UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS CÂMPUS DE BOTUCATU AVALIAÇÃO DE RESÍDUOS ORGÂNICOS PARA O MANEJO DE FUSARIOSE EM DIFERENTES PATOSSISTEMAS CASSIANO FORNER Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da Unesp – Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia (Proteção de Plantas). BOTUCATU – SP Janeiro – 2016 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS CÂMPUS DE BOTUCATU AVALIAÇÃO DE RESÍDUOS ORGÂNICOS PARA O MANEJO DE FUSARIOSE EM DIFERENTES PATOSSISTEMAS CASSIANO FORNER Orientador: Dr. Wagner Bettiol Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da Unesp – Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia (Proteção de Plantas). BOTUCATU – SP Janeiro – 2016 III “Bem-aventurado o homem que acha sabedoria, e o homem que adquire conhecimento. Porque é melhor a sua mercadoria do que artigos de prata, e maior o seu lucro que o ouro mais fino. Mais preciosa é do que os rubis, e tudo o que mais possas desejar não se pode comparar a ela.” Provérbios 3:13-15 IV DEDICO Aos meus pais Luiz Forner e Marisa Pavan Forner, minha irmã Talita Forner, que apesar da distância, participaram ativamente na minha formação, ajudando e incentivando a suportar os momentos difíceis. V AGRADECIMENTOS A Deus, pela força de todos os dias em atingir essa conquista. À minha namorada Gabriela De Cia Moraes, pela paciência, ajuda, carinho e atenção em todas as horas. À sua família, Angélica De Cia, André Moraes e Marcelo De Cia Moraes, por me adotarem como um filho. Ao Dr. Wagner Bettiol, por ser meu segundo pai, pela orientação, paciência, ensinamentos e risos que proporcionou. Ao orientador de graduação Dr. Idalmir dos Santos, por introduzir a pesquisa a um estudante de agronomia perdido e abrir os seus olhos a um novo mundo. Aos amigos Alex Marcelo Menegazzo, Max William Pellegrini, Daniel Silveira, pelos conselhos, força e momentos de descontração. Agradeço aos meus avos: Armindo, Miraci, Catarina, Raimundo (in memoriam), tios: Nilza, Guido (in memoriam), Nelvi, Amarildo, Rosane, Teresinha, Maximino, Alécio, Aclécio, Renata, Carlos, Nani, Benildo, Soeli, Jurema, Moacir, Marcílio, Luiza, Claudete, Nilton, Loidir, Nair, Junice (in memoriam), Domingos, Décia, Alcides; Primos: Max, Lucas, Daniel, Bruna, Eduardo, Igor, Rodrigo, Amanda, Gabriela, Gustavo, Maristela, Roni, Talise Mírian, Leuri, Patrícia, Fernando, Sandro, Samuel, Adriane, Renan, Tiago, Alesane, Camila, Nicholas, Erick, Anthony, Henrique, Gabriela, Nathalia, Alan, Derli, Marisa, André e Ana Alice, pelo apoio em seguir em frente. À UNESP/FCA, por permitir a realização do curso. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela concessão da bolsa de estudos de doutorado e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de estudos de doutorado sanduíche. VI À Universidade de Guelph, pela oportunidade de realizar trabalhos. À Embrapa Meio Ambiente, por disponibilizar a infraestrutura na condução dos experimentos. Ao Dr. Paul Goodwin, da Universidade de Guelph, por me aceitar como aluno no doutorado sanduíche. Ao Dr. Eugenio Sanfuentes Von Stowasser, da Universidade de Concepción, pelos trabalhos realizados em conjunto. Aos professores do Programa de Pós Graduação em Proteção de Plantas: Antonio Carlos Maringoni, Edson Luis Furtado, Silvia Renata Siciliano Wilcken, Carlos Gilberto Raetano, Renate Krause Sakate, Marcelo Agenor Pavan, Carlos Frederico Wilcken, Adriana Zanin Kronka, Raquel Ghini e Wagner Bettiol, pelo aprendizado e estimulo. Aos amigos de convívio, em especial, Dalton Dorighello, Mariana Monadez, Renato Boreli Silva, André Carvalho, Michelli de Souza Santos, Mauricio Martins, Regiane Iost, Guilherme Navarro, Rosilene Iost Navarro, Alba Iost Navarro, Larissa Rezende, Daniel Winter Heck, José Abrahão Haddad Galvão, Wilson Antonioli, Fábio Sérgio, Mateus Santos, Gustavo Venturini, Pamela Palmeira, Thiago Cedran, Rebeca Ramos, Tainá Oliveira, Daniella Gregório, Raissa Sylvestrin Stancatte, Francini Rodrigues, Marcos Madeira, Danilo Tosta, Ana Paula Andrade Braga, Zayame Vegette Pinto, Alexandre Visconti, Rodrigo Estevam de Oliveira Mac Leod, Carlos Eduardo Oliveira da Silva, Juliano César Silva, Muricy Morais, Leonardo José da Silva, Daniel Hinz, Fernanda Ribeiro de Andrade Oliveira, Vanessa Nessner Kavamura, Leandro Tomio, Luana Piermann, Luiz Alexandre Sereda, Suikinai Nobre Santos, Lúcio Bertoldo Costa, Fábio Luiz Soares Júnior, Rodrigo e Natália Taketani, Rafael Eduardo Silva, Wallace Rafael de Souza, Andressa Brida, Patrícia Leite, Marcelo Soman, Lucivane Gonçalves, Paula Leite VII dos Santos, Luiz Eduardo da Rocha Pannuti, Tatiane Mituti, Felipe Renzi, Bernardo Tomchinsky, Raphael Travaglini, a todos os colegas de graduação em Agronomia da UTFPR, em especial Benhur Azzolini, Maicon Lucini, Lucas Cieslik, Anderson Signorini, Giovani Dinon, Josemar Nesi, Rafael Talheimer, Luis Carlos Plucinski Filho, Renan Mosquen, Felipe Grisa, Emerson Trogello, Tacyani Cristina, Eduardo Pagliosa e Laurês Cieslik, amigos de Marmeleiro, Francisco Beltrão, Pato Branco e Jaguariúna que não mencionei, mas foram importantes direta ou indiretamente. Aos amigos canadenses: Doug Tonner e Mary Tonner (in memoriam), seus filhos e netos, por me adotarem neste período de um ano. Aos colegas da Universidade de Guelph: Amanda, Jie, Alma, Weihong, Jamison, Sarah, Ana Lucia, Judith, Megan e Molly, pelo convívio. Aos amigos de Guelph, em especial aos colegas de Jiu Jitsu da Sisu, pelos momentos de alegria. Aos amigos chilenos da Universidade de Concepción: Daniela Alejandra e família, Erwin Guzmán Riffo, Adrián Garrido, Angélica, Diego Musiet Soto, Felipe Balocchi, Graciela Suárez, Javier Rodolfo Estrada Arias, Fernando Contreras Ruiz, Jocelyn Esquivel San Martin, Karina Vargas, José Leonardo García, Marco Sabag, Paulina Geraldine, Sebastián Nicolás Fajardo Acuña e Myriam Solís García. Aos colegas de convívio: Benner Giacomozzi Sepúlvera, Santiago Mafla Andrade, Pablo Fernández Vásquez, Camila Pinto, Constanza Ramírez Alegría, Felipe Andres Cruz Meza, Gabi Lilu Narváez, Leticia Poblete Cepeda, Jan Schwimmer, Valentina Arriaza, Alicia Ferrada e Juan Carlos Arriaza Torres. Aos colegas de Jiu Jitsu Nova União (Chile): Reinaldo Duguet, Daniel Vieira, Adrián Parada Vidal, Claudio Lagos Lagos, Cristian Cordova, Cristopher Cifuentes Ambiado, Dennin Ucas, Fabian Salazar Galleguillos, Felipe Albornoz Lagos, Hans Lemp, Juan Pablo, Luciano Quiero Acevedo, Manuel Alejandro, Mauricio Barros, Pablo Arias Garcés, Rafael Molina e Diego. VIII Aos técnicos do Laboratório de Microbiologia Ambiental: João Luiz da Silva, Rosely dos Santos Nascimento, Elke Dias Simone Vilela, Márcia Maria Parma, Anamaria Ferreira Mayer Dentzien e Tatiana Alvez Rigamonte Fernandes, pela ajuda. Aos pesquisadores e funcionários da Embrapa Meio Ambiente, pela ajuda. Aos companheiros de treino de Muay thai, capoeira e da Equipe Conexão Jiu-Jitsu: Alex Marcelo Menegazzo, Mestre Cristiano Cecon, Renato Machado, Luciano Domingues, Fernando Salla, Leandro Fonseca, Marclei Neves, Fernão Zanon, Adriano Sisti, Alexandro Ruiz, Alexandre Giardiello, Andre Troitino, Raul Ramos, Emerson Vieira, Pedro Dell Vecchio, Tiago Ribeiro, Vitor Rol, Eduardo Azevedo, Gustavo Siviero, Jair Gomes da Rosa, Deividy Gardel, Volnei Felipeto, Tiago Leopoldo, Arthur Menegazzo e a todos os outros que ajudaram a superar os problemas e apoiaram em toda a caminhada do curso. IX SUMÁRIO 1 RESUMO ..................................................................................................................... 1 2 SUMMARY .................................................................................................................2 3 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 3 4 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................... 5 4.1 Agentes de controle biológico ..................................................................................................8 4.1.1 Trichoderma sp. ....................................................................................................................8 4.1.2 Bacillus sp. ............................................................................................................................9 4.2 Patossistemas ......................................................................................................................... 10 4.2.1 Fusarium oxysporum f. sp. lactucae..................................................................................... 10 4.2.2 Fusarium circinatum x Pinus radiata .................................................................................. 12 4.2.3 Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici x tomateiro .............................................................. 13 CAPÍTULO 1 EFEITO DA INCORPORAÇÃO DE MATERIAIS ORGÂNICOS SOBRE A GERMINAÇÃO DE CONÍDIOS DE Fusarium oxysporum f. sp. lactucae.................. 