ESTUDO MORFOLÓGICO COMPARATIVO DAS GLÂNDULAS SALIVARES DE FÊMEAS DE CARRAPATOS Rhipicephalus (Boophilus) microplus (CANESTRINI, 1887) (ACARI: IXODIDAE) EM DOIS ESTÁGIOS DE ALIMENTAÇÃO ERIKA TAKAGI NUNES Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Biologia Celular e Molecular). Rio Claro Estado de São Paulo – Brasil Fevereiro - 2006 PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - RIO CLARO ESTUDO MORFOLÓGICO COMPARATIVO DAS GLÂNDULAS SALIVARES DE FÊMEAS DE CARRAPATOS Rhipicephalus (Boophilus) microplus (CANESTRINI, 1887) (ACARI: IXODIDAE) EM DOIS ESTÁGIOS DE ALIMENTAÇÃO ERIKA TAKAGI NUNES Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Biologia Celular e Molecular). Rio Claro Estado de São Paulo – Brasil Fevereiro - 2006 PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR Orientadora: Profa. Dra. Maria Izabel Camargo-Mathias UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - RIO CLARO 595.42 Nunes, Erika Takagi N972e Estudo morfológico comparativo das glândulas salivares de fêmeas de carrapatos Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887) (Acari : Ixodidae) em dois estágios de alimentação / Erika Takagi Nunes. – Rio Claro : [s.n.], 2006 143 f. : il., tabs. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Rio Claro Orientador: Maria Izabel Camargo Mathias 1. Ácaro. 2. Histologia. 3. Histoquímica. 4. Morte celular. 5. Ultra-estrutura. 6. Carrapato-do-boi I. Título. Ficha Catalográfica elaborada pela STATI – Biblioteca da UNESP Campus de Rio Claro/SP i À Deus, por ter me oferecido a vida, me guiado nos momentos de decisões e permitido que pudesse concluir mais uma etapa de minha carreira profissional... À meus queridos pais, meus pilares, pelo amor, dedicação e suporte em todos os momentos... Amo vocês! À minha irmã Karina, pelo apoio, amor e orgulho... Também te amo muito, maninha! Ao “Tico meu”, Rodolfo A. Ruiz, por ter compartilhado comigo os momentos difíceis e também de alegrias... Te amo muito, muito, muito.... Dedico esta dissertação... ii Agradeço de modo muito especial, à Profa. Dra. Maria Izabel Camargo-Mathias, pelo exemplo de garra, coragem e trabalho realizado e por ter sido, além de uma grande orientadora, uma amiga, nestes anos em que caminhamos juntas! Bel, aí vai o meu “muito obrigado” pelo incentivo, pelo apoio às crises e pelos momentos em que me fez sorrir com seu alto-astral. Carregarei sempre comigo os seus bons ensinamentos... “Às vezes sou grande; Às vezes sou pequena; Tão pequena sou que... Às vezes ele é pequeno; Às vezes ele é grande, Tão grande o mundo que aos poucos percebo que crescer me torna pequena”. (Lígia Calconi Tayar) iii Cada dia em nossas vidas nos ensina lições que muitas vezes nem percebemos. Desde o nosso primeiro piscar de olhos, desde cada momento em que a fome bate, desde cada palavra que falamos. Passamos por inúmeras situações, na maioria delas somos protegidos, até que um dia a gente cresce e começa a enfrentar o mundo sozinho. Escolher a profissão, ingressar numa faculdade, conseguir um emprego... Essas são tarefas que nem todos suportam com um sorriso no rosto ou nem todos fazem por vontade própria. Cada um tem suas condições de vida e cada qual será recompensado pelo esforço, que não é em vão. Às vezes acontecem coisas que a gente nem acredita. Às vezes, dá tudo, tudo errado! Você pensa que escolheu a profissão errada, que você não consegue sair do lugar, às vezes você sente que o mundo todo virou as costas ... Parece que você caiu e não consegue levantar... Está a ponto de perder o ar... Talvez você descubra que quem dizia ser seu amigo, nunca foi seu amigo de verdade e talvez você passe a vida inteira tentando descobrir quem são seus inimigos e nunca chegue a uma conclusão. Mas nem tudo pode dar errado ao mesmo tempo, desde que você não queira. E aí... Você pode mudar a sua vida! Se tiver vontade de jogar tudo pro alto, pense bem nas conseqüências, mas pense no bem que isso poderá proporcionar. Não procure a pessoa certa, porque no momento certo aparecerá. Você não pode procurar um amigo de verdade ou um amor como procura roupas de marca no shopping e nem mesmo encontrar as qualidades que deseja como encontra nas cores e tecidos ou nas capas dos livros. Olhe menos para as vitrines, mas tente conhecer de perto o que está sendo exibido. Eu poderia estar falando de moda, de surf, de tecnologia ou cultura, mas hoje, escolhi falar sobre a vida! Encontre um sentido para a sua vida, desde que você saiba guiá-la com sabedoria. Não deixe tudo nas mãos do destino, você nem sabe se o destino realmente existe... Faça acontecer e não espere que alguém resolva os seus problemas, nem fuja deles. Encare-os de frente. Aceite ajuda apenas de quem quer o seu bem, pois embora não possam resolver os seus problemas, quem quer o seu bem te dará toda a força necessária pra que você possa suportar e... Confie! Entenda que a vida é bela, mas nem tanto ... Mas você deve estar bem consigo mesmo pra que possa estar bem com a vida. Costumam dizer por aí que quem espera sempre alcança, mas percebi que quem alcança é quem corre atrás... Não importa a tua idade, nem o tamanho de seu sonho... A sua vida está em suas próprias mãos e só você sabe o que fazer com ela... (Lilian Roque de Oliveira) iv AGRADECIMENTOS Agradecimento especial à (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo), pelo apoio financeiro concedido para a realização deste trabalho (Processo nº 04 / 03252-1). Ao Prof. Dr. Gervásio Henrique Bechara, a quem tenho um carinho muito especial, pela sua disposição ao envio dos carrapatos, sugestões e pelo apoio. Sou muito grata a tudo que fez por mim! Aos docentes do Departamento de Biologia da UNESP de Rio Claro, por estarem sempre dispostos ao esclarecimento de dúvidas, Profa. Carminda de Cruz- Landim, Márcia B. Braga, Ana C. Leonardo, e em especial, aos professores José Chaud Netto, Maria Ap. Marim-Morales e Doralice Maria Cella, pelo carinho que sempre me trasmitiram. Aos técnicos de laboratório Anderson, Rogilene Ap. Prado, Reinaldo Del Vecchio (Jaboticabal), pela cooperação e suporte no envio e/ou processamento do material, assim como ao Gerson de Mello Souza, Mônika Iamonte e Antônio T. Yabuki, que além da gratidão pelo auxílio, tenho um grande carinho pela forma com que sempre me trataram. À secretária do departamento de Biologia, Lucila de Lourdes S. Franco e em especial, à Cristiane Milleo pelo “socorro” na montagem das pranchas. Aos porteiros, pelas vezes que abrigaram nossos “ticks” em cada chegada de Jaboticabal. Aos meus amigos de pós-graduação: Marielle, Fábio Britto, Zé Augusto, Thays, Zinho, Silvana, Giselly, Dani, Márcia, Reinaldo, Bruno, Rodrigo e Márcio (um quase pós-graduando), pelos bons momentos compartilhando brincadeiras e também por aqueles de cansaço e desânimo. Àqueles amigos, também orientados da Bel, por tudo que passamos juntos, pelos momentos divertidos, comentários de babados e também, por aqueles de choro, nervoso e desespero... Pablito, Gaby´s, Jú Rollo, Amandita, Paty, Luciano: um grande beijo! Em especial, à Karim, pela inestimável ajuda com sugestões para a realização deste trabalho; à Gis, pelo “help” na formatação final (com uma ajudinha v do “CB”, é claro!) e à Lorena, Sandra “Cabrita” e Déby, pelo ombro amigo, com quem pude sempre contar... Vocês todas ficarão para sempre em meu coração! Às todas as meninas que um dia moraram comigo: Eli, Luzinha, Sil, Telly, Isa, Camila, Amá, Dani, Íris (apesar de pouco tempo!), Ani e Marina (esta deu trabalho!), por todos os bons momentos que passamos juntas! Aos meus amigos de graduação, alguns que assim como eu, permaneceram em Rio Claro e que encontro de vez em quando, Peão, Glei, Gui Gomes, Nena, Sunao, Ivan, Gra, Bruna, além daqueles que estão longe, mas que sempre demonstram carinho: Douglas, Telly, Cris, Mú, Rob’s, Oz e Sarinha. Aos meus sogros Irineu e Neuza, pelo exemplo de luta e por sempre terem torcido pela minha felicidade e sucesso. Aos meus primos Sérgio, Kátia e Willian, pela preocupação, incentivo e amor. Àqueles que são muito mais que amigos antigos: Vivi, Magú, Geovane, Alê, Glauce, Silvério, Alline, Aline, pela torcida e amizade. Que Deus os abençoe e que possamos estar sempre juntos! E àquelas amigas que apesar de um bom tempo sem nos reencontrarmos, também tenho um carinho especial: Marcita, Débora e Vã. Agradeço a todas as pessoas que um dia fizeram parte de minha história de vida! vi ÍNDICE RESUMO E ABSTRACT.................................................................................... 1 I. INTRODUÇÃO................................................................................................. 4 II. OBJETIVOS.................................................................................................... 19 III. MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................... 21 III.1. MATERIAL................................................................................................ 22 III.2. MÉTODOS................................................................................................. 23 III.2.1. MICROSCOPIA DE LUZ.................................................................... 23 III.2.1.1. Análise morfológica....................................................................... 23 III.2.1.1.1. Técnica da Hematoxilina de Harris- Eosina Aquosa................ 23 III.2.1.2. Análise Histoquímica..................................................................... 23 III.2.1.2.1. Azul de Nilo para detecção de lipídios..................................... 23 III.2.1.2.2. PAS / Azul de Alcian para detecção de polissacarídeos.......... 24 III.2.1.2.3. Azul de Bromofenol para detecção de proteínas...................... 24 III.2.1.2.4 Xylidine Ponceau para detecção de proteínas.......................... 24 III.2.1.2.5. Técnica de Exclusão de Corante utilizando o Azul do Nilo..... 25 III.2.1.2.6. Localização da Atividade da Fosfatase Ácida.......................... 25 III.2.1.2.7. Localização da Atividade da ATPase...................................... 26 III.2.1.3. Análise Citoquímica....................................................................... 27 III.2.1.3.1. Reação de Feulgen.................................................................... 27 III.2.1.3.2. Técnica do Azul do Toluidina.................................................. 27 III.2.2. MICROSCOPIA ELETRÔNICA......................................................... 28 III.2.2.1. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)................................ 28 III.2.2.2. Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)............................. 28 III.2.2.2.1. Análise Morfológica (Rotina)................................................... 28 III.2.2.2.2. Análise Citoquímica para localização da Fosfatase Ácida....... 29 IV. RESULTADOS............................................................................................... 30 vii CAPÍTULO 1: Morphological, histological, and ultrastructural characterization of degenerating salivary glands in females of the cattle- tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887) (Acari: Ixodidae) ....................………………………………………………..……. 32 CAPÍTULO 2: Structural and cytochemical changes in the salivary glands of the Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887) (Acari: Ixodidae) tick during feeding...........…….....................…………… 36 CAPÍTULO 3: Ultrastructural comparison of female Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887) (Acari: Ixodidae) salivary glands during feeding: cell death features at semi-engorged stage...…...…. 61 CAPÍTULO 4: Acid phosphatase and ATPase activities in female catlle- tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887) (Acari: Ixodidae) salivary glands during the feeding period...