Campus de Araçatuba NAYARA GABRIELY DOURADO Atividade antibiofilme da ablação a laser com indocianina verde comparada a terapia fotodinâmica com azul de metileno e curcuma em canais radiculares contaminados com Candida albicans e Enterococcus faecalis Araçatuba – SP 2024 NAYARA GABRIELY DOURADO Atividade antibiofilme da ablação a laser com indocianina verde comparada à terapia fotodinâmica com azul de metileno e curcuma em canais radiculares contaminados com Candida albicans e Enterococcus faecalis Trabalho de Conclusão de Curso apresentada à Faculdade de Odontologia de Araçatuba da Universidade Estadual Paulista (UNESP), como parte dos requisitos para a obtenção do título de Cirurgião-Dentista. Orientador: Prof. Assoc. Rogério de Castilho Jacinto Araçatuba – SP 2024 Dedico esse momento aos meus pais Rita e Vanderlei, com amor, admiração e gratidão, pois não mediram esforços para que esse sonho se realizasse. À minha irmã Nataly, ao meu sobrinho João Gabriel, e aos meus avós Maria e Vrademir (in memoriam), que tanto amo. AGRADECIMENTOS À Deus, que a cada dia me rege, guarda, governa e ilumina, junto à Nossa Senhora que me dão forças para superar as dificuldades. Aos meus pais Rita e Vanderlei, sem vocês eu não poderia estar onde estou. À minha irmã Nataly e meu cunhado Luís Eduardo, meus avós paternos Maria e Vrademir (in memoriam), meus avós maternos Maria e Hélio e à toda a minha família, que tanto admiro, pelo carinho e incansável apoio ao longo da graduação. Ao Prof. Rogério pela oportunidade de realizar a iniciação científica e pela orientação prestada na elaboração deste trabalho. Aos amigos de laboratório, Gladiston, Laura e Yuri, que tanto me ajudaram na execução deste projeto e nunca mediram esforços, sem vocês não seria possível esse momento. À Profª. Karina, com quem tive o prazer de dividir as clínicas e salas de aulas em diversas oportunidades e que com muita admiração, pela mulher e profissional que é, escolhi para compor minha banca. Aos meus amigos, aos antigos e aos novos que a universidade me deu, por terem feito dos meus desafios parte dos seus e compartilharem momentos incríveis comigo. Aos amigos do laboratório de fisiologia do Depatamento de Ciências Básicas da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP, à Dra. Pilar, Dr. Ari, Loredana e Dra. Renata, que me acolheram e que nos anos de convivência, muito me ensinaram, contribuindo para meu crescimento científico e profissional. À Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, na pessoa do diretor da Faculdade de Odontologia de Araçatuba Prof. Alberto Carlos Botazzo Delbem e do vice-diretor Prof. Luciano Tavares Angelo Cintra. Por fim, à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Processo nº 2023/05137-6. À todos, obrigada. “Consagre ao Senhor tudo o que você faz, e os seus planos serão bem-sucedidos”. Provérbios 16:3. RESUMO DOURADO, N. G. Atividade antibiofilme da ablação à laser com indocianina verde comparada à terapia fotodinâmica com azul de metileno e curcuma em canais radiculares contaminados com Candida albicans e Enterococcus faecalis. 2024. 35 f. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Odontologia) – Faculdade de Odontologia, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Araçatuba, 2024. A terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT) e a ablação a laser são combinadas aos tratamentos endodônticos visando aumentar a redução microbiana. O objetivo deste estudo in vitro foi avaliar a eficiência da aPDT utilizando fotossensibilizador (FS) azul de metileno (MB) e curcumina (CUR) e da ablação a laser com indocianina verde (ICG) na redução de biofilmes de Enterococcus faecalis e Candida albicans. Foram preparadas e padronizadas cem raízes de incisivos bovinos e seus canais radiculares foram infectados com Enterococcus faecalis e Candida albicans durante 10 dias para formação de biofilmes. Logo, foram divididos em 5 grupos (n=20): G1: MB 0,01% ativado por laser vermelho; G2: CUR 0,05% ativado por LED azul; G3: ICG 0,05% ativado por laser de diodo; G4: tratamento com solução salina estéril – controle negativo (CN); e G5: tratamento com hipoclorito de sódio 2,5% (NaOCl) – controle positivo (CP). Foi realizada a coleta do canal radicular antes