16 Resumo........................................................................................................................................ 17 Abstract ....................................................................................................................................... 18 INTRODUÇÃO ........................................................................................................................... 19 MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................................... 21 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................................. 23 AGRADECIMENTOS ................................................................................................................. 28 REFERÊNCIAS .......................................................................................................................... 28 CAPÍTULO 2 EFEITO DE RESÍDUOS ORGÂNICOS E Trichoderma harzianum NO CONTROLE DE Fusarium circinatum EM Pinus radiata .................................................................. 39 RESUMO .................................................................................................................................... 40 ABSTRACT ................................................................................................................................ 40 INTRODUÇÃO ........................................................................................................................... 40 MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................................... 42 Multiplicação do patógeno e antagonista ...................................................................................... 42 X Materiais orgânicos ...................................................................................................................... 43 Efeito dos resíduos orgânicos incorporados ao solo sobre a germinação de microconídios. ........... 43 Experimento em casa de vegetação .............................................................................................. 44 Análise estatística ........................................................................................................................ 44 RESULTADOS ........................................................................................................................... 45 Efeito dos resíduos orgânicos incorporados ao solo sobre a germinação de microconídios ............ 45 Experimento em casa de vegetação .............................................................................................. 45 DISCUSSÃO ............................................................................................................................... 45 CONCLUSÃO ............................................................................................................................. 47 AGRADECIMENTOS ................................................................................................................. 47 LITERATURA CITADA ............................................................................................................. 47 CAPÍTULO 3 HIDROLISADO DE PEIXE ASSOCIADO A Trichoderma harzianum e Bacillus spp. NO CONTROLE DA MURCHA DE FUSARIUM EM TOMATEIRO ...................... 58 Resumo........................................................................................................................................ 59 Abstract ....................................................................................................................................... 60 INTRODUÇÃO ........................................................................................................................... 60 MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................................... 63 Infestação do solo, incorporação do hidrolisado de peixe e tratamento de produtos biológicos ...... 64 Análise estatística ........................................................................................................................ 66 RESULTADOS ........................................................................................................................... 66 Severidade da doença ................................................................................................................... 66 pH e condutividade elétrica .......................................................................................................... 67 Desprendimento de CO2 ............................................................................................................... 67 DISCUSSÃO ............................................................................................................................... 68 CONCLUSÃO ............................................................................................................................. 73 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................................... 73 4 CONSIDERAÇÕES FINAIS .................................................................................... 82 5 CONCLUSÕES ......................................................................................................... 83 6 REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 84 1 AVALIAÇÃO DE RESÍDUOS ORGÂNICOS PARA O MANEJO DE FUSARIOSE EM DIFERENTES PATOSSISTEMAS. Botucatu, 2016. 94f. Tese (Doutorado em Agronomia/Proteção de Plantas) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista Autor: CASSIANO FORNER Orientador: Dr. Wagner Bettiol 1 RESUMO Os resíduos orgânicos e agentes de biocontrole podem constituir em alternativas no controle dos fitopatógenos habitantes do solo. O trabalho teve por objetivo estudar o controle de Fusarium spp. com resíduos orgânicos e agentes de biocontrole. Inicialmente foi avaliado o efeito de hidrolisado e emulsão de peixe, nas concentrações de 0, 10, 20, 30, 40 e 50% do volume de água para atingir a capacidade de campo do solo; e de alga, casca de camarão, concha de marisco e caroço de abacate moídos, nas concentrações de 0, 1, 2, 3, 4 e 5% v/v, na germinação de microconídios de Fusarium oxysporum f. sp. lactucae, em casa de vegetação. Enquanto a emulsão e o hidrolisado de peixe reduziram a germinação de microconídios do patógeno, os demais resíduos não apresentaram efeito. Também foi avaliado o efeito de resíduos de alga, concha de marisco, casca de caranguejo e repolho triturado fresco, nas concentrações de 0, 1, 2 e 4% v/v, sobre a germinação de microconídios de Fusarium circinatum em condições controladas, e associado ou não, a Trichoderma harzianum, no controle da fusariose (F. circinatum) em plantas de Pinus radiata mantidas em casa de vegetação. Nenhum resíduo reduziu a germinação de microconídios de F. circinatum ou a doença em casa de vegetação. No terceiro estudo foi avaliado o efeito de hidrolisado de peixe nas concentrações de 0, 5, 10, 15 e 20% do volume de água necessário para atingir a capacidade de campo, a partir do solo seco, associados ou não a T. harzianum (Iblf 006) e Bacillus subtilis + Bacillus licheniformis no controle de F. oxysporum f. sp. lycopersici (raça 3) em tomateiro, em casa de vegetação. O hidrolisado de peixe e os agentes de biocontrole não controlaram a doença. Palavras-chave: Alface, Fusarium, matéria orgânica, Pinus, supressividade, tomateiro. 2 EVALUATION OF ORGANIC RESIDUES TO MANAGEMENT OF FUSARIUM IN DIFFERENT PATHOSYSTEMS. Botucatu, 2016. 94f. Thesis (Doctor in Agronomy/Plant Protection) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista Author: CASSIANO FORNER Adviser: Dr. Wagner Bettiol 2 SUMMARY The organic residues and biocontrol agent might be alternative in the control of soilborne plant pathogens. This work aimed to study the control of Fusarium species with organic residues and biocontrol agents. First, the effect of fish hydrolyzed and fish emulsion was evaluated, at concentrations of 0, 10, 20, 30, 40 and 50% of volume of water required to reach the water retention capacity of the soil; and the seaweed, shrimp shells, clamshell and grounded avocado seeds at concentration of 0, 1, 2, 3, 4 and 5% v/v in the microconidia germination of Fusarium oxysporum f. sp. lactucae in greenhouse. Fish emulsion and fish hydrolyzed reduced the microconidia germination and none of the other residues presented effect. Also, it was evaluated the effect of seaweed, clamshell, crab shell and fresh triturated cabbage, at concentrations of 0, 1, 2 and 4% v/v, in the germination of Fusarium circinatum microconidia under controlled conditions and associated or not with Trichoderma harzianum in Pinus radiata to control the disease caused by F. circinatum in greenhouse. Neither residue reduced the F. circinatum microconidia germination or the disease in greenhouse. In the third study the effect of fish hydrolyzed was evaluated at concentration of 0, 5, 10, 15 and 20% of volume of water to required to reach the water retention capacity of the soil, from dry soil, associated or not with T. harzianum (Iblf 006) and Bacillus subtilis + Bacillus licheniformis in the control of F. oxysporum f. sp. lycopersici (race 3) in tomato plants in the greenhouse. Neither residue or biocontrol agents controlled the disease. Keywords: Lettuce, Fusarium, organic matter, Pinus, suppressiveness, tomato. 