…….......................... 87 V. DISCUSSÃO FINAL....................................................................................... 113 VI. CONCLUSÕES.............................................................................................. 120 VII. REFERÊNCIAS........................................................................................... 123 Resumo e Abstract Resumo e Abstract Erika Takagi Nunes 2 RESUMO As glândulas salivares dos carrapatos são órgãos importantes na transmissão de patógenos a seus hospedeiros, entretanto, o conhecimento das mudanças morfo- fisiológicas que nelas ocorrem durante o período de alimentação são limitados. Neste trabalho estudou-se as glândulas salivares de fêmeas de carrapatos Rhipicephalus (Boophilus) microplus por meio de técnicas de morfologia, histoquímica e citoquímica de luz e ultra-estrutural em fêmeas em dois diferentes estágios de alimentação (inicial: 24 a 48 horas de infestação, peso inferior a 0,03g e semi- ingurgitado: 4 a 5 dias de infestação, peso entre 0,13g e 0,25g), de modo a verificar as mudanças que ocorreriam no tecido glandular neste período e identificar quando teria início o processo de degeneração, além de estabelecer que tipo de morte celular estaria envolvida. As glândulas salivares das fêmeas em início de alimentação mostraram suas células fortemente positivas para ATPase e eficientes na exclusão de corante vital, estando portanto, ativas ou apenas em início de degeneração. Os núcleos, de maneira geral, apresentaram-se preservados, sendo assim, descartada a ocorrência de morte celular neste estágio. A localização da fosfatase ácida demonstrou a participação desta enzima na atividade metabólica destes órgãos, regulando o processo secretor e degradando proteínas. Fêmeas no estágio semi- ingurgitado apresentaram glândulas com características de degeneração, como perda das especializações de membrana, presença de figuras mielínicas, vacúolos autofágicos, lisossomos, além de alterações nucleares como condensação e marginalização cromatínica, formação de blebs e chegando à fragmentação nuclear. À medida que o processo de alimentação avançou, houve aumento da enzima fosfatase ácida, entretanto, os ácinos mantiveram-se fortemente ATPase positivos. Os resultados aqui obtidos demonstraram que as glândulas salivares das fêmeas de R. (B.) microplus, já no estágio semi-ingurgitado começam a degenerar e sofrem morte celular por apoptose, contrariando o que é descrito para as demais espécies de ixodídeos, quando a degeneração ocorre após o ingurgitamento e os ductos excretores morrem por necrose. Resumo e Abstract Erika Takagi Nunes 3 ABSTRACT The ticks’ salivary glands are important organs to the pathogens transmission to their hosts, however, the knowledge regarding the morpho- physiological changes which occur in these structures during the feeding period are limited. In this work, the salivary glands of the Rhipicephalus (Boophilus) microplus female ticks were studied, using morphological, histochemical and ultrastructural citochemistry techniques in individuals at two different feeding stages (initial: 24-48 hours of attachment; weigh lower than 0.03g, and semi-engorged: 4-5 days of attachment; weigh around 0.13 and 0.25g ), in attempt to verifying the changes that would occur in the glandular tissue at this feeding period and identifying when the degeneration process would start, besides establishing which cell death type would be involved. The salivary glands from females at beginning of feeding showed their cells strongly positive to ATPase and efficient for the vital stain exclusion, being thus, active or at initial stages of degeneration. The nuclei, in a general way, present themselves preserved, being thus discarded the signs of the apoptosis occurrence in this stage. The acid phosphatase localization demonstrated this enzyme participation in the metabolic activity of these organs, regulating the secretory process and degrading proteins. Females at semi-engorged stage showed glands with degenerative characteristics, as loss of membrane especialization, presence of mielinic figures, autophagic vacuoles, lysosomes, besides nuclear alterations as chromatin condensation and marginalization, blebs formation and nuclear fragmentation. As the feeding process progressed, there was a acid phosphatase enzyme increase, however, the acini maintained strongly ATPase-positive. The results here obtained showed that the R. (B.) microplus salivary glands in females at the semi-engorged stage start to degenerate and suffer cell death by apoptosis, unlike the descriptions to the others ixodids species, when the degeneration occurs after the engorgement and the excretory ducts die by necrosis. Introdução Introdução Erika Takagi Nunes 5 I. INTRODUÇÃO Os carrapatos são artrópodes ectoparasitas de vertebrados representantes da ordem Acarina e, portanto, não apresentam divisões corporais, sendo a cabeça, tórax e abdomen fundidos e não segmentados (STORER; USINGER, 1977). O grupo é constituído de animais pequenos ou médios cujo corpo é achatado e ovalado, com algumas espécies atingindo cerca de 3 cm de comprimento. Apesar de apresentarem um forte tegumento podem ter suas dimensões aumentadas durante o repasto sangüíneo no hospedeiro. Na região anterior do corpo, não se distingue a cabeça e sim, um conjunto de peças bucais quitinizadas denominado gnatossoma (REY, 1973). Muitas espécies podem viver por longos períodos sem alimento (até mais de um ano) entre as vegetações (RUPERT; BARNES, 1996) e são resistentes à dessecação por possuírem o integumento recoberto por cera (WALKER, 1994). Além disto, porções do corpo não são totalmente esclerotizadas, sendo capaz de uma grande expansão quando ingurgitado com sangue. Os carrapatos são classificados em três famílias: Ixodidae, Argasidae e Nutalliellidae. O corpo das espécies Ixodidae é recoberto por uma grande placa dorsal quitinosa, o escudo, que pode ter a superfície ornamentada por manchas, depressões e desenhos (REY, 1973) e é onde encontram-se as partes bucais na região frontal do corpo. Já os Argasidae não apresentam essa placa dura e as partes bucais Introdução Erika Takagi Nunes 6 encontram-se localizadas ventralmente (WALKER, 1994; WALL; SHEARER, 1997). A família Nutalliellidae é menor do que as outras duas e consiste apenas de uma espécie (SAUER et al., 2000). Dentre os artrópodes, os carrapatos constituem, provavelmente, um dos mais importantes grupos do ponto de vista médico e veterinário, uma vez que provocam lesões no hospedeiro, seja no processo de repasto sanguíneo ou pela transmissão de agentes patogênicos. São animais hematófagos e vetores de arboviroses, ricketsioses, espiroquetoses e protozoários tanto para o homem quanto para animais domésticos (KAUFMAN, 1989). Esse parasitismo compromete todo o desenvolvimento do hospedeiro pela espoliação direta causada pelo hematofagismo, o que permite a entrada de organismos responsáveis pelas infecções secundárias como miíases cutâneas, ou paralisia provocada pela ação tóxica da saliva do parasita (WALL; SHEARER, 1997), tudo isso influenciando negativamente em sua produtividade cujos reflexos atingem até mesmo a comercialização de produtos como a carne, couro e o leite. Estima-se, no Brasil, que os prejuízos causados pelos carrapatos chegam a alcançar quase um bilhão de dólares (HORN, 1983 apud ANDREOTTI, 2002). Segundo Harwood e James (1979), este extraordinário sucesso dos carrapatos como vetores de microrganismos se deve às características biológicas que apresentam, dentre as quais destacam-se: hematofagismo em todas as fases do desenvolvimento; fixação profunda nos hospedeiros, o que dificulta sua remoção; ingurgitamento lento, havendo tempo para inocular patógenos; adaptação a diferentes espécies de hospedeiros; resistência a adversidade climática devido a grande esclerotização; longevidade nos ambientes, propiciando tempo para multiplicação dos patógenos. O carrapato da espécie Boophilus microplus é um ectoparasita de bovinos distribuído geograficamente nas regiões tropicais e subtropicais do mundo (WILLADSEN; JONGEJAN, 1999). Pertence à família dos carrapatos duros (Ixodidae) e é a única, das cinco espécies conhecidas, presente no Brasil (PEREIRA, 1982), destacando-se por ser vetor principalmente da rickettsia Anaplasma sp e do protozoário Babesia spp, responsáveis pela “Tristeza Parasitária Bovina”, causadora de grandes prejuízos ao sistema de produção. Por exemplo, só com a exportação de Introdução Erika Takagi Nunes 7 couro e produtos manufaturados, o Brasil deixou de exportar em 1997, cerca de US$ 500 milhões, decorrentes da má qualidade do produto, devido aos danos produzidos principalmente por ectoparasitas, incluindo o carrapato. Recentemente, Nunes et al. (2005) encontraram, em nível ultra-estrutural, a presença de microrganismos nas glândulas salivares de alguns espécimens desta espécie, o que evidencia a potencialidade destes carrapatos na transmissão de patógenos. Muitos estudos morfológicos e moleculares com carrapatos Rhipicephalus (Koch, 1844) e Boophilus (Curtice, 1891) mostraram similaridades entre estes gêneros e revelaram que o primeiro não é uma linhagem monofilética, tendo algumas espécies mais próximas àquelas do gênero Boophilus que às outras de mesmo gênero (NEUMANN, 1904, CAMICAS; MOREL, 1977; MURREL et al., 2001; KLOMPEN et al., 1996). Assim, Murrel e Barker (2003), revisando a filogenia, redefiniram a nomenclatura, o que tornou Boophilus um subgênero de Rhipicephalus, sendo todas as cinco espécies deste gênero membros de Rhiphicepalus (Boophilus). O ciclo de vida dos carrapatos ixodídeos consiste em: ovo, larva, ninfa e adulto, sendo que dispendem parte do período no seu hospedeiro e parte no ambiente. O carrapato-do-boi é um parasito monoxeno, isto é, depende de apenas um hospedeiro em seu ciclo de vida, preferencialmente o bovino. No entanto, Arthur (1960) cita outras espécies que podem comportar-se como hospedeiros tais como búfalos, ovinos, caprinos, coelhos, animais domésticos e silvestres, além de ser freqüente o ataque ao homem (REY, 1973). No caso deste carrapato, o ciclo de vida apresenta duas fases: a de vida livre que se inicia com o desprendimento do hospedeiro e caída no solo, período com duração de 32 dias (GONZALES, 1995) durante os quais o carrapato não se alimenta, sobrevivendo apenas de suas reservas (FARIAS, 1995); e a fase parasitária que se inicia quando a larva fixa suas peças bucais no tecido do hospedeiro, iniciando o processo de alimentação. Segundo Oliver Jr. (1974), no início da fase parasitária, a alimentação é descontínua ou à taxas muito baixas até que ocorra o acasalamento, processo esse sucedido com a rápida fase alimentar que culmina com o ingurgitamento. No processo de fixação do carrapato no hospedeiro, o hipostômio penetra lentamente na pele, como conseqüência da ação combinada entre as quelíceras e a Introdução Erika Takagi Nunes 8 saliva. A digestão dos tecidos ao redor do canal de penetração causa ruptura dos capilares e vasos linfáticos, permitindo a sucção do sangue alternada com a eliminação da saliva produzida nas glândulas salivares. As larvas da espécie Boophilus microplus alimentam-se preferencialmente do plasma sangüíneo, sendo o sangue o principal constituinte alimentar nos momentos que precedem o rápido ingurgitamento das ninfas e fêmeas (BENNETT, 1974). A fêmea de Boophilus microplus, durante os seis primeiros dias de fixação, ingere apenas 3,8 µL de sangue, porém, nos momentos que precedem sua queda (12- 24 horas), a ingestão atinge valores em torno de 300 a 500 µL (TATCHELL et al., 1972), podendo aumentar seu peso em até 200 vezes (KEMP et al., 1982). Após desprender-se do bovino, a fêmea ingurgitada procura um local protegido da luz solar direta para realizar a