UNESP – UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA CAMPUS DE ARARAQUARA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA Recuperação de níquel e outros metais a partir de diferentes fontes (rejeitos de processo industrial e pentlandita (Ni,Fe)9S8) por lixiviação bacteriana e ácida. Nury Alexandra Muñoz Blandón Araraquara 2010 2 UNESP – UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA CAMPUS DE ARARAQUARA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA RECUPERAÇÃO DE NÍQUEL E OUTROS METAIS A PARTIR DE DIFERENTES FONTES (REJEITOS MINERAIS DE PROCESSO INDUSTRIAL E PENTLANDITA (Ni,Fe)9S8) POR LIXIVIAÇÃO BACTERIANA E ÁCIDA Tese de Doutorado 2010 3 NURY ALEXANDRA MUÑOZ BLANDON RECUPERAÇÃO DE NÍQUEL E OUTROS METAIS A PARTIR DE DIFERENTES FONTES (REJEITOS MINERAIS DE PROCESSO INDUSTRIAL E PENTLANDITA (Ni,Fe)9S8) POR LIXIVIAÇÃO BACTERIANA E ÁCIDA Defesa de Doutorado a ser apresentada ao Instituto de Química – Campus de Araraquara da Universidade Estadual Paulista – UNESP, como parte dos requisitos para a obtenção do Titulo de Doutor pelo Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Orientador: Prof. Dr. Oswaldo Garcia Jr. Co-orientadora: Dra. Denise Bevilaqua. Araraquara – SP 2010 4 DADOS CURRICULARES NURY ALEXANDRA MUÑOZ BLANDÓN 1. Dados Pessoais Nacionalidade: Colombiana Naturalidade: Medellín, Antioquia Filiação: Joaquín Emilio Muñoz Quiceno Alba Ofelia Blandón Correa Estado civil: Solteira Profissão: Microbiologa Documento de identidade: RNE v4479552 Cadastro de Pessoa Física: 232.150.048-44 Endereço: Av. Itápolis 2471, Bairro Bela Vista CEP: 14800-040, Araraquara – SP e-mail: alexamb@iq.unesp.br 2. Formação Acadêmica/Titulação 2.1. Graduação Bacharel em Microbiologia, Universidad de Antioquia – UdeA, Medellín, Colômbia. Concluído em agosto de 1996. 2.2. Pós-graduação Mestrado em Biotecnologia, Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín – UNALMED, Medellín, Colômbia. Concluído em 2002. 3. Produção Bibliográfica 3.1. Trabalhos publicados/submetidos a periódicos mailto:alexamb@iq.unesp.br 5 Muñoz A., Montoya O., Márquez M., Ruiz O., Lemehsko V. Evaluación de oxidación bacteriana de sulfuros com Acidithiobacillus ferrooxidans mediante pruebas de FTIR y difracción de rayos X. Revista Colombiana de Biotecnología, v. V (1), p. 73-81. 2003. MUÑOZ, A.; BEVILAQUA, D.; GARCIA JUNIOR, O. Leaching of Ni and Cu from mine wastes (tailings and slags) by acid solutions and by A. ferrooxidans. Advances Materials Research, v. 71-73, p. 425-428. 2009. 3.2. Trabalhos publicados em congressos MUÑOZ, A.; BEVILAQUA, D.; GARCIA JUNIOR, O. Leaching of Ni and Cu from mine wastes (tailings and slags) by acid solutions and by A. ferrooxidans. In International Biohydrometallurgy Symposyum IBS 2009, 18th, 2009, Bariloche. Proceedings... Zurich: Trans Tech Publications Ltd, 2009. p 425-428. MUÑOZ, A.; BEVILAQUA, D.; GARCIA JUNIOR, O. Bioleaching of Ni and Co from mine wastes: slags and flotation tailings. In Conference on Environmental and Mineral Processing,13th, 2009, Ostrava. Proceedings...Ostrava. p. 27-30. MUÑOZ, A.; BEVILAQUA, D.; GARCIA JUNIOR, O. Comparative study on the nickel bioleaching of mine wastes (slag and tailings). In: ALTA 2010 Nickel/Cobalt/Copper Conference, 2010, Perth. Proceedings... 3.3. Participação em eventos - II Simpósio de Microbiologia Aplicada. UNESP- Rio Claro. Brasil. 2007. - XV Jornadas de Jóvenes Investigadores de la Asociación de Universidades Grupo Montevideo. Universidad de La Asunción. Paraguay. 2007. - VII Curso Latinoamericano de Biotecnologia y XXXVIII Curso Internacional de Ingeniera Bioquímica. Universidad Católica de Valparaiso. Chile. 2008. - II Workshop Internacional de Microbiologia Ambiental. Universidade Tiradentes. Sergipe, Brasil. 2008. - 13th Conference of Mineral Processing and Environment & Exhibition. University of Ostrava. República Checa. 2009. - 18th International Biohydrometallurgy Symposyum, Bariloche, Argentina. 2009. - ALTA 2010 Nickel/Cobalt/Copper Conference, Perth, Australia. 2010. 6 3.4. Outros Premio. 2do melhor poster em: VII Curso Latinoamericano de Biotecnologia y XXXVIII Curso Internacional de Ingeniera Bioquímica. Universidad Católica de Valparaiso. Chile. 2008. Estágio. Estágio durante 6 meses no laboratório de Biotecnologia Aquatica do Biofilm Center da Universidade Duisburg-Essen com o Prof. Dr. Wolfgang Sand. Bolsa de curta duração do DAAD, 2009. Revisão de paper para a revista Hydrometallurgy, 2010. 7 AGRADECIMENTOS A minha família, especialmente meus pais pelo apoio sempre incondicional. A COLFUTURO, pela bolsa concedida para iniciar o doutorado. Ao Prof. Dr. Oswlado Garcia Júnior e à Dra. Denise Bevilaqua, por me aceitar aqui, pelo voto de confiança, pelas orientações, pelo tempo que me dedicaram. A meus colegas de laboratório: Ana Paula, Wanessa, Fabiana, Gustavo, Waldenir, Pricila, Robson, Marcelo, Robson, Daniel e Mauricio, pela amizade e parceria, por tanta ajuda que me ofereceram. Por me ensinar português!! À Jéssica, Claire, Miguel e Simone meus amigos de casa, por tantas risadas juntas, pelas confidencias, por tantos momentos bons. Ao Flávio Soares, meu melhor amigo brasileiro, por tanta ternura, carinho, apoio e dedicação, por meus melhores momentos no Brasil e especialmente por ter me ensinado tanto como pessoa. Ao Instituto de Química, especialmente às “meninas” da PG, Sandra, Célia, Patricia, Vania, pela paciência e colaboração. Aos membros da banca pelas correções e sugestões para melhorar este trabalho. Ao CNPq pela bolsa concedida para terminar o doutorado. À VOTORANTIM METAIS pelo apoio técnico e financeiro. 8 RESUMO Uma possibilidade para a recuperação de metais a partir de minerais com baixos teores ou de rejeitos industriais é a utilização da lixiviação com micro- organismos. A biolixiviação é o processo de oxidação bacteriana de sulfetos metálicos contendo metais de valor (por exemplo, níquel, cobre ou zinco), os quais são liberados para a solução, seguida da recuperação por técnicas metalúrgicas convencionais. Estudos de biolixiviação de concentrados de sulfetos minerais em tanques agitados e, sobretudo em pilhas, têm sido desenvolvidos em escala piloto e comercial. Entretanto, poucos trabalhos têm sido realizados sobre o aproveitamento de rejeitos minerais de processos convencionais, tais como flotação ou fusão em forno “flash”, por rotas biotecnológicas. O objetivo deste trabalho foi recuperar níquel e cobre de rejeitos industriais, provenientes de processo de flotação e de fusão, utilizando bactérias, especialmente da espécie Acidithiobacillus ferrooxidans ou pelo uso de soluções ácidas, em escala de laboratório. Também foram realizados experimentos de biolixiviação de um sulfeto de níquel (pentlandita) para avaliar o processo de solubilização do metal. Conjuntamente, outros experimentos foram realizados com a finalidade de se obter novas linhagens isoladas a partir destes rejeitos minerais. Suas diferenças fisiológicas foram avaliadas. A partir dos experimentos com os rejeitos encontrou-se que com a escória foi possível obter 13% de níquel e 8 % de cobre em solução após 14 dias de lixiviação biológica. Com soluções ácidas, em pH 0,5 e 1,0, as recuperações foram de 56% de níquel e 24% de cobre em pH 0,5 enquanto que em pH 1,0 as concentrações foram de 21% e 12% de niquele e cobre, respectivamente. Para a recuperação de níquel e cobre deste rejeito sugere-se a lixiviação ácida e não bacteriana. Com a lama as porcentagens de recuperação dos metais foram de 23% e 16% de níquel e cobre com as soluções ácidas em pH 0,5 e 1,0 enquanto que após 14 dias de lixiviação bacteriana as concentrações em solução foram de 46% e 17% de níquel e cobre, respectivamente. Com estes resultados foi observado que o rejeito da lama pode ser tratado com lixiviação bacteriana para uma maior recuperação dos metais. Os estudos de biolixiviação do sulfeto de níquel com diferentes espécies bacterianas só atingiram 20% da concentração de níquel em solução após 30 dias de processo. Esta baixa recuperação de níquel, a partir do minério pode ser 9 explicada pela composição do mesmo e pela química das reações que ocorrem durante a lixiviação. Diferentes linhagens de Aciditiobacillus ferrooxidans foram obtidas a partir dos rejeitos tratados neste trabalho. Cada uma das linhagens apresentou uma morfologia de colônia diferente e respostas também diversas para os testes de avaliação fisiológica, confirmando a diversidade fenotípica desta espécie bacteriana. Palavras chaves: A. ferrooxidans, Biolixiviação, rejeitos minerais, pentlandita 10 ABSTRACT Bacterial leaching is a feasible to recover metals from minerals with low grade or from mine wastes using microorganisms. The bioleaching process is the bacterial oxidation of valuables metals bearing sulphide minerals (e.g. nickel, copper or zinc), which are released to the solution, followed by conventional recovered by metallurgical techniques. Studies on bioleaching of sulphide minerals concentrates in stirred tanks and, particularly, in heaps, have been developed on pilot and commercial scales. However, few studies have been undertaken on using of mineral wastes from conventional processes such as flotation or flashing smelting through biotechnological routes. This work aims at recovering nickel and copper from industrial wastes such as flotation tailings and slag using bacteria, especially Acidithiobacillus ferrooxidans species, or using acid solutions at laboratory scale. Experiments were also accomplished for nickel sulfide bioleaching to evaluate the metal dissolution process, for comparison purpose. Other experiments were also carried out to obtain new strains isolated from mineral waste to study the physiological differences between them. After 14 days of bioleaching of slag it was possible to extract 13% of nickel and 8% of copper in solution while with acid solutions the extractions were 56% of nickel and 24% of copper at pH 0.5 and 21% and 12% at pH 1.0, respectively. For the metals solubilization from the slag it is suggested the acid leaching instead of bioleaching. With the flotation tailings the recoveries of nickel and copper were 23% e 16% at pH 0.5 or 1.0 while after 14 days with bioleaching the concentrations in solution were 46 % and 17% for nickel and copper. These results show that the flotation tailings can be treated with biological leaching for a higher recovery of metals. The studies of nickel sulfide bioleaching with different bacterial species reached only 20% of the concentration of nickel in solution after 30 days of process. This low recovery of nickel from the ore can be explained by the mineralogical composition and the chemical reactions that occur during leaching Different strains of Aciditiobacillus ferrooxidans were obtained from the waste treated in this work. Each of the strains had different colony morphology and also different responses to physiological tests confirming the phenotypic diversity of bacterial species. 11 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Variação do preço do níquel no mercado durante os últimos 5 anos. 23 Figura 2. Variação do preço do cobalto no mercado durante os últimos 5 anos. 25 Figura 3. Variação do preço do cobre no mercado durante os últimos 5 anos. 26 Figura 4. Esquema resumido do processo de recuperação de metais. 33 Figura 5. Difratogramas das amostras originais de escória e da lama utilizadas nos ensaios de biolixiviação. 51 Figura 6. Consumo de oxigênio de A. ferrooxidans-LR na presença de 100 mg de rejeito: lama original; lama moída; escória original; escória moída. 53 Figura 7. Variação do pH e potencial de óxido-redução nos experimentos de biolixiviação da escória (frascos agitados). 