RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 08/09/2024. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA Larissa Rodrigues Pereira Santi Caracterização da expressão gênica do sistema renina- angiotensina em pacientes com SARS-CoV-2 tratados ou não com drogas anti-hipertensivas na presença e ausência de comorbidades associadas Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina,Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Doenças Tropicais. Orientadora: Profª Drª Virgínia Bodelão Richini Pereira Coorientador: Profº Drº Carlos Ferreira dos Santos Botucatu 2022 Larissa Rodrigues Pereira Santi CARACTERIZAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA DO SISTEMA RENINA- ANGIOTENSINA EM PACIENTES COM SARS-CoV-2 TRATADOS OU NÃO COM DROGAS ANTI-HIPERTENSIVAS NA PRESENÇA E AUSÊNCIA DE COMORBIDADES ASSOCIADAS Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Doenças Tropicais. Orientadora: Profª Drª Virgínia Bodelão Richini Pereira Coorientador: Profº Drº Carlos Ferreira dos Santos Botucatu 2022 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE-CRB 8/5651 Santi, Larissa Rodrigues Pereira. Caracterização da expressão gênica do sistema renina-angiotensina em pacientes com SARS-CoV-2 tratados ou não com drogas anti-hipertensivas na presença e ausência de comorbidades associadas / Larissa Rodrigues Pereira Santi. - Botucatu, 2022 Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Faculdade de Medicina de Botucatu Orientador: Virgínia Bodelão Richini Pereira Coorientador: Carlos Ferreira dos Santos Capes: 40101096 1. Sistema renina-angiotensina. 2. Reação em cadeia da polimerase. 3. Expressão gênica. 4. Anti-hipertensivos. 5. COVID-19 (Doença). 6. SARS-CoV-2. Palavras-chave: COVID-19; SARS-CoV-2; Sistema renina-angiotensina. Larissa Rodrigues Pereira Santi CARACTERIZAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA DO SISTEMA RENINA- ANGIOTENSINA EM PACIENTES COM SARS-CoV-2 TRATADOS OU NÃO COM DROGAS ANTI-HIPERTENSIVAS NA PRESENÇA E AUSÊNCIA DE COMORBIDADES ASSOCIADAS Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Doenças Tropicais. Orientador: Profª Drª Virgínia Bodelão Richini Pereira Coorientador: Profº Drº Carlos Ferreira dos Santos Comissão examinadora: ______________________ Profª Drª Marília Afonso Rabelo Buzalaf Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP) - Botucatu ______________________ Profª Drª Ana Carla Pereira Latini Instituto Lauro de Souza Lima - Bauru ______________________ Profª Drª Virgínia Bodelão Richini Pereira Instituto Adolfo Lutz - Centro de Laboratórios Regionais - Bauru Botucatu, 08 de setembro de 2022 Dedicatória Gostaria de dedicar essa pesquisa, primeiramente, a todos os pacientes que, de alguma forma, colaboraram com o estudo, também gostaria de dedicar à todos os profissionais, professores e alunos que trabalharam intensamente na linha de frente para combater e estudar essa doença, à todos que trabalharam na coleta das amostras, nos laboratórios, nas análises, a todos que deixaram de lado o medo de contágio da doença para poder ajudar a população. Em especial gostaria de dedicar esse trabalho a toda equipe de extração e análise da FOB-USP e do Instituto Adolfo Lutz e aos professores Virgínia Bodelão e Carlos Ferreira dos Santos, que encararam esse desafio com maestria e muita dedicação. A ajuda e união de todos fizeram com que esse trabalho árduo valesse a pena. E por fim gostaria de dedicar a conclusão deste trabalho à minha família que esteve ao meu lado em todo momento, acreditando em mim. Aos meus pais Luiz e Luciana e ao meu irmão Lucas, que me incentivaram e não deixaram eu desistir, à minha querida Vó Neise que esteve ao meu lado me ajudando em vários momentos, ao meu noivo Davi que me deu todo apoio para realizar esse