postura, que pode durar de uma semana a vários meses, dependendo das condições ambientais como temperatura e umidade. A fêmea morre após haver completado a postura (FREITAS, 1982). O aparelho bucal dos carrapatos inclui um par de glândulas salivares localizadas dentro do idiossoma (WALKER et al., 1985). Morfologicamente, estas são estruturas alongadas, com subunidades em forma de ácinos secretores e ductos excretores localizados nas porções antero-laterais do corpo do animal (TILL, 1961; BALASHOV, 1983; WALKER et al., 1985; SAUER ; HAIR, 1986). Schumaker e Serra-Freire (1991) observaram em Argas miniatus que esses órgãos apresentam cor branco-leitosa e possuem tamanhos aproximadamente iguais dos dois lados do corpo. Segundo Megaw e Beadle (1979), cada glândula salivar é formada por aproximadamente 400 ácinos, classificados de acordo com a presença ou ausência de granulação no citoplasma das células. As glândulas salivares dos carrapatos podem ser consideradas um dos mais importantes órgãos desses indivíduos, uma vez que desempenham funções essenciais para a sobrevivência e por serem a principal via de transmissão de patógenos a seus hospedeiros. Estas estruturas são responsáveis pela elaboração de uma substância que, ao tomar contato com o aparato bucal, permite a captação da umidade do meio pelo parasita, facilitando desse modo o processo da alimentação (RUDOLPH; KUNLLE, 1974). Segundo Moorhouse e Tatchell (1966) a saliva secretada é o componente responsável pela fixação dos carrapatos que possuem aparelho bucal Introdução Erika Takagi Nunes 9 curto como as espécies do gênero Rhipicephalus. Dados de análises bioquímicas mostraram que a saliva de fêmeas de Boophilus microplus em alimentação contém proteínas, carboidratos e lipídios, além de íons cloro e sódio concentrados (BALASHOV, 1983). Em carrapatos ixodídeos, as glândulas salivares também servem como órgãos osmoregulatórios, uma vez que regulam os íons, principalmente cloro e sódio presentes na hemolinfa do hospedeiro (MEGAW, 1976). Gregson (1967) observou que um volume significante de água é excretado para o interior do hospedeiro via glândula salivar, destacando assim, a função excretora dessas estruturas. Como demonstrado por Ribeiro et al. (1985), os ácinos também produzem substâncias que causam a debilitação do sistema de defesa do hospedeiro, além de excretarem toxinas paralisantes (CRAUSE et al., 1993). Neste sentido, as glândulas desempenham papel fundamental no mecanismo de alimentação, como também em outras funções específicas como é o caso da produção de secreções cementantes (COWDRY ; DANKS, 1933), anticoagulantes (NUTTAL; STRICKLAND, 1908), enzimas hidrolíticas (TATCHELL, 1969) e proteolíticas (HOWELL et al., 1975). Há algumas descrições histológicas de glândulas salivares em diferentes espécies de carrapatos ixodídeos. Até o presente, foi descrita a presença de três tipos de ácinos nas fêmeas e quatro nos machos (WALKER et al., 1985; FAWCET et al., 1986; COONS; ALBERTI, 1999). Os ácinos do tipo I, situados ao longo do ducto excretor principal de ambos os sexos, são agranulares, possuem função osmoregulatória e sugere-se que através destes, o carrapato secrete sal proveniente da hemolinfa na região oral para captação de água do ar insaturado. Os demais ácinos (II, III e IV) são formados por células granulares distribuídas ao longo de um sistema ramificado de ductos e são responsáveis pela secreção de produtos relacionados com a fixação do carrapato no hospedeiro, digestão de tecidos (LAVOIPIERRE; RIEK, 1955; WALKER et al., 1985), inibição da coagulação sangüínea e reação primária do hospedeiro através de reação inflamatória (NUTTALL; STRICKLAND, 1908; KÜNSBERG, 1911; WALKER et al., 1985; RIBEIRO; MATHER, 1998; PAESEN et al., 1999), além da secreção de quinases que catalisam a bradicinina, o que explica, em parte, a ausência de dor no hospedeiro (RIBEIRO, 1987). Acredita-se que o fluido excretado pelo carrapato é exportado, na sua maior parte, pelo ácino tipo III durante o processo de alimentação (COONS; L’AMOREAUX, 1986). Os ácinos IV, Introdução Erika Takagi Nunes 10 restritos aos machos, provavelmente estejam relacionados com o papel reprodutivo (SAUER et al., 1995). Binnington (1978), em estudo histológico e histoquímico com glândulas salivares de Boophilus microplus durante o período de alimentação, descreveu no ácino tipo I a existência de uma célula central maior rodeada por células periféricas agranulares, bem como uma grande diversidade de tipos celulares nos ácinos granulares tipo II (a, b, c1-c4) e III (d, e e f). Este autor encontrou as células a, d e e repletas de grânulos de secreção antes da infestação, ou seja, no período em que o carrapato encontrar-se-ia fora do seu hospedeiro e sugeriu que estas seriam responsáveis pela secreção de precursores de cemento, sendo encontradas aparentemente funcionais até aproximadamente 72 horas de alimentação. As células c2 e f tornar-se-iam ativas na alimentação e secretariam seus grânulos glicoproteicos entre 24-72 horas depois da infestação, enquanto as b e c3, também com glicoproteínas e ricas em enzimas, seriam ativas durante toda a fase parasitária. Já a célula c1, como todas as demais, apresentaria atividade esterase, enquanto as do tipo f, ocupando todo o fundo do ácino, tornar-se-iam ativas aproximadamente 12-24 horas após a infestação, tendo perdido a maioria de seus grânulos após 72 horas. Ainda, foram observadas por Binnington (1978), células epiteliais em B. microplus equivalentes às “water-cells” observadas por Meredith e Kaufman (1973) em Dermacentor andersoni apresentando uma grande área de superfície devido à presença de microvilos e sendo responsáveis pela excreção de água durante o processo de ingurgitamento. Ao se alimentar, os carrapatos em geral ativam a expressão de novos genes (OAKS et al., 1991) e há evidências de que o crescimento e desenvolvimento das glândulas salivares pode ser controlado por fatores liberados para a hemolinfa durante a alimentação do animal (COONS; KAUFMAN, 1988). Kaufman e Phillips (1973b) encontraram que a adrenalina, noradrenalina e dopamina são estimuladores da secreção de fluido em glândulas salivares isoladas de fêmeas de D. andersoni e Needham e Sauer (1975) observaram o mesmo em fêmeas de Amblyomma americanum em processo de ingurgitamento. Em B. microplus, foi identificada a presença de catecolamina nas glândulas e nervos salivares (BINNINGTON; STONE, 1977). Introdução Erika Takagi Nunes 11 Registros da literatura mostram que as glândulas salivares dos carrapatos sofrem transformações estruturais e funcionais que são determinadas pelo estágio fisiológico do parasito: possuem, durante a pré-fixação, ácinos volumosos com células secretoras apresentando grânulos de secreção citoplasmáticos e núcleos grandes (SCHUMAKER; SERRA FREIRE, 1991); que sofrem gradativa regressão, demonstrando mudanças morfológicas, inclusive autólise induzida por enzimas lisossômicas (FAWCETT et al., 1986). Needham et al. (1983) e Barker et al. (1984), em estudos realizados com glândulas salivares de Amblyomma americanum, também observaram mudanças significativas no diâmetro dos ácinos tipo I durante o processo de alimentação. Observações feitas, por Robinson e Davidson (1913b) e True (1932) em argasídeos, demonstraram que somente ocorreria redução das glândulas salivares após o ingurgitamento, sem que tivesse sido mostrada extrema degeneração. Ao contrário, Vitzhum (1943) trabalhando com ixodídeos, verificou que na fêmea adulta ocorreria atrofia da glândula seguida de degeneração depois de completo o processo de ingurgitamento. Posteriormente, Till (1961), confirmou que durante a alimentação dos carrapatos, as glândulas salivares passariam por modificações morfológicas e fisiológicas, ocorrendo, primeiramente, um aumento no tamanho das mesmas que seria seguido de redução (em argasídeos) ou degeneração (em ixodídeos), assim que fosse completada a fase de ingurgitamento, porém, pouco é conhecido sobre as mudanças que estes órgãos sofrem durante e ao longo de seu ciclo de vida. Segundo Sauer et al. (2000) não existem informações sobre o controle da degeneração das glândulas salivares de carrapatos durante as mudas larva-ninfa ou ninfa-adulto. Sonenshine (1991), estudando a biologia dos carrapatos em geral, observou que, caso haja uma interrupção na alimentação dos animais, as glândulas das fêmeas podem perder parcialmente sua competência, a qual pode ser rapidamente restabelecida após a realimentação do indivíduo. Entretanto, após o período de ingurgitamento, as fêmeas fertilizadas perdem quase que totalmente sua capacidade de produzir e secretar saliva. Weiss e Kaufman (2001) afirmam que o comportamento de fêmeas removidas prematuramente do hospedeiro é influenciado pela quantidade de sangue ingerido e pelo acasalamento. Caso a fêmea virgem ou a fecundada seja removida Introdução Erika Takagi Nunes 12 antes de ter atingido aproximadamente 10 vezes o peso da em jejum (peso crítico), ela é capaz de reiniciar o processo de alimentação em outro hospedeiro. No entanto, fêmeas virgens acima deste peso ou acasaladas que estejam na fase rápida de ingurgitamento, não voltam a se alimentar em outro hospedeiro e suas glândulas salivares degeneram dentro de aproximadamente oito dias, no caso das virgens, ou quatro dias no das acasaladas. Lomas et al. (1998) afirmaram que fêmeas de A. hebraeum parcialmente alimentadas que tenham atingido este “peso crítico”, aproximadamente, 300mg para esta espécie (HARRIS; KAUFMAN, 1984), a degeneração da glândula ocorre entre 24 - 48 horas depois de sua remoção do hospedeiro. Apesar disto, a degeneração do tecido começa dentro de 24 horas depois do ingurgitamento e conseqüente desprendimento do carrapato (KAUFMAN; LOMAS, 1996). Segundo Harris e Kaufman (1985) a degeneração das glândulas salivares está sob controle hormonal, uma vez que tanto a ecdisona como 20-hidroxiecdisona levam ao processo degenerativo quando injetadas na hemocele do carrapato ou quando estes órgãos estão expostos a certas quantidades fisiológicas destes ecdisteróides in vitro. Assim, pode-se sugerir que os mecanismos que envolvem a degeneração em ixodídeos são programados em resposta à estimulação hormonal de um receptor de ecdisteróide. A secreção do ecdisteróide in vivo é acelerada por uma proteína presente no espermatóforo o qual é transferido durante a cópula, desencadeando assim, o processo degenerativo da glândula salivar (LOMAS; KAUFMAN, 1992a, b). Tal fato explica a diferença de tempo de degeneração observada entre fêmeas virgens e fecundadas, uma vez que nas primeiras a secreção do ecdisteróide é mais demorada (LOMAS; KAUFMAN, 1992a). Recentemente, Denardi (2002) e Oliveira (2003) estudando fêmeas semi- ingurgitadas de A. cajennense e R. sanguineus, respectivamente, encontraram as glândulas salivares em atividade, ao contrário do encontrado por Nunes et al. (2005) para a espécie R. (B.) microplus, que já verificaram características morfológicas e ultra-estruturais indicativas de processo degenerativo em fêmeas no mesmo estágio de alimentação. L’Amoreaux et al. (2003) encontraram evidências morfológicas de degeneração envolvendo, pelo menos em parte, morte celular programada tipo 1 em Introdução Erika Takagi Nunes 13 carrapatos D. variabilis. Estes autores demonstraram que no 5º dia após o desprendimento do carrapato, já são observadas células apoptóticas nos ácinos tipo II e III, sendo este último, o mais atingido. Do 8º ao 11º dia é observada maior quantidade de ácinos do tipo II em processo de morte celular, sendo os do tipo I ainda preservados, o que demonstra uma organização temporal entre os três tipos de ácinos. Ainda segundo estes autores, por volta do 33º dia após o desprendimento, a glândula encontra-se totalmente degenerada, sendo observados