54 Figura 8. Extração de níquel e cobre nos sistemas de biolixiviação da escória (frascos agitados). 55 Figura 9. Difração de raios X dos sólidos da escória após 14 dias de biolixiviação. 56 Figura 10. Lixiviação ácida da escória realizada em pilha. 59 Figura 11. Sistema estático em bandeja com escória. 60 Figura 12. Lixiviação ácida da escória estático (béquer). 61 Figura 13. Variação do pH e potencial redox nos experimentos com lama. 62 Figura 14. Extração de níquel e cobre nos experimentos com lama. 62 Figura 15. Difração de raios X dos sólidos da lama após 14 dias de 12 biolixiviação. 64 Figura 16. Variação do pH e Eh nos experimentos com lama (50 dias) 66 Figura 17. Extração de níquel e cobalto nos experimentos com lama (50 dias). 66 Figura 18. Difração de raios X dos sólidos após 50 dias de biolixiviação. 68 Figura 19. pH e Eh da biolixiviação da lama em um sistema estático. 69 Figura 20. Solubilização de níquel e cobalto a partir da lama em sistema estático 70 Figura 21. pH e Eh de lama em sistema estático com adição de ácido sulfúrico numa concentração 1,25 mol L-1. 71 Figura 22. Solubilização de níquel e cobalto a partir da lama em sistema estático com adição de ácido sulfúrico 1,25 mol L-1. 71 Figura 23. DRX da amostra original e após a lavagem com EDTA-NaOH 73 Figura 24. Variação do pH nos experimentos de biolixiviação de pentlandita. 74 Figura 25. Solubilização de níquel, cobre, magnésio e sulfato nos experimentos de biolixiviação de pentlandita. 75 Figura 26. DRX dos resíduos sólidos após 30 dias de lixiviação biológica e abiótica. 76 Figura 27. Variação do pH e Eh nos experimentos de perda de metais. 79 Figura 28. Extração de níquel e cobre nos experimentos de perda de metais. 80 Figura 29. Extração de níquel e cobre nos experimentos de perda de metais sem adição do metal. 81 Figura 30. DRX dos sólidos após o ensaio de perda de metais com pirrotita e pentlandita mais 1 g L-1 de níquel ou cobre. 82 Figura 31. Variação do pH e Eh nos experimentos de biolixiviação de 13 pentlandita. 83 Figura 32. Extração de níquel e cobre nos experimentos de biolixiviação de pentlandita. 84 Figura 33. Solubilização de ferro total nos experimentos de biolixiviação de pentlandita. 86 Figura 34. DRX dos resíduos sólidos após 30 dias de lixiviação biológica e abiótica. 87 Figura 35. Colônias crescidas em meio T&K pH 1,8-agarose a partir dos diferentes rejeitos. 91 Figura 36. Fotografias em detalhe das colônias obtidas a partir dos cultivos de ferro ferroso em meio sólido T&K-agarose. 92 Figura 37. Produtos da amplificação do DNA em gel de electroferese com a técnica de DGGE. 95 Figura 38. Consumo de oxigênio das linhagens isoladas comparadas com linhagens de coleção (LR e ATCC) a diferentes temperaturas (30, 35 e 45°C). 97 Figura 39. Porcentagem de oxidação de ferro ferroso em diferentes valores de pH (1,4 – 1,8 – 2,2) 99 Figura 40. Consumo de oxigênio das linhagens isoladas comparadas com a linhagem de coleção A. ferrooxidans–LR em lama ou escória como substratos. 100 Figura 41. Consumo de oxigênio das linhagens isoladas comparadas com a linhagem de coleção A. ferrooxidans–LR em pentlandita, pirita ou calcopirita como substratos. 101 Figura 42. Porcentagens de oxidação de ferro ferroso das linhagens isoladas comparadas com a cepa de coleção LR em presencia de diferentes concentrações de níquel. 102 Figura 43. Porcentagens de oxidação de ferro ferroso das linhagens isoladas comparadas com a cepa de coleção A.f-LR em presencia de diferentes concentrações de cobalto. 106 Figura 44. Porcentagens de oxidação de ferro ferroso das linhagens isoladas comparadas com a cepa de coleção At.f-LR em presencia de diferentes concentrações de cobre. 107 Figura 45. Variação do pH e potencial redox das biolixiviações de lama 14 e escória. 109 Figura 46. Porcentagens de extração de Ni e Co a partir de lama e escória. 110 15 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Descrição dos diferentes tratamentos da biolixiviação de escória ou lama. 37 Tabela 2. Descrição dos diferentes tratamentos da biolixiviação da lama. 39 Tabela 3. Meios líquidos utilizados no enriquecimento de microorganismos acidófilos oxidantes de ferro e enxofre. 40 Tabela 4. Meio sólido T&K-agarose. 46 Tabela 5. Meio sólido com tiossulfato para bactérias oxidantes de enxofre. 47 Tabela 6. Concentrações dos elementos escolhidos para o teste de resistência. 49 Tabela 7. Concentração de níquel, cobalto e cobre nos rejeitos (%). 50 Tabela 8. Porcentagens de extração de níquel e cobre depois de lixiviação química. 52 Tabela 9. Porcentagens de extração após 14 dias de biolixiviação da escória em frascos agitados. 56 Tabela 10. Porcentagem de recuperação dos metais Ni, Cu e Co em cada pilha ácida e seu correspondente consumo de ácido 59 Tabela 11. Porcentagens de extração após 14 dias de biolixiviação da lama. 63 Tabela 12. Porcentagens de extração de níquel e cobre depois da lixiviação bacteriana agitada. 65 Tabela 13. Porcentagens de extração de metais após 50 dias de biolixiviação da lama 67 Tabela 14. Porcentagens de extração de níquel e cobalto nos sistemas 16 estáticos com lama após lixiviação bacteriana. 72 Tabela 15. Descrição das colônias crescidas em meio sólido a partir dos diferentes rejeitos. 90 Tabela 16. Identificação presumível de microorganismos acidófilos oxidantes de ferro baseada na morfologia de colônia 93 17 SUMÁRIO RESUMO ABSTRACT INTRODUÇÃO 19 OBJETIVOS 20 1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 21 1.1 Metais de interesse: níquel, cobalto e cobre. 21 1.1.1 Níquel 21 1.1.2 Cobalto 23 1.1.3 Cobre 25 1.2 Mecanismos de biolixiviação 26 1.3 Processos biotecnológicos de lixiviação de metais 28 1.3.1 Biolixiviação de montes 29 1.3.2 Biolixiviação/Bioxidação em pilhas 29 1.3.3 Biolixiviação/Bioxidação em tanques agitados 31 1.4 Solubilização de metais a partir de rejeitos minerais 31 1.5 Solubilização de níquel e cobre a partir de minério natural 34 1.6 Micro-organismos relevantes à extração de metais 34 2. MATERIAIS E MÉTODOS 36 2.1 Solubilização de níquel, cobre e cobalto a partir de rejeitos minerais 36 18 2.2 Solubilização de níquel e cobre a partir de minério natural 40 2.3 Isolamento de micro-organismos a partir de rejeitos minerais 44 3. RESULTADOS E DISCUSÃO 50 3.1 Solubilização de níquel, cobre e cobalto a partir de rejeitos minerais 50 3.2 Solubilização de níquel, cobre e cobalto a partir de minério natural 75 3.3 Isolamento de microorganismos a partir de rejeitos minerais 89 3.3.1 Estudos de biolixiviação de lama e escória com consorcio de cepas isoladas 108 3.3.2 Isolamento de micro-organismos oxidantes de enxofre 110 4. CONCLUSÕES 111 5. REFERENCIAS 117 19 INTRODUÇÃO GERAL O uso de micro-organismos em hidrometalurgia para a solubilização de metais como cobre, urânio e níquel, a partir de minérios de baixos teores ou de concentrados minerais (denominado bio-lixiviação) e como pré-tratamento de sulfetos na extração de ouro e prata (denominado bio-oxidação) é bem conhecido desde há muito tempo e já vem sendo aplicado em escala piloto e comercial. Nestes processos os micro-organismos utilizam os sulfetos minerais insolúveis como fonte de energia, levando à formação dos sulfatos solúveis e facilitando a recuperação dos metais. Muitos estudos de laboratório têm demonstrado que os minérios contendo níquel e outros metais podem ser biolixiviados usando micro-organismos acidófilos oxidantes de ferro e/ou enxofre. Na indústria do níquel, particularmente, os estudos sobre lixiviação de sulfetos com interesse comercial têm sido aplicados nos seguintes minerais: milerita (NiS); niquelina (NiS); violarita [(Ni,Fe)3S4], bravoita [(Ni,Fe)S2]; heazelwoodita (Ni3S2) e mais comumente a pentlandita [(Fe,Ni)9S8]. Contudo, vários especialistas têm destacado a necessidade de se averiguar as possibilidades de exploração das reservas de silicatos de níquel, e a recuperação a partir da reciclagem de níquel já utilizado, visando o atendimento à demanda futura e a redução dos custos de produção do metal. Rejeitos e resíduos de minas, como as escórias, oferecem outra fonte de reservas de metais. Poucos dados, com relação à biolixiviação de escórias, podem ser encontrados na literatura. Por tal motivo é importante avaliar o uso potencial de micro-organismos para recuperar metais contidos em rejeitos minerais e ao mesmo tempo propor um aproveitamento e melhor disposição desses materiais que põem em risco o meio ambiente pela possibilidade real de ocorrer a conhecida “drenagem ácida de mina” e pela presença de metais pesados. O presente trabalho apresenta os resultados obtidos nos estudos exploratórios de lixiviação ácida e bacteriana nas amostras de rejeitos fornecidas pela empresa Votorantim Metais, assim como uma comparação com uma biolixiviação de um minério natural de níquel (pentlandita). Também são apresentados os estudos microbiológicos realizados com as novas linhagens isoladas a partir das mesmas amostras. 20 OBJETIVOS O objetivo central desse projeto foi o desenvolvimento de um estudo de lixiviação bacteriana e/ou ácida de resíduos gerados por uma planta de processamento de um minério de níquel da Companhia Votorantim Metais, contendo, além do níquel, cobre e cobalto como elementos de maior interesse. Os objetivos específicos são destacados a seguir: i) Realizar ensaios de lixiviação bacteriana dos rejeitos “escória” e “lama” utilizando a linhagem de coleção A. ferrooxidans-LR ii) Isolar micro-organismos com capacidade de bio-oxidar sulfetos minerais e bio-lixiviar níquel, cobre e cobalto a partir dos resíduos fornecidos pela empresa ou de locais adequados na própria mina. iii) Comparar a eficiência da oxidação dos sulfetos presentes nas amostras, bem como da biolixiviação dos metais mencionados, utilizando cepas isoladas desses materiais e da mina da empresa com as cepas da coleção do laboratório de biohidrometalurgia do IQ/UNESP. 21 1. REVISÃO BIBLIOGRAFICA 1.1. Metais de interesse: níquel, cobre e cobalto Os metais são elementos simples que se caracterizam por possuir um brilho especial, boa condutividade de calor e de eletricidade e uma tendência a formar cátions. Os metais têm múltiplas aplicações e tem tido uma grande importância na historia da humanidade, em diferentes áreas, desde a saúde até diferentes processos tecnológicos que governam a vida moderna. A metalurgia é a ciência aplicada encarregada de estudar os processos pelos quais os metais são extraídos a partir dos minerais e sua aplicação é tão antiga que pode ser registrada desde o ano 6.000 a.C. Atualmente existem 86 metais conhecidos dos quais 12 deles foram descobertos antes do século 18 (como o ouro e o cobre) e outros 12 até o século 19 (como o cobalto e o níquel). (International...2010) Todos os metais e compostos metálicos têm certo nível de toxicidade, podendo causar efeitos adversos sobre os organismos vivos. O níquel, em certas formas, e em circunstâncias especiais, pode gerar efeitos prejudiciais no ambiente (incluindo à saúde e segurança); não obstante, ele é considerado um elemento vital para a saúde pública por alguns cientistas. Com a crescente preocupação ambiental em nível mundial, vários países e/ou organizações internacionais foram estimulados a regularem a utilização de metais, incluindo o níquel, de acordo com suas propriedades químicas e físicas e os possíveis efeitos adversos que as suas aplicações possam causar. Existem, também, novos regulamentos que visam à proteção dos trabalhadores e dos consumidores (abordagem de saúde pública), enquanto outros se concentram na proteção do meio ambiente (visão ecológica). 