projeto. Agradecimentos Gostaria de agradecer a todos que me ajudaram para que este trabalho se concretizasse, especialmente: Ao meu coorientador, professor Drº Carlos Ferreira dos Santos (CROSP 49.884) por ter confiado essa pesquisa a mim e por ter me dado todo suporte necessário e a minha orientadora Profª Drª Virgínia Bodelão Richini Pereira (CRBIO nº 035147/01 D), que também acreditou no meu potencial e me orientou com maestria. Agradeço a eles por toda ajuda e ensinamento. Gostaria de agradecer imensamente a toda equipe multidisciplinar que foi treinada para a realização desse projeto: Ao especialista de Laboratório, Drº Thiago José Dionísio (CROSP 3268) e a Especialista de Laboratório, Drª Marina Morettin Zupelari (CRFa 13827), agradeço por toda disponibilidade e ensinamento na parte de análise laboratorial. À bióloga Drª Elza Araújo Torres (CRBio 270501/01- D) que nos auxiliou muito em relação aos documentos necessários, principalmente, em relação ao CEP. Agradeço à técnica de Laboratório Viviane Aparecida Parisi (CROSP 4059) e à Bióloga e doutora Thais Francini Garbieri (CRBio 97568/01-D) por toda ajuda e aprendizado na área de extração do material genético. Agradeço também à Biomédica e doutoranda Gabriela de Moraes Oliveira (CRBM/SP: 27846), à Dentista e doutoranda Isadora Prado Cano (CROSP:116831), à especialista em laboratório do departamento de bioquímica da FOB/USP Thelma Lopes Silva, ao Alexandre Simões Garcia, técnico de laboratório no setor de radiologia e estomatologia FOB/USP e aos demais colegas que nos auxiliaram em todo esse processo. À médica pneumologista e Diretora Executiva do Hospital Estadual de Bauru, Drª Deborah Maciel Cavalcanti Rosa (CRM/SP107135 / RQE 51303) que nos auxiliou em relação aos prontuários dos pacientes. Agradeço ao Instituto Adolfo Lutz pela parceria para realização deste trabalho. Agradeço ao CEP por ter aprovado a análise das amostras dos pacien tes. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 88887.508433/2020-00. Gostaria de agradecer aos professores Profª Drª Marília Afonso Rabelo Buzalaf e Profº Drº Carlos Magno Castelo Branco Fortaleza pelas contribuições científicas na banca da minha qualificação. Sou imensamente grata aos meus pais que me incentivaram e apostaram em mim para realização dessa pesquisa, ao meu pai que me ajudou na elaboração das planilhas.Agradeço por conhecer cada um e por crescer tanto como pessoa e como profissional, foi uma experiência única, bem cansativa mas muito enriquecedora. RESUMO No início de 2020 a população mundial enfrentou um momento crítico, devido à Coronavírus Disease 2019 (COVID-19), doença que tem como agente causal o Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) que proporcionou vários desafios, afetando a saúde pública e também sistemas econômicos e padrões socioculturais. A Enzima Conversora de Angiotensina (ECA 2), um importante componente do Sistema Renina-Angiotensina (SRA), está relacionada ao processo de infecção do vírus às células do hospedeiro e diferenças em seus níveis de expressão nos diferentes tecidos podem contribuir com a capacidade de infecção do SARS-CoV-2. O objetivo do presente projeto foi caracterizar a expressão gênica, por RT-PCR em tempo real, dos componentes do SRA em pacientes: G1A: Positivos que fazem uso de fármacos anti-hipertensivos atuantes no SRA (tais como antagonistas dos receptores AT1, inibidores da ECA e da Renina) (n=47); G1B: Positivos que não fazem uso (n=49); G2A: Negativos que fazem uso (n=50); G2B: Negativos que não fazem uso (n=50), no momento do diagnóstico laboratorial e relacionar às informações dos registros clínicos como idade, sexo, desenvolvimento do quadro clínico para cura ou óbito, comorbidades associadas, em amostras que foram coletadas no Hospital Estadual