apenas núcleos de células do ducto. Este assincronismo na degradação glandular também ocorre nos insetos, como observado em Apis (SILVA; SILVA DE MORAES, 1999), Bombyx mori (SEHNAL; AKAI, 1990) e Manduca sexta (LOCKSHIN; ZAKERI, 1994), onde o processo degenerativo tem início na porção secretora distal e avança para a região proximal. A morte celular pode ser acidental ou programada. O primeiro tipo, conhecido como necrose, é resultado de um trauma ou patologia, onde células morrem devido à exposição a condições ambientais não fisiológicas (BOWEN; BOWEN, 1990) e, em essência, é uma morte sem controle (ZAKERI; LOCKSHIN, 2002). O desenvolvimento da necrose é precedido pelo surgimento de anormalidades morfológicas que indicam o distúrbio da homeostase celular, como por exemplo, inchamento da célula, “blebbing” de superfície, dilatação das cisternas do retículo endoplasmático, encolhimento seguido de inchamento do compartimento interno das mitocôndrias, dispersão e desaparecimento de ribossomos e pequeno acúmulo de cromatina condensada (TRUMP et al., 1981) sem, contudo, haver observação de fragmentos de núcleos envoltos por membrana. Nos estágios finais da necrose, depois da desintegração das membranas celulares, ocorre a degradação do DNA via nucleases e proteases lisossomais (BERGES; ISAACS, 1993), havendo o desaparecimento da cromatina. A ruptura da membrana plasmática resulta na diminuição da definição dos limites celulares, no entanto, células necróticas tendem a reter sua forma até serem removidas por fagócitos (SCHWARTZ; OSBORNE, 1995). Ao contrário, a morte celular programada ocorre sob controle genético e fisiológico, sendo ativada durante períodos específicos do ciclo de vida dos Introdução Erika Takagi Nunes 14 organismos multicelulares, em resposta a estímulos hormonais ou ambientais ou de acordo com sua utilidade morfogenética (BOWEN; BOWEN, 1990). Este tipo de morte celular é dividido em duas categorias, baseadas nas mudanças bioquímicas e morfológicas (ZAKERI; LOCKSHIN, 2002). O tipo 1, conhecido como apoptose é caracterizado pela condensação do citoplasma e perda do contato entre células ou com a matriz extracelular, condensação da cromatina na superfície interna da membrana nuclear e fragmentação do DNA devido à clivagem por endonucleases, fagocitose e degradação de fragmentos celulares por lisossomos secundários de células vizinhas. As mitocôndrias mantêm-se intactas ou um pouco encolhidas, despolarizadas e permitindo o escape do citocromo c. Na morte celular tipo 2 ou lisossômica a destruição do DNA é tardia e sua característica principal é o aparecimento de grandes vacúolos autofágicos derivados de lisossomos que degradam o citoplasma enquanto a célula mantém-se funcional. Somente quando aproximadamente 80% do citoplasma encontra-se destruído, a condensação e marginalização cromatínica torna-se aparente, a eletroforese revela os ladders de DNA e restos da célula são fagocitados como na apoptose clássica (ZAKERI et al., 1993). Este tipo de morte celular programada é mais característico de células com citoplasma volumoso como as encontradas nos tecidos glandulares (glândulas de insetos em metamorfose), músculo e neurônios diferenciados. Halaby et al. (1994) encontraram este tipo de morte nas células das glândulas labiais em degeneração de Manduca. Enquanto a necrose é um fenômeno freqüentemente descrito como multicelular, a apoptose, ao contrário, envolve cada célula do tecido (KERR et al., 1995). Apesar desta classificação, segundo Zakeri et al. (1995), algumas células podem ter características comuns aos três tipos de morte celular. Análises morfológicas de núcleos têm sido amplamente utilizadas nos casos de morte celular programada, uma vez que estes apresentam as primeiras evidências de células em apoptose: a cromatina condensa-se e torna-se agregada em massas uniformes na superfície interna do envelope nuclear, sendo as primeiras mudanças frequentemente acompanhadas por invaginação da membrana nuclear e formação de borbulhas (“blebs”) e, em casos mais extremos, fragmentos de diversos tamanhos são Introdução Erika Takagi Nunes 15 produzidos (KERR et al., 1995). Esta picnose nuclear com posterior marginalização da cromatina condensada, no entanto, pode ou não estar presente nos processos de degeneração nos insetos. No caso das glândulas hipofaríngeas de operárias campeiras de abelhas, por exemplo, embora o entumescimento nuclear seja o fenômeno mais difundido durante a degeneração, condensação e marginalização cromatínica também são observadas em algumas células (SILVA DE MORAES; BOWEN, 2000). O estudo de morte celular programada em invertebrados tem gerado muitas controvérsias, uma vez que as características típicas de apoptose estabelecidas em vertebrados não estão incondicionalmente presentes nas células destes animais. Um dos eventos bem definidos relacionado à apoptose envolve a fragmentação do DNA devido a ativação de endonucleases que são responsáveis pela sua clivagem em regiões internucleossômicas, gerando fragmentos com 180-200 pares de bases (WYLLIE, 1980). Esta fragmentação é normalmente utilizada na identificação de células apoptóticas por ser considerada característica típica de apoptose (WYLLIE, 1981, WALKER et al., 1988; McCONKEY et al., 1990). Assim, nem todos os tipos de morte celular programada são acompanhados pela ativação de endonucleases (LOCKSHIN; ZAKERI, 1992; BOWEN et al., 1993; ZAKERI et al., 1993). Em alguns insetos ocorre síntese ao invés de fragmentação do DNA durante a morte celular programada (BOWEN et al., 1993), sendo a participação das endonucleases no processo confirmada somente por alguns autores (GREGORC; BOWEN, 1997; JOCHOVÁ et al., 1997b; SILVA DE MORAES; BOWEN, 2000). O nemátodo Caenorhabditis elegans tem sido um modelo muito utilizado no estabelecimento dos fundamentos da organização genética para o controle da morte celular, pois das 1090 células somáticas formadas durante o desenvolvimento destes vermes, 131 sofrem morte celular programada (ELLIS et al., 1991). Nos eventos apoptóticos é reconhecida a participação dos genes egl-1, ced-4, ced-3 e ced- 9, sendo este último, o responsável pela prevenção da apoptose (HENGARTNER, 1999). As caspases, proteases de cisteínas, funcionam como efetoras da morte celular (KIDD, 1998). No caso dos vertebrados, as caspases podem ter como alvo as laminas nucleares (COHEN et al., 2001), as proteínas integrais da membrana nuclear Introdução Erika Takagi Nunes 16 e algumas proteínas do poro nuclear (BUENDIA et al., 1999). Todas as laminas e as proteínas a elas associadas são clivadas em resíduos específicos por caspases específicas (TZUR et al., 2002) e esta proteólise é importante para a progressão da apoptose, uma vez que facilita a ativação das nucleases responsáveis pela fragmentação do DNA (RAO et al., 1996). Apesar disto, Tzur et al. (2002) sugeriram que a clivagem de laminas não seja essencial para que a apoptose ocorra em C. elegans. Para a detecção de morte celular os corantes para microscopia de luz, hematoxilina-eosina, têm sido amplamente utilizados, evidenciando citoplasma e núcleos condensados mais fortemente corados quando as células encontram-se em processo de morte. No entanto, a sensibilidade deste método é baixa (ZAKERI; LOCKSHIN, 2002). Segundo estes mesmos autores, o uso de corantes vitais também serve para identificar apoptose, sendo sua vantagem a rapidez de aplicação da técnica e a observação da morte celular em três dimensões. Alguns métodos citoquímicos aplicados à microscopia de luz, como a reação de Feulgen (FEULGEN; ROSSENBECK, 1924) e a coloração com azul de toluidina (MELLO; VIDAL, 1980), também têm sido amplamente utilizados para o estudo de morte celular, uma vez que possibilitam a quantificação do DNA e exibem a morfologia das compactações cromatínicas. Há muito tempo foi verificada que a degeneração de tecidos coincide com uma diminuição na atividade de enzimas que estão relacionadas com o metabolismo energético das células (WEBER, 1969), como por exemplo, a ATPase. Assim sendo, Hammar e Mottet, em 1971, propuseram o emprego de estudos histoquímicos para observar tecidos em processo de morte celular, uma vez que a apoptose é um processo ATP-dependente (SILVA DE MORAES, 1998). A fosfatase ácida, termo genérico para uma série de fosfatases não- específicas que em pH ácido hidrolisam mono-ésteres ortofosfato (SILVA- ZACARIN, 2003), também tem sido utilizada como marcador de atividade lítica nas células. Estas hidrolases podem ser encontradas no interior de lisossomos, bem como livres no citoplasma das células, entre as cisternas do retículo endoplasmático, no complexo de Golgi, associadas à grânulos e em vacúolos. No entanto, Cruz-Landim et al. (2002) também verificaram a atividade da fosfatase ácida no interior de núcleos Introdução Erika Takagi Nunes 17 em células de ovário e de intestino de larvas e pupas de A. mellifera, sugerindo que esta enzima participa do controle da expressão gênica ou hidrolisa proteínas da matriz nuclear em células em início de morte celular. A atividade da fosfatase ácida livre e lisossomal tem sido determinada histoquimicamente em hemócitos e glândulas salivares de insetos (ARMBRUSTER et al., 1986) e, especificamente, no corpo gorduroso (De PRIESTER et al., 1979) e glândulas salivares (BOWEN, 1984) de Calliphora erythrocephala. Em larva de Drosophila auraria e no ventrículo de A. mellifera também foram observados resultados semelhantes por Dimitriadis e Kastristsis (1985) e Jimenez e Gilliam (1990), respectivamente. Algumas análises citoquímicas da fosfatase ácida demonstrando a morte celular fisiológica também foram realizadas no intestino médio de larvas de Calliphora vomitoria (SKELTON; BOWEN, 1987) e A. mellifera (GREGORC; BOWEN, 1997) e nas glândulas salivares de D. melanogaster (JONES; BOWEN, 1993). A fosfatase ácida tem sido utilizada nos estudos de morte celular programada em insetos através do emprego do substrato de um amplo espectro de atividade, o p-paranitrofenilfosfato (JONES, 1990; JONES; BOWEN, 1993; CAVALCANTE, 1998; CRUZ-LANDIM et al., 2002; SILVA-ZACARIN, 2003; TOMAINO, 2003), nafthol AS-TR fosfato (WORRIL, 1991; JONES; BOWEN, 1993; GREGORC; BOWEN, 1997; SILVA DE MORAES, 1998) e o β- glicerofosfato (LANE, 1968; LAICINE et al., 1991; SILVA DE MORAES et al., 1996b). No entanto, o p-paranitrofenilfosfato parece ser um indicador mais sensível para autólise celular particularmente nos estágios iniciais deste processo (RYDER; BOWEN, 1975). Alguns autores sugerem ainda que a atividade da fosfatase ácida está relacionada e pode ser induzida pelos níveis de hormônio juvenil e de ecdisona na hemolinfa (van PELT VERKUIL, 1980; SILVA DE MORAES, 1998). Embora a morte celular programada seja um assunto polêmico e bastante investigado em vertebrados e alguns invertebrados, em carrapatos, os estudos dos aspectos morfo-fisiológicos deste fenômeno são escassos, ainda que sejam extremamente importantes para a compreensão da fisiologia destes animais. Assim, investigações sobre a morfologia dos Ixodidae se fazem necessárias para auxiliarem Introdução Erika Takagi Nunes 18 no desenvolvimento de medidas de controle destes parasitas e das patologias por eles causadas. Objetivos Objetivos Erika Takagi Nunes 20 II. OBJETIVOS Tendo em vista que as glândulas salivares dos carrapatos são órgãos de particular importância na transmissão de patógenos a seus hospedeiros e que o conhecimento a respeito das mudanças morfo-fisiológicas que nelas ocorrem durante o período de alimentação do carrapato são limitados, estudos tornam-se necessários para a compreensão da biologia e ecologia destes parasitas com o intuito de se desenvolver estratégias integradas no manejo de suas infestações. Sendo assim, o objetivo do presente trabalho foi realizar um estudo das glândulas