3 3 INTRODUÇÃO Os fitopatógenos são responsáveis por grandes perdas na agricultura. O gênero Fusarium está entre os mais importantes, pois é de difícil manejo e destaca-se pela agressividade e sobrevivência por longos períodos nas áreas infestadas. Diversos métodos alternativos de controle de fitopatógenos são empregados na agricultura a fim de reduzir ou racionalizar o uso de agrotóxicos e garantir o manejo de doenças de plantas com menor impacto na saúde humana e ambiental. Dentre estes métodos, destacam-se o uso de resíduos orgânicos com potencial de induzir a supressividade do solo aos patógenos habitantes do solo e agentes de biocontrole. Resíduos orgânicos são utilizados na agricultura desde épocas remotas para aumentar a fertilidade dos solos, mas também colaboram como destino final de resíduo da agropecuária, da indústria e urbanos. Estes resíduos podem alterar as características físicas, químicas e biológicas dos solos, fornecendo nutrientes e estimulando a vida do solo, com consequente geração de compostos que podem controlar fitopatógenos. Os agentes de biocontrole estão presentes em muitos solos, exercendo um controle biológico natural nesse ambiente. Entretanto, diversos deles são explorados comercialmente como Trichoderma e Bacillus. Estes agentes de biocontrole podem agir por parasitismo, competição, predação, antibiose, indução de resistência e promoção de crescimento das plantas. Considerando as diversas possibilidades de controle de fitopatógenos e a necessidade de desenvolver práticas de controle alternativas, o estudo objetivou: 1) avaliar o efeito de hidrolisado de peixe, emulsão de peixe, concha de marisco, casca de camarão, alga e caroço de abacate moídos na inibição da germinação de 4 microconídios de Fusarium oxysporum f. sp. lactucae no solo; 2) avaliar o efeito de alga, concha de marisco, casca de caranguejo e repolho fresco triturado sobre a inibição da germinação de microconídios de Fusarium circinatum, além da associação ou não com Trichoderma harzianum, no controle da doença causada por F. circinatum em mudas de pinus; e 3) avaliar o potencial de hidrolisado de peixe, associado ou não a Trichoderma harzianum e Bacillus subtilis + Bacillus licheniformis, no controle de F. oxysporum f. sp. lycopersici (raça 3) em tomateiro. 5 4 REVISÃO DE LITERATURA Vários resíduos orgânicos incorporados ao solo apresentam capacidade de suprimirem fitopatógenos, aumentando a funcionalidade destes resíduos na agricultura. A aplicação de emulsão de peixe ao solo controlou R. solani e Pythium aphanidermatum em rabanete e pepino, sendo esse efeito relacionado com o estimulo da atividade microbiana no substrato e solo (ABBASI, CONN e LAZAROVITS, 2004). Nas concentrações de 0,5 e 1% p/p, a emulsão de peixe também reduziu a murcha de Verticillium em berinjela e a sarna da batata, em alguns dos solos testados (ABBASI, CONN e LAZAROVITS, 2006). Abbasi, Lazarovits e Jabaji-Hare (2009) atribuíram a supressão de microescleródios de V. dahliae aos ácidos graxos voláteis presentes na emulsão de peixe, como ácidos glicólico, acético, fórmico, n-butírico e propiônico. A ação foi maior em solo com pH mais ácido. A ação tóxica da emulsão de peixe depende do solo ou substrato, pois foi maior em solos orgânicos e franco-arenosos, mas não em turfa (ABBASI, LAZAROVITS e JABAJI-HARE, 2009). É importante salientar que a emulsão de peixe não exerceu efeito residual (de um ano de cultivo para o outro) no controle de sarna da batata (ABBASI, CONN e LAZAROVITS, 2006). Outro produto obtido da fermentação de resíduos de peixe, o hidrolisado de peixe também apresenta potencial para induzir a supressividade a fitopatógenos, conforme demonstrado para Cylindrocladium spathiphylli e F. oxysporum f. sp. chrysanthemi (PINTO, BETTIOL e MORANDI, 2010; VISCONTI, BETTIOL e MORANDI, 2010). 6 Dentre os resíduos orgânicos de origem sólida, a casca de camarão na concentração de 4% suprimiu a doença causada por F. oxysporum f. sp. chrysanthemi através das alterações químicas e biológicas no substrato (PINTO, BETTIOL e MORANDI, 2010). Este resíduo também reduziu a doença causada por F. oxysporum f. sp. zingiberi em gengibre, possivelmente devido ao estímulo de actinobactérias, por ação da quitina presente na casca de camarão (GHINI, DOMINGUES e BETTIOL, 2006). B. subtilis (NPU 001), isolado do solo, quando cultivado em meio contendo casca de camarão e caranguejo, libera quitinase que antagoniza F. oxysporum (CHANG, CHEN e WANG, 2010). A quitina extraída de casca de camarão/caranguejo não reduziu a severidade da doença causada por F. oxysporum f. sp. radicis-cucumerinum em pepino, mas houve maior crescimento de planta na ausência do patógeno (ROSE, PARKER e PUNJA, 2003). Porém, a casca de camarão pode ocasionar fitotoxicidade em plantas, dependendo da concentração incorporada ao solo. A concentração de 5% de casca de camarão ao solo causou a morte das plantas de crisântemo, relacionado a alta concentração de nitrato no substrato (PINTO, BETTIOL e MORANDI, 2010). Em gengibre, a concentração de 20% v/v reduziu o desenvolvimento da planta comparado à concentração de 15% (GHINI, DOMINGUES e BETTIOL, 2006). Outros resíduos orgânicos sólidos podem ser utilizados na agricultura para o controle de doenças de plantas. Benchimol, Sutton e Dias-Filho (2006) verificaram que a mortalidade de mudas de pimenteira-do-reino por F. solani f. sp. piperis foi reduzida em 20% com a adição de 1% de casca de caranguejo ao solo. Visconti (2011) verificou que com 6% de pó de concha de marisco, incorporada ao substrato ocorreu redução da doença causada por R. solanacearum em tomateiro, possivelmente associada ao nitrogênio presente no resíduo e a elevação do pH do substrato. No caso de algas, alguns autores não demonstraram efeitos diretos sobre a germinação do patógeno. Paulert et al. (2009) e Gonçalves e Stadnik (2012), estudando o efeito de extratos solúveis e insolúveis em metanol e solução aquosa de ulvana (Ulva fasciata) na germinação de conídios de Colletotrichum lindemuthianum e Colletotrichum gloeosporioides, não verificaram efeito direto desses extratos. A adição ao solo de pó de algas Stokeyia variabile, Spatoglossum variabile e Melanothamnus afaqhusainii, duas semanas antes da semeadura de berinjela ou melancia, apresentaram resultados inconsistentes no controle de R. solani, F. solani e F. oxysporum (BALOCH et al., 2013). Resultados similares foram obtidos com a adição de 7 M. afaqhusainii, S. variabile e Halimeda tuna sobre Macrophomina phaseolina, R. solani, F. solani e Meloidogyne javanica em tomateiro e girassol (SULTANA et al., 2011). No entanto, S. variabile e M. afaqhusainii reduziram o ataque de M. phaseolina e nematoides de galha (BALOCH et al., 2013). O tratamento por irrigação das raízes, pulverização foliar ou ambos, em pepinos com extrato comercial da alga (Ascophyllum nodosum) nas concentrações de 0,5 e 1%, induziu resistência contra Alternaria cucumerinum, Didymella applanata, Botrytis cinerea e F. oxysporum, através do aumento da atividade das enzimas quitinase, glucanase, peroxidase, polifenol oxidase, fenilalanina amônia liase e lipoxigenase nas folhas (JAYARAMAN, NORRIE e PUNJA, 2011). As brássicas podem ser eficientes no controle de fitopatógenos, pois isotiocianatos produzidos durante a sua decomposição, apresentam ação fungistática ao crescimento micelial de F. oxysporum patogênicos de coníferas. A ação pode estar relacionada com a concentração aplicada e o isolado do patógeno (SMOLINSKA et al., 2003). Diversas brássicas reduziram o crescimento micelial de R. solani, Phytophthora erythroseptica, P. ultimum, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium sambucinum e F. oxysporum. Em especial a Brassica juncea reduziu em grandes proporções os patógenos do gênero Fusarium (LARKIN e GRIFFIN, 2007). A formação de conídios de F. oxysporum não foi afetada por isotiocianatos, porém a germinação de conídios e clamidósporos foi suscetível, principalmente a propenil, etílico, benzílico e feniletil que inibiram totalmente a germinação (SMOLINSKA et al., 2003). A incorporação de B. juncea no solo e cobertura com filme plástico, reduziu a Murcha de Fusarium em espinafre (F. oxysporum f. sp. spinaciae), sendo o controle relacionado com o acúmulo de ácido graxos voláteis e a mudança da comunidade microbiana (MOWLICK et al., 2013). Em casa de vegetação, as brássicas (nabo, mostarda indiana, colza, canola, rabanete e mostarda amarela) reduziram o inóculo de R. solani, e rabanete, colza e mostarda indiana reduziram a severidade e a incidência da doença em mudas de batata (LARKIN e GRIFFIN, 2007). No campo, diferentes brássicas, em rotação seguida da incorporação, proporcionaram controle de doenças em tubérculos de batatas. A mostarda indiana reduziu a incidência e a severidade da sarna pulverulenta (Spongospora subterranea), enquanto que canola, colza e mostarda amarela reduziram a presença de escleródios de R. solani em tubérculos de batata (LARKIN e GRIFFIN, 2007). 