de Bauru (HE). Os resultados mostraram um aumento da expressão do receptor MAS e da protease TMPRSS2 em pacientes positivos para COVID-19 que não utilizavam fármacos anti-hipertensivos e para FURIN a expressão foi aumentada nos pacientes sob tratamento anti-hipertensivo, não havendo diferença entre os pacientes positivos ou negativos. Em relação aos parâmetros analisados, foi possível identificar que as comorbidades, com destaque para a hipertensão arterial sistêmica, contribuem para um maior risco no agravamento do quadro clínico da infecção por COVID-19. Porém, o uso de terapia anti-hipertensiva com inibidores da ECA (iECAs) e antagonistas dos receptores (ARBs) não influenciou na expressão gênica dos componentes do SRA e desta forma foi possível uma melhor compreensão dos eventos moleculares relacionados à infecção e desenvolvimento da COVID-19. Palavras-chave: COVID-19, SARS-CoV-2, Sistema Renina-Angiotensina, Reação em Cadeia da Polimerase, Transcrição Reversa. ABSTRACT At the beginning of 2020, the world population faced a critical moment, due to the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a disease that has the Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) as its causal agent, which has provided several challenges, affecting the public health and also economic systems and sociocultural patterns. The Angiotensin Converting Enzyme (ACE 2), an important component of the Renin-Angiotensin System (RAS), is related to the process of virus infection to host cells and differences in their expression levels in different tissues may contribute to the ability to SARS- CoV-2 infection. The objective of the present project was to characterize the gene expression, by real-time RT-PCR, of the RAS components in patients: G1A: Positives who use antihypertensive drugs acting on the RAS (such as AT1 receptor antagonists, ACE and Renin) (n=47); G1B: Positives that do not use (n=49); G2A: Negatives that make use (n=50); G2B: Negatives that do not use (n=50), at the time of laboratory diagnosis and report to information from clinical records such as age, sex, development of the clinical condition for cure or death, associated comorbidities, in samples that were collected at the State Hospital from Bauru (HE). The results showed an increase in the expression of the MAS receptor and the TMPRSS2 protease in positive patients for COVID-19 who did not use antihypertensive drugs, and for FURIN the expression was increased in patients under antihypertensive treatment, with no difference between positive patients. or negative. Considering the parameters analyzed, it was possible to identify that comorbidities, especially systemic arterial hypertension, contribute to a greater risk of worsening the clinical picture of COVID-19 infection. However, the use of antihypertensive therapy with ACE inhibitors (ACE inhibitors) and receptor antagonists (ARBs) did not influence the gene expression of the RAS components and, in this way, a better understanding of the molecular events related to the infection and development of COVID-19 was possible. Key-words: COVID-19, SARS-CoV-2, Renin-Angiotensin System, Polymerase Chain Reaction, Reverse Transcription. Sumário 1. INTRODUÇÃO 8 2. OBJETIVOS 16 2.1. Primário 16 2.2. Secundário 16 3. MATERIAL E MÉTODOS 18 3.1. Aspectos éticos 18 3.2. Amostras e infraestruturas laboratoriais 18 3.3. Isolamento e purificação do RNA viral 20 3.4. Reação de RT-PCR em tempo real para identificação do SARS-CoV-2 20 3.5. Separação dos pacientes em grupos 22 3.6. Reação de PCR para os componentes do SRA 23 3.7. Análise estatística 24 4. RESULTADOS 27 4.1. Caracterização das amostras de COVID-19 27 4.2. Caracterização expressão gênica do Sistema Renina-Angiotensina 31 5. DISCUSSÃO 37 6. CONCLUSÃO 43 