e após os diferentes protocolos de tratamento e plaqueadas em meio de cultura seletivo para cada microrganismo para contagem de UFC/mL. Os dados foram transformados em square root e porcentagem de redução (%) e submetidos ao teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste de Student-Newman-Keuls (α=0,05). Os protocolos utilizando ICG, MB e CUR apresentaram redução de 98,91%, 96,98% e 98,48% contra Enterococcus faecalis e 99,08%, 95,05% e 96,78% contra Candida albicans, reduções significativas de UFC/mL em comparação ao CN. Houve diferenças da ICG com MB para Enterococcus faecalis e ICG com MB e CUR para Candida albicans (p<0,05), e apenas o grupo ICG não obteve diferença estatisticamente ao CP. Os outros fotossensibilizadores mostraram-se inferiores na redução de UFC/mL. Ademais, o protocolo de ablação a laser usando ICG foi superior a aPDT com MB ou CUR na redução de biofilmes de Enterococcus faecalis e Candida albicans. Palavras-chave: Fotoquimioterapia; azul de metileno; Enterococcus faecalis. ABSTRACT DOURADO, N. G. Antibiofilm activity of laser ablation with indocyanine green compared to photodynamic therapy with methylene blue and turmeric in root canals contaminated with Candida albicans and Enterococcus faecalis. 2024. 35 f. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Odontologia) – Faculdade de Odontologia, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Araçatuba, 2024. Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) and laser ablation are combined with endodontic treatments that increase microbial reduction. The objective of this in vitro study was to evaluate the efficiency of aPDT using photosensitizer (FS) methylene blue (MB) and curcumin (CUR) and laser ablation with indocyanine green (ICG) in reducing biofilms of Enterococcus faecalis and Candida albicans. One hundred bovine incisor roots were graded and standardized and their root canals were infected with Enterococcus faecalis and Candida albicans for 10 days to form biofilms. Therefore, they were divided into 5 groups (n=20): G1: MB 0.01% activated by red laser; G2: CUR 0.05% activated by blue LED; G3: 0.05% ICG activated by diode laser; G4: treatment with sterile saline solution – negative control (NC); and G5: treatment with 2.5% sodium hypochlorite (NaOCl) – positive control (PC). The root canal was collected before and after the different treatment protocols and plated in selective culture medium for each microorganism to count UFC/mL. The data were transformed into square root and percentage of reduction (%) and subjected to the Kruskal-Wallis test, followed by the Student-Newman-Keuls test (α=0.05). The protocols using ICG, MB and CUR showed a reduction of 98.91%, 96.98% and 98.48% against Enterococcus faecalis and 99.08%, 95.05% and 96.78% against Candida albicans, significant reductions in UFC/mL compared to NC. There were differences between ICG and MB for Enterococcus faecalis and ICG with MB and CUR for Candida albicans (p<0.05), and only the ICG group did not obtain a statistically significant difference in PC. The other photosensitizers were inferior in reducing UFC/mL. Furthermore, the laser ablation protocol using ICG was superior to aPDT with MB or CUR in reducing Enterococcus faecalis and Candida albicans biofilms. Keywords: Photochemotherapy; Methylene blue; Enterococcus faecalis. LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Padronização dos espécimes 18 Figura 2 – Cultura de C. albicans em placa de ágar SDA 19 Figura 3 – Cultura de E. Faecalis em placa de ágar Mitis Salivarius 19 Figura 4 – Suspensão celular ajustada em espectrofotômetro 20 Figura 5 – Contaminação do espécime com E. Faecalis e C. albicans 20 Figura 6 – Selamento dos espécimes 21 Figura 7 – Acesso cervical selado com cimento provisório 21 Figura 8 – Canal preenchido com solução fisiológica estéril 22 Figura 9 – Coleta dos canais 22 Figura 10 – Diluição em placa ágar Mitis Salivarius 22 Figura 11 – Diluição em placa ágar SDA com cloranfenicol 23 Figura 12 – Preenchimento dos canais radiculares com fotossensibilizador 24 Figura 13 – Preenchimento dos canais radiculares com fotossensibilizador 24 Figura 14 – Preenchimento dos canais radiculares com fotossensibilizador 24 Figura 15 – Coleta do conteúdo do canal radicular (S2) 26 LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Média das contagens de UFC de E. faecalis e C. albicans (square root) antes e depois dos procedimentos de descontaminação e percentual de redução de UFC 28 LISTA DE ABREVIATURAS μL Microlitros °C Graus Celsius aPDT Terapia fotodinâmica antimicrobiana BHI Brain Heart infusion BL Diodo Emissor de Luz (LED) azul C. a Candida albicans Céls Células somáticas CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais cm² Centímetros quadrados CN Controle Negativo CP Controle Positivo CUR Curcumina DL Laser diodo infravermelho EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético E. f Enterococcus faecalis FS Fotossensibilizador GA Grupo A GB Grupo B GC Grupo C GD Grupo D GE Grupo E ICG Indocianina verde J Joules LED Diodo Emissor de Luz LTDA Limitada MB Azul de metileno mL Mililitros mm Milímetros MO Microrganismos ms Milissegundos NaOCl Hipoclorito de sódio nm Nanômetros PBM Preparo biomecânico do canal radicular PQM Preparo químico-mecânico RL Laser vermelho S1 Sample 1 S2 Sample 2 SCR Sistema de canais radiculares SDA Agár sabouraud dextrose TFD Terapia fotodinâmica UFC Unidade formadora de colônia W Watts SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 13 2 OBJETIVOS 16 3 MATERIAIS E MÉTODOS 17 3.1 Cálculo amostral 17 3.2 Desenho experimental 17 3.3 Preparo dos espécimes 17 3.4 Contaminação dos espécimes 18 3.5 Coleta das amostras (S1) 21 3.6 Protocolo experimental 23 3.7 Coleta das amostras (S2) 24 3.8 Forma de análise dos resultados 25 3.8.1 Análise microbiológica 25 3.8.2 Análise estatística 26 4 RESULTADOS 27 5 DISCUSSÃO 29 6 CONCLUSÃO 31 REFERÊNCIAS 32 ANEXO 35 13 1 INTRODUÇÃO O tratamento endodôntico tem como principal objetivo a descontaminação eficaz do sistema de canais radiculares (SCR) em dentes com necrose pulpar (Holland et al., 2003). Para este objetivo ser alcançado lançamos mão de diferentes estratégias terapêuticas como: preparo biomecânico do canal radicular (PBM) (Shuping et al., 2000), uso de soluções irrigadoras de hipoclorito de sódio (Siqueira et al. 2007) e emprego de medicação intracanal de hidróxido de cálcio (Zancan et al., 2016), diminuindo assim, a quantidade de microrganismos (MO) e seus produtos tóxicos. Entretanto, estudos apontam que somente o PBM combinado às soluções irrigadoras e medicação intracanal, não permitem que o SCR fique totalmente isento de MO (Machado et al., 2019), principalmente em casos de infecções persistentes (Siqueira et al., 2004). Portanto, novas estratégias terapêuticas são constantemente investigadas a fim de erradicar as infecções endodônticas. Com o avanço dos aparelhos de laser e LED, inovações ocorreram para diversos tratamentos na área da saúde como, por exemplo, a terapia fotodinâmica (TFD) (Plotino et al., 2019), que consiste na ação de um fotossensibilizador (FS) exógeno que quando ativado por uma luz de comprimento de onda específico (laser ou LED) tem a finalidade de promover uma destruição seletiva em um sítio específico (célula-alvo) (Cushnie et al., 2016). O mecanismo de ação básico se dá quando o FS absorve os fótons da luz irradiada e seus elétrons passam do estado normal para o mais estimulado. Na presença de oxigênio, o FS transfere sua energia ao substrato. Ao retornar ao seu estado normal, forma espécies altamente reativas e de vida curta (oxigênio singleto), oxidação de lipídios, aminoácidos e proteínas, que levam nos locais específicos a injúrias, como necrose, apoptose. Estudos comprovam que a terapia fotodinamica antimicrobiana (aPDT) aumenta a desinfecção do canal radicular, pois ao contrário dos antibióticos, que possuem uma ação específica, o oxigênio singleto derivado de uma reação fotodinâmica tem um mecanismo de ação inespecífico, evitando o desenvolvimento de resistência microbiana (Shrestha et al., 2012). Dentre os FS encontrados comercialmente, destacamos o azul de metileno (MB), curcumina (CUR) e a indocianina verde (ICG). O MB possui 14 características fotossensibilizadoras, sendo utilizado na TFD, por possuir uma banda de absorção na faixa de 500 nm a 700 nm, portanto este é ativado pela luz vermelha (Tardivo et al., 2005). Já a CUR é um composto natural com banda de