8 4.1 Agentes de controle biológico 4.1.1 Trichoderma sp. O gênero Trichoderma compreende espécies de fungos de vida livre do solo, que podem ser simbiontes oportunistas de plantas. Algumas espécies podem induzir de resistência e promover o crescimento em plantas, ou antagonizar patógenos por parasitismo e antibiose (HARMAN et al., 2004). Comercialmente, no Brasil, até o momento, existem seis produtos biológicos à base de Trichoderma spp. registrados para utilização na agricultura, sendo dois de Trichoderma asperellum, três de Trichoderma harzianum e um de Trichoderma stromaticum (BRASIL, 2016). Diversos exemplos são encontrados na literatura mostrando o sucesso de Trichoderma spp. no controle biológico de doenças de plantas. Os isolados de T. harzianum (CEN287 e CEN316), utilizados em ensaios no campo, reduziram o número de apotécios de S. sclerotiorum na área e a severidade de mofo branco em feijoeiro (CARVALHO et al., 2015b). Também em feijoeiro no campo, os mesmos isolados reduziram a incidência e a severidade de Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli (CARVALHO et al., 2015a). Por sua vez, o T. harzianum (T22) reduziu a severidade da doença causada por Fusarium oxysporum f. sp. lactucae em alface, em substrato sob condição úmida (-0,03 MPa) e seca (-0,5 MPa) (INNOCENTI, ROBERTI E PIATTONI, 2015). Dezenove isolados de Trichoderma spp. induziram resistência em pepino contra C. lagenarium (SILVA et al., 2011). O T. asperellum, por meio do tratamento de sementes, protegeu plântulas de tomate contra o tombamento de pré e pós emergência causado por P. aphanidermatum (KIPNGENO et al., 2015). Algumas espécies de Trichoderma podem ser endofíticos, como Trichoderma atroviride (77) ou Trichoderma koningiopsis (26 e 36), isolados de diferentes plantas do bioma da Caatinga, os quais reduziram a severidade de Fusarium guttiforme em plântulas de abacaxi, em ensaios a campo (SOUZA, TROCOLI e MONTEIRO, 2016). Outro mecanismo de ação de espécies de Trichoderma é a produção de enzimas degradadoras da parede celular de fitopatógenos, como verificado para o isolado CCTCC-RW0014 de T. asperellum, na redução de F. oxysporum f. sp. cucumerinum em pepino. O CCTCC-RW0014 tem grande atividade de quitinase, protease, celulase e β-(1-3) glucanase, além de produzir compostos que podem diminuir a expressão 9 da proteína Snt2 de F. oxysporum f. sp. cucumerinum, responsável pelo crescimento e patogenicidade (SARAVANAKUMAR et al., 2016). Similarmente, T. harzianum (Tr9) produz as enzimas exoquitinase e β-(1-3) glucanase. Este isolado reduziu a mortalidade de plantas de Amorphophallus paeonifolius causada por Sclerotium rolfsii (JOHN et al., 2015). Além de controlar patógenos, espécies de Trichoderma podem promover o crescimento de plantas (SILVA et al., 2011; INNOCENTI, ROBERTI E PIATTONI, 2015; SARAVANAKUMAR et al., 2016). Li et al. (2015) demonstraram que o T. harzianum (SQR-T037) solubiliza fitato, Fe2O3, CuO e Zn in vitro, aumentando a absorção de nutrientes e a biomassa em tomateiro. No entanto, em condições de deficiência de fósforo (fitato), o SQR-T037, compete com o tomateiro e reduz o crescimento da planta. 4.1.2 Bacillus sp. O gênero Bacillus é composto por bactérias não patogênicas e formadoras de endósporos que apresentam diversos mecanismos de ação no controle de doenças de plantas, tal como antibiose, competição e a indução de resistência de plantas (CAWOY et al., 2011). No Brasil, há dois produtos à base de Bacillus pumilus e Bacillus subtilis para o controle de doenças de plantas (BRASIL, 2016). O tratamento de sementes com B. subtilis (BS 01) protegeu plântulas de tomate contra o tombamento de pré e pós emergência causado por P. aphanidermatum (KIPNGENO et al., 2015). Bacillus amyloliquefaciens (W2) reduziu a incidência e a severidade de F. oxysporum em açafrão (GUPTA e VAKHLU, 2015). A aplicação de B. subtilis (RC 218), associado ou não a Brevibacillus sp. (RC263), no estádio de antese do trigo, reduziu em um ano de cultivo a incidência e em dois anos a severidade da doença causada por Fusarium graminearum. Os agentes de biocontrole também reduziram o acúmulo da microtoxina desoxinivalenol no trigo (PALAZZINI et al., 2016). Baysal, Çaliskan e Yesilova (2008) e Grover et al. (2010) demonstraram que diversos isolados de B. subtilis produzem iturina, fengicina, surfactina e bacilomicina os quais possuem ação contra diversos fitopatógenos. De forma similar, a iturina A (iturina) e plipastatina A (fengicina) produzidas por B. amyloliquefaciens (S76-3) inibem a germinação de conídios e o crescimento de hifas de F. graminearum (GONG et al., 2015). Já o B. subtilis subsp. subtilis apresentou especificidade na antibiose contra 10 Setophoma terrestris in vitro. A produção de compostos antifúngicos é estimulada pela presença do patógeno, já que a suspensão livre de células do antagonista crescida com ausência do patógeno, não inibiu S. terrestris (ORIO, BRÜCHER e DUCASSE, 2016). O isolado de Bacillus sp. (DFs1414) reduziu a área abaixo da curva de progresso da doença causada por F. oxysporum f. sp. lycopersici em tomateiro, sob condições de casa de vegetação. Os compostos voláteis produzidos pelo antagonista reduziram o crescimento micelial do patógeno in vitro, porém não foi descartada a indução de resistência no tomateiro como o mecanismo de ação (ROCHA E MOURA, 2013). A indução de resistência é frequentemente observada por agentes microbianos do gênero Bacillus. Akram, Anjum e Ali (2015) observaram que o éster metílico, do ácido ftálico, produzido e liberado por B. subtilis (IAGS174), induz resistência de tomateiro a F. oxysporum s. sp. lycopersici. Bacillus sp. também promovem o crescimento de plantas (SWAIN e RAY, 2009; YU et al., 2010; KIPNGENO et al., 2015). 4.2 Patossistemas 4.2.1 Fusarium oxysporum f. sp. lactucae A murcha de Fusarium da alface, causada por F. oxysporum f. sp. lactucae, ocorre tanto em viveiros de mudas como em campo (KOBORI, BRUNELLI E GIORIA, 2011). O patógeno foi separado em grupos, pelos diferentes cultivares de alface que atacam. O grupo 1, ataca severamente cultivares de alface crespa e roxa, enquanto ataca levemente lisa e “Green leaf”. O grupo 2 ataca severamente cultivares do tipo lisa, mas levemente os tipos crespa e “leaf”. Por sua vez, o grupo 3 causam sintomas leve a moderados na maioria das cultivares (YAMAUCHI, HORIUCHI E SATOU, 2001). Fujinaga et al. (2003) afirmaram que as raças 1, 2 e 3 de F. oxysporum f. sp. lactucae correspondem aos grupos 3, 1 e 2, respectivamente. A murcha de Fusarium foi relatada em vários países: Itália, Irã, Japão, Taiwan, Portugal, Estados Unidos da América e Brasil (SCOTT et al., 2012). As três raças foram identificadas no Japão, enquanto nos Estados Unidos da América e na Itália, apenas a raça 1 foi identificada (FUJINAGA et al., 2005). No Brasil, a murcha de Fusarium foi relatada no ano de 2000 (VENTURA e COSTA, 2008) em vários estados 11 brasileiros (LOPES, QUEZADO-DUVAL e REIS, 2010). Brunelli et al. (2010) identificaram apenas a raça 1 do patógeno na região sul e sudeste, com diferentes níveis de agressividade, podendo ser a única raça presente no país, ou pelo menos, a prevalecente. A doença causa redução no crescimento da planta, escurecimento dos vasos do xilema e amarelecimento e murcha foliar (LOPES, QUEZADO-DUVAL e REIS, 2010). Quando a planta morre, o patógeno produz clamidósporos dentro do tecido doente, que incorporados ao solo permanecem viáveis por mais de um ano (SCOTT et al., 2012). A época de semeadura, relacionada com a temperatura do solo, e o estádio de desenvolvimento da cultura são importantes na ocorrência da murcha de Fusarium (MATHERON et al., 2005). Temperaturas altas favorecem o desenvolvimento da doença em cultivares de alfaces altamente suscetíveis ao patógeno, porém, não em cultivares resistentes (SCOTT et al., 2010). Assim, as perdas por murcha de Fusarium podem ser reduzidas evitando o cultivo de cultivares suscetíveis em períodos quentes do ano (SCOTT et al., 2012). A disseminação de F. oxysporum f. sp. lactucae ocorre via sementes, provavelmente como um contaminante externo. A desinfestação das sementes com hipoclorito de sódio reduz sua disseminação (GARIBALDI, GILARDI e GULLINO, 2004). O tratamento de sementes, artificialmente inoculadas, com dichlofluanid, mancozeb, prochloraz, carbendazim e azoxystrobin reduziu a porcentagem de plantas de alface doentes (GILARDI et al., 2005). Algumas variedades de alface apresentam resistência contra F. oxysporum f. sp. lactucae raça 1, como Costa Rica No. 4, River Green, Salinas e Salinas 88 (MCCREIGHT et al., 2005). No Brasil, todas as cultivares apresentaram sintomas da doença causada por F. oxysporum f. sp. lactucae raça 1, mas algumas destacaram-se, como a Roxa 01, pela baixa severidade a vários isolados do patógeno (CABRAL E REIS, 2013). Em solo infestado com F. oxysporum f. sp. lactucae, mantido em pousio por 6 e 12 meses, a densidade do inóculo reduziu em 71% e 86%, respectivamente. Após 34 meses, foi recuperado apenas 0,5% das unidades formadoras de colônias da população inicial. Isso indica que aproximadamente um ano sem o cultivo de culturas suscetíveis, há uma significante redução do inóculo (SCOTT et al., 2012). 