salivares de fêmeas de carrapatos Rhipicephalus (Boophilus) microplus, utilizando técnicas morfológicas, histoquímicas e citoquímicas ultra-estruturais em indivíduos que se encontram em dois diferentes estágios de alimentação (em início – 24 a 48 horas de infestação e semi-ingurgitado – 4 a 5 dias de infestação), de modo a verificar: - avaliar as mudanças que ocorrem no tecido glandular do carrapato nos dois estágios de alimentação; - quando se iniciam os processos de degeneração nas células glandulares; - quais os tipos de morte celular que podem estar envolvidos. Material e Métodos Material e Métodos Erika Takagi Nunes 22 III. MATERIAL E MÉTODOS II.1. MATERIAL Para o desenvolvimento do presente estudo foram utilizadas fêmeas de carrapatos da espécie Rhipicephalus (Boophilus) microplus provenientes da criação de gado (Bos taurus) da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da UNESP Jaboticabal – SP/ Brasil, que foram coletadas em estágio inicial de alimentação e semi-ingurgitadas. Foram consideradas fêmeas em início de alimentação, aquelas com peso inferior a 0,03g (24-48 horas de infestação) e semi-alimentadas as que possuíam peso médio entre 0,13g e 0,25g (4-5 dias de infestação). Para a análise foram utilizados equipamentos disponíveis nos laboratórios de Histologia e Microscopia Eletrônica do Departamento de Biologia da UNESP Campus Rio Claro. As fêmeas, depois de anestesiadas a frio (4ºC), tiveram suas glândulas salivares retiradas em placa de Petri contendo solução fisiológica para insetos (NaCl 7,5 g/L, Na2HPO4 2,38 g/L e KH2PO4 2,72 g/L; pH 7.2), com o auxílio de pinças de ponta fina e micro-tesouras cirúrgicas para serem submetidas as diferentes técnicas. Material e Métodos Erika Takagi Nunes 23 III.2. MÉTODOS III.2.1. MICROSCOPIA DE LUZ III.2.1.1. Análise Morfológica: III.2.1.1.1. Técnica da Hematoxilina de Harris - Eosina Aquosa (Segundo JUNQUEIRA; JUNQUEIRA, 1983) As glândulas salivares foram fixadas em formalina neutra tamponada (pH 7- 7.4) e acetona, na proporção 9:1, durante uma hora e trinta minutos, a 4ºC, ou em paraformaldeído 4% durante 24 horas. Posteriormente, o material foi desidratado em banhos de 15 minutos cada nos álcoois 70-95% e transferido para a resina de embebição onde permaneceu por 24 horas. A inclusão foi realizada em resina Leica e os blocos, depois de polimerizados em estufa (37ºC), foram seccionados em micrótomo Leica RM 2145. As secções de 4-5µm de espessura foram recolhidas em lâminas de vidro, colocadas em estufa à 37ºC e coradas com Hematoxilina de Harris durante 10 minutos, lavadas em água corrente por 5 minutos, para retirada do excesso e reação do corante e, a seguir, coradas com Eosina durante 5 minutos. Após nova lavagem em água corrente, as lâminas foram secas à temperatura ambiente, montadas em Bálsamo do Canadá para a observação e documentação fotográfica. III.2.1.2. Análise Histoquímica: III.2.1.2.1. Azul de Nilo para detecção de lipídios (Segundo JUNQUEIRA; JUNQUEIRA, 1983): Material e Métodos Erika Takagi Nunes 24 As lâminas permaneceram no corante à 37º por 5 minutos, foram lavadas em água corrente e, posteriormente, colocadas em ácido acético 1% por 1 minuto. Depois de secas, foram montadas em Bálsamo do Canadá para a observação e documentação fotográfica. III.2.1.2.2. PAS / Azul de Alcian para detecção de polissacarídeos ácidos e básicos (Segundo JUNQUEIRA; JUNQUEIRA, 1983): As lâminas foram coradas com Alcian Blue pH 2,5, durante 30 minutos e, posteriormente, lavadas com água destilada. A seguir, foram colocadas em ácido periódico 1% durante 5 minutos e novamente lavadas em água destilada. A seguir, as lâminas permaneceram no reagente de Schiff por 30 minutos, no escuro, e foram submetidas a uma lavagem em água corrente por 5 a 10 minutos. Logo após, foram coradas por hematoxilina por 2 minutos e lavadas em seguida. Foram secas e montadas em Bálsamo do Canadá para a observação e documentação fotográfica. III.2.1.2.3. Azul de Bromofenol para detecção de proteínas totais (Segundo JUNQUEIRA; JUNQUEIRA, 1983): As lâminas foram coradas pelo azul de bromofenol durante 2 horas, à temperatura ambiente. Logo após, lavadas com ácido acético 0,5% por 5 minutos e com água corrente por 15 minutos e, a seguir, foram passadas rapidamente por uma solução de álcool butílico. Foram, então, diafanizadas em xilol e montadas em Bálsamo do Canadá para a observação e documentação fotográfica. III.2.1.2.4. Xylidine Ponceau para detecção de proteínas totais (Segundo JUNQUEIRA; JUNQUEIRA, 1983): As lâminas permaneceram no corante por 5 minutos e, posteriormente, foram lavadas em água corrente. Após 1 minuto em ácido acético 1%, foram secas Material e Métodos Erika Takagi Nunes 25 e montadas em Bálsamo do Canadá para posterior observação e documentação fotográfica. III.2.1.2.5. Técnica de Exclusão de Corante utilizando Azul do Nilo (Segundo SAUNDERS et al., 1962). As glândulas salivares, após retiradas foram transferidas para o corante Azul do Nilo (0,001g de Azul do Nilo em 10mL de solução salina) onde permaneceram por 30 minutos, à temperatura ambiente. Foram então lavadas em água destilada por duas vezes e, então, fixadas em formalina neutra tamponada e acetona, na proporção 9:1, durante uma hora e trinta minutos, a 4ºC. As glândulas foram colocadas sobre lâmina e montadas em gelatina glicerinada para posterior observação e documentação fotográfica. III.2.1.2.6. Localização da Atividade da Fosfatase Ácida (Segundo HUSSEIN et al., 1990) • Secções em resina Após a fixação em formalina neutra tamponada 10% e acetona, na proporção 9:1, durante uma hora e trinta minutos, a 4ºC, o material foi lavado em tampão acetato (0,05M, pH 4.8) e incubado à 37ºC, por 45 minutos, em meio de incubação contendo: naftol AS-TR fosfato, DMSO (dimetil sulfóxido), tampão acetato (0,05M, pH 4.8), MnCl2.4H2O 10% e sal vermelho violeta. Para o preparo do meio de incubação, foram dissolvidos 3mg do substrato naftol AS-TR fosfato em duas gotas de DMSO e, em seguida, adicionados 10mL do tampão acetato. Na seqüência, foi acrescentado 0,2mL do cloreto de manganês e, por último, 6mg do sal, sendo a solução vigorosamente misturada. O controle foi feito excluindo-se o substrato do meio de incubação. Material e Métodos Erika Takagi Nunes 26 Depois de incubadas, as glândulas salivares foram lavadas em água destilada e desidratadas em banhos de 15 minutos cada nos álcoois 70-95%. O material permaneceu por 24 horas em resina de embebição (mistura de 50mL de resina + 0,5g de ativador) e, posteriormente, foi incluído em resina Leica. Após a inclusão, o material foi seccionado em micrótomo e os cortes de 6 µm foram recolhidos em lâminas de vidro e contra-corados em Hematoxilina. As lâminas foram montadas em Permount para observação e documentação fotográfica. • Montagem total Após a fixação das glândulas salivares em formalina neutra tamponada 10% e acetona, na proporção 9:1, durante uma hora e trinta minutos, a 4ºC, estas foram rapidamente lavadas em tampão acetato de sódio (0,05M, pH 4.8), incubadas e desidratadas como descrito nesta técnica para secções em resina. O material foi colocado sobre lâminas de vidro que, a seguir, foram montadas em Bálsamo do Canadá para observação e documentação fotográfica. III.2.1.2.7. Localização da Atividade da ATPase (Segundo HUSSEIN et al., 1990) As glândulas salivares foram fixadas em glutaraldeído 0,5% em tampão cacodilato de sódio 0,2M, pH 7.2, durante uma hora, a 4ºC. O material foi incubado durante 48 minutos, a 37º C, no seguinte meio: Tris maleato (200mM, pH 7.2), ATP (5mM), MgSO4 (5mM), KCl (15mM), CaCl2 (10mM), acetato de chumbo (4mM), sacarose (160mM). O acetato de chumbo foi dissolvido no tampão, usando agitador magnético e deixado durante à noite, a 37ºC, para completa dissolução. O ATP foi adicionado por último e no momento da incubação, exceto no grupo controle, onde este não foi utilizado. Após a incubação, as glândulas salivares foram lavadas em tampão Tris- maleato (pH 7.2) durante 5 minutos, a 4ºC, e fixadas em solução de formalina neutra tamponada e acetona (9:1) por 20 minutos. Posteriormente, foram desidratadas em Material e Métodos Erika Takagi Nunes 27 álcool 70-95%, com banhos de 15 minutos e transferidas para resina de embebição, onde permaneceram por 24 horas. A inclusão foi realizada em resina Leica e o material foi seccionado em 6 µm de espessura. As lâminas secas contendo as secções foram colocadas em solução de sulfeto de amônia 1% por 5 minutos para diferenciação da ATPase, coradas com Hematoxilina por 10 minutos, secas e montadas com Bálsamo do Canadá. III.2.1.3. Análise Citoquímica Para a realização das duas técnicas a seguir, as glândulas salivares foram fixadas em mistura de álcool e ácido acético na proporção 3:1 por 12 minutos, desidratadas em banhos de 15 minutos cada nos álcoois 70-95% e incluídas em resina Leica. As secções com 5µm de espessura foram colocadas sobre lâminas de vidro. III.2.1.3.1. Reação de Feulgen (Segundo FEULGEN; ROSSENBECK, 1924) As lâminas contendo as secções permaneceram por 11 minutos em solução de HCl 1N (60ºC), foram lavadas em água destilada e submetidas ao reativo de Schiff por uma hora. Os cortes foram contra-corados com eosina durante 5 minutos. Em seguida, as lâminas foram lavadas em água corrente, secas e montadas em Bálsamo do Canadá, para posterior observação e documentação fotográfica. III.2.1.3.2. Técnica de Azul do Toluidina (Segundo MELLO; VIDAL, 1980) As lâminas permaneceram em solução de Azul de Toluidina 0,025% em tampão McIlvane (pH 4.0) durante 20 minutos à temperatura ambiente, foram lavadas Material e Métodos Erika Takagi Nunes 28 rapidamente em água destilada e montadas em Permount para análise e documentação fotográfica. III.2.2. MICROSCOPIA ELETRÔNICA III.2.2.1. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV): As glândulas salivares foram fixadas em solução de Karnovsky por 24h e desidratadas em concentrações crescentes de acetona (70-100%) por 5 minutos cada. O material foi levado ao ponto crítico, colado em suporte de alumínio, onde recebeu banho de ouro, e posteriormente, foi examinado ao Microscópio Eletrônico de Varredura PHILLIPS 505 SEM. III.2.2.2. Microscopia Eletrônica de Transmissão III.2.2.2.1. Análise Morfológica (Rotina) As glândulas salivares das fêmeas foram fixadas em solução de glutaraldeído 2,5% em tampão cacodilato de sódio 0,1M (pH 7,2) durante 24 horas, à 4ºC. A seguir, passaram por duas lavagens de 15 minutos cada em solução tampão cacodilato de sódio 0,1M. A pós-fixação foi realizada em tetróxido de ósmio 1% em solução tampão cacodilato de sódio 0,1M durante 2 horas, à temperatura ambiente, no escuro. Posteriormente, o material passou por mais duas lavagens de 15 minutos cada em solução tampão de cacodilato de sódio 0,1M e foi contrastado em solução de acetato de uranila 2% com acetona 10%, por 2 a 4 horas no escuro. A desidratação foi realizada em série crescente de acetona 50% a 95% e 100% duas vezes, com duração de 5 minutos cada. Logo após, o material permaneceu em mistura de acetona e resina na proporção de 1:1 onde permaneceu por 12 horas. O material foi incluído em resina pura com catalisador e colocado em estufa à 60ºC por um período de 48 horas. Depois de polimerizados, os blocos foram seccionados em ultra-micrótomo. Os cortes foram coletados em grades de cobre e Material e Métodos Erika Takagi Nunes 29 passaram por contraste com acetato de uranila e citrato de chumbo durante 45 e 10 minutos, respectivamente. As grades foram analisadas em Microscópio Eletrônico de Transmissão PHILLIPS 100 TEM para documentação. III.2.2.2.2. Análise Citoquímica para localização da Fosfatase Ácida (Segundo modificação de RYDER; BOWEN, 1975) As glândulas salivares, depois de retiradas, foram fixadas durante 1 hora, à 4ºC, em solução de glutaraldeído 