absorção entre 420 nm e 480 nm e, portanto, é ativado pela luz azul (Rego-Filho et al., 2014). Por sua vez, a ICG tem ganhado destaque como novo FS devido à sua baixa toxicidade e baixa tensão superficial, o que facilita na penetração dos túbulos dentinários. Sua ativação é próxima ao espectro infravermelho e seu pico de absorção em 810 nm coincide com os diodos lasers disponíveis comercialmente para uso odontológico, que penetram mais profundamente que um laser vermelho, favorecendo assim a eliminação de bactérias durante o tratamento endodôntico. Quando a bactéria é exposta a ICG ela absorve o fotossensibilizador e na presença do laser, a ICG absorve o oxigênio do ambiente e transforma em dióxidona, liberando radicais livres e causando a morte da bactéria. Semelhante à aPDT, a ablação a laser é um tratamento realizado em duas etapas que envolvem a aplicação e retenção de um composto fotossensibilizador nos tecidos-alvo (primeira etapa), que é então ativado pela exposição à luz em um comprimento de onda apropriado (segunda etapa). Após a irradiação, o fotossensibilizador sofre a transição do “estado fundamental” do nível singleto de baixa energia para um “estado tripleto” de alta energia. O Enterococcus faecalis, é bastante importante na microbiota de canais radiculares com falhas no tratamento endodôntico, pois estes microrganismos têm demonstrado capacidade de sobrevivência em ambiente com escassez de nutrientes e pH altamente alcalino, podendo sobreviver em pH 12,5 por 72 horas (Weckwerth et al. 2013). Enterococcus faecalis pode invadir os túbulos dentinários em profundidade e, é provável que consiga sobreviver em casos de falhas na instrumentação química- mecânica e na medicação intracanal (Dametto et al., 2005). Outro microrganismo presente em canais radiculares com falhas no tratamento endodôntico é a levedura do gênero Candida, principalmente a espécie Candida albicans. Que possui uma variedade de fatores de virulência que podem facilitar sua penetração no interior dos túbulos dentinários, como capacidade de adaptação a uma variedade de condições ambientais, adesão a diferentes superfícies, produção de enzimas hidrolíticas, transição morfológica e formação de biofilme (Oliveira et al., 2007). Muitos estudos apontam a Enterococcus faecalis como a principal 15 responsável pelas periodontites apicais, porém a literatura pesquisada demonstra que os fungos também podem estar presentes nestes casos. Eles são encontrados em infecções primárias dos SCR e podem ocorrer frequentemente em dentes obturados com lesões refratárias ao tratamento. Entre as espécies fúngicas encontradas, a Candida albicans tem maior prevalência (Lins et al., 2010). A literatura mostra a atividade antimicrobiana significativa do uso de indocianina verde contra biofilme de Enterococcus faecalis, Streptococcus mutans e Porphyromonas gingivalis. Entretanto, não há estudos comparando a eficácia antimicrobiana do uso da ablação a laser ICG contra um biofilme multiespecie, epecialmente envolvendo a Candida albicans. 16 2 OBJETIVOS Avaliar os diferentes protocolos de terapia fotodinâmica com os fotossensibilizadores azul de metileno, cúrcuma e indocianina verde, comparados ao hipoclorito de sódio 2,5% (controle positivo) e soro fisiológico (controle negativo) na redução de biofilme duo-espécie de Cândida albicans e Enterococcus faecalis em canais radiculares. As hipóteses nulas testadas foram: 1) não há diferença entre os protocolos e 2) que a terapia a laser não é efetiva contra um biofilme duo-espécie de Cândida albicans e Enterococcus faecalis. 17 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Cálculo amostral O cálculo do tamanho da amostra foi baseado em dados de uma investigação anterior (Marinho et al., 2015). Foi realizado por meio do software (www.sealedenvelope.com/power), com erro do tipo α = 0,05 e potência β = 0,80. O cálculo indicou que 17 dentes são necessários para cada grupo. Um total de 20 dentes foi incluído por grupo considerando a possibilidade de perda dentária ao longo do estudo. 