOS) dos hidrolisados hemicelulósicos pós-tratamento hidrotérmico do subproduto de Eucalyptus. Onde: X2=xilobiose, X3=xilotriose, X4=xilotetraose, >X6=xilo-oligossacarídeos com mais de seis unidades repetitivas e Total=>X6+X4+X3+X2. Os teores são apresentados em miligramas de xilo-oligossacarídeos (XOS) por grama de Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 20/42 9/22 subproduto de Eucalyptus (dados em base seca). [022] A Figura 4 apresenta a conversão de xilana em xilo-oligossacarídeos (XOS) pós-tratamento hidrotérmico do subproduto de Eucalyptus. Onde: X2=xilobiose, X3=xilotriose, X4=xilotetraose, >X6=xilo-oligossacarídeos com mais de seis unidades repetitivas e Total=>X6+X4+X3+X2. Dados apresentados em porcentagem (grama de produtos por 100 gramas de xilana oriundo do subproduto, dados em base seca). [023] A Figura 5 apresenta a conversão de celulose em celo-oligossacarídeos (COS) da fração sólida pós-tratamento hidrotérmico do subproduto de Eucalyptus seguido de extração alcalina. Onde: C3=celotriose, ≥C4=celo- oligossacarídeos com quatro ou mais unidades repetitivas e Total=C3+≥C4. Hidrólise enzimática utilizando extrato enzimático rico em atividades de endoglucanases (Celluclast-Novozymes). Dados apresentados em porcentagem (grama de produtos por 100 gramas de xilana oriundo do subproduto, dados em base seca). [024] A Figura 6 apresenta a conversão de celulose em celo-oligossacarídeos (COS) totais e glicose da fração sólida pós-tratamento hidrotérmico do subproduto de Eucalyptus seguido de extração alcalina. Hidrólise enzimática utilizando extrato enzimático rico em atividade de endoglucanases (Celluclast-Novozymes). Dados apresentados em porcentagem (grama de produtos por 100 gramas de celulose oriundo do subproduto, dados em base seca). [025] A Figura 7 apresenta a imagem da fração sólida (“resíduo final do bioprocesso”) rica em lignina pós- Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 21/42 10/22 hidrólise enzimática utilizando preparado enzimático rico em atividade de endoglucanases (Celluclast-Novozymes). DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [026] A presente invenção descreve o bioprocesso de obtenção de oligossacarídeos e lignina, conforme Figura 1, compreendendo as etapas de: a) Pré-tratamento hidrotérmico do subproduto de Eucalyptus e obtenção de uma fração líquida (hidrolisado hemicelulósico rico em XOS) e uma fração sólida rica em celulose e lignina; b) Extração alcalina da fração sólida obtida na etapa (“a”) e obtenção de uma nova fração sólida rica em lignina e celulose. c) Hidrólise enzimática da fração sólida obtida na etapa (“b”) e obtenção de uma fração líquida (hidrolisado celulósico rico em COS) e uma fração sólida rica em lignina (“resíduo final do bioprocesso”). Etapa A – Pré-tratamento hidrotérmico do subproduto de Eucalyptus [027] Foram pesados aproximadamente 50 g (dados em base seca) de subproduto de Eucalyptus original (não tratado) em um béquer de polipropileno de 1 L que foram transferidos para reatores de aço inoxidável. Após a transferência do material foram adicionados volumes de água destilada pré- definidos (330-1000 mL) culminando em diferentes consistências no meio reacional (5-15%). Os reatores de aço inoxidável foram fechados. Então, o equipamento foi ligado e ajustado a temperatura (140-180ºC). Após atingir a temperatura desejada os reatores de aço inoxidável permaneceram por um tempo determinado (30-90 min) com Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 22/42 11/22 agitação de 2-10 rpm. Ao final das reações os reatores de aço inoxidável foram desconectados e resfriados naturalmente. [028] A suspensão obtida pós-tratamento hidrotérmico foi filtrada através de filtro de vidro sinterizado de porosidade número 3 de 50 mL. O filtrado foi recolhido, borbulhado com nitrogênio até a retirada do excesso de oxigênio e estocado em freezer a -20ºC até o momento do uso. [029] O material