7. INTERCORRÊNCIAS 45 8. REFERÊNCIAS 47 ANEXOS 54 8 INTRODUÇÃO 9 1. INTRODUÇÃO Coronavírus (CoVs) são membros da família Coronaviridae e representam um grupo diversificado de vírus capazes de causar infecções respiratórias e intestinais em humanos e animais (CUI et al., 2019). No entanto, nas últimas décadas, alguns coronavírus altamente patogênicos, como o SARS-CoV e o Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), surgiram causando doenças respiratórias graves com alta taxa de mortalidade e contaminação por volta dos anos de 2002 e 2012, respectivamente (GUO et al., 2020; PINTO et al., 2020; GORBALENYA et al., 2020; WHO Interim Guidance 2020). Em dezembro de 2019, os primeiros casos de uma pneumonia de etiologia desconhecida foram reportados em Wuhan (Hubei, China) (GUO et al., 2020; LU et al., 2020). O agente causal foi nomeado pelo Coronavírus Study Group (CSG) do International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) e pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como SARS-CoV-2. A doença foi denominada COVID- 2019 pela OMS, que rapidamente se espalhou por diversos outros países e se transformou em uma pandemia global em 2020 (GUAN et al., 2020; HUANG et al., 2020; ZHU et al., 2020; WHO, 2020). A infecção pelo SARS-CoV-2 pode variar de casos assintomáticos, oligossintomáticos, até quadros moderados, graves e críticos, sendo necessária atenção especial aos sinais e sintomas que indicam piora do quadro clínico que exijam a hospitalização do paciente (LONG et al., 2022). De acordo com a OMS, a maioria dos pacientes com COVID-19 (cerca de 80%) podem ser assintomáticos ou oligossintomáticos, cerca de 20% requerem atendimento hospitalar por dificuldade respiratória e, desses, aproximadamente 5% podem apresentar a forma crítica da doença, com complicações como falência respiratória, sepse e choque séptico, tromboembolismo e/ou falência múltipla de órgãos, incluindo lesão hepática ou cardíaca aguda e requerem cuidados intensivos (WHO, 2020). O painel interativo de rastreamento de casos de COVID-19 em tempo real do Center for Systems Science and Engineering (CSSE) da Johns Hopkins University (JHU) (DONG et al., 2020) informou que desde o início da pandemia 10 até julho de 2022 mais de 580 milhões de casos foram registrados no mundo, com mais de 6 milhões de mortes. No Brasil, foram confirmados mais de 34 milhões de casos e 680 mil óbitos. No Estado de São Paulo, os casos ultrapassaram 5,9 milhões e o número de óbitos 170 mil (SEADE, 2022). Estudos a respeito das características epidemiológicas da COVID-19 revelaram condições e fatores de risco a serem considerados para possíveis complicações, tais como: idade igual ou superior a 60 anos, tabagismo, obesidade, miocardiopatias, hipertensão arterial, doença cerebrovascular, pneumopatias graves ou descompensadas, imunodepressão e imunossupressão, doenças renais crônicas em estágio avançado, diabetes, doenças cromossômicas com estado de fragilidade imunológica, neoplasia maligna, doença hepática crônica, algumas doenças hematológicas (CDC, 2020). Porém, em decorrência da implementação das vacinas, iniciada em 2021, esse quadro se alterou. A vacinação, além de gerar proteção contra os sintomas graves da doença, diminuiu significativamente a propagação do vírus e consequentemente reduziu a taxa de infecção (VITIELLO et al., 2021). Também é necessário considerar que mutações adaptativas no genoma viral aconteceram ao longo da pandemia, com o surgimento de variantes de preocupação (VOCs), tais como a Alpha, Beta, Gamma, Delta e Ômicron, associadas a maior transmissibilidade ou virulência, redução na neutralização por anticorpos e desta forma, ainda há dúvidas sobre o tempo de duração da imunidade natural ou obtida por meio da vacinação (ALEEM et