3.2 Desenho experimental G1 (n=20) MB+RL – pré-irradiação: 180 segundos e ativado por laser vermelho λ 660 nm por 60 segundos. G2 (n=20) CUR+BL – pré-irradiação: 300 segundos e ativado por LED azul λ 480 nm por 240 segundos. G3 (n=20) ICG+DL – pré-irradiação: 30 segundos e ativado por 30 segundos com laser de diodo infravermelho λ 810 nm. G4 (n=20) CN – irrigado com 2 mL de solução salina estéril e não recebeu tratamento com laser. G5 (n=20) CP – irrigado com 2 mL de NaOCl 2,5%, inativado por 2 mL de tiossulfato de sódio 5% e não recebeu tratamento com laser. 3.3 Preparo dos espécimes Este projeto de pesquisa foi submetido à Comissão de Ética no Uso de Animais – CEUA da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP (Anexo A). Foram utilizados 100 dentes incisivos bovinos, recém-extraídos, doados para fins de pesquisa científica (Frigorífico JBS S.A., Andradina, SP, Brasil) com idade entre 29 e 35 meses. Dentes com trincas, fraturas ou raízes foram descartados e substituídos. As coroas clínicas foram separadas das raízes 1 mm acima da junção cemento- esmalte usando um disco de diamante (Carbodent; Gysi, Buenos Aires, Argentina) em baixa velocidade sob-resfriamento constante com água, padronizados com comprimento da raiz em 16 mm (Figura 1) e diâmetro do canal em 4 mm. O comprimento de trabalho das raízes foi estabelecido 1 mm aquém do comprimento original dos dentes, e os espécimes foram tratados endodonticamente por 18 instrumentação mecânica. Os canais foram irrigados com uma seringa contendo 10 mL de solução de hipoclorito de sódio a 2,5% por 15 segundos para cada troca de lima, até atingir as limas K nº 80 (Maillefer Instruments, Tulsa, OK, EUA). Para a remoção da smear layer, todas as raízes foram imersas em um frasco plástico de 10 mL contendo ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) a 17% (Biodinâmica – Química e Farmacêutica LTDA, Ibiporã, PR, Brasil) com dez amostras por frascos. Em seguida, os espécimes foram irrigados com 5 mL de água destilada, os canais radiculares foram aspirados e secos com pontas de papel absorvente estéreis (Dentsply Sirona, York, PA, EUA), colocados individualmente em tubos plásticos estéreis de 2 mL, imersos em caldo de Brain Heart infusion (BHI, Acumedia, Neogen, Lansing, MI, EUA). Eles foram ativados por ultrassom por 1 minuto para liberar o ar aprisionado e permitir a penetração do meio de cultura no canal radicular. Prosseguindo, os canais radiculares foram esterilizados a 121°C em autoclave por 30 minutos. Para evitar o escape do FS, os forames apicais foram selados com ácido fosfórico a 35% (3M ESPE, St Paul, MN, EUA), adesivo dental (Adper Single Bond 2; 3 M ESPE) e resina composta (Filtek Z350 XT; 3M ESPE). Figura 1 - Padronização dos espécimes Fonte: Elaborado pelo autor (2024) 3.4 Contaminação dos espécimes Todos os procedimentos microbiológicos foram realizados em condições assépticas (câmara de fluxo laminar). Foram utilizadas colônias isoladas (24 horas) de culturas puras de Candida albicans (ATCC 10231) (Figura 2) e Enterococcus faecalis (ATCC 51299) (Figura 3) cultivadas em placas de ágar Sabouraud Dextrose (SDA; Difco, Le Pont de Claix, França) e ágar Mitis Salivarius (Himedia) e foram 19 suspensas em 10 mL de caldo de Sabouraud Dextrose (SDB; Difco) e caldo Brain Heart Infusion (BHI, Acumedia, Neogen, Lansing, MI, EUA). As suspensões celulares foram ajustadas em espectrofotômetro (Figura 4) para igualar a turbidez, padronizadas em 1,5 X 108 unidades formadoras de colônia (UFC/mL) (equivalente a 0,5 padrão Mc Farland). Figura 2 – Cultura de C. albicans em placa de ágar SDA Fonte: Elaborado pelo autor (2024) Figura 3 – Cultura de E. faecalis em placa de ágar Mitis Salivarius Fonte: Elaborado pelo autor (2024) 20 Figura 4 – Suspensão celular ajustada em espectrofotômetro Fonte: Elaborado pelo autor (2024) Primeiramente os cem espécimes foram contaminados com 5 μL da suspensão contendo Enterococcus faecalis (108 céls/mL), com 5 μL da suspensão contendo Candida albicans (108 céls/mL) e mais 10 μL de caldo BHI estéril (Figura 5) e foram selados com uma bola de algodão estéril embebida em caldo BHI colocado na embocadura dos canais (Figura 6). O acesso cervical foi selado com cimento provisório Cimpat (Figura 7) e foram mantidos em estufa à 37ºC por 10 dias. Durante este período, foram removidos os meios de cultura antigos e adicionados 10 μL de meio de cultura estéril (caldo BHI) e 10 μL de caldo de