12 4.2.2 Fusarium circinatum x Pinus radiata O cancro resinoso do pinus, causado por Fusarium circinatum, foi relatado pela primeira vez nos Estados Unidos da América em 1945 (HEPTING e ROTH, 1946). Atualmente, a doença é encontrada em várias partes do mundo (GORDON, 2006). Especificamente na América do Sul, F. circinatum foi identificado no Chile em Pinus radiata (WINGFIELD et al., 2002), ainda que a ocorrência seja restrita a viveiros (JACOBS et al., 2007), sintomas da doença são encontrados em Pinus spp. em cultivos comerciais, porém a doença não está estabelecida. Estas ocorrências provavelmente são originárias de plantas infectadas provenientes de viveiros. No entanto, o risco do estabelecimento é intensificado pela predominância do cultivo de P. radiata, altamente suscetível ao patógeno (WINGFIELD et al., 2008). O patógeno também foi encontrado em viveiros de mudas de Pinus taeda no Uruguai (ALONSO e BETTUCCI, 2009). Na Colômbia o patógeno foi isolado tanto de viveiro de mudas, como em árvores em plantações de até 11 anos de idade (STEENKAMP et al., 2012). Recentemente, foi relatado no Brasil, ocasionando doença em viveiro com plantas de Pinus patula, no estado de Santa Catarina (PFENNING et al., 2014). Especula-se que a ausência de insetos vetores específicos associados ao patógeno e fatores ambientais desfavoráveis ao estabelecimento da doença são responsáveis pelo patógeno não se estabelecer em cultivos comerciais no Chile (WINGFIELD et al., 2008). Na África do Sul, F. circinatum permaneceu restrito em viveiros por aproximadamente 15 anos, até causar doença em plantações de P. radiata. A ocorrência está associada às condições climáticas favoráveis, a associação do patógeno com a infestação do gorgulho Pissodes nemorensis, além da prática de poda causar ferimentos e favorecer o desenvolvimento da doença (COUTINHO et al., 2007). Os sintomas causados por F. circinatum em viveiros são a podridão radicular, do colo e da parte aérea, podridão da ponteira e morte da planta (FOURIE et al., 2014). Em plantas adultas, os sintomas caracterizam-se principalmente pela clorose das acículas próximo ao sítio de infecção e consequente morte de ramos (anelamento do ramo). Podem ocorrer repetidas infecções que causam extensos danos à copa do hospedeiro. Grandes infecções ocupam uma parte do ramo ou tronco, acarretando em intensa produção 13 de resina. Lesões próximas ao nível do solo podem anelar o tronco e causar clorose em todas as acículas em plantas jovens (GORDON, STORER E WOOD, 2001). Plântulas de P. radiata inoculadas com F. circinatum aumentam a quantidade de resina exsudada. As plântulas que exsudaram moderada ou elevada quantidade de resina em 21 dias após a inoculação do patógeno, morreram 56 dias após a inoculação. A produção de resina favorece a infecção de F. circinatum, pois, este tolera a resina e utiliza os dutos de resina para colonização vertical em novas zonas (MARTÍN- RODRIGUES et al., 2013). O crescimento de F. circinatum apresenta três fases, primeiro, ocorre aumento da biomassa até sete dias após a inoculação, a qual coincide com a colonização do córtex e floema. Entre 7-21 dias a biomassa continua aumentando, mas lentamente, ocorre a colonização do xilema e floema, com produção de conidióforo no floema. O menor crescimento do fungo neste período deve-se a mudança morfológica de micélio vegetativo para conidiogênese, o que requer grande quantidade de energia. A produção de conídios na cavidade medular dispersa o patógeno para áreas abaixo e longe do sítio de infecção. A colonização na medula, em locais acima do ponto de inoculação, parece estar associada a colonização do xilema. Após 21 dias o crescimento estabiliza, surgem os sintomas de clorose, murcha das acículas e dessecação da ponta da plântula (MARTÍN-RODRIGUES et al., 2013). O patógeno avança via radial, em direção à medula e tangencial, através do floema e córtex. A colonização do córtex e medula dá-se pelos espaços intercelulares e provavelmente o fungo libera enzimas degradadoras da parede celular no apoplasto, liberando nutrientes nos tecidos da planta (MARTÍN-RODRIGUES et al., 2013). Trabalhos com resistência ao patógeno estão sendo realizados. De cinco famílias de pinheiros inoculadas com dois isolados de F. circinatum, na Colômbia, os acessos de P. maximinoi (PM1564CA e PM1517CA) e P. tecunumanii (PTECSUIZ) originados de áreas de baixa altitude apresentaram lesões menores (STEENKAMP et al., 2012). 4.2.3 Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici x tomateiro A murcha do tomateiro, causada por F. oxysporum f. sp. lycopersici (Fol) é uma das doenças mais destrutivas do tomateiro, eventualmente pode destruir 14 campos inteiros antes da colheita (AGRIOS, 2005). O patógeno está presente nos principais centros produtores de tomate do mundo (REIS et al., 2005). A ocorrência da raça 3 de Fol foi observada na Austrália em 1978 (GRATTIDGE e O'BRIEN, 1982). No Brasil, foi identificada pela primeira vez em 2005 em campos produtores de Venda Nova do Imigrante, Espírito Santo (REIS et al., 2005). No ano seguinte foi relatada nas cidades de São José de Ubá e Itaocara (Rio de Janeiro). A ocorrência quase simultânea dessa raça em regiões geográficas isoladas pode ser devido a lotes de sementes contaminadas (REIS e BOITEUX, 2007). Marlatt et al. (1996) identificaram diferenças de grupos de compatibilidade entre isolados de Fol raça 3 (VCG 0030 e 0033) de diferentes regiões dos Estados Unidos da América. Estes dois grupos apresentaram duas populações geneticamente distintas, sugerindo duas linhas de evolução. Cai et al. (2003), utilizando métodos moleculares, sugerem que a raça 3 de Fol presente na Califórnia, é originária de uma população local de Fol raça 2. Os genes de avirulência do Fol (AVR1, 2 e 3) e de resistência do tomateiro (I, I2 e I3) são responsáveis pela compatibilidade do patógeno e hospedeiro (INAMI et al., 2012). Houterman et al. (2009) apresentam um esquema evolucionário da raça 3 de Fol, no qual a raça 1 perdeu gene AVR1 e originou a raça 2. A raça 3 emergiu da mutação na raça 2 em AVR2 (avr2). Uma evolução alternativa para o isolado KoChi-1, obtido no Japão, que possui em seu cromossomo: avg1, avg2 e AVG3, foi apresentado por Inami et al. (2012), em que a raça 1 do patógeno sofreu uma inserção no transposon dentro de AVR1, emergindo a raça 2. A raça 3 (KoChi-1) originou da mutação de AVR2 Os sintomas da murcha de Fusarium em plantas jovens são a paralisação do crescimento, desfolha das folhas velhas e algumas tornam-se amareladas, também ocorre o escurecimento do tecido vascular (CSIZINSZKY et al., 2005). Após os primeiros sintomas, normalmente as mudas murcham e morrem (AGRIOS, 2005). Em plantas adultas, predomina o amarelecimento das folhas velhas, ocorre à progressão do amarelecimento foliar, murcha da planta, principalmente nos períodos quentes do dia (GRATTIDGE e O'BRIEN, 1982; CSIZINSZKY et al., 2005), desfolha e necrose marginal das folhas (AGRIOS, 2005) e eventualmente a planta morre. O sistema vascular sofre escurecimento (GRATTIDGE e O'BRIEN, 1982; AGRIOS, 2005; CSIZINSZKY et al., 2005). 15 O patógeno penetra as raízes diretamente através dos pelos absorventes ou por ferimentos, assim colonizando o sistema vascular da planta (KUROZAWA e PAVAN, 2005). O patógeno pode permanecer por vários anos no solo. A temperatura ideal de crescimento é de 28 ºC. A disseminação ocorre via sementes, estacas, solo, mudas infectadas (CSIZINSZKY et al., 2005), vento, água, implementos agrícolas e tratos culturais (KUROZAWA e PAVAN, 2005). No controle podem ser utilizadas cultivares resistentes, rotação de cultura de 5 a 7 anos (CSIZINSZKY et al., 2005), tratamento de sementes e plantio em áreas com ausência do patógeno (KUROZAWA e PAVAN, 2005). O esterco de galinha peletizado reduziu a severidade da doença (Fol raça 2). Maior efeito ocorreu com o resíduo na concentração de 1% v/v e incubado a 35 ºC. O esterco de galinha peletizado e a compostagem de bagaço de azeitona reduziram a população do patógeno no solo (BORREGO-BENJUMEA et al., 2014). Cinco diferentes compostos, sendo dois comerciais (Plant-mix e Ferticompost) e os compostos de esterco ovelha, vaca e frango, em mistura com turfa na proporção de 1:4, reduziram a murcha de Fusarium em tomateiro (TAGHDI et al., 2015). Fusarium solani (305) e Streptomyces sp. (A19), isolados da rizosfera de plantas sadias de tomate crescidas em composto de resíduos de uva e cortiça, reduziram a área abaixo da curva do progresso da doença, causado por Fol raça 2, em substrato de fibra de coco (conducente ao patógeno). Em substrato de composto de cortiça (moderadamente supressivo), Streptomyces sp. (A19) aumentou a supressividade a Fol raça 2. Em composto de resíduo de uvas (altamente supressivo) não houve diferença no controle (CASTAÑO et al., 2013). Trichoderma asperellum (CT9), isolado de composto de esterco de frango, e Trichoderma virens (ST11), isolado do solo, reduziram a murcha de Fusarium (TAGHDI et al., 2015). 