al., 2022; ZENG et al., 2022). Alguns estudos demonstraram que certas comorbidades associadas contribuem para uma maior suscetibilidade a gravidade da doença e que o Sistema Renina-Angiotensina (SRA) desempenha uma participação importante, tanto na infecção pelo SARS-CoV-2, quanto na maioria das comorbidades associadas que parecem contribuir para uma evolução mais grave e intensa da doença e maior porcentagem dos casos de óbito, demonstrando seu grande envolvimento em ambas situações (INGRAHAM et al., 2020; PINTO et al., 2020; PATHANGEY et al., 2021). O SRA é conhecido, principalmente, por ser importante na regulação da pressão sanguínea e balanço eletrolítico. Além do SRA sistêmico, a existência 11 de SRA localmente em tecidos tem sido descrita, bem como, diversas outras funções vêm sendo atribuídas às moléculas deste sistema, como por exemplo na inflamação, participando de maneira endócrina, parácrina e autócrina (SANTOS et al., 2015). A cascata de eventos bioquímicos do SRA tem início com a liberação da renina (sintetizada nos rins) para a circulação, a qual atua clivando seu substrato, o angiotensinogênio (ANGT – liberado pelo fígado), no decapeptídeo Ang I ou Ang 1-10, ao qual não são atribuídas funções biológicas importantes. No entanto, quando clivado no octapeptídeo Ang II ou Ang 1-8, por meio da ação da Enzima Conversora de Angiotensina (ECA), torna-se uma das moléculas-chave deste sistema, e que tem sua atuação por meio da ligação em seus receptores específicos AT1 e AT2. Tanto a Ang I quanto a Ang II servem como substrato para síntese de outra molécula importante deste sistema, a Ang 1-7, por meio da atuação da ECA2, presente principalmente no endotélio dos pulmões (HAMMING et al., 2004; FYHRQUIST; SAIJONMAA, 2008; BENIGNI; CASSIS; REMUZZI, 2010) (Figura 1). Essa mesma proteína de membrana, ECA2, que faz parte do SRA, tem sido considerada facilitadora da ligação entre o SARS-CoV-2 e a célula hospedeira, sendo crucial no processo de infecção (ZHOU et al., 2020) Figura 1- Esquema de eventos bioquímicos que ocorrem na cascata do Sistema Renina-Angiotensina. 12 Fonte: Adaptado de FYHRQUIST; SAIJONMAA, 2008. Especificando, o SARS-CoV-2 é um vírus de RNA de fita simples, de sentido positivo e envelopado de gênero Betacoronavirus. Ele é composto pelas proteínas estruturais: nucleocapsídeo, membrana, envelope e spike (JACKSON et al., 2022). A proteína estrutural spike realiza uma ligação com o domínio receptor da enzima conservadora de angiotensina-2 (ECA-2), facilitando dessa forma a entrada do patógeno na célula-alvo. Porém, para que ocorra a replicação viral intracelular, é necessária a coexpressão de ECA-2 e de uma outra protease, denominada TMPRSS2, na superfície da célula hospedeira. Essas duas proteases que participam da entrada do vírus na célula hospedeira, além de estarem presentes no trato respiratório, também estão nas células miocárdicas, células renais, gastrointestinais, hepatobiliares, pancreáticas e até em células neurológicas, ou seja, isso pode explicar a lesão múltipla dos órgãos e consequentemente a presença de sintomas variados (GONZALES; SOUZA, 2020). Há, ainda, outras proteases celulares sendo consideradas importantes na infecção da célula hospedeira, como a Furin (codificada pelo gene FURIN) (MILLET; WHITTAKER, 2015; KLEINE-WEBER et al., 2018; HOFFMANN et al., 2020). Existem diversas classes de medicamentos que atuam em diferentes pontos da cascata do SRA, sejam inibidores da ECA (por exemplo o Captopril e Enalapril) ou antagonistas dos receptores da angiotensina (por exemplo Losartan e Olmesartan) (RIBEIRO; FLORÊNCIO, 2000). Muitas dúvidas têm sido levantadas sobre a utilização destes fármacos nos pacientes durante a infecção pelo SARS-CoV-2, se elas podem diminuir o processo de infecção