Sabouraud Dextrose no interior dos canais radiculares a cada 2 dias. Figura 5 – Contaminação do espécime com E. Faecalis e C. albicans Fonte: Elaborado pelo autor (2024) 21 Figura 6 – Selamento dos espécimes Fonte: Elaborado pelo autor (2024) Figura 7 – Acesso cervical selado com cimento provisório Fonte: Elaborado pelo autor (2024) 3.5 Coleta das amostras (S1) Após o período de contaminação, foi realizada coleta de todas as amostras para confirmação da contaminação dos canais radiculares (S1). Os canais foram preenchidos com solução fisiológica estéril (Figura 8), a qual foi agitada com uma lima tipo Kerr nº 30, e foram coletadas em três pontas de papel absorvente estéril #80 (Dentsply Maillefer, Suíça) (Figura 9), sendo transferidos para tubos tipo Eppendorf, estéreis, contendo 1 mL Ringer estéril (Sigma-Aldrich, St Luis, MI, EUA). A seguir, foram realizadas diluições em alíquotas de 100 μL e foram semeadas em duplicata em placas contendo ágar Mitis Salivarius (Figura 10) e ágar Sabouraud Dextrose com cloranfenicol (Figura 11) para analisar a presença de Enterococcus faecalis e Candida albicans, respectivamente. As placas foram incubadas à 37ºC por 48 horas, para verificação do crescimento dos dois microrganismos. 22 Figura 8 – Canal preenchido com solução fisiológica estéril Fonte: Elaborado pelo autor (2024) Figura 9 – Coleta dos canais Fonte: Elaborado pelo autor (2024) Figura 10 – Diluição em placa ágar Mitis Salivarius Fonte: Elaborado pelo autor (2024) 23 Figura 11 – Diluição em placa ágar SDA com cloranfenicol Fonte: Elaborado pelo autor (2024) 3.6 Protocolo experimental Cem amostras de raízes foram preparadas e infectadas como descrito acima. As amostras foram distribuídas aleatoriamente em 5 grupos experimentais de acordo com o protocolo de descontaminação: G1 (n=20) MB+RL – os canais radiculares foram preenchidos com azul de metileno 0,01% (ChimioLux, DMC Importação Exportação de Equipamentos LTDA, São Carlos – SP, Brasil) com tempo de pré-irradiação de 180 segundos e ativado por laser vermelho λ 660 nm (Laser DUO MMOptics, São Carlos, SP, Brasil) por 60 segundos, utilizando uma fibra óptica flexível de 300 μm de diâmetro (MMOptics, São Carlos, SP, Brasil), com energia final de 72 J/cm² (Figura 12); G2 (n=20) CUR+BL – os canais radiculares foram preenchidos com curcumina 0,05% (Apothićario – Farmácia de Manipulação, Araçatuba-SP) com tempo de pré-irradiação de 300 segundos e ativado por LED azul λ 480 nm (Poly Wireless – Kavo Kerr, Joinville-SC) por 240 segundos, utilizando uma fibra óptica flexível de 300 μm de diâmetro (MMOptics, São Carlos, SP, Brasil), com energia final de 72 J/cm² (Figura 13); G3 (n=20) ICG+DL – os canais radiculares foram preenchidos com indocianina verde 0,05% (MP Biomedicals - Thermo Fisher Scientific), com tempo de pré-irradiação de 30 segundos e ativados por 30 segundos com laser de diodo infravermelho λ 810 nm (Donatello, CAO Group, West Jordan- UT), sob potência de 2,5 W, intervalo de 300 ms e duração de 100 ms (Figura 14); G4 (n=20) CN – os canais radiculares foram irrigados com 2 mL de solução salina estéril e não receberam tratamento com laser; G5 (n=20) CP – os canais radiculares foram irrigados com 2 mL de NaOCl 2,5%, inativado por 2 mL de tiossulfato de sódio 5%, e não receberam tratamento com laser. 24 Figura 12 – Preenchimento dos canais radiculares com fotossensibilizador Fonte: Elaborado pelo autor (2024) Figura 13 – Preenchimento dos canais radiculares com fotossensibilizador Fonte: Elaborado pelo autor (2024) Figura 14 – Preenchimento dos canais radiculares com fotossensibilizador Fonte: Elaborado pelo autor (2024) 3.7 Coleta das amostras (S2) A coleta do conteúdo do canal radicular foi realizada novamente, após os 25 diferentes protocolos de tratamento (S2). Os canais foram preenchidos com solução fisiológica estéril, a qual foi agitada com uma lima tipo Kerr nº 30, e foram coletadas em três pontas de papel absorvente estéril #80 (Dentsply Maillefer, Suíça), sendo transferidos para tubos tipo Eppendorf, estéreis, contendo 1 mL Ringer estéril (Sigma-Aldrich, St Luis, MI, EUA). A seguir, foram realizadas diluições em alíquotas de 100 μL e foram semeadas em duplicata em placas contendo ágar Mitis Salivarius e ágar Sabouraud Dextrose com cloranfenicol para analisar a presença de Enterococcus faecalis e Candida albicans, respectivamente. As placas foram incubadas à 37ºC por 48 horas, para verificação do crescimento dos dois microrganismos. 