16 CAPÍTULO 1 EFEITO DA INCORPORAÇÃO DE MATERIAIS ORGÂNICOS SOBRE A GERMINAÇÃO DE CONÍDIOS DE Fusarium oxysporum f. sp. lactucae Este capítulo foi redigido em formato de artigo de acordo com as normas da revista Tropical Plant Pathology 17 Efeito da incorporação de materiais orgânicos sobre a germinação de conídios de 1 Fusarium oxysporum f. sp. lactucae 2 Cassiano Forner1*; Dalton Dorighello1**; Wagner Bettiol2 3 4 1Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita 5 Filhoˮ (UNESP), Câmpus Botucatu, CEP 18.610-307 - Botucatu, SP, Brasil. *Bolsista 6 CNPq e **Bolsista CAPES. 7 2Embrapa Meio Ambiente, CP 69, CEP 13.820-000 Jaguariúna, SP, Brasil. Bolsista do 8 CNPq. 9 10 Autor para correspondência: Cassiano Forner, e-mail: forner687@hotmail.com 11 12 Resumo 13 A murcha de Fusarium (Fusarium oxysporum f. sp. lactucae) causa prejuízos consideráveis 14 aos produtores de alface. A incorporação de resíduos orgânicos é uma alternativa para a 15 adequada disposição dos resíduos agrícolas e urbanos, podendo também colaborar na 16 fertilidade e na indução de supressividade a patógenos habitantes do solo. O estudo 17 objetivou avaliar o efeito de hidrolisado de peixe, emulsão de peixe, alga, concha de 18 marisco, casca de camarão e caroço de abacate, incorporados em substrato, sobre a 19 germinação de microconídios de F. oxysporum f. sp. lactucae (Fola). Para isto, suportes 20 foram construídos com buchas e luvas de redução hidráulica, nos quais foram depositadas 21 duas membranas de ester de celulose, contento uma suspensão de microconídios de Fola. 22 Os suportes foram enterrados na mistura de substrato e resíduos orgânicos duas horas e 23 sete dias após a incorporação dos resíduos orgânicos. Os suportes permaneceram por 24 24 horas enterrados, quando foram removidos e as membranas retiradas, dispostas sobre 25 18 lâminas de vidro e os microconídios fixados em meio de cultura ágar-água. A germinação 26 dos microconídios foi paralisada com azul de lactofenol, seguida da determinação da 27 porcentagem de microconídios germinados. Duas horas após a incorporação desses 28 resíduos ao substrato foi observado que tanto o hidrolisado, como a emulsão de peixe 29 reduziram a germinação de microconídios. Alga, casca de camarão, concha de marisco e 30 caroço de abacate não inibiram a germinação dos microconídios de Fola. 31 Palavras chave: Alface, murcha de Fusarium, supressividade. 32 33 Effect of organic matter incorporated in container media on the conidia germination 34 of Fusarium oxysporum f. sp. lactucae 35 Abstract 36 Fusarium wilt, caused by Fusarium oxysporum f. sp. lactucae (Fola), may causes 37 serious losses to growers of lettuce. The incorporation of organic residues to induce 38 suppressiveness is an alternative control with a sustainable disposal of rural and urban 39 residues. This study aimed to evaluate the potential of fish hydrolyzed, fish emulsion, 40 shrimp peel, seaweed, mussel shell and grounded avocado seed to induce 41 suppressiveness against Fola in container media. For this, supports were built with 42 hydraulic pieces. Into the supports were deposited two cellulose ester membranes, 43 containing a Fola microconida suspension. Two hours and seven days after 44 incorporation of organic residue, the supports were buried in a mixture of substrate and 45 organic residues. The supports remained buried for 24 hours, then it was removed, the 46 membranes were arranged on glass slides and the microconidia were fixed in agar-water 47 media. The germination of microconidia was paralyzed with lactophenol blue, followed 48 by determining the percentage of microconidia germinated. The fish hydrolyzed and 49 fish emulsion inhibited microconidia germination after 2 h of incorporation in the 50 19 substrate. We concluded that fish emulsion and fish hydrolyzes induced suppressiveness 51 in the substrate to this soilborne fungi. Seaweed, mussel shell, shrimp peel and avocado 52 seed did not inhibit microconidia germination. 53 Keywords: Fusarium wilt, lettuce, suppressiveness. 54 55 INTRODUÇÃO 56 A alface é uma das principais hortaliças consumidas no mundo (Henz & Suinaga, 2009; 57 Kobori et al., 2011). No Brasil, é a hortaliça folhosa mais popular (Lopes et al., 2010), com 58 estimativa de 35 mil hectares cultivados e uma produção de 290.000 toneladas (Kobori et 59 al., 2011). A murcha de Fusarium, causada por Fusarium oxysporum f. sp. lactucae (Fola) 60 causa perdas no Brasil e no mundo (Lopes et al., 2010), ocorrendo desde viveiros de 61 produção de mudas até no campo (Kobori et al., 2011). 62 O patógeno é encontrado na Itália, Japão, Irã, Taiwan, Portugal, Estados Unidos da 63 América e Brasil (Scott et al., 2012), entre outros. Três raças de Fola foram catalogadas 64 (Fujinaga et al., 2003). No Japão, estão presentes as três raças (1, 2 e 3), enquanto nos 65 Estados Unidos da América e na Itália, apenas a raça 1 é encontrada (Fujinaga et al., 2005). 66 No Brasil, Fola foi relatada no ano de 2000 (Ventura & Costa, 2008), porém até o 67 momento, apenas a raça 1 foi identificada (Brunelli et al., 2010). 68 O patógeno causa redução no crescimento, escurecimento dos vasos do xilema e 69 amarelecimento e murcha foliar (Lopes et al., 2010). Fola pode produzir clamidósporos 70 dentro do tecido doente da planta, que, incorporados ao solo, podem sobreviver por anos 71 (Scott et al., 2012). 72 A severidade da doença é influenciada pela densidade do inóculo, condições ambientais e 73 cultivares de alface. Scott et al. (2012) discutem o manejo da murcha de Fusarium, 74 incluindo rotação de culturas e o uso de cultivares resistentes nos períodos mais quentes. 75 20 Agricultores utilizam há séculos materiais orgânicos para manter ou aumentar a fertilidade 76 do solo. O uso de materiais orgânicos na agricultura é também uma alternativa para o 77 aproveitamento de resíduos rurais e urbanos, aumentando a fertilidade do solo e 78 melhorando as características físicas, químicas e biológicas. Esses efeitos podem colaborar 79 no manejo de fitopatógenos habitantes do solo. Estratégias para o manejo da murcha de 80 Fusarium da alface, que minimizem as perdas causadas pela doença, necessitam ser 81 investigadas. Dessa forma, considerando os efeitos da incorporação de resíduos orgânicos 82 há necessidade de estudar quais materiais orgânicos possuem a capacidade de induzir a 83 supressividade do solo a Fola para se tornar uma alternativa viável ao seu controle. 84 Materiais orgânicos incorporados no solo ou substratos podem suprimir patógenos 85 diretamente devido a presença de compostos (ácido húmico, ácidos graxos voláteis, ácido 86 nitroso e amônia, entre outros) e indiretamente pelo estímulo de microrganismos residentes 87 com atividades antagonistas (Borrero et al., 2006; Conn & Lazarovits, 1999; Du et al., 88 2015; Gravel et al., 2015; Hoitink & Boehm, 1999; Postma et al., 2008; Postma & 89 Schilder, 2015; Tenuta et al., 2002; Tenuta & Lazarovits, 2002). Resíduos marinhos são 90 descritos como indutores de supressividade para patógenos de plantas, embora com efeitos 91 variáveis, dependendo do tipo de resíduo, concentração e modo de aplicação (Bailey & 92 Lazarovits, 2003). 93 A supressividade do solo induzida por materiais orgânicos foi verificada com o uso de 94 emulsão de peixe no controle de Rhizoctonia solani, Pythium aphanidermatum, Pythium 95 ultimum, Streptomyces scabie e Verticillium dahliae em rabanete, pepino, berinjela e 96 batata, respectivamente, por Abbasi et al. (2004, 2006, 2009); de hidrolisado de peixe para 97 controle de Cylindrocladium spathiphyllii em espatifilio (Visconti et al., 2010); de casca de 98 camarão moído para o controle de F. oxysporum f. sp. zingiberi em gengibre (Ghini et al., 99 2006); F. oxysporum f. sp. chrysanthemi em crisântemo (Pinto et al., 2010); de concha de 100 21 marisco no controle de Ralstonia solanacearum em tomateiro (Visconti, 2011) e de alga 101 (Ulva radiata) para controle de Alternaria porri em cebolinha (Araújo et al., 2012), entre 102 outros. 