1.1.1. Níquel O níquel (Ni) é o quinto elemento mais abundante na terra e na crosta terrestre. Ocorre naturalmente em combinação com outros elementos cristalinos formando minerais, dos quais apenas alguns estão nomeados. Devido às suas características físicas e químicas únicas, como alta resistência à corrosão, à oxidação e a altas temperaturas, pode, ainda, ser magnetizado e é facilmente combinado com outros metais para formar ligas. O níquel é altamente utilizado na indústria moderna, aproximadamente em 300 mil 22 produtos, especialmente na fabricação de aço inoxidável, magnetos, moedas, aeronaves, baterias recarregáveis e ligas, entre outros usos (International..., 2010). As vantagens do níquel não se limitam aos atributos para os diferentes materiais e processos. Também estão as dimensões ambientais e sócio-econômicas que vão além das razões técnicas pelas quais o uso de níquel é tão considerado. O níquel é um investimento que possibilita muitos produtos (novos e emergentes) além de processos importantes para o aumento da eficiência ambiental. Faz muitos outros produtos e processos de energia mais eficientes, duráveis e resistentes. O valor do níquel garante que ele seja usado de forma eficiente e altamente reciclado. Os atributos de materiais contendo níquel são inteiramente favoráveis à ecoeficiência. A produção, utilização e reciclagem de níquel é uma atividade econômica de valor agregado que apóia comunidades e governos. A extração de níquel pode ser realizada a partir de dois tipos de fontes minerais. A primeira é a fonte laterítica cujos principais minerais são óxidos como a limonita (Fe,Ni)O(OH), e a garnierita (Ni, Mg)3Si2O5(OH). A outra fonte de níquel, da qual é gerado 55% da produção mundial do metal, são os sulfetos minerais associados, geralmente, com ferro ou magnésio (XU et al., 2005), cujo principal mineral é a pentlandita (Ni,Fe)9S8. Vinte países, de todos os continentes, extraem níquel e em 25 países ele é processado e refinado. O uso do níquel aumentou ao longo do tempo e está correlacionado com o desenvolvimento econômico. Na década passada, a demanda de níquel no mundo aumentou de 1.01 bilhões de toneladas em 1998 para 1,28 bilhões de toneladas em 2008, uma taxa de crescimento de 2,4 por cento ao ano. No entanto, a tendência tem tido picos e vales (Figura 1). A maior demanda por níquel foi atingida em 2006 com 1,4 bilhões de toneladas. 23 Figura 1. Variação do preço do níquel no mercado durante os últimos 5 anos. Em 2007, a demanda diminuiu e em 2008 caiu novamente devido a crise econômica mundial. A Ásia é hoje o maior mercado regional para o níquel representando 54% da demanda mundial total. A China, isoladamente, representa 25% da demanda mundial de níquel em comparação com 4%, dez anos antes (International... 2010; Nickel Institut, 2010). Especialistas do setor estimam que os resíduos de níquel, 4.4-4.6 milhões de toneladas por ano, são recolhidos e reciclados. Nesse rejeito, são estimadas quase 350.000 toneladas de níquel (ou um quarto da demanda total) por ano, que são utilizadas, principalmente, na indústria de aço inoxidável. A maior parte da sucata provém de aço inoxidável, resultante de demolição de fábricas obsoletas, máquinas, equipamento e bens de consumo. O níquel traz contribuições significativas para a sustentabilidade e pode ser responsavelmente manejado através da cadeia de valor do níquel, desde a indústria do níquel primário até a reciclagem a partir dos produtos (International..., 2010; Nickel Institut, 2010). 1.1.2 Cobalto O cobalto (Co) é um dos metais essenciais para o ser humano e também é muito importante na indústria por suas qualidades estratégicas de alto ponto de fusão e resistência à corrosão. Antigamente era usado unicamente como corante e apenas a 24 partir do ano 1735 começou a ser utilizado como metal em ligas e posteriormente em magnetos. Na última década, o uso do cobalto tem-se incrementado em aplicações especificas, nas quais é difícil de substituir com materiais alternativos. Os principais usos do cobalto são a fabricação de baterias, pigmentos, corantes, ligas magnéticas, acessórios eletrônicos entre outros. Este metal tem baixa concentração na crosta terrestre, geralmente associado com níquel ou cobre e alguns casos com prata ou arsênico. Cerca de 50% do cobalto provem da indústria do níquel, 35% da indústria de cobre e outros e 15% de fontes de cobalto primário (p.e: cobaltita, CoAsS), (Cobalt..., 2010) O mercado do cobalto é dinâmico, mas pequeno em comparação com outros metais. Em 1995, o consumo de cobalto foi de 24.000 toneladas e cresceu a 60.800 toneladas no ano 2008. Os altos preços durante os anos 2006-2008 (Figura 2) levaram a um interesse de novos projetos para extração de cobalto em África, Australásia, Ásia e as Américas (incluindo Brasil). Vários deles projetados e financiados para produzir quantidades significativas de cobalto nos anos 2009-15. Durante 2009 a produção do cobalto aumento ligeiramente e a demanda caiu modestamente comparado com o ano 2008. Contudo, é esperado que a demanda supere a oferta devido á limitada produção e ausência de reservas para os anos 2014-2018 (Geovic...2010). Uma rápida queda dos preços acoplada com a recessão global tem afetado a demanda e, conseqüentemente, as operações de extração. Contudo, o cobalto é, principalmente, um subproduto de operações de níquel e cobre e, portanto o preço é irrelevante à viabilidade do projeto. Embora a dependência do preço do mercado passa a ser relevante para projetos de cobalto primário. Por outro lado, a reciclagem de cobalto a partir de material secundário tem aumentado nos últimos anos a ponto de dobrar a quantidade de metal recuperado de rejeitos, baterias e resíduos de refinaria de níquel (Cobalt..., 2010). 25 Figura 2. Variação do preço do cobalto no mercado durante os últimos 5 anos. 1.1.3 Cobre O cobre (Cu) é um elemento essencial para todos os seres vivos e utilizado desde a antiguidade. Teve uma significativa participação na Revolução Industrial e desempenha um papel muito importante na tecnologia moderna por seus múltiplos usos. Sua grande aplicação dá-se pela combinação de suas propriedades como durabilidade, capacidade condutora de calor e eletricidade e porque pode ser reciclado. O cobre é utilizado em produtos na construção, na eletrônica, no transporte, na agricultura, nas aplicações industriais e maquinaria, entre outros (European..., 2010). Este elemento ocorre, naturalmente, no ambiente de várias formas e diferentes teores desde traços, na maioria de rochas e solos, até elevados teores em sulfetos minerais (calcopirita [CuFeS2], bornita [CuFeS4], calcocita [Cu2S]), carbonatos (azurita [Cu3(OH)2(CO3)2], malaquita [Cu2CO3(OH)2]) e silicatos (chrysycolla [(CuAl)2H2Si2O5(OH)4, dioptase [CuSiO2(OH)2) ou como cobre metálico. Fatores econômicos, sociais e tecnológicos afetam o suplemento e demanda de cobre. À medida que a população mundial se expande a demanda por cobre tende a incrementar, enquanto sobrevive aos ciclos econômicos, avanços tecnológicos e competição com outros materiais (European..., 2010). 26 A produção de cobre primário vem da extração a partir de minérios ricos em cobre principalmente da calcopirita. O cobre é associado, naturalmente, a muitos outros minérios, e consideráveis quantidades de cobre podem ser encontradas nos resíduos de operações metalúrgicas de outros metais como o níquel e o cobalto. Considerando o preço do cobre no mercado e as previsões de incremento na demanda, os rejeitos minerais representam uma importante fonte de material secundário para a produção de cobre (ANTONIJEVIC; BOYRAZLI; TUMEN., 2008). Figura 3. Variação do preço do cobre no mercado durante os últimos 5 anos. 1.2 Mecanismos de biolixiviação Na biohidrometalurgia já tem sido confirmado que a velocidade de oxidação dos sulfetos minerais é, marcadamente, acelerada na presença de micro-organismos quimiolitotróficos, acidófilos e oxidantes de ferro e/ou enxofre como os do gênero Acidithiobacillus. Além da possível lixiviação bacteriana direta, pelo ataque das células ao sulfeto mineral (processo ainda controvertido) a lixiviação química de sulfetos é bem conhecida e o íon férrico e prótons são dois agentes importantes nesse processo químico de lixiviação. Nesse processo, o papel dos micro- organismos é regenerar os reagentes químicos lixiviantes (RAWLINGS, 2005). Em um sistema bacteriano de lixiviação aproximadamente 80% das células microbianas buscarão se aderir à superfície do mineral, enquanto que o restante permanecerá na solução como células planctônicas. Esta adesão é, 27 predominantemente, mediada por sustâncias poliméricas extracelulares (EPS) ao redor da célula (composto de açúcares, ácidos graxos, ácido glucorônico e íons férricos) (GEHRKE et al., 1998). Vários estudos têm evidenciado que o processo de adesão celular ocorre, preferencialmente, em locais com visíveis imperfeições na superfície do mineral tais como sítios corroídos ou de baixa cristalização. Diversos estudos afirmam que dentro do EPS é o lugar onde as reações de biooxidação ocorrem servindo, então, como espaço de reação (ROHWERDER et al., 2003; SAND; GEHRKE, 2006). Nos primeiros estudos dos mecanismos de ação das bactérias na oxidação de minerais referia-se a um mecanismo direto (enzimático) da célula sobre a superfície do mineral. Muitos estudos têm rejeitado tal hipótese afirmando que a biolixiviação ocorre por mecanismos indiretos. Por enquanto permanecem algumas dúvidas e ambos os mecanismos têm sido aceitos (BOON, 2001). Um conceito bem estabelecido é que as reações de dissolução dos minerais não são iguais para todos os sulfetos minerais e ocorrem via intermediários diferentes: o mecanismo via tiossulfato quando a célula é aderida a um mineral ácido-insolúvel como pirita (FeS2), e o mecanismo via polisulfetos para minerais solúveis em ácido como a calcopirita (CuFeS2). No primeiro caso a solubilização ocorre por meio do ataque do íon férrico, com o tiossulfato como intermediário principal, e sulfato como produto final: FeS2 + 6 Fe3+ + 3 H2O → S2O3 2- + 7 Fe2+ 6 H+ (1) S2O3 2- + 8 Fe32+ + 5 H2O → 2 SO4 2- + 8 Fe2+ + 10 H+ (2) O tiossulfato pode ser atacado pelo ferro e produzir mais intermediários como tetrationato, tritionato entre outros (RODRIGUEZ et al., 2003). No mecanismo dos polisulfetos a solubilização do mineral solúvel em ácido ocorre através do ataque combinado dos íons férricos e prótons, com enxofre elementar como principal intermediário que, por sua vez, pode ser oxidado por micro-organismos para produzir sulfato: MS + Fe3+ + H+ → M2+ + 0,5 H2Sn + Fe2+ (n>2) (3) 0,5 H2Sn + Fe3+ → 0,125 S8 + Fe2+ + H+ (4) 0,125 S8 + 1,5 O2 + H2O → SO4 2- + 2 H+ (5) 28 O íon ferroso gerado nas equações (1) ou (3) em presença de bactérias oxidantes de ferro será oxidado a íon férrico (RAWLINGS, 2005): 2 Fe2+ + 0,5 O2 + 2 H+ → 2 Fe3+ + H2O (6) 1.3 Processos biotecnológicos para a lixiviação de metais A escolha da rota tecnológica e do produto final a ser produzido por uma unidade industrial de níquel depende, diretamente, das características do minério a ser alimentado na planta. Os métodos para processar minérios lateríticos incluem lixiviação ácida sob pressão ambiente, lixiviação ácida sob pressão a alta temperatura, pirometalurgia, aquecimento com micro-ondas e lixiviação biológica. O níquel contido em matrizes de sulfetos é concentrado várias vezes por diferentes técnicas relativamente econômicas antes de ser fundido e refinado em seus produtos (RIEKKOLA-VANHANEM, 2006; YANTING et al., 2005; YANBIN et al., 2005). A pirometalurgia é o processo mais escolhido para pré-tratar o concentrado de sulfetos ou lateritas com alto conteúdo de níquel, no qual os metais são separados da escória para serem refinados posteriormente. Nos processos hidrometalúrgicos, incluindo a biohidrometalurgia, os metais de interesse são lixiviados a partir dos concentrados minerais. Este processo de pré-tratamento é usualmente empregado para concentrados de sulfetos ou lateríticos com baixo teor de níquel (YANNOPOULOS,1990). O uso de micro-organismos em hidrometalurgia para a solubilização de metais como cobre, urânio e níquel a partir de minérios de baixos teores (bio- lixiviação) ou como pré-tratamento de sulfetos na extração de ouro e prata (bio- oxidação) é bem conhecido há muito tempo e já vem sendo aplicado em escala piloto e comercial em todo o mundo. Esta aplicação comercial é usada em três diferentes desenhos ou sistemas: biolixiviação em montes para rejeitos minerais (conhecido como “dump leaching”), biolixiviação/biooxidação em pilhas (“heap leaching”) e em tanques agitados para concentrados. 