3.8 Forma de análise dos resultados 3.8.1 Análise microbiológica A coleta do conteúdo do canal radicular foi realizada em dois momentos: 10 dias após a contaminação bacteriana (S1) e imediatamente após os diferentes protocolos de tratamento (S2). Cada canal foi preenchido com solução salina estéril (1 mL) e três pontas de papel absorvente estéril #80 (Dentsply Maillefer, Suíça) foram inseridas no canal, por 1 minuto cada (Figura 15). Em seguida, as pontas de papel foram transferidas para tubos Eppendorf contendo 1 mL de solução de Ringer estéril (Sigma-Aldrich, St Luis, MI, EUA). Cada amostra foi homogeneizada e diluída a 10-4 antes dos protocolos de tratamento e em 10-¹ após os diferentes protocolos de tratamento. As diluições foram cultivadas em placas de ágar SDA e ágar Mitis Salivarius incubadas por 24 horas à 37ºC. O crescimento microbiano foi determinado pela contagem do número de unidades formadoras de colônia (UFC/mL). 26 Figura 15 – Coleta do conteúdo do canal radicular (S2) Fonte: Elaborado pelo autor (2024) 3.8.2 Análise estatística Os dados coletados (UFC/mL) foram analisados estatisticamente usando o software Sigma Plot 12.0 para Windows (Systat Software Inc, San Jose, CA). Uma comparação antes e depois da descontaminação foi realizada usando o teste ANOVA Two-way e teste de Student-Newman-Keuls, (p<0,05). Para análise microbiológica, após o período de incubação, foi realizada a contagem do número de unidades formadoras de colônias nas placas comparando as coletas das amostras S1 e S2. Para análise estatística, os dados obtidos foram transformados em square root e porcentagem de redução e submetidos ao teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste de Student-Newman-Keuls (α=0,05). 27 4 RESULTADOS A Tabela 1 mostra as médias de contagens de UFC de Enterococcus faecalis e Candida albicans (square root) antes e depois dos procedimentos de descontaminação, juntamente com a porcentagem de redução de UFC. Todos os grupos apresentaram diferenças estatísticas após os protocolos de descontaminação (p<0,05), exceto o controle negativo (solução salina). Seguindo os protocolos de descontaminação, todos os grupos apresentaram redução estatisticamente significativa das UFC em comparação ao controle negativo (solução salina) (p<0,05). Houve diferenças estatísticas entre o protocolo de aPDT com MB e CUR e o protocolo de ablação a laser com ICG para Candida albicans (p<0,05) e somente ablação a laser com ICG (Figura 16) e aPDT com MB (Figura 17) tiveram diferença estatística para Enterococcus faecalis, porém todos os protocolos foram superiores ao controle negativo. 28 Tabela 1 – Média das contagens de UFC de E. faecalis e C. albicans (square root) antes e depois dos procedimentos de descontaminação e percentual de redução de UFC Resultados em parênteses expressa o desvio padrão. Para redução de % de UFC, letras sobrescritas indicam diferenças significativas entre os grupos (testes de Kruskal Wallis e Student-Newman-Keuls, p<0,05, n=20/grupo). ICG – Verde de Indocianina; MB – Azul de Metileno; CUR – Curcumina; CN – Controle Negativo; CP – Controle Positivo. Fonte: Elaborado pelo autor (2024) Antes da descontaminação Depois da descontaminação % UFC redução Grupos ICG+DL E. f 4911,64 59,31 98,91ad (1,46) C. a 2899,36 24,90 99,08a (0,61) MB+RL E. f 4736,15 138,33 96,98b (1,35) C. a 485,82 20,98 95,05b (2,75) CUR+BL E. f 5142,14 74,78 98,48a (0,62) C. a 3318,09 94,34 96,78b (1,98) CN E. f 3547,16 1954,27 43,59c (7,00) C. a 730,44 399,34 44,67c (9,62) CP E. f 4922,83 51,99 98,99d (0,84) C. a 4212,62 48,09 98,99a (0,96) 29 5 DISCUSSÃO A complexidade anatômica do SCR, com numerosos canais acessórios e deltas apicais, torna o preparo mecânico insuficiente para eliminação de bactérias aderidas às paredes do SCR. O tecido orgânico e as bactérias presentes nos túbulos dentinários não podem ser totalmente removidos pela limpeza mecânica, pois o instrumento endodôntico não toca em toda a extensão das paredes dos SRC, necessitando de supervisão química