retido nos filtros foi lavado com solução de água destilada até atingir pH neutro, retirado do filtro e seco em estufa com circulação de ar a temperatura de 40-60ºC por 24-72h. O material seco foi pesado e armazenado até o momento de seu uso. Etapa B - Extração alcalina da fração sólida obtida pós-tratamento hidrotérmico [030] Foram pesados aproximadamente 10 g (dados em base seca) da fração sólida do subproduto de Eucalyptus pós- tratamento hidrotérmico em um béquer e transferido para reator de aço inoxidável. Após a transferência do material foi adicionado 100 mL de NaOH 0,5-5% (massa/volume) culminando em uma consistência final no meio reacional de 10% (massa/volume). Os reatores de aço inoxidável foram fechados, ligados e após atingir a temperatura de 70-90°C os mesmos permaneceram por 1-2h com agitação de 2-10rpm. [031] Ao final de 1-2h os reatores de aço inoxidável foram desligados e resfriados naturalmente. Após o resfriamento as amostras foram retiradas dos reatores e lavadas com água destilada em caixa de lavagem com tela de retenção de #100/pol, até a água de lavagem atingir pH Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 23/42 12/22 neutro. O material obtido foi seco em estufa com circulação de ar à 40-60°C por 24-72h. O material seco foi pesado e armazenado até o momento de seu uso. Etapa C – Hidrólise enzimática da fração sólida obtida pós-extração alcalina [032] A fração sólida do material pré-tratado hidrotermicamente seguido de extração alcalina (itens A e B) foi hidrolisada com preparado enzimático comercial contendo atividade de endoglucanases (Celluclast- Novozymes). Foi utilizada uma carga enzimática 100-200 UI de endoglucanases por grama de substrato (dados em base seca). [033] As reações foram realizadas a 2-10% de consistência em solução tampão acetato de sódio 20-50 mM, pH= 4,8. Os ensaios foram realizados em Elernmeyers de 125 mL sob agitação de 120-170 rpm a 45°C por 3-72h. [034] Durante o processo de sacarificação enzimática, as reações foram monitoradas em intervalos de 3, 6, 12, 24, 48, e 72h. Foram retiradas alíquotas de 3 mL que foram tratadas termicamente a 100ºC, centrifugadas e o sobrenadante foi congelado em freezer a -20ºC até o momento do uso. [035] A presente invenção também se refere aos XOS, COS e lignina obtidos a partir do bioprocesso descrito e uso dos mesmos na formulação de bioprodutos de interesse comercial. Caracterização química das amostras [036] Todas as frações insolúveis (frações sólidas) geradas foram caracterizadas quimicamente quanto aos teores de celulose, xilana, grupos arabinosil, grupos acetil e Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 24/42 13/22 lignina, incluindo o subproduto de Eucalyptus original (não tratado). A determinação foi realizada através de hidrólise ácida controlada. Foram determinados os teores de celulose, xilana, grupos arabinosil e acetil por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE-RID). A lignina foi determinada por gravimetria e espectrofotometria. [037] O hidrolisado hemicelulósico obtido pós- tratamento hidrotérmico foi caracterizado quanto aos teores de: X2=xilobiose, X3=xilotriose, X4=xilotetraose, X5=xilopentaose, X6=xilohexaose e >X6=xilo-oligossacarídeos com mais de seis unidades repetitivas. A determinação foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE-RID). A confirmação da presença dos XOS foi realizada através da técnica de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (CLAE-MS). [038] O hidrolisado celulósico obtido pós-hidrólise enzimática foi caracterizado quanto aos teores de: C1=glicose, C2=celobiose, C3=celotriose e ≥C4=celo- oligossacarídeos com mais de quatro unidades repetitivas. A determinação foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE-RID). Determinação de atividades enzimáticas de preparado enzimático [039] As seguintes determinações foram realizadas: β- glicosidases, endoglucanases e exoglucanases. Exemplo de concretização da invenção [040] Os exemplos aqui apresentados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo, sem limitar o escopo da mesma. Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 25/42 14/22 [041] A Tabela 1 apresenta a composição química do subproduto de Eucalyptus original (não tratado), pós- tratamento hidrotérmico e pós-extração alcalina. Tabela 1 – Composição química dos componentes da biomassa do subproduto de Eucalyptus original (não tratado), pós-tratamento hidrotérmico e pós-extração alcalina. Teores apresentados em gramas por 100 gramas de biomassa (dados em base seca). Componentes da biomassa (g/100g de material bruto) Amostras Não tratada Pré-tratado hidrotermicamente Extração alcalina Rendimento (g/100g de material)(%) - 76.5 84.5 Celulose (%) 43.9 ± 0.5 49.7 ± 0.5 59.0 ± 2.1 Xilana (%) 14.1 ± 0.3 7.5 ± 0.1 5.9 ± 0.2 Grupo acetil (%) 3.2 ± 0.0 1.0 ± 0.0 * Lignina (%) 28.5 ± 0.6 32.4 ± 0.2 30.2 ± 0.3 Soma (%) 89.7 ± 1.4 90.6 ± 0.8 95.1 ± 2.6 Componentes da biomassa (g/100g de material original) Amostras Não tratada Pré-tratado hidrotermicamente Extração alcalina Rendimento (g/100g de material)(%) - 76.5 84.5 Celulose (%) 43.9 ± 0.5 38.1 ± 0.6 49.8 ± 2.1 Xilana (%) 14.1 ± 0.3 5.7 ± 0.1 5.0 ± 0.1 Grupo acetil (%) 3.2 ± 0.0 0.7 ± 0.0 * Lignina (%) 28.5 ± 0.6 24.8 ± 0.2 25.6 ± 0.3 Soma (%) 89.7 ± 1.4 69.3 ± 0.9 80.4 ± 2.5 Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 26/42 15/22 *=não detectável. Teores de extrativos e cinzas no subproduto de Eucalyptus original (não tratado)=3,4% e 0.7%, (massa/massa, base seca), respectivamente. As amostras tratadas (hidrotermicamente e extraídas com NaOH) não apresentaram teores significativos de extrativos e cinzas. Foram realizados os testes de Tukey (95% de confiança) para determinar se houve redução significativa dos componentes. [042] Os teores de celulose, xilana, grupos acetil, lignina, extrativos e cinzas do subproduto de Eucalyptus original (não tratado) apresentaram teores de 43,9%, 14,1%, 3,3%, 28,5%, 3,4% e 0,7% (massa/massa), respectivamente. A soma de todos os componentes foi de 93,9% (massa/massa) (Tabela 1). A Figura 1a apresenta o aspecto visual do subproduto de Eucalyptus original (não tratado) previamente caracterizado. [043] Todavia, o método utilizado para a quantificação da arabinose não foi sensível o suficiente para sua detecção. Desta forma, a presença de grupos arabinosil no subproduto de Eucalyptus original (não tratado) (que são comuns em madeira de Eucalyptus) não foi detectável. [044] Os componentes não determinados podem ser atribuídos a presença de ácido metil-glucurônico que é frequentemente encontrado nas cadeias de hemicelulose de madeiras de Eucalyptus, que não foram determinados nas amostras em estudo. Além disso, a formação de produtos de oxidação de açúcares (como hidroximetilfurfural, furfural, ácido fórmico e ácido levulínico) formados durante a etapa de hidrólise ácida (método analítico para determinação de celulose, hemicelulose e lignina) também fazem parte do conteúdo dos componentes não determinados. [045] A fração insolúvel (sólido recuperado) do subproduto de Eucalyptus pós-tratamento hidrotérmico também foi caracterizado quimicamente (Tabela 1 e Figura 2b). O Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 27/42 16/22 aspecto visual subproduto de Eucalyptus pós-tratamento hidrotérmico apresentou-se com uma coloração mais escura quando comparado ao subproduto de Eucalyptus original (não tratado) (Figura 2ab). O subproduto de Eucalyptus pós- tratamento hidrotérmico apresentou um rendimento de 76,5% (massa/massa, dados em base seca), sendo considerado um bioprocesso de alto rendimento. O subproduto de Eucalyptus pós-tratamento hidrotérmico apresentou teores brutos de celulose, xilana, grupos acetil e lignina de 49,7%, 7,5%, 1,0% e 32,4% (massa/massa, dados em base seca), respectivamente (Tabela 1). Desta forma, foi