1.3.1 Biolixiviação em montes A biolixiviação em montes (contendo milhões de toneladas de rejeitos minerais) foi aplicada, pela primeira vez, para rejeitos do processo de extração de 29 cobre, nos quais o teor do metal era baixo demais para o custo de sua recuperação ser sustentado por tecnologias convencionais como flotação e fundição. Neste sistema, água ácida é aplicada no topo do monte e à medida que a solução percola através do monte gera condições favoráveis para o crescimento de micro- organismos nativos que catalisam as reações de oxidação dos sulfetos minerais. O metal é dissolvido na lixívia e percola até o final do monte onde será recuperado (BRIERLEY, 2008a; PRADHAN et al., 2008). A biolixiviação em montes continua sendo um método altamente econômico para recuperar cobre de rejeitos com baixos teores. A companhia internacional BHP Biliton iniciou em 2006 uma operação de biolixiviação em montes na mina Escondida no Chile incluindo melhorias técnicas, esperando produzir até 200.000 t/a de cobre nos 40 anos seguintes. A adoção de técnicas que estão sendo aplicadas na prática de biolixiviação em montes, como aeração ou diminuição de tamanho de partícula, está reduzindo a diferença entre biolixiviação em montes e pilhas (BRIERLEY, 2008a). 1.3.2 Biolixiviação/Bioxidação em pilhas Em um sistema de pilhas o minério (de baixo teor) é aglomerado e disposto em uma pilha sobre uma superfície sintética e provida de um sistema eficiente de distribuição da solução lixiviante e de coleta da lixívia. Uma solução ácida é percolada através da pilha e os micro-organismos nativos produzirão íons férricos e acidez necessários para a dissolução do mineral e a solubilização dos metais. A principal diferença com a biolixiviação em montes está na aplicação de um sistema de aeração que pode ser passiva com o ar descendo junto com o fluxo de liquido ou ativa com o ar sendo injetado no interior da pilha por meio de canais instalados no fundo da pilha (RAWLINGS; DEW; PLESSIS, 2003). As pilhas são reatores mais econômicos de construir e de operar que os tanques agitados e são adequados para a biolixiviação de sulfetos primários de cobre como a calcopirita (BRIERLEY, 2008a- b; PRADHAN et al., 2008). A biolixiviação em pilhas para a recuperação de cobre é uma tecnologia exitosamente aplicada no Chile com mais de 85.000 t de mineral processado por dia. Vinte e três pilhas de biolixiviação de cobre no mundo, e sua produção anual, são listadas por BRIERLEY (2008a-b). O processo BioNIC® foi introduzido para a extração de níquel a partir de minério de baixo teor em pilhas e é utilizado por varias 30 companhias como Pacific Ore Technologies, a GENCOR, a Mintek Corporate e Billiton (GROENEVEL, 2010; BRIERLEY; BRIERLEY, 2001). Talvivaara Mining Company tem agora a maior pilha de biolixiviação de níquel e cobalto no mundo. A companhia Newmont Mining Corporation começou em 1999 a aplicar a tecnologia da pilha com o processo BIOPROTM para pré-tratar minerais refratários contendo ouro. Nestes minerais partículas microscópicas de ouro encontram-se aprisionadas ou ocluídas dentro do sulfeto mineral, usualmente pirita ou arsenopirita ou ambas. Para a recuperação do ouro os sulfetos devem ser oxidados antes de ser tratados com cianeto. Este pré-tratamento em pilhas difere da biolixiviação de metais por ser inoculada com diferentes populações microbianas crescidas, a priori, em um tanque externo, e, em seguida, a completa oxidação do mineral, a pilha é removida e tratada com cal antes da adição de cianeto. O processo GEOCOATTM, desenvolvido pela Geobiotics, LLC, é outra tecnologia inovadora para bioxidar, em pilhas, sulfetos refratários contendo ouro (BRIERLEY, 2008b). Por outro lado, a companhia finlandesa Talvivaara Mining desde 2005 começou a aplicação de biotecnologia para a extração de níquel e outros metais a partir de uma grande região de minérios de baixos teores e quatro anos depois já obteve a primeira produção de metais mediante o sistema de pilhas de minério irrigadas com solução sulfúrica, sistema este conhecido como Bioheap leaching. Com este processo a empresa finlandesa posicionou-se como a produtora número um na extração biotecnológica de níquel com 33.000 t/a. Também prevê uma produção anual aproximada de 50.000 t de níquel, o que representa, potencialmente, 2,3% da produção anual mundial de níquel primário para o ano 2012, além de uma previsão de exploração de mais 60 anos (RIEKKOLA- VANHANEN, 2007; WATLING, 2008). 1.3.3 Biolixiviação/Bioxidação em tanques agitados Os tanques agitados aerados para biolixiviação/bioxidação é uma técnica usualmente aplicada a concentrados de minerais devido ao seu custo de capital e de operação. Esta tecnologia é realizada em grandes tanques de aço inoxidável equipados com agitadores que mantêm a polpa em suspensão e garantem a transferência de oxigênio para os micro-organismos. Os tanques agitados permitem um melhor controle dos parâmetros chaves para a dissolução do mineral como 31 temperatura e concentração de oxigênio, e em comparação com a operação das pilhas, o tempo de operação é de dias e não de meses ou anos (BRIERLEY, 2008b). A limitação deste sistema está na concentração de sólidos que podem ser tratados nos tanques, pois só até 20% de polpa pode ser mantida em suspensão. Esta limitação, junto com os altos custos de construção e operação faz com que o sistema de tanques agitados seja aplicado somente para minérios de alto teor ou concentrados (RAWLINGS; DEW; PLESSIS, 2003). Catorze plantas de bioxidação em tanques agitados para o pre-tratamento de mineral refratário contendo ouro, tem sido construídas, em todo o mundo, a partir de dos anos 80 até agora e inclusive uma no Brasil, a mina São Bento, pertencente a Eldorado Gold Corporation. A única planta comercial para biolixiviação de metais base (cobalto) está localizada em Uganda (BRIERLEY; BRIERLEY, 2001; BRIERLEY, 2008b). Outros projetos para aplicar biolixiviação de metais como cobre, níquel e zinco, em tanques agitados estão sendo testados em escala piloto (MORIN et al., 2008). 1.4 Solubilização de metais a partir de rejeitos minerais Milhares de toneladas de rejeitos são geradas a cada ano no mundo todo, provenientes de operações metalúrgicas contendo grandes quantidades de metais como cobre, níquel e cobalto, presentes em baixos teores. Estima-se que para cada tonelada de cobre produzida, 400 toneladas de resíduos são geradas na mineração e metalurgia, sendo estas acumuladas/abandonadas durante anos por cada empresa de extração de metais (ZHAN; WU; WANG., 2008). Os rejeitos são gerados em dois pontos importantes do processo de extração de metais durante os métodos de concentração. Primeiramente, o minério deve ser moído e britado até um tamanho de partícula adequado para ser processado por métodos de concentração como flotação por exemplo. Com este método de concentração, os sulfetos contendo os metais de interesse são separados de outros minerais como carbonatos e silicatos (denominados de forma geral como ganga). Mas uma pequena porção de sulfetos fica junto com a ganga e por isso baixas porcentagens de metais são encontradas nos rejeitos. O produto concentrado no processo de flotação é, então, submetido a um tratamento térmico em fornos de altas temperaturas (~1300°C) que será convertido em metal impuro. Os sulfetos minerais que são oxidados neste processo formam 32 óxidos, que combinados com sílica produzem uma escória caracterizada por cristais de faialita (Fe2SiO4) (LI; PAPANGELAKIS; PEREDERIY, 2009). Este tipo de rejeito é denominado “escória”. Nestes processos de concentração, entre 3-8% dos metais são perdidos nos rejeitos em cada etapa de concentração (LI; PEREDERIY; PAPANGELAKIS, 2008). Embora este rejeito pareça um material inócuo por ser um sólido duro, pode representar um problema ambiental por não suportar o crescimento de plantas para reflorestamento e pode sofrer lixiviação lenta causada por micro-organismos ou chuvas ácidas levando a um potencial risco de contaminação ambiental por metais pesados (BAGHALHA; PAPANGELAKIS; CURLOOK, 2007). A figura 4 esquematiza, de maneira resumida, o processo de extração de metais a partir de um minério contendo metais de interesse. Os requisitos econômicos e ambientais impõem o desenvolvimento de métodos efetivos e não custosos para a recuperação de metais de interesse a partir de fontes secundárias como os rejeitos. Assim, vários métodos têm sido aplicados para tratar as escórias e recuperar os metais contidos nelas. Esses métodos incluem lixiviação direta com ácido sulfúrico ou cloreto férrico a pressão atmosférica, lixiviação oxidativa ácida a alta pressão com ácido sulfúrico, ou sulfato de amônio, ou sulfato férrico, ou cianeto, ou nitrato, ou clorato ou perclorato, ou re-enviar a escória para um forno para concentrar de novo. Mas todos esses procedimentos com altas temperaturas (>90°C) aumentam os custos de operação (ARSLAN; ARSLAN, 2002; LI; PEREDERIY; PAPANGELAKIS, 2008; 2009; RUDNIK; BURZYNSKA; GUMOWSKA, 2009). 33 Figura 4. Esquema resumido do processo de recuperação de metais Já para os rejeitos gerados após flotação têm sido testados e aplicados diferentes métodos de tratamento como lixiviação com ácido sulfúrico ou clorídrico, sulfato férrico, sulfato de amônio, cloreto férrico e lixiviação bacteriana (GBOR; AHMED; JIA, 2000; YANTIN et al., 2005). A lixiviação de metais a partir de rejeitos é medida em termos de décadas porque apresenta ineficiências consideráveis, comparando com a lixiviação de concentrados de alto teor de metais ou com a realizada em reatores ou pilhas de alta tecnologia. Neste trabalho os dois tipos de rejeitos, provenientes dos processos de concentração (flotação e forno “flash”) da planta de extração de níquel da companhia Votorantim Metais, em Serra de Fortaleza-MG, foram estudados em testes de lixiviação ácida e bacteriana para determinar a viabilidade de processar estes rejeitos com aplicação biotecnológica. 