adicional para a remoção (Yamaguchi et al., 2018). A aPDT tem sido utilizada para melhorar a desinfecção dos SCR, utilizando um FS ativado por luz específica para destruir microrganismos. A ablação a laser, semelhante a aPDT, envolve a aplicação de um FS composto em tecidos- alvo, que é então ativado pela exposição à luz (Cushnie et al., 2016). Neste estudo, observamos uma diferença entre a ablação a laser com ICG e a aPDT com MB e CUR na eliminação de Enterococcus faecalis, além de uma diferença estatística entre a ablação a laser e a aPDT com MB na eliminação de Candida albicans, rejeitando assim a hipótese nula do estudo. Yamamoto et al. (2021) também observaram maior eficácia do ICG contra Enterococcus Faecalis, quando formando um biofilme monoespécie; e o estudo de Azizi et al. (2016), que relataram redução significativa nas UFC de Candida albicans utilizando ICG, também em um biofilme monoespécie, enquanto no presente estudo o filme foi formado com o crescimento concomitante das duas espécies. Além disso, os resultados também correlacionam o estudo de Adnan et al. (2023), que verificaram taxas de inibição de crescimento de Candida albicans utilizando MB entre 74% e 95%. O hipoclorito de sódio é amplamente utilizado como agente irrigador durante o preparo químico-mecânico (PQM) devido às suas propriedades antimicrobianas e à sua capacidade de removedor de tecido orgânico, além de penetrar eficientemente nos túbulos dentinários (Aviv et al., 2024). Neste estudo, o protocolo de ablação a laser mostrou-se tão eficaz quanto o NaOCl na redução de Enterococcus faecalis e Candida albicans, sem diferença estatística significativa entre as técnicas. A literatura também confirma que a ablação a laser é tão eficaz quanto o NaOCl contra Enterococcus faecalis (Yamamoto et al., 2021). O objetivo principal da terapia endodôntica é eliminar ou reduzir os 30 microrganismos e seus subprodutos, o que é crucial para prevenir doenças apicais (Machado et al., 2019) e alcançar o sucesso endodôntico. As técnicas principais estão associadas ao preparo PQM, utilizando principalmente soluções irrigadoras. No entanto, segundo Diogo et al. o mecanismo de ação e a eficácia de alguns agentes de limpeza antimicrobianos, como NaOCl, clorexidina, ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), peróxido de hidrogênio, entre outros, foram investigados e algumas espécies, como Enterococcus faecalis e Candida albicans, apresentaram resistência a esses agentes. Apesar de não haver diferença estatística na redução de Candida albicans entre os fotossensibilizadores ICG e CUR, o protocolo de ablação a laser com ICG apresentou maior redução. Dado que este estudo foi realizado in vitro, deve-se ter cautela ao interpretar os resultados devido às limitações inerentes ao modelo. A utilização de duas cepas e a falta de um cenário polimicrobiano pode restringir a aplicabilidade dos resultados. Estudos futuros com modelos de multiespécies poderão oferecer insights pré-clínicos mais abrangentes. 31 6 CONCLUSÃO Em conclusão, o protocolo de ablação a laser usando ICG se mostrou superior à aPDT com MB ou CUR na redução de biofilmes de Enterococcus faecalis e Candida albicans, com resultados comparáveis ao NaOCl. Embora o estudo tenha avaliado a ação antimicrobiana da aPDT e a ablação a laser de forma independente, recomenda-se que esses métodos sejam utilizados clinicamente como complementos ao preparo biomecânico, às soluções de irrigação e à medicação intracanal. 32 REFERÊNCIAS ADNAN, R. O.; JAWAD, H. A. Antimicrobial photodynamic therapy using a low-power 650 nm laser to inhibit oral Candida albicans activity: an in vitro study. Journal of Medicine and Life, v. 17, n. 1, p. 28-34, Jan 2024. DOI: 10.25122/jml-2023-0285. AVIV, S.; ALIN, Y.; NETA, l.; YAEL, H.; LADA, Z.; AVIA, F. N.; DIANA, R.; MOTI, M.; DAVID, P. Elimination of E. faecalis with NaOCl versus chlorhexidine gluconate from primary molar root canal systems: an ex vivo model study. Clin Oral Investig, v. 28, n. 5, p. 265, Apr 2024. DOI: 10.1007/s00784-024-05621-6. AZIZI, A.; AMIRZADEH, Z.; REZAI, M.; LAWAF, S.; RAHIMI, A. Effect of photodynamic therapy with two photosensitizers on Candida albicans. 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