2,5% e tampão cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7.2). A seguir, o material foi rapidamente lavado em tampão acetato de sódio 0,05 M (pH 4.8) e incubado por 2 horas, à temperatura ambiente, em meio contendo: A) paranitrofenilfosfato (5mg) e B) tampão acetato de sódio (10mL, 0,05 M, pH 4.8) e acetato de chumbo (5mg). Para a preparação deste meio, primeiramente dissolveu-se o acetato de chumbo no tampão acetato de sódio (B), e na seqüência acrescentou-se B a A. O controle foi feito excluindo-se o substrato (p-nitrofenilfosfato) do meio de incubação. Após a incubação, o material foi lavado por 30 minutos, a 4ºC, em tampão cacodilato de sódio (pH 7.2) e, a seguir, permaneceu por 1 hora, a 4ºC, em tetróxido de ósmio de Millonig. O material foi desidratado em série crescente de acetona (50% - 100%) de 5 minutos cada, embebido em mistura de resina e acetona durante à noite e, posteriormente, em resina pura (Epon+DDSA_Araldite). A inclusão foi realizada em resina pura e catalisador. Após a inclusão, seccionou-se o material em ultra-micrótomo, coletou-se em grades de cobre e observou-se ao Microscópio Eletrônico de Transmissão PHILLIPS 100 TEM para documentação fotográfica. Resultados Resultados Erika Takagi Nunes 31 IV. RESULTADOS Os resultados obtidos no presente estudo serão apresentados na forma de artigos, os quais foram submetidos e publicados em revistas especializadas, onde: Capítulo 1: “Morphological, histological, and ultrastructural characterization of degenerating salivary glands in females of the cattle-tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus (CANESTRINI, 1887) (Acari: Ixodidae)”. Artigo publicado em 2005 na Micron, 36: 437-447. Capítulo 2: “Structural and cytochemical changes in the salivary glands of Rhipicephalus (Boophilus) microplus (CANESTRINI, 1887) (Acari: Ixodidae) tick female during feeding”. Artigo submetido à Veterinary Parasitology. Capítulo 3: “Ultrastructural comparison of female Rhipicephalus (Boophilus) microplus (CANESTRINI, 1887) (Acari: Ixodidae) salivary glands during feeding: cell death features at semi-engorged stage”. Artigo submetido à The Veterinary Journal. Capítulo 4: “Acid phosphatase and ATPase activities in female cattle-tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus (CANESTRINI, 1887) (Acari: Ixodidae) salivary glands during the feeding period”. Artigo aceito na Experimental Parasitology. Capítulo 1 Capítulo 1 Erika Takagi Nunes 33 CAPÍTULO 1 TITLE: Morphological, histological, and ultrastructural characterization of degenerating salivary glands in females of the cattle-tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus (CANESTRINI, 1887) (Acari: Ixodidae). AUTHORS: Erika Takagi Nunes1, Gervásio Henrique Bechara2, Kelly Cristina Saito1, Sandra Eloisi Denardi1, Patrícia Rosa de Oliveira1 and Maria Izabel Camargo Mathias1. 1. Departamento de Biologia – Instituto de Biociências- UNESP, Av. 24A, nº1515. Cx. Postal 199 – CEP: 13506-900 – Rio Claro, S.P.- Brazil. Tel: +55 (19) 3526-4135. FAX +55 (19)3526-4136. 2. Departamento de Patologia Veterinária – FCAV – UNESP – Jaboticabal, S.P.- Brazil. Periódico: Micron, v. 36, p. 437-447, 2005. Capítulo 1 Erika Takagi Nunes 34 RESUMO O presente estudo descreve a morfologia e a ultra-estrutura das glândulas salivares de fêmeas semi-ingurgitadas do carrapato-do-boi Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Os ácinos que compõem estas glândulas, neste estágio específico de alimentação, demonstram células que caracterizam o processo degenerativo das glândulas salivares, como: citoplasma vacuolizado, cromatina condensada, núcleos fragmentados e presença de corpos apoptóticos. Além disto, foi detectada, no interior destes órgãos, a presença de microrganismos com morfologia típica de protozoário. PALAVRAS-CHAVE: Rhipicephalus (Boophilus) microplus; carrapato-do-boi; glândulas salivares; histologia; histoquímica; ultra-estrutura; apoptose. Capítulo 1 Erika Takagi Nunes 35 Capítulo 2 Capítulo 2 Erika Takagi Nunes 37 CAPÍTULO 2 TITLE: Structural and cytochemical changes in the salivary glands of Rhipicephalus (Boophilus) microplus (CANESTRINI, 1887) (Acari:Ixodidae) tick female during feeding AUTHORS: Erika Takagi Nunes1, Maria Izabel Camargo Mathias1 and Gervásio Henrique Bechara2 1. Departamento de Biologia – Instituto de Biociências- UNESP, Av. 24A, nº1515. Cx. Postal 199 – CEP: 13506-900 – Rio Claro, S.P.- Brazil. Tel: +55 (19) 3526-4135. FAX +55 (19)3526-4136. 2. Departamento de Patologia Veterinária – FCAV – UNESP – Jaboticabal, S.P.- Brazil. Send the proofs to the first author (E-mail: erikatnunes@yahoo.com.br) Capítulo 2 Erika Takagi Nunes 38 RESUMO Este estudo descreve a morfologia das glândulas salivares de fêmeas de carrapatos Rhipicephalus (Boophilus) microplus em início de alimentação (24-48 horas de infestação) e semi-ingurgitadas (4 a 5 dias de infestação) a fim de verificar as características degenerativas deste órgão e a fase do ciclo secretor em que o processo se inicia. No primeiro caso, as glândulas salivares apresentaram-se preservadas com os três tipos de ácinos (I, II e III) sendo individualizados. Grânulos de secreção foram observados apenas no citoplasma das células b, c1, c2, c4 (ácino tipo II) e d (ácino tipo III), bem como núcleos grandes com morfologia regular e preservada. Nas fêmeas semi-ingurgitadas os ácinos apresentaram raras células íntegras, poucas semi-preservadas e as restantes em diversos estágios de degeneração, ou seja, com retração e vacuolização citoplasmática e núcleos com cromatina em diferentes graus de condensação, picnóticos e/ou em fragmentação. Nos ácinos tipo I e nos ductos excretores das glândulas estudadas não foram observadas características degenerativas. Nas fêmeas de R. (B.) microplus, as glândulas salivares degeneram assincrônica e precocemente quando comparadas a outras espécies de carrapatos. PALAVRAS-CHAVE: Rhipicephalus (Boophilus) microplus – carrapato-do-boi– glândulas salivares – histologia – histoquímica –citoquímica– degeneração- morte celular- apoptose. ABSTRACT This study describes the morphology of salivary glands of Rhipicephalus (Boophilus) microplus female ticks at beginning of feeding (24-48 hours of attachment) and semi-engorged (4-5 days of attachment) to verify the degenerative characteristics of these organs and the secretory phase in which the process begins. At beginning of feeding, secretion granules had been observed only in the cytoplasm Capítulo 2 Erika Takagi Nunes 39 of cells b, c1, c2, c4 (type II acinus) and d (type III acinus), as well as large nuclei with regular and preserved morphology. In the semi-engorged females the acini presented rare normal cells, few partially preserved ones, and the remaining ones in several stages of degeneration, that is, with retraction and cytoplasmic vacuolization, and nuclei with chromatin in several stages of condensation, picnotic and/or in fragmentation. In type I acinus and in the excretory ducts of the studied glands, at both feeding stages, it was not observed any degenerative characteristic. In females of R. (B.) microplus, the salivary glands degenerate asynchronically and precociously when compared to those of other tick species. KEY WORDS: Rhipicephalus (Boophilus) microplus – cattle-tick – salivary glands – histology – histochemistry – cytochemistry– degeneration- cell death- apoptosis. Capítulo 2 Erika Takagi Nunes 40 INTRODUCTION The tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus, synonymy of Boophilus microplus (Murrel & Barker, 2003) is the major bovine ectoparasite in Brazil and it is one of the principal causes of the great economical losses to cattle breeding. Blood diseases, bite stress, allergic reactions to the tick´s saliva, hide damage, infection with Babesia and Anaplasma, anorexia and death are all consequences of the tick parasitism (Brossard & Wikel, 1997). Salivary glands and their secretions play a vital role during tick-host interaction since they are organs responsible for the tick fluid homeostasis, and for the secretion of molecules with pharmacological properties that evade the host defense mechanisms (Ribeiro, 1995). Moreover, they are also the main transmission route for pathogenic organisms (Sauer et al., 1995; Nunes et al., 2005). These organs present functional and structural changes, which are determined by the physiological stage of the tick. Thus, they show during the pre- fixation phase massive acini, secretory cells with granules of cytoplasmic secretion and large nuclei (Schumaker & Serra-Freire, 1991), following afterwards a gradual regression with morphological and structural changes including autolysis (Fawcett et al., 1986). According to studies accomplished by Till (1961), as soon the engorgement phase is completed the salivary glands of ticks suffer a reduction of size (in argasids) or they degenerate (in ixodids), however, the knowledge concerning how these changes happen in their life-cycle is still scarce. Despite of the knowledge regarding the function of the salivary glands, few studies were performed, especially those ones focusing specifically in the changes that happen during the secretory cycle of R. (B.) microplus. Recently, Nunes et al. (2005) affirmed that salivary glands of R. (B.) microplus female ticks already show degenerative process at semi-engorged stage. Hence, the object of present work is to verify the possible morphological alterations that point the degenerative process in Capítulo 2 Erika Takagi Nunes 41 the salivary glands of females of this tick species during the early feeding stage and when they are semi-engorged to presume the feeding-point that this event starts. MATERIAL AND METHODS Forty adult females of Rhipicephalus (Boophilus) microplus ticks parasitizing Bos taurus cattle at the Faculty of Agrarian and Veterinary Sciences / UNESP – Jaboticabal, S.P., Brazil, being 20 at early stage of feeding and 20 semi-engorged ones have been used for this work. In this study, we considered females at the beginning of feeding stage (24-48 hours of attachment) those whose weigh was lower than 0.03g, and partially fed (4-5 days of attachment) whose weigh was around 0.13g ad 0.25g. Equipment in the Histology Laboratory of the Biology Department at the Bioscience Institute, UNESP – Rio Claro, SP, Brazil, was utilized throughout the study. The salivary glands of individual ticks kept at refrigeration (4ºC) for thermal shock anesthesia were removed in saline solution (NaCl 7.5 g/L, Na2HPO4 2.38 g/L and KH2PO4 2.72 g/L; pH 7.2) and utilized in the following techniques: -Scanning Electron Microscopy (SEM) The salivary glands were fixed in Karnovsky solution for 24h and dehydrated in a graded 70-100% acetone series. The material was processed by critical point drying, sputtered with gold and examined in a PHILLIPS 505 SEM. -Stain Exclusion Technique The salivary glands were kept in stain (0.001g of Nile blue stain in 10mL of saline solution) for 30 minutes, at room temperature. Afterwards, they were washed in distilled water twice, fixed in 9:1 v/v mixture of 10% neutral buffered formalin and acetone for one hour and thirty minutes and then, they were set with glycerinated gel. Capítulo 2 Erika Takagi Nunes 42 -General Morphology The salivary glands were fixed in 9:1 v/v mixture of 10% neutral buffered formalin and acetone (pH 7-7.4) at 4ºC for one hour and thirty minutes, and then dehydrated in a graded 70-95% ethanol series. The inclusion was performed in Leica resin and the polymerized blocks were sectioned with a dry glass knife. The sections of 5µm thickness were collected and placed afterwards on glass slides and stained with Hematoxylin and Eosin. For the following two techniques, the glands were fixed in alcohol and acetic acid in the proportion of 3:1 for 12 minutes, then