34 1.5 Solubilização de níquel e cobre a partir de minério natural A bem sucedida lixiviação em pilhas e posterior biolixiviação em escala comercial junto com os altos preços de níquel tem estimulado a aplicação desta tecnologia para o tratamento de sulfetos de níquel de baixos teores ou de difícil processamento. Em diferentes países está sendo extraído níquel mediante os sistemas de lixiviação em pilhas e tanques agitados. Watling (2008) faz um resumo dos projetos e biotecnologias aplicadas na extração de níquel como, por exemplo, as pilhas de Radio Hill e Sherlock Bay em Austrália; Talvivaara em Finlândia; Jinchuan em China e os tanques dos processos BioNIC® e BacTech/Mintek. Todos os trabalhos publicados para a solubilização de níquel a partir de concentrados de pentlandita, contendo pirrotita e calcopirita, utilizando bactérias quimiolitotroficas como A. ferrooxidans (adaptadas ou não), têm reportado porcentagens de extração superiores a 20%, inclusive até 100% de níquel em diferentes sistemas de reatores e durante diferentes tempos de residência (LI; KE, 2001a,b; MASON; RICE, 2002; KE; LI, 2006; SANTOS et al., 2006; WATLING, 2008). Com relação a minérios naturais de sulfetos de níquel, Garcia et al. (1997) reportaram 40% de recuperação de níquel com A. ferrooxidans, 30% com A. thiooxidans e 20% com o controle abiótico após 4 semanas de biolixiviação de um espécime mineral de pentlandita contendo pirrotita, calcopirita e cubanita. A revisão de Watling (2008) apresenta alguns trabalhos de biolixiviação de pentlanditas com melhores resultados de recuperação de níquel do que os obtidos por Garcia et al., (1997). Mas um resultado semelhante em todos os testes são os produtos de oxidação após a lixiviação bacteriana. Nesses trabalhos foi observado que a pentlandita foi oxidada em menor grau que a pirita e a pirrotita, acompanhada de acúmulo de precipitados de ferro como jarositas e enxofre. 1.6 Micro-organismos relevantes na extração de metais Os micro-organismos mais importantes relacionados com a oxidação de minerais são aqueles que têm a habilidade para produzir íon férrico (Fe3+) e ácido sulfúrico (H2SO4), ambos necessários para as reações de oxidação. Devido ao limitado tipo de substratos disponíveis nos ambientes de minas a diversidade microbiana não é 35 tão grande como em outros ambientes. Contudo, agora é conhecido um grande número de espécies microbianas relevantes aos processos de solubilização de metais (BAKER; BANFIELD, 2003). Esses micro-organismos, bactérias e archeas, principalmente, são extremadamente acidófilos (pH ótimo de crescimento menor de 3); quimiolitotróficos pois são capazes de oxidar compostos de enxofre inorgânico e/ou íons ferrosos (Fe2+); crescem autotroficamente fixando CO2 da atmosfera, utilizam o oxigênio como aceptor de elétrons e toleram uma ampla faixa de concentrações de diferentes metais (RAWLINGS, 2001). Eles também têm sido classificados segundo sua temperatura ótima de crescimento: mesófilos (entre 25- 40°C), termófilos moderados (entre 40 e 65°) e termófilos extremos (>65°C). O papel de bactérias oxidantes de ferro e/ou enxofre na dissolução de sulfetos minerais está muito bem documentado na área da Biohidrometalurgia e denominado como “bio-lixiviação” quando se trata da solubilização de metais de interesse a partir de um sulfeto mineral insolúvel e “bio-oxidação” quando se aplica a minerais contendo ouro para facilitar sua extração. Os minerais sulfetados diferem em sua susceptibilidade em serem oxidados e é assim que alguns sulfetos de ferro (como a pirita [Fe2S]) são oxidados pelo íon férrico. Com esses minerais os micro-organismos oxidantes de ferro como Acidithiobacillus (A.) ferrooxidans, Leptospirillum sp, Acidimicrobium (Am.) ferrooxidans e Sulfolobus metallicus tem uma função importante na dissolução desses minerais. O estudo da variabilidade genotípica e fisiológica natural de novos isolados de A. ferrooxidans é de grande importância para encontrar cepas mais eficientes para solubilizar metais ou para resistir às condições mais extremas (como maior acidez ou concentração de metais); para discernir as rotas de evolução da espécie, entender os mecanismos de ação sobre os minerais ou outros substratos e para seu monitoramento em processos biohidrometalúrgicos ou naturais. Neste trabalho está descrita a metodologia aplicada no isolamento de cepas bacterianas nativas acidófilas e mesófilas do gênero Acidithiobacillus a partir de amostras de rejeitos provenientes da planta de beneficiamento de níquel da Empresa Votorantim S.A. 36 1. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Solubilização de níquel, cobre e cobalto a partir de rejeitos minerais Caracterização química dos rejeitos Neste estudo foram utilizados dois tipos de rejeitos, um proveniente do processo pirometalúrgico com forno “flash”, denominado “escória”, e outro proveniente dos resíduos do processo de concentração por flotação chamado de “lama”. Esses rejeitos foram utilizados para os testes de biolixiviação e foram determinados os teores dos elementos níquel, cobalto, cobre e sílica. A caracterização química foi realizada após dois tipos de aberturas: uma abertura parcial feita com água régia (porção solúvel do metal) e uma abertura total feita com ácido fluorídrico e aquecimento em forno de micro-ondas (porção total do metal). As amostras antes e após serem submetidas à lixiviação foram analisadas a fim de determinar a composição mineralógica das suas fases principais mediante a técnica de difração de raios X. Medidas de pH e potencial redox O pH e o potencial de oxido-redução nas amostras coletadas foram medidos utilizando um eletrodo de vidro e um eletrodo de Pt (contra um eletrodo de referência Ag°/AgCl/KClsat) respectivamente. Espectrometria de Absorção Atômica As concentrações dos elementos de interesse foram determinadas mediante a técnica de Absorção Atômica realizadas com um espectrômetro de chama com fonte de linhas (LSFAAS), AAnalyst 100 (Perkin Elmer®) Difração de Raios X (DRX) Para as análises com a técnica de DRX todas as amostras foram moídas até uma granulometria >50 µm e dispostas em porta amostras de teflon ou vidro. Foi utilizado o difratômetro D5000 – Siemens (do Laboratório de Físico Química) com as condições de rotina: tempo de contagem 2s, passo 0,05, ângulo de varredura de 10 a 70° (2θ). 37 Testes de consumo de ácido pelas amostras As lixiviações ácidas com a escória e com a lama foram realizadas em dois valores de pH: 1,0 e 0,5. Os testes de consumo de ácido foram realizados em frascos de 250 mL contendo 20 g do rejeito em 80 mL de água. Os frascos foram agitados em placa com agitador magnético durante 48 horas. Durante este período o pH foi medido e mantido nas condições descritas pela adição de ácido sulfúrico 0,5 mol L-1. Linhagem bacteriana Foi utilizada a linhagem Acidithiobacillus ferrooxidans-LR, isolada de lixívia ácida de minério de urânio proveniente de Lagoa Real-BA (GARCIA, 1991). Todos os cultivos bacterianos utilizados como inóculo para o processo de lixiviação foram obtidos após o crescimento em meio específico T&K (TUOVINEM; KELLY, 1973). A Tabela 1 descreve a composição do meio de cultivo T&K. Tabela 1. Meios líquidos utilizados no enriquecimento de micro-organismos acidófilos oxidantes de ferro e/ou enxofre. Composto Meio T&K pH 1,8 (g/L) Meio 9K-So pH 2,8 (g/L) (NH4)2SO4 0,5 3,00 KCl - 0,10 K2HPO4 0,50 0,50 MgSO4 .7H2O 0,50 0,50 Ca(NO3)2.4H2O - 0,014 FeSO4.7H2O 33,3 ---- S° ---- 10 38 Testes de oxidação de substratos (respirometria) Para uma investigação preliminar da oxidação dos rejeitos por A. ferrooxidans foram realizados ensaios de respirometria celular. A técnica de respirometria celular indica, rapidamente, a capacidade, ou não, da bactéria em oxidar substratos mediante a determinação do consumo de oxigênio. Os ensaios respirométricos foram realizados em aparelho de Warburg com uma suspensão celular de A. ferrooxidans- LR desacoplando-a do crescimento, ou seja, limitando a fixação de CO2 para não permitir o processo de divisão celular. A suspensão celular foi crescida em meio T&K, centrifugada para obtenção de um pellet e lavada três vezes com água ácida (pH 1,8). Previamente à utilização das células no experimento, a proteína total foi quantificada como indicativo da biomassa celular pelo método de Hartree (HARTREE, 1972). Os frascos de reação continham, além da suspensão celular do A. ferrooxidans- LR (300 μg de proteína total), 100 mg dos rejeitos e 2,5 mL de tampão glicina (pH 2,2). Frascos sem a presença de células foram utilizados como controles abióticos. Os ensaios foram conduzidos a 30ºC, sendo realizados em duplicata. Biolixiviação em frascos Os ensaios de biolixiviação de rejeitos foram realizados em frascos erlenmeyers de 250 mL, contendo 150 mL de meio T&K (com ou sem adição do íon Fe2+ como fonte energética), 5% (p/v) de rejeito (escória ou lama) e 5% (v/v) de inóculo bacteriano. Todos os frascos foram incubados a 30°C e agitados a 150 rpm, durante 14 dias. Os ensaios foram realizados em duplicata. As condições dos ensaios estão apresentadas na Tabela 2. Os ensaios de lixiviação bacteriana da lama foram repetidos, posteriormente, com um tempo de 50 dias. Periodicamente, foram retiradas amostras dos frascos para as medidas do pH e potencial redox (Eh) do sistema e determinações de níquel e cobre na lixívia. O resíduo sólido final de cada frasco foi, também, tratado para análise das alterações da fase sólida por difração de raios X (DRX). 39 Lixiviação estática (escória) Os ensaios de lixiviação da escória em pilhas foram realizados em bandejas de vidro contendo 1 kg da escória e 200 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) em diferentes concentrações (mol L-1): 2,5 – 5 - 10 e 18. As pilhas foram secas em temperatura ambiente durante 8 dias antes da primeira lavagem. Posteriormente, cada pilha foi lavada com 350 mL de água não acidificada 4 vezes, chamando de licor rico ao primeiro volume da lixívia e água de lavagem 1, 2 e 3 para as seguintes lixívias, nas quais foram medidos o pH, o potencial redox (Eh) e o volume recuperado. Esta metodologia de secagem e lavagem foi realizada por 4 vezes para a pilha acidificada com H2SO4 18 mol L-1 e 5 vezes para as outras pilhas. Em alguns casos, quando o pH da solução aumentou, as lavagens foram realizadas com água acida pH 1,0. Simultaneamente, uma pilha foi montada em béquer com H2SO4 2,5 mol L-1. Neste caso, o rejeito (1 kg) foi encharcado com 500 mL de ácido. Tabela 2. Descrição dos diferentes tratamentos da biolixiviação de escória ou lama. Frasco A Frasco B Frasco C Frasco D Frascos inoculados com A. f – LR Meio de cultura T&K sem ferro Meio T&K com adição de 120 mmol L -1 de Fe 2+ Cultivo bacteriano crescido e contendo ~120 mmol L -1 Fe 3+ Cultivo bacteriano crescido e contendo ~120 mmol L -1 Fe 3+ + H2SO4 1,25 mol L -1 Frascos controles sem A. f -LR Meio de cultura T&K sem ferro Meio T&K com adição de 120 mmol L -1 de Fe 2+ Cultivo com ~ 120 mmol L -1 Fe 3+ (estéril) H2SO4 1,25 mol L -1 (estéril) Lixiviação estática (lama) A lixiviação estática da lama foi realizada em béquer de 2 L com 1 kg de rejeito encharcado com 500 mL de solução como descrito na Tabela 3. Todas as condições 40 foram corrigidas para pH 1,0 inicial. Correções posteriores foram realizadas com adição de ácido sulfúrico concentrado até pH 1,5. Considerando o constante aumento de pH nesses sistemas, outro sistema com lama foi realizado levando-se em conta a relação ácido-minério avaliado na primeira etapa nos testes de consumo de ácido. Deste modo, foram preparados dois reatores, um com 1 kg da lama e 500 mL de um cultivo crescido de A. ferrooxidans- LR. A quantidade de ácido consumida nos testes iniciais foi considerada para a preparação de outra condição com uma solução de 1,25 mol L-1. O outro reator foi o controle abiótico também na mesma concentração. Tabela 3. Descrição dos diferentes tratamentos da biolixiviação da lama. Frasco A Frasco B Frasco C Frasco D Reatores Meio T&K sem ferro inoculado com A.ferrooxidans-LR Meio T&K com adição de 120 mmol L-1 de Fe2+ sem bactérias Cultivo bacteriano crescido e contendo ~120 mmol L-1 de Fe3+ Cultivo bacteriano crescido e filtrado (com membrana 0,45 µm) contendo ~120 mmol L-1 Fe3 2.2 Solubilização de níquel e cobre a partir de minério natural Minério de Pentlandita (Ni,Fe)8S9 O sulfeto de níquel utilizado nos experimentos