103 Um dos possíveis mecanismos de ação da incorporação de fontes de matéria orgânica ao 104 solo para controlar fitopatógenos é a inibição da germinação de esporos. Assim, este 105 estudo objetivou avaliar o potencial do hidrolisado e emulsão de peixe, casca de camarão, 106 alga, concha de marisco e sementes de abacate incorporadas no solo para inibir a 107 germinação de microconídios de F. oxysporum f. sp. lactucae. 108 109 MATERIAL E MÉTODOS 110 O isolado de F. oxysporum f. sp. lactucae Fola 281 (Sakata Seeds Sudamerica SA) foi 111 crescido em meio BDA (Batata, dextrose e ágar), com adição de sulfato de estreptomicina 112 (1000 mg L-1) e eritromicina (100 mg L-1), por cinco dias à 25 ± 1 ºC. Transcorrido esse 113 período foi acrescentada água esterilizada ao meio, sendo em seguida filtrada em gaze para 114 obter uma suspensão de microconídios que foi ajustada para 2 x 105 microconídos mL-1. 115 O hidrolisado de Peixe (HP) foi fornecido por FishFértil Active®Fish Fertilizantes Ltda., 116 Estiva Gerbi – SP e a emulsão de Peixe (EP), por JK Fertilizantes, Paulínia – SP. A alga – 117 Sargassum sp. (AL), casca de camarão (CC) e concha de mariscos (CM) foram coletados 118 no litoral do estado de Santa Catarina (Balneário Camboriú e Penha), secos em estufa de ar 119 forçado a 40 ºC, triturados, moídos e separados em peneira de 60 Mesh (0,25 mm). O 120 caroço de abacate (CA), coletado em São Sebastião do Paraíso (São Paulo), foi seco, 121 triturado, moído e passado por um peneira de 60 Mesh. Os atributos químicos dos 122 materiais são apresentados na Tabela 1. 123 Uma suspensão de 150 µL de Fola foi dispensada entre as duas membranas de ester de 124 celulose (Millipore 0,22 µm de poro) de 25 mm de diâmetro e fixadas em um suporte de 125 22 anel de PVC. Os suportes foram preparados com luvas hidráulicas de ¾” de diâmetro e 126 buchas de redução hidráulicas. Dentro de cada suporte foram acomodados 127 sequencialmente: um anel de borracha de vedação, as membranas de Millipore contendo a 128 suspensão de Fola e novamente um anel de borracha de vedação. Em seguida os suportes 129 foram rosqueados para utilização (Figura 1). 130 Uma mistura (3:1) de solo (latossolo) + substrato à base de casca de pinus foi depositada 131 em vasos plásticos de 850 mL de volume. A essa mistura foram incorporados HP e EP nas 132 concentrações de 0 (Testemunha), 10, 20, 30, 40 e 50% do volume de água para atingir a 133 capacidade de campo a partir da mistura solo+substrato completamente seca. Os resíduos 134 foram dispensados na superfície da mistura solo + substrato e o percolado foi coletado e 135 novamente dispensado na mistura por duas vezes. A mesma metodologia foi utilizada para 136 AL, CC, CM e CA, porém a incorporação foi nas concentrações de 0 (Testemunha), 1, 2, 137 3, 4 e 5% (v/v) para cada material orgânico. Para esses materiais orgânicos, a incorporação 138 foi anterior à transferência da mistura para os vasos plásticos. Após a homogeneização, o 139 solo recebeu água até atingir a capacidade de campo, determinada anteriormente. A 140 umidade da mistura solo+substrato, antes da incorporação das matérias orgânicas, é 141 apresentada na Tabela 2. 142 Os suportes (dois por vaso) foram enterrados na mistura de solo + substrato, duas horas 143 após e sete dias após a incorporação dos resíduos a uma profundidade de 4 cm. O 144 delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado, com três vasos para cada 145 concentração dos materiais orgânicos, cada vaso consistiu em uma repetição. 146 Os suportes permaneceram enterrados por 24 horas, nesse período a temperatura do ar 147 (máxima e mínima) foi registrada. Após este período, os suportes foram removidos do solo 148 e cada par de membranas foi recuperado com auxílio de uma pinça. As membranas foram 149 depositadas sobre lâminas de vidro, com a face contendo as estruturas do patógeno 150 23 voltadas para cima. Com auxílio de anéis de alumínio, o meio de cultura ágar-água foi 151 depositado sobre a superfície das membranas. Após a solidificação do ágar, as membranas 152 foram removidas e as estruturas remanescentes do fungo foram mantidas aderidas à 153 superfície do meio de cultura. Subsequentemente, duas gotas de azul de lactofenol foram 154 depositadas sobre o meio de cultura para facilitar a determinação da porcentagem de 155 microconídios germinados, sendo avaliados 100 microconídios por disco de ágar. 156 Os resultados foram analisados por meio de regressão polinomial usando o programa 157 estatístico SAS v. 9.0, considerando apenas as regressões de primeiro, segundo e terceiro 158 grau. Cada experimento foi repetido duas vezes, exceto os ensaios com hidrolisado e 159 emulsão de peixe com microconídios incubados duas horas após a incorporação dos 160 materiais orgânicos, que foram realizados três vezes. 161 162 RESULTADOS E DISCUSSÃO 163 Os materiais orgânicos líquidos (HP e EP) reduziram a germinação dos microconídios de 164 Fola (Figuras 6 e 7). Tanto para HP e EP, duas horas após a incorporação, foi verificado 165 um modelo de regressão quadrática, com uma redução da germinação mais expressiva na 166 concentração de 10% (Figuras 2A). 167 O potencial desses dois resíduos no controle de patógenos de plantas foi relatado por 168 diversos autores. A emulsão de peixe (0,5% v/v) reduziu a severidade de F. solani e F. 169 oxysporum em aspargo. A emulsão de peixe reduziu a população de Fusarium no solo e 170 aumentou a população de bactérias cultiváveis, além de ocasionar um aumento inicial do 171 pH do solo, seguido de um rápido declínio, a partir do segundo ao sétimo dia (Borrego-172 Benjumea et al., 2014). Por outro lado, Abbasi (2013) verificou que a aplicação de baixas 173 doses de emulsão de peixe (0,1% v/v), duas vezes ao ano, antes do plantio e depois da 174 colheita de batata, reduziram a sarna da batata durante os quatro anos e a infecção de 175 24 Verticillium dahliae nos três anos de ensaio. O controle foi atribuído ao aumento da 176 população bacteriana nos dois primeiros anos. A emulsão de peixe, além de aumentar a 177 atividade microbiana do solo, serviu como fonte de nutriente para os microrganismos 178 promotores de crescimento de plantas de rabanete (El-Tarabily et al., 2003). 179 Abbasi et al. (2009) verificaram, em solo franco-arenoso, que a emulsão de peixe (1 e 2% 180 m/m de solo seco) reduziu a germinação de microescleródios de V. dahliae em avaliações 181 de 1, 3 e 6 dias após a incorporação. Essa rápida inativação do patógeno, também foi 182 observada no presente estudo, onde 24 h após a incorporação, a germinação de Fola foi 183 reduzida, tanto com a emulsão, quanto com o hidrolisado de peixe. Abbasi et al. (2009) 184 também mostraram que os ácidos graxos voláteis, presentes na emulsão de peixe, 185 principalmente ácido acético, fórmico n-butírico e propiónico, inibiram a germinação de V. 186 dahliae em pH baixo (3-4). Em pH 6, apenas as concentrações de emulsão de peixe ou 187 solução de ácidos equivalentes à concentração de 10% de emulsão, reduziram a 188 germinação de microescleródios. Os ácidos graxos voláteis também foram tóxicos para P. 189 ultimum. 190 Os ácidos graxos voláteis presentes na emulsão de peixe protegeram plântulas de pepino 191 contra P. ultimum em solos orgânicos e franco-arenosos, mas não em turfa, sugerindo que 192 a ação tóxica da emulsão de peixe depende do tipo de solo e do substrato (Abbasi et al., 193 2009). 194 Apesar da baixa germinação de microconídios observada sete dias após a incubação, 195 possivelmente devido às temperaturas atingidas durante a incubação, que podem ter 196 prejudicado a germinação de microconídios, observou-se um efeito da EP na redução na 197 germinação dos microconídios de Fola. Algumas concentrações de HP aumentaram a 198 germinação de microconídios (Figura 2B). Abbasi et al. (2006) afirmam que a aplicação da 199 emulsão de peixe em um ano não exerce efeito residual de controle no ano seguinte. 200 25 Visconti et al. (2010) verificaram que o hidrolisado de peixe reduziu o crescimento 201 micelial e a germinação de conídios de C. spathiphylli. Entretanto, não observaram 202 supressividade do substrato, naturalmente infestado com C. spathiphylli, após 60 dias. No 203 presente trabalho, similarmente, o hidrolisado de peixe não foi efetivo sete dias após a sua 204 incorporação ao substrato. Possivelmente, os ácidos graxos voláteis, presentes no 205 hidrolisado, são disponibilizados mais rapidamente que na emulsão, sendo esgotados em 206 menos de sete dias. O ligeiro aumento na germinação, proporcionado por algumas 207 concentrações de hidrolisado, pode ser devido ao uso de alguma fonte de nutrientes pelo 208 patógeno. No entanto, essa redução inicial da germinação, poderia possibilitar a redução do 209 potencial de inóculo no solo, reduzindo a doença no campo. Esse fator é importante, 210 principalmente, para a cultura de ciclo curto como a alface, o que pode proporcionar o 211 escape da cultura, minimizando os prejuízos. 