averiguado um enriquecimento da fração de celulose do subproduto de Eucalyptus pós-tratamento hidrotérmico quando comparado ao subproduto de Eucalyptus original (não tratado) (43,9%) (Tabela 1). [046] O balanço de massa dos componentes foi necessário para comparar a fração pré-tratada hidrotermicamente, diretamente, com o subproduto de Eucalyptus original (não tratado) (Tabela 1). Desta forma, o subproduto de Eucalyptus pós-tratamento hidrotérmico apresentou reduções significativas nos teores de celulose (13,2%), xilana (59,6%), grupos acetil (76,9%) e lignina (13,0%) (massa/massa, dados em base seca), respectivamente (teste de Tukey). [047] A fração insolúvel (sólido recuperado) do subproduto de Eucalyptus pós-tratamento hidrotérmico seguido de extração alcalina também foi caracterizada quimicamente (Tabela 1). O subproduto de Eucalyptus pós- tratamento hidrotérmico seguido de extração alcalina apresentou rendimento de 84,5% (massa/massa, dados em base Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 28/42 17/22 seca), em relação ao material pré-tratado hidrotermicamente, sendo considerado um processo de alto rendimento. Entretanto, o rendimento global do processo, ou seja, pré-tratamento hidrotérmico seguido de extração alcalina em relação ao subproduto de Eucalyptus original (não tratado) foi de 64,6% (massa/massa, dados em base seca). O subproduto de Eucalyptus pós-tratamento hidrotérmico seguido de extração alcalina apresentou teores brutos de celulose, xilana e lignina de 59,0%, 5,9% e 30,2% (massa/massa, dados em base seca), respectivamente (Tabela 1). Desta forma, foi averiguado um enriquecimento da fração de celulose do subproduto de Eucalyptus pós-tratamento hidrotérmico seguido de extração alcalina (maior pureza de celulose no material) quando comparado ao subproduto de Eucalyptus pós-tratamento hidrotérmico (49,7%) (Tabela 1). [048] O balanço de massa dos componentes foi necessário para compararmos a fração pré-tratada hidrotermicamente seguida de extração alcalina, diretamente, com o subproduto de Eucalyptus pré-tratada hidrotermicamente (Tabela 1). Desta forma, o subproduto pré-tratado hidrotermicamente seguido de extração alcalina não apresentou redução significativa no teor de celulose (Teste de Tukey). Entretanto, o subproduto pré-tratado hidrotermicamente seguido de extração alcalina apresentou reduções significativas das frações de xilana (33,3%) e lignina (21,0%), respectivamente (Tabela 1). Além disso, os grupos acetil foram completamente removidos. Desta forma, foi constatado que a extração alcalina foi seletiva na remoção das frações residuais de xilana e lignina, não removendo à fração de celulose, assim, atingindo o objeto proposto. Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 29/42 18/22 Caracterização do hidrolisado hemicelulósico rico em XOS (fração líquida) oriundo do pré-tratamento hidrotérmico [049] O hidrolisado hemicelulósico (fração líquida) do subproduto de Eucalyptus pós-tratamento hidrotérmico foi caraterizado quimicamente (Figura 2c e 3). O aspecto visual do hidrolisado hemicelulósico apresentou-se com uma coloração levemente amarelada (Figura 2c). [050] Os teores totais de XOS do subproduto de Eucalyptus pós-tratamento hidrotérmico foi de 61,3 mg.g -1 (dados em base seca). O hidrolisado hemicelulósico apresentou teores de >X6 (XOS com mais de 6 unidades de xilose), xilotetraose (X4), xilotriose (X3) e xilobiose (X2) da ordem de 28,1 mg.g -1 ,7,4 mg.g -1 , 9,4 mg.g -1 e 17,4 mg.g -1 , respectivamente (dados em base seca). Todavia, não foi detectada a formação de xilopentaose e xilohexaose (Figura 3). [051] A análise por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (CLAE-MS), também foi realizada para confirmar a presença dos XOS no hidrolisado hemicelulósico do subproduto de Eucalyptus pós-tratamento hidrotérmico. Desta forma, foi confirmada à presença de xilobiose (X2), xilotriose (X3) e xilotetraose (X4) no hidrolisado. Esses resultados confirmam a presença dos XOS previamente determinados por cromatografia líquida acoplado a um detector de índice de refração (CLAE-RID). [052] A Figura 4 apresenta as conversões de xilana em XOS do hidrolisado hemicelulósico pós-tratamento hidrotérmico do subproduto de Eucalyptus. Assim, as conversões de xilana em xilobiose (X2), xilotriose (X3), xilotetraose (X4), >X6 (XOS com mais de 6 unidades de Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 30/42 19/22 xilose) e XOS totais (X2+ X3+ X4+>X6) foram de 10,9%, 6,4%, 5,1%, 19,1% e 42,3% (massa/massa, dados em base seca), respectivamente. Caracterização de preparado enzimático comercial [053] O preparado enzimático Celluclast (Novozymes) foi caracterizado frente aos teores de proteínas totais e atividades de celulases (endoglucanase, exoglucanase e β- glicosidase) (Tabela 2). Tabela 2 – Teores de proteínas totais e atividades enzimáticas específicas de celulases. Proteínas expressadas em miligramas de proteínas por mililitro de preparado enzimático e atividade expressada em UI por miligrama de proteína. Preparado enzimático Celluclast (Novozymes) Proteínas totais (mg.mL -1 ) 25.4 Endoglucanase (UI.mg -1 ) 11.7 Exoglucanase (UI.mg -1 ) 0.9 β-glicosidase (UI.mg -1 ) 2.7 [054] A Tabela 2 apresenta os teores de proteínas totais e atividades específicas das diferentes celulases presentes no preparado enzimático Celluclast (Novozymes). Desta forma, as atividades de endoglucanase, exoglucanase e β-glicosidase foram de 297,2 UI.mL -1 , 22,9 UI.mL -1 e 68,6 UI.mL -1 , respectivamente. Assim, o preparado enzimático apresentou potencial para a hidrólise enzimática de materiais ricos em celulose visando a produção de COS, pois apresenta atividades de exoglucanase e β-glicosidase relativamente baixas. Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 31/42 20/22 Determinação dos bioprodutos formados no hidrolisado celulósico pós-tratamento hidrotérmico seguido de extração alcalina do subproduto de Eucalyptus [055] O pré-tratamento hidrotérmico seguido de extração alcalina tornaram a celulose contida no subproduto mais susceptível à ação de endoglucanases, influenciando diretamente na conversão de celulose em COS e glicose. [056] Com o objetivo de avaliar a eficiência do pré- tratamento hidrotérmico seguido de extração alcalina frente à conversão de celulose em COS e glicose, foram realizados ensaios de hidrólise enzimática com o presente subproduto por até 72h. [057] O cromatograma oriundo da cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) confirmou a presença de C3=celotriose e ≥C4=celo-oligossacarídeos com quatro ou mais unidades repetitivas e glicose nos hidrolisados enzimáticos. Entretanto, a celobiose não foi detectada. [058] A Figura 5 apresenta o perfil de conversão de celulose em C3 e ≥C4 na hidrólise enzimática do subproduto de Eucalyptus pós-tratamento hidrotérmico seguido de extração alcalina em função do tempo. Foi constatado um acúmulo de C3 ao longo da hidrólise enzimática, atingindo uma conversão máxima em 24h (35,3%, massa/massa, dados em base seca), todavia, após esse tempo o teor de C3 foi diminuído, sendo totalmente removido em 72h de hidrólise enzimática. Além disso, foi constatado o acúmulo de ≥C4, atingindo uma conversão máxima em 72h de hidrólise enzimática (28,6%, massa/massa, dados em base seca). [059] A Figura 6 apresenta o perfil de conversão de celulose em COS totais (C3+≥C4) na hidrólise enzimática da Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 32/42 21/22 celulose do subproduto de Eucalyptus pós-tratamento hidrotérmico seguido de extração alcalina em função do tempo. Desta forma, a celulose foi rapidamente convertida em COS totais, atingindo um máximo em 24h, culminando em conversões de celulose em COS da ordem de 53,6% (massa/massa, dados em base seca). Todavia, a celulose também foi parcialmente convertida em glicose após 24h