foi uma amostra mineral de pentlandita “grau minério” fornecido por KRANTZ (Dr. F. Krantz Rheinisches Mineralien-Kontor) na cidade de Bonn, Alemanha. O sulfeto se apresentou em forma de rochas naturais de aproximadamente 3 kg em total. Para todos os experimentos e análises o sulfeto foi moído manualmente e peneirado até obter-se uma granulometria >200 µm. Minério de Pirrotita (Fe1-xS; x = 0 – 0.17) Uma amostra de pirrotita “grau minério” foi utilizada nos experimentos de perda de níquel. Esta amostra foi fornecida pela Ward´s Study Pack. O sulfeto se apresentou em forma de rochas naturais de aproximadamente 1 kg em total. Para 41 todos os experimentos e análises o sulfeto foi moído manualmente e peneirado até obter-se uma granulometria >200 µm. Caracterização da pentlandita e pirrotita Para a caracterização química dos minérios utilizados nos testes, 1 g do sulfeto foi aberto com água régia (DIXON; GARDNER; HUDSON, 1997) e posteriormente o teor dos elementos foi determinado por espectroscopia de absorção atômica. As análises das fases mineralógicas predominantes foram feitas mediante a técnica de Difração de Raios X (Figura 23). Técnicas analíticas As analises para determinação de metais em solução foram feitas por Espectrometria de Absorção Atômica. As fases mineralógicas foram identificadas por Difração de raios X. Ambas as técnicas foram descritas na metodologia da seção correspondente à biolixiviação de rejeitos minerais. As determinações de sulfato em solução foram realizadas por Cromatografia. Para este propósito foi utilizado um equipamento Dionex DX500 em combinação com um software Chromeleon Version 6.7 do laboratório de Biotecnologia Aquatica da Universidade Duisburg-Essen, Duisburg – Alemanha. As amostras foram inicialmente centrifugadas a 10000 rpm por 10 minutos para eliminar células e partículas. O sobrenadante foi usado para as medições. As amostras foram diluídas 1:100 com água bidestilada e novamente diluídas 1:10 com tampão fosfato (2,5 mmol L-1, pH 7,0) (NOEL, 2008). Biolixiviação de pentlandita (1ª série) Duas séries de experimentos foram realizadas para estudar o processo de biolixiviação de pentlandita. A primeira delas foi conduzida no laboratório de Biotecnologia Aquática do Centro de Biofilmes na Universidade de Duisburg-Essen, na Alemanha. Preparo dos ínóculos As linhagens utilizadas nos ensaios de biolixiviação de pentlandita foram A. ferrooxidans-LR (descrita anteriormente) e uma linhagem de L. ferrooxidans (cepa 42 tipo) da coleção de micro-organismos do laboratório de Biotecnologia Aquática, do Centro de Biofilmes da Universidade de Duisburg-Essen, Alemanha Para obter a concentração celular desejada para os experimentos de biolixiviação de pentlandita (108 células/mL), as linhagens de A. ferrooixdans-LR e L.ferrooxidans foram crescidas em frascos de 5 L contendo o meio de cultivo Mackintosh como descrito a seguir: (NH4)2S04, 1,0 mmol L-1; KH2P04, 0,2 mmol L-1; MgCl2, 125 µmol L-1; CaCl2,, 1-0 mmol L-1; MnCI2,, 0.5 µmol L-1; ZnCl2,, 0.5 µmol L-1 ; CoCI2, 0.5 µmol L-1; H3BO3, 0.5 µmol L-1; Na2MoO4, 0.05 µmol L-1; CuCI2, 0.5 µmol L- 1 ; H2S04, 9,6 mmol L-1, FeSO4, 180 mmol L-1; pH 1,8 (MACKINTOSH, 1978). Após o crescimento celular os cultivos foram centrifugados (8000 rpm x 10 minutos a 10°C) e o pellet resultante foi lavado várias vezes com uma solução de sais do meio Mackintosh (sem íons ferrosos) em pH 1,8. A partir dessa biomassa recuperada, foi realizada a contagem celular em câmara de Thoma. Ensaios de biolixiviação Antes de ser realizado um dos testes de biolixiviação, a pentlandita foi lavada com uma solução de EDTA- NaOH para eliminar os óxidos contidos no sulfeto durante 10 minutos em agitação, lavada com água destilada várias vezes até o pH estabilizar em 7 e, posteriormente, foi lavada com acetona para remover os íons férricos e compostos de enxofre (GEHRKE et al., 1999; NOEL, 2008). O protocolo anterior é para garantir que os metais solubilizados provêm especificamente do minério e não de impurezas solúveis associadas. A pentlandita foi esterilizada em frascos tampados com atmosfera de nitrogênio em estufa a 120°C durante 4 horas. A seguir, foram realizados os ensaios de biolixiviação em frascos erlenmeyer de 250 mL, contendo 150 mL de meio Mackintosh (sem adição do íon Fe2+ como fonte energética), 10% (p/v) de pentlandita. Os frascos foram inoculados com uma concentração de células de A. ferrooxidans-LR de 108 células/mL. Outra série de frascos foi inoculada após 48 horas de acidificação com ácido sulfúrico. Este procedimento teve como objetivo diminuir o consumo de ácido pela ganga durante a lixiviação bacteriana. Alguns destes frascos foram inoculados com A. ferrooxidans- LR e outros com a linhagem de L. ferrooxidans (linhagem tipo). Após 5 dias, esses frascos foram re-inoculados com as mesmas cepas. 43 Todos os frascos foram incubados a 30°C e agitados a 150 rpm, durante 28 dias. Os ensaios foram feitos em duplicata e frascos abióticos foram utilizados simultaneamente. Periodicamente, foram retiradas amostras dos frascos para as medidas de pH, determinações de níquel, magnésio e cobre em solução por absorção atômica e concentração de sulfato por cromatografia em fase liquida. O resíduo sólido final de cada frasco foi também recuperado para análise das alterações da fase sólida por difração de raios X (DRX). Biolixiviação de pentlandita (2ª série) A segunda série foi realizada no laboratório de Biohidrometalurgia do Instituto de Química-UNESP. Preparo dos ínóculos Na segunda série de ensaios de biolixiviação de pentlandita foram utilizadas linhagens da coleção do laboratório, A. ferrooxidans-LR e A. thiooxidans-FG01. A linhagem da coleção do laboratório, A. thiooxidans-FG01, foi isolada de drenagem ácida de uma mina de urânio, em Figueira-PR. O meio de cultivo 9k para o crescimento e manutenção desta espécie bacteriana está descrito na Tabela 1. Cultivos bacterianos de 100 mL para o crescimento e manutenção destas linhagens foram realizados com os meios T&K (pH1,8) e 9K (pH2,8) respectivamente. Alíquotas desses cultivos foram tomadas para inocular os frascos dos ensaios de biolixiviação (5% v/v). Ensaios de biolixiviação Algumas modificações em relação ao ensaio anterior foram feitas. Os testes foram realizados com cultivos puros e mistos de A. ferrooxidans-LR e A. thiooxidans- FG01. Para os cultivos com a linhagem oxidante de ferro o meio utilizado foi o T&K (pH 1,8) e para o cultivo puro da linhagem oxidante de enxofre foi o meio 9K (pH 2,8) já descritos anteriormente. Em ambos os casos não foi adicionada a fonte de energia (íons ferrosos e enxofre, respectivamente). A porcentagem de sólidos utilizada neste ensaio foi de 5% (p/v). Todas as outras condições foram as mesmas do ensaio descrito anteriormente. 44 Determinação do ferro total em solução Alíquotas do sobrenadante dos ensaios de biolixiviação da segunda série foram tomadas para a determinação da concentração de ferro total em solução. As análises foram feitas mediante a técnica de Karamanev (KARAMANEV, NIKOLOV, MAMATARKOVA, 2002), utilizando um espectrofotômetro 600S (FEMTO). Testes de perda de níquel e cobre da solução Ensaios de perda de metais foram realizados em frascos erlenmeyers contendo 2,5% (p/v) de mineral (pentlandita ou pirrotita), 150 mL de meio T&K (pH 1,8) e cobre ou níquel em uma concentração de 1 g L-1 e inoculados com A. ferrooxidans- LR (5% v/v). Todos os frascos foram incubados a 30°C e agitados a 150 rpm, durante 30 dias. Os ensaios foram feitos em duplicata. As concentrações de níquel e cobre em solução foram determinadas por espectroscopia de absorção atômica. 2.3 Isolamento de micro-organismos a partir de rejeitos minerais Isolamento de micro-organismos As amostras para o isolamento de micro-organismos foram a “escória” e a “lama” utilizadas nos testes de biolixiviação. Adicionalmente, outros tipos de rejeitos foram fornecidos pela empresa Votorantim Metais. Esses rejeitos são gerados a partir do processo de flotação da mesma forma que a lama, e foram diferenciados por um processo de separação magnética. Após esta separação, a parte contendo ferro denominou-se “rejeito magnético” e a outra “não magnético”. O conjunto de ambos denominou-se “rejeito total”. Os rejeitos “total” e “não magnético” pelotizados foram tomados como amostras para o isolamento de micro-organismos oxidante de ferro e enxofre. A seguir estão descritos os meios utilizados nos procedimentos de enriquecimento e purificação que foram selecionados para o isolamento e cultivo de bactérias mesófilas acidófilas oxidantes do ferro e/ou enxofre. Meios líquidos para o enriquecimento celular Na Tabela 1 está indicada a composição dos meios líquidos utilizados nos cultivos de enriquecimento que favorecem o desenvolvimento de bactérias oxidantes do ferro (meio T&K) e do enxofre (meio 9K-S°). A preparação deles realizou-se 45 segundo a técnica descrita por Tuovinen e Kelly (1973). No caso particular do meio denominado 9K-S° substituiu-se a fonte de energia (o íon ferroso) por enxofre, e foram adicionados alguns outros sais. Os valores iniciais de pH (1,8 e 2,8 respectivamente) foram sugeridos por Garcia, Mukai e Andrade (1992). Meios sólidos para a purificação: O meio sólido para bactérias oxidantes de ferro foi preparado utilizando o meio líquido descrito por Tuovinen e Kelly (1973), mas foram testadas 3 concentrações de sais minerais. Na Tabela 4 estão apresentadas as composições do meio utilizado nos ensaios. A preparação do meio sólido está descrita a seguir: Solução A: Dissolveram-se separadamente, os sais da solução A em água destilada, ajustando-se o pH em 1,8 com ácido sulfúrico H2SO4 0,5 mol L-1 e esterilizou-se em autoclave a 120ºC durante 20 minutos. Solução B: O sulfato ferroso foi dissolvido ajustando-se o pH em 1,8 com H2SO4 0,5 mol L-1 e foi esterilizado por filtração em membrana (Millipore 0,45 m diâmetro de poro). Foram misturadas as soluções A e B na relação 4:1 no momento de uso. Solução C: A solução de agarose foi preparada em um volume correspondente à metade do volume final, de modo que a concentração final fosse de 0,45% m/v. Esterilizou-se em autoclave a 120ºC durante 20 minutos e esfriou-se até uma temperatura de 50ºC, aproximadamente, antes de misturar com o resto dos sais. No momento de misturar o meio nutritivo com igual volume da solução de agarose, tomou-se a precaução de que ambas as soluções não estivessem em temperatura muito elevada para evitar a hidrólise da agarose já que isto pode impedir que o meio se solidifique. Assim que as soluções foram misturadas, distribuiu-se o meio preparado em placas de Petri, previamente esterilizadas (aproximadamente 20-25 mL por placa). O meio sólido para bactérias que oxidam enxofre foi preparado utilizando-se o meio líquido descrito por Garcia et al. (1992). Na Tabela 5 está apresentada a composição dos meios utilizados nos ensaios. 46 Tabela 4. Meio sólido T&K-agarose Solução A (pH1,8) 400 mL 1 (g/L) 2 (g/L) 3 (g/L) (NH4)2SO4 K2HPO4 MgSO4.7H2O 0,5 0,5 0,5 0,4 0,1 0,4 0,3 0,3 0,3 Solução B (100 mL, pH1,8) FeSO4.7H2O 33,3 Solução C Agarose H2O destilada 4,5 (0,45%p/v) 500 ml Condições gerais na preparação dos meios de cultivo O pH do meio de cultivo foi ajustado antes de ser esterilizado mediante a adição de H2SO4 diluído até alcançar o valor requerido para cada caso. Os meios de cultivo sem ferro foram esterilizados em autoclave a 120 ºC durante 20 minutos. Os meios com ferro ferroso foram esterilizados por filtração através de membranas Millipore de 0,2 m de diâmetro. O enxofre em pó foi esterilizado em autoclave a 110°C durante 60 minutos antes de ser adicionado ao meio sem ferro. Adicionalmente, foram realizados controles periódicos de placas sem inóculo, para detectar uma possível contaminação dos sólidos utilizados obtendo-se sempre resultados negativos. 