dehydrated and embedded in resin. -Cytochemical Techniques Feulgen Reaction: The slides were kept at HCl 1N (60ºC) solution for 11 minutes, then washed in distilled water and submitted to Schiff reactive for one hour in darkness. The slides were counter-stained with Eosin for 5 minutes. Toluidine Blue Technique: The slides were kept in 0.025% Toluidine Blue solution in McIlvane buffer (pH 4.0) for 20 minutes; afterwards, on they were washed in distilled water and set in Permount. The material obtained for the light microscopy techniques was analyzed and photographed in a Zeiss photomicroscope. RESULTS Scanning Electron Microscopy (SEM) The employment of SEM technique has shown that the salivary glands of semi engorged females are significantly larger when compared to the glands of those at beginning of feeding stage (Figs. 1A, 1B). Capítulo 2 Erika Takagi Nunes 43 It is possible to observe details of superficial alterations of granular acini (larger ones) of the glands in semi-engorged specimens (Fig. 1B), which present folds and/or re-entrance. These irregularities are not observed in acini of glands from females at beginning of feeding stage, once these keep their homogeneous aspect (Fig. 1A). The type I acini and the excretory ducts from individuals at both feeding stages present themselves preserved. Stain Exclusion Technique The application of such technique demonstrates that the acini of salivary glands of individuals at both feeding stages react differently to the stain (Figs. 1C, D, E and F). In females at the beginning of feeding the majority of acini is efficient for the stain exclusion, suggesting that the most part of their cells are active and/or in early stage of degeneration showing a more transparent aspect when compared to semi- engorged females (Figs. 1C, D). In the semi-engorged stage, some acini of the salivary glands exclude the stain (Fig. 1E) while others retain it displaying it as blue granules as shown the detail in the Figure 1F, demonstrating the asynchrony of cell activity among the different acini along the process. In addition, inside the same acini, there are cells with a larger accumulation of stain (Fig. 1F), showing that different cells vary in the ability of its exclusion, that is, among the active ones there are others whose membrane ion bomb probably are not functioning any longer. Histology of the Salivary Glands By using the Hematoxylin-Eosin technique it was possible to identify the three types of acini in salivary glands of early feeding stage individuals (Figs. 2A, B, C and D). The type I acini (agranular) do not show characteristics of cell degeneration in the two feeding stages here studied. The cell’s cytoplasm presents a fine Capítulo 2 Erika Takagi Nunes 44 granulation and the nuclei, inherent and some located at the periphery present a round morphology with non-condensed chromatin (Figs. 2A, E). At the beginning of feeding stage, the presence of secretion granules in the cytoplasm of cells b, c1, c2 and c4 (type II acini) and d (type III acini), made possible the identification of these different types of cells (Figs. 2B, C, and D). The nuclei of these cells, despite their integrality and disperses chromatin, which are indicative of activity, suffer size increase. In c2cells, the granules present their central part more strongly stained by eosin being probably at early stage of maturation (Fig. 2C). In semi-engorged females, there are partially preserved acini with some cells with evident granulation, coexisting with others cells in degeneration that are characterized by the presence of nuclei showing a range of alterations that goes from little morphological ones to completely picnotic nuclei and/or fragmented ones (Figs. 2F-K). Among the semi-preserved type II acini, it is still possible to identify the cells: a, b, c2 and c3. The a cells present secretion, but not in granules, and picnotic nuclei (Fig. 2F). There is a huge quantity of dispersing granules in the cytoplasm of the b cells and the nuclei of them are irregular with extremely condensed chromatin and in beginning of the fragmentation process (Fig. 2G). The apical portion of c2 cells has a concentration of smaller and matured birefringent granules; the nuclei are irregular and with disperse chromatin (Fig. 2H). The c3 cells, still full with secretion granules of several sizes, however smaller than those ones in c2 cells, present very dilated and irregular nuclei with non-condensed chromatin (Fig. 2F). Together with the anterior cell types above described, cells without secretion granules are observed in the same acini, whose nuclei can be dilated, irregular and/or picnotic and which now cannot be identified. In the salivary glands of semi-engorged females, some partially preserved type III acini are presented. Their d cells are small, located close to the excretory duct and containing only remains of secretion; there is nuclear picnosis. The f cells, larger than the d ones, have in the cytoplasm a finely granular material also observed in the lumen of the acinus; their nuclei appear to be preserved. Among the secretory cells of the type III acinus, interstitial epithelial cells whose apical portion is projected Capítulo 2 Erika Takagi Nunes 45 towards the lumen of the acinus are observed. Together, epithelial and secretory cells delimitate a wide lumen (Fig. 2I). In the semi-engorged stage, there are acini that cannot be identified due to the degeneration and consequent absence of granulation. They present cells with irregular nuclei and in fragmentation process (Fig. 2J). Others, at more advanced stages of degeneration, exhibit extensive cytoplasmic retraction areas and intensive vacuolization. Preserved nuclei are no longer observed (Fig. 2K). Cytochemistry of Salivary Glands The Feulgen and Toluidine Blue cytochemical techniques show details of the structural organization regarding the nuclei of cells that comprise the acini types I, II, and III (Figure 3). The Toluidine Blue staining shows that the nuclei of all the cells of the three acini types of R. (B.) microplus salivary glands are orthochromatic ones, that is, they present blue staining independently of the feeding stage. In the salivary glands from females at the beginning of feeding stage, the nuclei of secretory cells are large and, most of the times, they showed a preserved morphology, mainly the types I and II acini (Figs. 3A, B, C and D). Cells with smaller nuclei and little dilated besides the evidenced nucleoli are also observed in the acinus II (Fig. 3C). In the type III acinus the nuclei assume a flattened shape and presenting a lower blue-staining. Few cells in region of the insertion of the acinar ductule have irregular, smaller and condensed nuclei, however they are orthochromatic ones (Figs. 3E and F). In semi-engorged female glands, all the type I acini and some of type II and III find themselves partially preserved containing secretory cells with very dilated and orthochromatic nuclei (Figs. 3G, H, I and J). In the type I acini, the nuclei are spherical (Figs. 3G, H) while some cells of the types II and III acini present irregular nuclei and an evidenced nucleoli (Figs. 3I, J). However, several types II and III acini present cells with degeneration characteristics where the chromatin are more condensed and in a marginalization process, surrounding the nuclear envelope, or in Capítulo 2 Erika Takagi Nunes 46 fragmentation (Figs. 3K, L). In some acini, the total degeneration is observed remaining only few nuclear fragments among the retracted and vacuolated cytoplasmic mass (Figs. 3M, N). Capítulo 2 Erika Takagi Nunes 47 FIGURES FIGURE 1: SEM and total set of female’s salivary glands belonging to the species R. (B.) microplus. A. General aspect in individuals at the beginning of feeding-stage. B. General aspect in semi-engorged individuals showing the alterations at the surface of the granular acini (ga). C-F. Total set and the staining by Stain Exclusion Technique using Nile blue. C. D. Females at the beginning feeding-stage E. F. Semi-engorged females. a=acinus, I= type I acinus, ad= acinar ductule, id= intermediate duct, ecd= excretory common duct. Bars: A-B= 1mm , C-E= 10µm, D-F=20µm Capítulo 2 Erika Takagi Nunes 48 FIGURE 2: Histological sections of the acini I, II, III of salivary glands of R. (B.) microplus females A-D. Females at beginning of feeding-stage. Note the presence of granules of secretion in the cells (b, c1, c2 and d) and dilated nuclei (dn), however with regular morphology still. E-K. Semi-engorged females evidencing in: E, H and I, nuclei with regular morphology (n); F, G, H and I, picnotic nuclei (pn); J, nuclei in fragmentation process (fn) and in K, cytoplasmic vacuolization (v). F-I. Semi- preserved cells with granules of secretion (b, c2, c3 e f), a cells and d cells with secretion remains and f cell with finely granular material. ed= excretory duct, ec= interstitial epithelial cells, lu= lumen. H-E Stain. Bars:A-K=20µm Capítulo 2 Erika Takagi Nunes 49 FIGURE 3: Histological sections of salivary glands of R. (B.) microplus females stained by Toluidine Blue and submitted to the Feulgen reaction. A -F. Females at beginning of feeding-stage. Note the presence of dilated nuclei, however with regular morphology still (n) in A and B (type I acinus) and in C and D (type II acinus). In E and F, type III acinus demonstrating cells with irregular nuclei (in) delimiting a larger lumen (lu). G-N. Semi-engorged females. G-H. Type I acini with cells without morphological alterations. I-J. Partially preserved acini II, with cells of irregular nuclei, dilated (dn) and evident nucleolus (nu). K-L. Cells under degeneration presenting chromatinic marginalization (cm), fragmented (fn) and condensed nuclei (cn). M-N. Acini with cells at advanced stages of degeneration, where can be observed the cytoplasmic retraction (arrow) and fragments of nuclei (fn), ed=excretory duct. Bars: A-N=20µm. Capítulo 2 Erika Takagi Nunes 50 Capítulo 2 Erika Takagi Nunes 51 DISCUSSION The morphological, cytochemical and histochemical analyzes here performed demonstrated that the salivary glands of females of Rhipicephalus (Boophilus) microplus are organs that pass through great modifications during the feeding period in the host. The SEM technique has shown that the type I acini of R. (B.) microplus possess a smaller size when compared to type II and III acini, as mentioned in the literature (Binnington, 1978). The histological results corroborate with the ones anteriorly found by Binnington (1978) for the same species, which observed in type I acini the presence of central cell with a large nucleus and other pheripherical cells with fibrilar cytoplasm without granules of secretion and smaller nuclei. Furthermore, according to this author, there was detected no morphological change during the entire period of feeding. In an opposite way, Barker et al. (1984) and Needham et al. (1983), in studies performed with salivary glands of Amblyomma americanum observed significative changes in the diameter of type I acini during the feeding of ticks. In granular acini (types II and III) of glands from females of R. (B.) microplus at beginning of feeding stage, it was possible to identify some cells (b, c1, c2, c4, and d) according to Binnington (1978) classification who worked with the same tick species and described the different sizes and histochemical properties of the granules of each cell type. This author affirmed that after approximately 72 hours of feeding, the type II and III acini suffer remarkable changes such as reduction (a cell) and/or size improvement of the cell, loss of cytoplasmic granulation and nuclear morphology alteration. Likewise the a cell (type II acinus) the cells d and e (type III acinus), anteriorly with