de hidrólise enzimática, culminando em conversões de celulose em glicose de 14,8% massa/massa, dados em base seca). [060] A Figura 7 apresenta o aspecto visual do subproduto de Eucalyptus pós-tratamento hidrotérmico seguido de extração alcalina e hidrólise enzimática. O material apresentou uma coloração mais escura quando comparado ao subproduto pré-tratado hidrotermicamente, sendo caraterístico de lignina residual. Conclusão [061] O pré-tratamento hidrotérmico do subproduto de Eucalyptus original foi seletivo na remoção da fração de hemicelulose. [062] O hidrolisado hemicelulósico (fração líquida) oriundo do pré-tratamento hidrotérmico apresentou potencial para a produção de XOS (em média 62 mg de XOS para cada grama de subproduto de Eucalyptus original, dados em base seca). [063] O processo de pré-tratamento hidrotérmico seguido de extração alcalina foi seletivo para remoção de lignina e hemicelulose culminando em uma celulose com maior pureza. [064] A hidrólise enzimática do subproduto de Eucalyptus pós-tratamento hidrotérmico seguido de extração alcalina com preparado enzimático (Celluclast-Novozymes) Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 33/42 22/22 apresentou potencial para a produção de COS (em média 0,4 g de COS para cada grama de subproduto pós-tratamento hidrotérmico seguido de extração alcalina, dados em base seca), confirmando que a extração alcalina no subproduto pós-tratamento hidrotérmico foi eficiente, permitindo maior acesso às endoglucanases à molécula de celulose. [065] O processo de produção de oligossacarídeos (XOS e COS) a partir de um subproduto de Eucalyptus pode ser uma alternativa promissora no setor celulósico, pois os oligossacarídeos são bioprodutos que contêm alto valor agregado e tem potencial de comercialização em nível mundial. Sendo que para cada 200 toneladas de subproduto é possível produzir em média 12,4 toneladas de XOS e 61,2 toneladas de COS (dados em base seca). [066] O “resíduo final do bioprocesso” (subproduto pré- tratado hidrotermicamente seguido de extração alcalina e hidrolisado enzimaticamente), enriquecido em lignina tem potencial para ser utilizado na cogeração de energia no setor celulósico, pois este “resíduo final do bioprocesso” contém maior eficiência energética quando comparado ao subproduto de Eucalyptus original. Outras alternativas seriam à aplicação nos setores de química e de construção civil. Algumas bioprodutos formulados a partir de lignina podem ser destacadas, como se segue: produção de aglutinantes naturais, adesivos, compósitos, fibra de carbono, dentre outros bioprodutos. Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 34/42 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Processo de obtenção de xilo-oligossacarídeos (XOS), celo-oligossacarídeos (COS) e lignina, caracterizado por compreender as etapas de: a) Pré-tratamento hidrotérmico do subproduto de Eucalyptus original; obtenção de hidrolisado hemicelulósico rico em XOS (fração líquida) e obtenção de subproduto pós- tratamento hidrotérmico (fração sólida); b) Extração alcalina do subproduto gerado no processamento pós-tratamento hidrotérmico (“a”) (fração sólida) e obtenção de subproduto pós-tratamento hidrotérmico seguido de extração alcalina (fração sólida); e c) Hidrólise enzimática do subproduto pós-tratamento hidrotérmico seguido de extração alcalina (“b”) (fração sólida); obtenção de hidrolisado enzimático rico em COS (fração líquida) e obtenção de “resíduo final do bioprocesso” rico em lignina. 2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de, na etapa “a”, a biomassa do subproduto de Eucalyptus original ser adicionada em reator na proporção de 50 g de biomassa para 330-1000 mL de água destilada, mantido fechado à temperatura de 140-180ºC por um intervalo de tempo de 30-90 min com agitação de 2-10 rpm. 3. Processo, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de a suspensão pós-tratamento hidrotérmico ser filtrada obtendo-se o hidrolisado hemicelulósico (contendo 62 mg de XOS por grama de subproduto de Eucalyptus original, fração líquida), além da Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 35/42 2/3 recuperação do subproduto pós-tratamento hidrotérmico (fração sólida). 