47 Tabela 5. Meio sólido com tiossulfato para bactérias oxidantes de enxofre. Solução A [mg] Solução B [g] Solução C [g] (NH4)2SO4 Mg SO4.7H2O Ca(NO3)2.4H2O K2HPO4 H2O destilada 120 300 14 100 700 ml Na2S2O3.5H2O H2O destilada pH final 4,2 5 150 ml Agar H2O destilada 15 150 ml Isolamento e enriquecimento em meio líquido Foram preparados frascos erlenmeyers de 125 ml contendo 50 ml de meio estéril (T&K em pH 1,8 ou 9K em pH 2,8) inoculados com uma ponta de espátula da amostra sólida (lama, escória, rejeito total ou rejeito não magnético). Os frascos foram incubados a 30ºC com agitação constante a 180 rpm. Este procedimento foi realizado em duplicata. O crescimento de bactérias oxidantes de ferro foi verificado pela mudança na cor do meio T&K (de verde claro a laranja marrom), após 2 ou 3 dias de inoculação. Esta variação indicou a oxidação do substrato, o íon ferroso a íon férrico. O crescimento bacteriano nos cultivos com enxofre foi verificado pela diminuição do valor de pH e a turbidez no meio. Após o crescimento celular, estes cultivos foram reinoculados em frascos com meio de cultivo fresco para assegurar a manutenção das espécies bacterianas. Também foram crescidos em meio com enxofre a fim de se tentar a diferenciação do gênero e espécie. Isolamento e purificação em meio sólido T&K-agarose A partir dos cultivos enriquecidos correspondentes aos rejeitos, se realizou o isolamento em meio sólido mediante a técnica de diluições sucessivas em 6 tubos contendo 4,5 mL do surfatante Tween 80 (0,25%) e 0,5 mL do meio enriquecido. De cada diluição tomou-se 100 µL e colocou-se em placas de Petri com o meio (T&K ou 48 tiossulfato) e agarose como suporte. A utilização do surfatante teve como objetivo melhorar o tamanho das colônias no meio sólido (GARCIA; MUKAI; ANDRADE, 1992). Oxidação de substratos (respirometria) Nos testes de oxidação de substratos utilizando a técnica de consumo de oxigênio contendo diferentes substratos (como sulfato de ferro ou sulfetos minerais) foram realizados como descrito na metodologia 2.1. Dosagem de proteínas totais Centrifugou-se 1 mL de suspensão celular por 5 minutos a 12000 rpm. O sobrenadante foi desprezado e o pellet de células foi suspenso em 1 mL de NAOH 1 mol L-1 e hidrolisado por fervura em banho maria durante 30 minutos. Alíquotas dessa solução, diluídas adequadamente, foram utilizadas para a dosagem protéica pelo método de Hartree (HARTREE, 1972). Foi escolhido o valor da técnica de proteínas totais como unidade biológica de rotina para expressar os resultados dos estudos de respirometria, já que este método é simples de se realizar, preciso e muito sensível (15-110 µg). Crescimento em meio ácido Para os testes de tolerância à acidez, foram realizados ensaios de crescimentos em meio liquido T&K em diferentes valores de pH: 1,4; 1,8 e 2,2. Estes ensaios foram realizados em frascos erlenmeyers contendo 100 mL de meio de cultivo e 5% v/v de inóculo de cada linhagem. Os frascos foram incubados a 30°C e agitados a 150 rpm em agitador orbital. A determinação do crescimento foi acompanhada por titulação do íon ferroso com dicromato de potássio (VOGUEL, 1977). Resistência a metais Para avaliar diferenças fisiológicas entre as distintas células bacterianas isoladas neste trabalho, desenvolveu-se um teste de resistência a metais, onde foi avaliado o efeito destes na oxidação de ferro pelos micro-organismos oxidantes de ferro. 49 Este teste foi realizado da seguinte forma: foram selecionados níquel, cobalto e cobre como metais predominantes nos rejeitos de concentrado de flotação de níquel. As concentrações utilizadas estão descritas na Tabela 6. Tabela 6. Concentrações dos elementos escolhidos para o teste de resistência. Elemento Fonte Concentrações (g L-1) Níquel NiSO4 3 6 12 24 Cobalto CoSO4 0,2 0,4 0,8 Cobre CuSO4 1,25 2,5 5,0 50 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Solubilização de níquel, cobre e cobalto a partir de rejeitos minerais Caracterização dos rejeitos minerais Os resultados das aberturas para cada rejeito estão apresentados na Tabela 7 e a caracterização mineralógica das amostras originais está apresentada na Figura 5. Pode-se observar que as porções “total” e “solúvel” de níquel na lama são muito similares, com o que pode ser deduzido que o níquel encontra-se nos sulfetos do rejeito e são facilmente extraíveis com um ataque ácido com água régia. Com a caracterização da escória pode ser observado que este rejeito tem o conteúdo de níquel total muito maior que o solúvel e considerando a grande porção de sílica é possível que o níquel encontra-se formando parte de uma rede cristalina diferente de sulfetos. As análises das amostras originais de escória e lama por difração de raios X (DRX) revelaram as diferenças mineralógicas de cada resíduo (Figura 5). Na escória encontrou-se uma única fase mineralógica característica de silicatos de ferro- magnésio tipo faialita ou forsterita [(Mg0.5Fe0.5)2SiO4]. A lama pelo contrario está constituída de uma variedade de fases mineralógicas como dolomita [CaMg(CO3)2]; kaolinita [Al2Si2O5(OH)4]; magnetita [Fe2+Fe3+ 2O4]; quartzo [SiO2]; silicatos [Mg3Si4O10(OH)2] e pirrotita [Fe(1-x)S] (Figura 5). Tabela 7. Concentração de níquel, cobalto e cobre nos rejeitos (%). Ni total Ni solúvel Cu total Cu solúvel Co total Co solúvel Si total Si solúvel Escória 0,26 0,07 0,27 0,06 0,06 0,06 13 0,2 Lama 0,30 0,25 0,03 0,03 0,01 0,01 22 0,9 51 0 10 20 30 40 50 60 70 0 100 200 300 F Escória Original F F F F F FF FF 2 CuK F 10 20 30 40 50 60 70 0 100 200 300 400 500 MQ P K Q K Q D P DM P M Lama original 2 CuK A-S A-S A-S Figura 5. Difratogramas das amostras originais de escória e da lama utilizadas nos ensaios de biolixiviação. F: faialita/forsterita; K: kaolinita; Q: quartzo; P: pirrotita; M: magnesita/magnesioferrita; D: dolomita; A-S: aluminosilicatos. Consumo de ácido pelas amostras O consumo de ácido em cada condição está apresentado na Tabela 8. Estes valores foram calculados a partir da quantidade de ácido sulfúrico que foi necessária para manter o valor de pH testado. Este consumo é um parâmetro frequentemente calculado nos projetos de metalurgia na hora de avaliar projetos de viabilidade econômica e/ou técnica para tratamentos de rejeitos minerais. Segundo estes resultados, pode ser visto que em pH 1,0 o consumo de ácido foi muito menor comparado com o teste em pH 0,5 e as extrações do níquel foram altas no caso da escória, indicando que não é necessário um gasto de ácido muito elevado para alcançar altas porcentagens de solubilização de metais . Os resultados dos testes de consumo de ácido com a escória e a lama, realizados em pH 1.0 e pH 0.5, estão também apresentados na Tabela 8. No caso da lixiviação ácida da escória, obteve-se uma grande porcentagem de níquel solúvel em ambos os valores de pH, mas a porção total só alcançou 56% na maior acidez. Isto pode ser devido à cristalinidade do material pois como foi visto com a abertura com água régia a porção solúvel foi muito baixa comparada com a porção total. Com relação ao cobre, foi extraído 52% em pH 1,0 da porção solúvel e 12 % do cobre total, enquanto que 100% do cobre solúvel e 24 % da porção total foi extraído em pH 0,5, indicando que o cobre está realmente refratário dentro da fase de sílica da escória. 52 No caso da lama não houve diferença significativa na extração de níquel total ou solúvel com ambos os valores de pH e foi extraído menos de 30% do metal. Com esses valores extraídos pode se deduzir que falta outro agente lixiviante no meio para solubilizar mais níquel. Enquanto ao cobre, houve uma maior solubilização do metal em pH 1,0 que a 0,5, indicando que uma maior concentração de ácido sulfúrico teve um efeito negativo na extração. Tabela 8. Porcentagens de extração de níquel e cobre depois de lixiviação química. Ni solúvel Ni total Cu solúvel Cu total Consumo de ácido (kg/T) Escória pH 0.5 100 56 100 24 560 pH 1.0 81 21 52 12 150 Lama pH 0.5 27 23 16 16 212 pH 1.0 26 22 28 28 123 Oxidação de substratos (respirometria) A linhagem A. ferrooxidans-LR foi analisada em sua capacidade para utilizar os rejeitos como fonte de energia mediante a técnica de respirometria. Os testes foram realizados com os rejeitos em seu tamanho de partícula original (50-100 µm para a lama e entre 100-500 µm para a escória) com os rejeitos moídos a uma granulometria de 50 µm. Os resultados estão apresentados na Figura 6. Com estes ensaios foi evidente que a escória parece ser um melhor substrato para as células bacterianas, pois fornece, facilmente, uma fonte de energia demonstrada pela cinética rápida de consumo de oxigênio, enquanto a respiração a partir de lama não apresentou um valor alto de oxigênio consumido. Isto poderia ser explicado talvez pela presença de substâncias ou compostos neste rejeito provenientes do processo de flotação que podem afetar o desenvolvimento microbiano, ou também pela alta concentração de ferro contido na escória que é facilmente solúvel em valores de pH baixos como íon ferroso. 53 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 -20 -10 0 10 20 30 40 50 At.f-LR controle O 2 c o n s u m id o ( u l) Tempo (min) A 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 20 40 60 80 100 120 140 160 At.f-LR controle O 2 c o n s u m id o ( L ) Tempo (min) B 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 10 20 30 At.f-LR controle O 2 c o n s u m id o ( L ) Tempo (min) C 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 10 20 30 40 50 60 At.f-LR controle O 2 c o n s u m id o ( L ) Tempo (min) D Figura 6. Consumo de oxigênio de A. ferrooxidans-LR (300 µg de proteína total) na presença de 100 mg de rejeito: (A) escória original; (B) escória moída; (C) lama original; (D) lama moída. Apesar dos testes de consumo de oxigênio demonstrarem uma maior oxidação de ferro na menor granulometria dos rejeitos, os estudos de lixiviação foram realizados com o tamanho de partícula original pois, na prática, o fato de diminuir a granulometria pode aumentar os custos de operação dos tratamentos de rejeitos. Biolixiviação da escória (frascos agitados) Na Figura 7A observa-se que a escória apresentou um consumo significativo de ácido durante as primeiras 24 horas de ensaio, conforme previsto no ensaio anterior, em quase todos os tratamentos, exceto naqueles que já continham íon férrico, os quais permaneceram com um pH estável. Nos sistemas onde houve elevação de pH, este foi corrigido pela adição de ácido sulfúrico 0,5 mol L-1. Na presença de A. ferrooxidans, o potencial de oxi-redução (medido com eletrodo de referência Ag/AgCl/KCl(Sat)) manteve-se ao redor de 600 mV durante todo o período do ensaio (Figura 7B), enquanto nos controles abióticos, o potencial 54 se manteve ao redor de 350 mV. Após 14 dias de ensaio o potencial elevou-se no frasco controle com adição de Fe2+. O controle com adição de Fe3+ apresentou Eh elevado durante todo o período de ensaio. Com os frascos sem adição de ferro pode ser visto que houve uma solubilização do íon ferroso a partir da escória o qual foi oxidado rapidamente pelas bactérias no frasco inoculado enquanto no frasco abiótico a oxidação química do ferro foi lenta como ocorre naturalmente. Na escória, a solubilização de cobre e níquel não foi afetada pelo aumento do Eh, somente pela concentração de ácido na solução. 