pyramidal form and full of granules, become flattened forming a fine lay of cells around the wide lumen. In females at beginning of feeding stage here studied similar morphological results were found, although in a lower time of attachment, as well as in some partially preserved acini from those semi-engorged females. Capítulo 2 Erika Takagi Nunes 52 Beyond these characteristics, in the present study, the a and d cells have presented nuclei with condensed chromatin pointing a possible and precocious loss of function related according to Chinery (1973) to the cement production during the first hours of fixation. In our laboratory, we verified that the d, e and f cells of type III acinus present replete of secretion granules in the salivary glands of Rhipicephalus sanguineus females at two days of feeding (Furquim, personal communication), unlike the results found to R. (B.) microplus who had already lost all of these cells granulation at both stages here studied. The presence of interstitial epithelial cells associated to the granular acini in R. (B.) microplus had been already observed by Binnington (1978) and also for the species Dermacentor andersoni (Meredith & Kaufman, 1973) and A. cajennense (Serra-Freire & Olivieri, 1992); these ones would be involved in the control of water and ions concentration in the individual during the engorgement process. Thus, they were developed and could be observed in the semi-engorged females in the species here studied. The several studies regarding salivary glands of ticks accomplished by different authors have been mainly focusing on the question concerning the degeneration process, in attempt to a better understanding of the physiology of such organs. Walker et al., in 1985, studied the structural changes that happen in salivary glands of R. appendiculatus during the feeding process and they verified that the autolysis of all acini began in the detachment moment of the tick from its host. L’Amoreaux et al. (2003) studying the salivary glands of D. variabilis in the searching for programmed cell death characteristics have observed that on the third day after the detachment of the individuals from their host, there were not signs of nuclear fragmentation in the cells of the different acini, however, on the fifth day, the apoptotic cells were already detected and the type III acinus was the most affected one. This work with females of R. (B.) microplus has demonstrated also a higher quantity of type III acini on degeneration process corroborating the results with the ones found to D. variabilis. Capítulo 2 Erika Takagi Nunes 53 In front of the available data on the literature regarding ixodids, the present study brings unpublished results that show when begins the process of degeneration of the salivary glands in R. (B.) microplus. The females with 4-5 days of attachment show already signals of cell death in these structures before even the ticks’ detachment from their host. However, the literature regarding the ixodids in general affirms that the process of degeneration only starts after the tick engorgement and consequent detachment. Some authors that investigated the physiology of ixodids salivary glands suggest that there was no significative difference in the time of degeneration of these structures in the genus Amblyomma and Dermacentor (Kaufman, 1976). This present study allows us to verify the existence of temporal variations regarding the beginning as well as the length of this event and the fact that they are specific-species. According to L’Amoreaux et al. (2003) on 33rd day after the detachment of the tick, that is at the end of the oviposition period, the salivary gland was totally degenerated being possible to observe the nuclei of excretory ducts cells and some apoptotic nuclei probably from the cells of type I acini. Studies performed by Harris & Kaufman (1984) has shown that salivary glands of semi-engorged females of A. hebraeum are able to degenerate in a period of between 24 - 48 hours if they are removed from the host after they had reached a “critical weight” (approximately 300 mg for this species). However, according to Kaufman & Lomas (1996), this process probably begins after the detachment of the tick. Other authors, although, registered that the salivary glands would degenerate only when the females reached the replete weight (and not the critical one) and this event would be completed in a period of four days after the detachment of the tick from its host (Sauer et al., 2000). Based on the terminology “critical weight” adopted by Harris & Kaufman (1984) the present study with semi-engorged females of R. (B.) microplus, demonstrates that in this tick species the weight varies around 130 to 250 mg. Besides, according to Lomas & Kaufman (1992) a protein in the spermatophore transferred to the female during the copulation hastening the secretion of hormonal ecdysteroid which is responsible for salivary gland degeneration. Thus, at this feeding stage, Capítulo 2 Erika Takagi Nunes 54 probably the females had already mated and this event would have stimulated the start of the degeneration process of the salivary glands. The application of Feulgen reaction in glands removed from females of R. (B.) microplus at both feeding stages has evidenced some cells with nuclei presenting compacted chromatin, especially those already in degeneration process. These same cells when submitted to Toluidine Blue stain, substance that binds to the phosphate groups of DNA, would present metachromatic nuclei, that is, a greenish stain, once the phosphate groups are binded to the histones, therefore, inaccessible to the molecules of the stain. Our results reveal, in an opposite way, the presence of orthochromatic nuclei. Similar results were found in larvae silk glands of Apis mellifera by Silva-Zacarin (2003). According to her, a possible DNA cleavage would cause the exposition of the histones which during the fixation process of the material (ethanol: acetic acid) would be extracted, making the phosphate groups available for binding to the stain. The types of cell death described until the present days involve processes widely studied in insects. It has been demonstrated that in silk glands of bees the process of vacuolization and loss of cytoplasmic volume is started after the releasing of the product of secretion, allowing additionally the observation of the picnotic nuclei (Cruz-Landim & Silva de Moraes, 2000). This process starts at the posterior region and progresses to the anterior region of the gland until it reaches the secretory tubules (Cruz-Landim & Melo, 1981; Silva & Silva de Moraes, 1999). These same characteristics were observed in the tick species here studied, where the degeneration does not happen simultaneously along the entire salivary gland. Furthermore, it makes clear that the granular acini (more distal ones) are the first ones to degenerate and the excretory ducts are the last structures to be reached by the process, corroborating to L’Amoreaux et al. (2003). Still regarding the insects, an important aspect concerning the mechanism of cell death is the way the cell glands are affected by the process; the cell glands are not affected in the same way nor concomitantly by such process meaning that in the same gland can be present active and inactive cells (Cruz-Landim, 1997; Silva de Moraes, 1998; Cruz-Landim et al., 1999). According to the results here obtained, it is evidenced that in semi-engorged females not all cells of the granular acini incorporate Capítulo 2 Erika Takagi Nunes 55 the Nile blue stain, pointing therefore the functional asynchronism. However, Silva de Moraes (1998) points out that not only living cells exclude the stain, being apoptotic ones at least in initial stages also able to exclude it while membrane ion-bomb are still functioning. According to Bursh et al. (1990) the functional asynchronism happens in cell death via apoptosis where cells respond differently to the degeneration stimulus, coexisting in the same tissue cells at different stage of apoptosis. Such event was observed here in the salivary glands of R. (B.) microplus tick females in semi- engorged stage. Thus, the present work has shown that the degenerative process of salivary glands in females of R. (B.) microplus starts precociously if compared to other ixodids described in the literature until now (Vitzhum, 1943; Till, 1961; Walker et al., 1985; Sonenshine, 1991; Kaufman & Lomas, 1996; L’Amoreaux et al., 2003), once such organs begin to loose some of their functions while the ticks are being fed in their host, differently than other species whose degeneration is started posteriorly to the engorgement and detachment from their host. Based on the degenerative characteristics presented in this work and accepting that the cell death process is part of the ontogenetic development of the individuals, where cells are programmed to be deactivated in determined moments, it is concluded that the degeneration of the salivary glands in tick females would represent a saving of energy for the next activity, that is, the oviposition. This would avoid consequently the investment in maintenance of organs that would have lost practically all their functions. ACKNOWLEDGEMENTS This research has been supported by FAPESP (grants 02/10149-7 and 04/03252-1). The authors thank Antonio Teruyoshi Yabuki, Gerson Mello Souza, Ronaldo Del Vecchio, Cristiane Marcia Mileo and Monika Iamonte for the technical support, and Karim C. Furquim for providing valuable comments. Part of this work has been facilitated through the Integrated Consortium on Ticks and Tick-borne Capítulo 2 Erika Takagi Nunes 56 Diseases (ICTTD-3) supported by the European Union under contract number 510561-INCO. REFERENCES BARKER, D. M., OWNBY, C. L., KROLAK, J. M., CLAYPOOL, P.L., SAUER, J. R. 1984. The effects of attachment, feeding and mating on the morphology of type I alveolus of salivary glands of the lone star tick, Amblyomma americanum. Int. Journal of Parasitology, 70, 99-113. BINNINGTON, K. C. 1978. Sequential changes in salivary gland structure during attachment and feeding of the cattle tick Boophilus microplus. Int. J. Parasitol., 8: 97- 115. BROSSARD, M., WIKEL, S. K. 1997. Immunology of interactions between ticks and host. Med. Vet. Entomol., 11: 270-276. BURSCH, W., KLEINE, L., TENNISWOOD, M. 1990. Biochemistry of cell death by apoptosis. Bioch. Cell Biol., 68: 1071-1074. CHINERY, W. A. 1973. The nature and origin of the ‘cement’ substance at the site of attachment and feeding of adult Haemaphysalis spinigera (Ixodidae). Journal of Medical Entomology, 10: 355-362. CRUZ-LANDIM, C. 1997. Cell reorganization and cell death during the secretory cycle of the hypopharyngeal gland in Meliponinae bee workers (Hymenoptera: Apidae). Acta Microscopica, 6. Supl. B. Proc. XVI Meeting of the Brazilian Society for Electron Mycroscopy, p.75-78. Capítulo 2 Erika Takagi Nunes 57 CRUZ-LANDIM, C., COSTA, R. A. C., SILVA DE MORAES, R. L. M. 1999. Hypopharyngeal gland function, glandular cell senescence and gland reactivation. Proc. 4th. Intern. Hymenopterists Conference . CRUZ-LANDIM, C., SILVA DE MORAES, R. L. M. 2000. Morte celular programada em abelhas como uma forma de redirecionar a morfologia e a fisiologia adaptativa. Rio Claro. Editora e Tipografia Costa. 48pp. CRUZ- LANDIM, C., MELO, R. A. 1981. Desenvolvimento e envelhecimento de Scaptotrigona postica (Hymenoptera: Apidae). Aspectos histológicos e histoquímicos. Aciesp, v.31, São Paulo, 118p. FAWCETT, D. W., BINNINGTON, K. C., VOIGHT, W. R. 1986. The cell biology of the ixodid tick salivary gland. In: Sauer, J. R., Hair, J. A. (Eds.) Morphology, Physiology and Behavioral Biology of Ticks. Ellis Horwood, Chichester, pp.22-45. HARRIS, R. A., KAUFMAN, W. R.