das células hospedeiras ou até mesmo piorar esse processo de infecção, uma vez que podem aumentar a expressão de ECA2, como é o caso dos bloqueadores dos receptores da angiotensina II, ou até mesmo aumentar as lesões no epitélio pulmonar por conta de uma maior disponibilidade de Ang II que, ligada ao receptor AT1, exerce atividades pró-inflamatórias. É evidente essa divergência 13 na comunidade científica, onde alguns defendem o uso de bloqueadores do receptor da angiotensina II como terapêutica para reduzir a gravidade dos casos de COVID-19 e outros argumentam que o uso destes fármacos pode ser potencialmente prejudicial e sugerem até mesmo que estes fármacos sejam substituídas por outras classes (ESLER; ESLER, 2020; GURWITZ, 2020). Diante desse impasse científico, essa avaliação dos aspectos moleculares associados ao SRA relacionados aos dados clínicos dos pacientes diagnosticados com COVID-19 é de extrema valia. Uma revisão sistemática com meta-análise, demonstrou que a expressão de ECA2 é aumentada em pulmões de pacientes com comorbidades associadas, infectados pelo SARS-CoV-2 e considerados casos mais graves em comparação aos casos controle. Esse estudo verificou, ainda, que os alvos IL-6 e INS (gene que codifica o hormônio insulina) estavam associados a todas as doenças pesquisadas (PINTO et al., 2020). Neste mesmo trabalho, os autores também verificaram aumento da expressão de NAD-dependent histone deacetylase Sirtuin 1 (SIRT1) em mais da metade dos estudos incluídos na revisão sistemática e meta-análise. Além de estar envolvido na sinalização de insulina (LIANG; KUME; KOYA, 2009) o SIRT1 também pode regular epigeneticamente a ECA2, sob condições de estresse de energia celular (CLARKE et al., 2014), o que demonstra a ligação entre fatores moleculares relacionados ao diabetes, uma doença de acometimento importante na população mundial atual, e a expressão de componentes do SRA que parecem interferir na infecção pelo SARS-CoV-2 e no desenvolvimento dos casos mais graves de COVID-19. Assim, ponderando todo o exposto e considerando que a pandemia de COVID-19 está em curso, destaca-se a necessidade de cooperação científica global no avanço da compreensão dos mecanismos envolvidos no SRA e o comportamento da expressão gênica dos componentes do SRA nestas células onde o vírus se encontra e associar ao desenvolvimento do quadro clínico dos pacientes acometidos ou não pelo SARS-CoV-2 e que fazem uso crônico ou não de fármacos que atuam no SRA. Vale salientar que a enzima ECA2, além dos outros componentes do SRA, foi encontrada em glândulas salivares em trabalho publicado pelo nosso grupo de pesquisa (CANO et al., 2019), bem como em células epiteliais orais (XU et al., 2020) e nasais humanas (SUNGNAK et al., 14 2020). Portanto, as hipóteses do presente estudo foram que, a expressão gênica dos componentes do SRA é modulada de maneira diferente em sujeitos positivos ou negativos para a COVID-19, diferindo ainda quanto às comorbidades associadas e medicamentos atuantes na cascata de eventos bioquímicos do SRA utilizados previamente o diagnóstico. E pacientes que fazem uso de bloqueadores do receptor AT1 da Ang II ou inibidores da ECA, previamente ao diagnóstico da COVID-19, possuem desenvolvimento clínico menos favorável dos sintomas relacionados à COVID- 19 em comparação àqueles que não fazem o uso, devido à maior disponibilidade de ECA2 nos pacientes em tratamento com estas drogas, colaborando dessa forma com a tomada de decisões médicas, se esses pacientes, que fazem uso de medicamentos atuantes no SRA, devem parar ou não de tomar esses medicamentos uma vez que positivaram para o SARS-CoV 2. 15 OBJETIVOS 46 REFERÊNCIAS 47 8. REFERÊNCIAS ALCÂNTARA, Enner et al. 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