0 2 4 6 8 10 12 14 1,6 2,0 2,4 2,8 3,2 p H Tempo (dias) A 0 2 4 6 8 10 12 14 200 300 400 500 600 E h /m V (v s A g /A g C l/ K C l (s a t) ) Tempo (dias) B Figura 7. Variação do pH (A) e potencial de óxido-redução (B) nos experimentos de biolixiviação da escória (frascos agitados). Frascos inoculados (símbolos cheios), controles (símbolos vazios). (■) meio sem adição de íon ferroso; (●) meio suplementado com 120 mmol L-1 Fe2+; (▲) meio de cultivo crescido com 120 mmol L-1 Fe3+. . As setas indicam o momento da correção ácida. As concentrações de níquel e cobre em solução a partir da lixiviação bacteriana podem ser observadas na Figura 8. Estão apresentados os valores de extração expressos em concentração (mg L-1). No caso do níquel, todos os frascos apresentaram o mesmo comportamento, obtendo-se valores muito semelhantes. No entanto, a curva para o cobre foi um pouco diferente. Neste caso a maioria dos cultivos bacterianos apresentou valores mais altos de solubilização de cobre do que aqueles apresentados pelos controles. 55 0 2 4 6 8 10 12 14 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 N i e xt ra id o (m g L-1 ) Tempo (dias) A 0 2 4 6 8 10 12 14 0 2 4 6 8 10 12 C u ex tr ai do ( m g L-1 ) Tempo (dias) B Figura 8. Extração de níquel (A) e cobre (B) nos sistemas de biolixiviação da escória (frascos agitados). Frascos inoculados (símbolos cheios), controles (símbolos vazios). (■) meio sem adição de íon ferroso; () meio suplementado com 120 mmol L-1 Fe2+; (▲) meio de cultivo crescido com 120 mmol L-1 Fe3+. Na biolixiviação da escória extraiu-se quase 50% de Ni solúvel, tanto nos frascos bacterianos quanto nos estéreis. A partir do conteúdo total extraiu-se só 13%. No caso do cobre, apesar de que a escória tem uma quantidade similar de ambos os metais, as porcentagens de extração foram mais baixos tanto na porção solúvel quanto a total (Tabela 9). Posteriormente ao processo de lixiviação os sólidos foram analisados por difração de raios X para determinar as mudanças das fases mineralógicas. Na Figura 9 são apresentados os difratogramas de cada sólido. Não foram encontradas mudanças significativas em relação aos difratogramas originais, exceto pela presença de pequenos picos de jarosita, especialmente nos sólidos biolixiviados com adição de íon férrico. 56 Tabela 9. Porcentagens de extração após 14 dias de biolixiviação da escória em frascos agitados. Frascos Ni solúvel (%) Ni total (%) Cu solúvel (%) Cu total (%) Inoculado sem ferro 46 13 32 8 Controle 50 13 22 5 Inoculado com adição de íon ferroso 46 12 31 8 Controle 46 12 30 7 Inoculado e com íon férrico 43 11 17 4 Controle 38 10 16 4 10 20 30 40 50 60 70 FF FF F F F F J J J J C 2 CuK FF FF F FF F J J B 3 0 0 3 0 0 3 0 0 FF J F F F F FF A Figura 9. Difração de raios X dos sólidos após 14 dias de biolixiviação. (A) meio sem adição de íon ferroso; (B) meio suplementado com 120 mmol L-1 Fe2+; (C) meio de cultivo crescido com 120 mmol L-1 Fe3+; Símbolos: J: jarosita; F: faialita/forsterita. Vários estudos têm reportado a formação de hematita e/ou goetita a partir da oxidação de faialita, mas em nosso trabalho as análises por DRX não revelaram tais precipitados e sim uma formação incipiente de jarositas a partir das lixiviações da escória. As jarositas [XFe3(SO4)2(OH)6] são formadas pela precipitação do íon férrico em meios contendo sulfato, como os encontrados na lixiviação bacteriana de 57 sulfetos minerais. Várias espécies de jarosita podem ser formadas dependendo do tipo do cátion são elas: K+ (potássio jarosita), NH4 + (amônio jarosita), Na+ (natro jarosita) e H3O + (hidrónio jarosita) (BEVILAQUA et al., 2002; DAOU; KARAMANEV, 2006).] Uma diminuição na dissolução de metais pode ser atribuída à formação de uma camada inibitória para a difusão dos íons ou precipitados na superfície do rejeito. A formação de um produto rico em ferro sobre a superfície é consistente com a química da solução, onde se observou a geração de íon férrico mediante a curva de potencial de oxi-redução e o aparecimento de picos de jarosita. Por outro lado, segundo Santelli et al., (2001) o Fe3+ gerado ou adicionado, (como nos ensaios inoculados com íons ferroso e férrico) tem um efeito negativo na dissolução de materiais silicatados como faialita. Segundo os autores, uma concentração de Fe3+ de 5 mmol L-1 é fortemente inibitória para a dissolução da faialita e cerca de 80 - 90% do ferro adicionado foi precipitado durante os experimentos (3 meses), gerando uma camada de, aproximadamente, 600 a 700 nm de espessura sobre a superfície do mineral, caracterizada pela fase mineralógica de goetita. Em nosso estudo, os experimentos continham 120 mmol L-1 de ferro adicionado como sulfato ferroso ou como íon férrico nas culturas crescidas. Essa quantidade foi muito maior do que a utilizada no estudo de Santelli, o que poderia ter gerado uma quantidade de precipitados muito maior do que a encontrada por esses autores. No entanto, como o tempo de ensaio em nossos estudos não ultrapassou 15 dias, a quantidade de precipitados formada era ainda incipiente. Outra possível explicação para a supressão da dissolução da escória na presença de micro-organismos e/ou Fe3+ é que este ferro hidrolizado se adsorve na superfície mineral, passivando-a quimicamente. Esta passivação química das superfícies também tem sido sugerida para outros metais e outros minerais. Conseqüentemente, superfícies de faialita que contenham íons férricos adsorvidos (adicionado ou gerado a partir da oxidação pelos micro-organismos), poderiam ser significativamente menos reativas (SANTELLI et al., 2001; WELCH; BANFIELD, 2002). Segundo Valix, Tang e Cheung (2001) o níquel pode ser adsorvido em mineral laterítico (caracterizado por oxi-hidróxidos de ferro e/ou óxidos de silício), dependendo das condições de acidez do meio. Esta adsorção teria como resultado uma diminuição da concentração de níquel solúvel. A proporção da adsorção do metal vai depender, também, do tipo de mineral a ser dissolvido. 58 A escória utilizada neste trabalho está constituída de óxidos de silício com ferro e/ou magnésio e os ensaios de biolixiviação foram realizados em pH inicial de 1,8 e chegaram a subir até 3,0. Por tanto, nessas condições é possível que nesse material tenha acontecido este tipo de fenômeno de adsorção de metais lixiviados. Lixiviação ácida estática da escória (pilhas) Considerando os resultados dos testes de consumo de ácido e da biolixiviação da escória, na qual a solubilização dos metais nos frascos abióticos foi similar aos frascos inoculados, realizou-se outra série de ensaios para lixiviar os metais de interesse a partir da escória. A Tabela 10 resume as porcentagens de extração de níquel, cobre e cobalto (porção solúvel) obtidas em cada pilha de escória lixiviada. A Tabela 10 ilustra, também, a quantidade de ácido sulfúrico consumido durante a lixiviação. Na figura 10 apresenta-se uma fotografia de uma das lixiviações realizadas em pilhas após secagem. Como se pode observar na Tabela 10, encontrou-se, novamente que uma maior concentração de ácido não oferece uma maior extração de metais a partir da escória. A pilha em bandeja lixiviada com H2SO4 5 mmol L-1 obteve a maior porcentagem de extração de níquel e cobalto solúvel de 77% e 17%, respectivamente. Por outro lado, as pilhas lixiviadas com ácido mais concentrado (10 e 18 mol L-1) só obteve-se próximo a 60% do níquel solúvel, entre 55-38% de cobre e 16-13% de cobalto, respectivamente. Banza, Gock e Kongolo (2002) descreveram que durante a lixiviação de escória com ácido sulfúrico ocorre a formação de sílica gel a qual prejudica a extração de metais. Por resultados anteriores, obtidos nesta tese, com outros testes em coluna, encontrou-se que as altas concentrações de ácido sulfúrico aglomeraram a escória e impediram a solubilização por percolação da solução lixiviante. 59 Tabela 10. Porcentagem de recuperação dos metais Ni, Cu e Co em cada pilha ácida e seu correspondente consumo de ácido. Pilha (H2SO4 mol L-1) Consumo de Ácido (kg t-1) Ni solúvel % Cu solúvel % Co solúvel % 18 198 58 38 13 10 243 57 55 16 5,0 196 77 43 17 2,5 153 33 22 7 Figura 10. Lixiviação ácida da escória realizada em pilha. Com todas as pilhas, especialmente com aquelas com maior concentração de ácido sulfúrico, ocorreu a formação de cristais sobre e ao redor da escória. Observou-se, também, uma grande lixiviação de ferro. Vários trabalhos têm reportado a importância de se evitar a dissolução de ferro no tratamento de escórias, já que este elemento pode formar precipitados que cobrem a superfície do material, impedindo o contato entre as partículas da escória e o agente lixiviante e também podem co-precipitar metais (ARSLAN; ARSLAN, 2002; ALTUNDONGAN; BOYRAZLI; TUMEN, 2004). 60 Nos outros testes com pilhas submersas (em bandeja ou em béquer) com ácido 2,5 mmol L-1, obteve quase o mesmo valor de extração dos metais (61-70% de níquel e 16-17% de cobalto respectivamente) sendo um pouco melhor que as pilhas anteriores com maior concentração de ácido além de consumir menos reagente, menos de 153 kg t-1 de ácido. Na Figura 11 observa-se a fotografia do sistema de pilha submersa com 1 kg de escória no primeiro dia. Na Figura 12 pode-se observar a variação do pH durante a lixiviação ácida da escória em béquer. O pH inicial com a concentração avaliada foi muito baixo; porém, observou-se um consumo constante de ácido durante os 28 dias de ensaio. Nos dias 18, 22 e 25 do ensaio o pH foi ajustado adicionando ácido sulfúrico pois na solução o pH aumentou para valores superiores a 2,0. Nos dias posteriores aos ajustes o material continuou consumindo ácido e, conseqüentemente, elevando o pH. A extração dos metais neste caso não foi muita alta, atingindo menos de 700 mg L-1 de níquel e 400 mg L-1 de cobalto, o que representa só 8% para níquel total, 30% de níquel solúvel e 18% e 20% para cobalto total e solúvel, respectivamente. Figura 11. Sistema estático submerso em bandeja com escória. Neste sistema de lixiviação a extração de cobalto teve um comportamento não desejado, pois a concentração do metal em solução não foi constante ou crescente, observando-se uma diminuição com o tempo o que pode ser devido à co- precipitação na ganga ou nos precipitados de ferro que ocorrem em pH maior que 1,8. 61 0 4 8 12 16 20 24 28 0 1 2 3 p H A Tempo (dias) 0 5 10 15 20 25 30 0 100 200 300 400 500 600 700 N i - C o e x tr a íd o ( m g L -1 ) Tempo (dias) Ni Co B Figura 12. Lixiviação ácida da escória no sistema estático (béquer). (A) pH; (B) extração de níquel e cobalto. As setas representam o momento das correções de acidez. A lixiviação da escória em sistemas estáticos permitiu uma boa recuperação de níquel e melhor ainda de cobalto, obtendo-se entre 15 e 20% de Ni total, e entre 75 e 100% de Co total. Essas recuperações ocorreram com um baixo consumo de ácido endógeno para curar a escória. Cabe destacar que a pilha tratada com ácido em uma concentração de 5 mol L-1 foi a que teve um melhor rendimento na extração dos metais. Esta pilha teve a particularidade de ficar curando durante um tempo mais prolongado do que as outras pilhas, e este fato pode ter influenciado para que a solubilização de níquel e cobalto fosse maior. Poderia interpretar-se que o tempo de cura tem um efeito mais relevante no tratamento da escória com esta técnica. Biolixiviação da lama (frascos agitados) Na Figura 13 estão representados as variações de pH e Eh para o ensaio com lama em frascos agitados. Da mesma forma que a escória, a lama também apresentou uma elevação do pH nas primeiras horas de ensaio, que foi corrigido com adição de ácido. Este aumento de pH deve-se ao consumo de ácido pela ganga presente no rejeito, como carbonatos e silicatos. Nos ensaios inoculados o potencial de oxi-redução manteve-se ao redor de 600 mV durante todo o período do ensaio (Figura 13B)