4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de, na etapa “b”, 10 g de biomassa de subproduto pós-tratamento hidrotérmico (fração sólida) ser embebido em 100 mL de solução NaOH 0,5-5% e a suspensão obtida ser extraída em reator com agitação de 2-10 rpm a temperatura de 70-90ºC por um intervalo de tempo de 1-2h. 5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de, na etapa “c”, o subproduto pós- tratamento hidrotérmico seguido de extração alcalina (fração sólida) ser hidrolisado com celulases comerciais, mais especificamente, 10-200 U.mL -1 de endoglucanases por grama de substrato, em condições ótimas para a atividade da enzima, em que o pH é de 4,8, sob agitação de 120-170 rpm, temperatura de 45C e tempo de 3-72h. 6. Processo, de acordo com as reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser obtido hidrolisado celulósico com um teor de 0,4 g de COS para cada grama de subproduto pós-tratamento hidrotérmico seguido de extração alcalina. 7. Processo, de acordo com as reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser obtido um “resíduo final do bioprocesso” rico em lignina. 8. Uso do hidrolisado hemicelulósico (rico em XOS) e do hidrolisado celulósico (rico em COS), conforme definido nas reivindicações 3 e 6, caracterizado por ser em alimentos funcionais, nutracêuticos, química fina, farmacológico, dentre outros. 9. Uso do “resíduo final do bioprocesso” rico em Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 36/42 3/3 lignina, conforme reivindicação 7, caracterizado por ser em cogeração de energia, produção de aglutinantes naturais, adesivos, compósitos, fibra de carbono, dentre outros. Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 37/42 1/4 FIGURAS Figura 1 Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 38/42 2/4 Figura 2 Figura 3 Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 39/42 3/4 Figura 4 Figura 5 Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 40/42 4/4 Figura 6 Figura 7 Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 41/42 1/1 RESUMO PROCESSO DE OBTENÇÃO DE OLIGOSSACARÍDEOS E LIGNINA A PARTIR DE SUBPRODUTO DE EUCALYPTUS E O USO DOS MESMOS A presente invenção refere-se ao processo de obtenção de xilo-oligossacarídeos (XOS), celo-oligossacarídeos (COS) e lignina a partir do subproduto de Eucalyptus gerado no processamento de cavacos de madeira do setor celulósico. O pré-tratamento hidrotérmico do subproduto de Eucalyptus promoveu a formação de um hidrolisado hemicelulósico rico em XOS (fração solúvel), gerando uma fração sólida rica em lignina e celulose (fração insolúvel). Assim, a fração rica em lignina e celulose (fração insolúvel) pós-tratamento hidrotérmico foi submetida à uma etapa de extração alcalina removendo-se parcialmente as frações de hemicelulose e lignina, no entanto, a celulose não foi removida, porém a mesma tonou-se mais acessível em resposta à hidrólise enzimática. O subproduto pós-tratamento hidrotérmico seguido de extração alcalina foi hidrolisado enzimaticamente com endoglucanases promovendo à formação de um hidrolisado celulósico rico em COS (fração solúvel), gerando um “resíduo final do bioprocesso” rico em lignina (fração insolúvel). Os XOS e COS produzidos podem ser utilizados para a formulação de diversos bioprodutos de interesse comercial. O “resíduo final do bioprocesso” rico em lignina pode ser aplicado para cogeração de energia. Petição 870190124110, de 27/11/2019, pág. 42/42 Peticionamento Eletrônico Formulário Procuração Comprovante de pagamento de GRU 200 Relatório Descritivo Reivindicação Desenho Resumo 2019-11-27T15:35:47-0300 Brasil Documento Assinado - INPI