212 Nenhum dos resíduos sólidos (alga, concha de marisco, casca de camarão e caroço de 213 abacate) reduziu a germinação de microconídios de Fola (Tabela 4). 214 Em relação à alga, os resultados obtidos estão de acordo com trabalhos que sugerem que 215 algumas algas não tem efeito direto sobre os patógenos (Gonçalves & Stadnik, 2012; 216 Paulert et al., 2009). Entretanto, a escolha dessa matéria orgânica foi motivada pela 217 possibilidade dos produtos de sua degradação interferir na germinação do patógeno. 218 Paulert et al. (2009) verificaram que os extratos solúveis e insolúveis em metanol e a 219 solução aquosa de ulvana, obtida de U. fasciata, não inibiram a germinação de 220 Colletotrichum lindemuthianum, ocorrendo inclusive estimulo da germinação. No entanto, 221 esses autores verificaram que o extrato solúvel em metanol reduziu o crescimento micelial 222 in vitro. A ulvana também não interferiu na germinação de esporos de C. gloeosporioides. 223 Porém, em um primeiro momento atrasou a formação do apressório, pois é utilizada como 224 fonte de nutriente e uma vez esgotada essa fonte, o patógeno inicia a formação do 225 26 apressório (Gonçalves & Stadnik, 2012). No entanto, diversos trabalhos indicam o 226 potencial de algas induzirem a resistência das plantas, como os observados para A. porri 227 em cebolinha (Araújo et al., 2012), antracnose em feijoeiro (Paulert et al., 2009), C. 228 gloeosporioides em mudas de macieira (Araujo & Stadnik, 2013) e Alternaria 229 cucumerinum, Didymella applanata, Botrytis cinerea e F. oxysporum em pepino 230 (Jayaraman et al., 2011). 231 A casca de camarão moída não apresentou efeito na germinação de microconídios de Fola. 232 Entretanto, existem evidências de que a casca de camarão suprime F. oxysporum f. sp. 233 chrysanthemi e F. oxysporum f. sp. zingiberi, sendo principalmente relacionado à ativação 234 de antagonistas do solo (Ghini et al., 2006; Pinto et al., 2010). O potencial de resíduos de 235 outros crustáceos no controle de fitopatógenos foi demonstrado por Benchimol et al. 236 (2006) os quais verificaram que casca de caranguejo a 1% v/v reduziu a morte de mudas de 237 pimenteira-do-reino, causada por Fusarium solani f. sp. piperis, quando aplicados em solo 238 de mata. 239 O Bacillus subtilis NPU 001, isolado do solo, quando cultivado em meio de cultura 240 contendo casca de camarão e caranguejo, liberou quitinase, a qual antagoniza F. 241 oxysporum (Chang et al., 2010). Trabalhando com casca de camarão, bem como os 242 resíduos de cogumelo e quitosana, López-Mondéjar et al. (2012) verificaram que esses 243 resíduos ativaram os genes quitinolíticos de Trichoderma harzianum (T-78), protegendo as 244 mudas de melões do ataque de F. oxysporum f. sp. melonis, sem no entanto diminuir a 245 população do patógeno. Esses relatos, aliados ao presente trabalho, apontam que a casca de 246 camarão adicionada no solo, não exerce efeito direto sobre o patógeno e, possivelmente, 247 age na microbiota do solo. Assim, necessita maior período pós-incorporação para este 248 estímulo e um solo habitado por potenciais antagonistas. Uma alternativa seria a adição 249 concomitante de microrganismos antagônicos que utilizem este resíduo como fonte de 250 27 nutriente, como realizado por López-Mondéjar et al. (2012). Assim, os resultados ora 251 obtidos podem ser devido ao curto tempo de incubação dos resíduos sólidos, não tendo 252 ocorrida a sua degradação e consequente liberação de metabólitos que inibissem a 253 germinação dos microconídios. 254 Poucos são os trabalhos com concha de marisco no controle de doença de plantas. No 255 presente estudo, a concha de marisco não influenciou na germinação de microconídios de 256 Fola. Entretanto, na concentração de 6% de pó de concha de marisco, Visconti (2011) 257 verificou redução na severidade e na incidência de R. solanacearum em tomateiro, 258 possivelmente associada ao nitrogênio presente no resíduo e a elevação do pH do substrato. 259 Entretanto, o mesmo autor verificou que a concha de marisco não reduziu a doença 260 causada por C. spathiphylli em espatifilo. 261 O caroço de abacate, possivelmente sendo a primeira vez estudado para o controle de um 262 fitopatógeno, também não afetou a germinação de microconídios de Fola. A sua lenta 263 degradação sugere a hipótese de que em sua composição pode ter algum composto com 264 efeito antagonista a Fola, mas o tempo de degradação pode ter sido insuficiente para 265 verificar este efeito. 266 A realização dos estudos avaliando os efeitos de fontes de matéria orgânica sobre a 267 germinação de microconídios de Fola, simulando condições de casa de vegetação, 268 possibilitou avaliar o efeito dos resíduos em sua interação com o solo e com as variações 269 do ambiente. Esses resultados apontam o potencial da emulsão e do hidrolisado de peixe 270 no controle de Fola. No entanto, o hidrolisado de peixe teve um breve efeito, pois sete dias 271 após a incorporação, com a nova adição de microconídios, não foi reduzida a germinação 272 de Fola, indicando uma vulnerabilidade com a reinfestação do solo. Em dados não 273 publicados, em experimento sob casa de vegetação utilizando solo em vasos plásticos, a 274 adição e revolvimento de hidrolisado de peixe, principalmente nas concentrações de 15 e 275 28 20% do volume necessário para atingir a capacidade de campo, a partir do solo seco, 276 causaram compactação do solo e fitotoxicidade em plântulas de tomate, transplantadas 7-277 14 dias após a incorporação. Visto isso, é importante avaliar o efeito de diferentes fontes 278 de matéria orgânica para diferentes patossistemas e estabelecer adequados períodos de 279 incubação antes de realizar o plantio. 280 281 AGRADECIMENTOS 282 Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq pelas bolsas 283 de estudos, ao Dr. Alexandre Visconti, da Epagri, pelo auxílio na coleta dos resíduos 284 marinhos e às empresas FishFértil Fertilizantes Ltda. e JK Fertilizantes Ltda., por 285 fornecerem os materiais líquidos testados. 286 287 REFERÊNCIAS 288 Abbasi PA (2013) Establishing suppressive conditions against soilborne potato diseases 289 with low rates of fish emulsion applied serially as a pre-plant soil amendment. Canadian 290 Journal of Plant Pathology 35:10-19. 291 Abbasi PA, Conn KL, Lazarovits G (2004) Suppression of Rhizoctonia and Pythium 292 damping-off of radish and cucumber seedlings by addition of fish emulsion to peat mix or 293 soil. 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Os valores são relativos as médias dos dois ensaios de cada material. 395 Material orgânico Umidade do solo+substrato (%) Alga 25,64 ± 3,14 Casca de camarão 25,64 ± 3,14 Concha de marisco 26,03 ± 1,69 Caroço de abacate 23,24 ± 1,63 Hidrolisado de peixe 12,91 ± 1,64 Emulsão de peixe 15,77 ± 5,03 35 Tabela 3. Temperatura mínima e máxima do ar durante as 24 horas de incubação dos 396 microconídios de Fusarium oxysporum f. sp. lactucae, duas horas e sete dias após a 397 incorporação dos respectivos materiais orgânicos. 398 Material orgânico Temperatura (ºC) 2 horas* 7 dias* Alga 11,7 – 24,6 13,5 – 38,9 Casca de camarão 11,7 – 24,6 13,5 – 38,9 Concha de marisco 9,9 – 31,3 12,8 – 28,4 Caroço de abacate 9,9 – 31,3 11,3 – 28,4 Hidrolisado de peixe 18,2 – 37,0 17,3 – 37,5 Emulsão de peixe 18,2 – 37,0 17,3 – 37,5 *Temperatura Mínima e Máxima do ar atingida nos dois ensaios de cada material orgânico. 399 36 Tabela 4. Média da germinação de microconídios de Fusarium oxysporum f. sp. lactucae 400 em solo+substrato previamente (duas horas e sete dias) incorporado com os materiais 401 orgânicos. 402 Incubação após a incorporação* Germinação (%) Algans Casca de camarãons Concha de mariscons Semente de abacatens 2 horas 54,2 47,8 71,0 68,2 7 dias 62,8 65,0 75,7 64,9 *Incubação de microconídios após a incorporação dos materiais orgânicos. Incubação dos 403 microconídios por 24 horas. ns = não significativo pela regressão polinomial (5% de 404 significância). 405 37 406 Figura 1. Suportes construídos para receberem as membranas contendo microconídios de 407 Fusarium oxysporum f. sp. lactucae. 408 A B C 38 Concentração (%) 0 10 20 30 40 50 G er m in aç ão (% ) 0 20 40 60 80 100 HP R2 = 0,680 y = 62,343 + (-3,152)x + 0,042x2 EP R2 = 0,623 y = 67,666 + (-3,192)x + 0,041x2 A Concentração (%) 0 10 20 30 40 50 G er m in aç ão (% ) 0 20 40 60 80 100 HP R2 = 0,7631 y = 23,945 + 0,186x + 0,055x2 + (-0,0012)x3 EP R2 = 0,524 y = 24,686 + 1,391x + (-0,117)x2 + 0,00016x3 B 409 Figura 2. Efeito da incorporação de hidrolisado de peixe (●) (──) e emulsão de peixe (○) 410 (─ ─) nas concentrações de 0, 10, 20, 30, 40 e 50% do volume de água para atingir a 411 capacidade de campo em mistura de solo + substrato secos sobre a germinação de 412 microconídios de Fusarium oxysporum f. sp. lactucae. Microconídios depositados no solo 413 duas horas (A) e sete dias (B) após a incorporação do material orgânico. Média de três 414 ensaios para duas horas (A) e dois ensaios para 7 dias (B) após a incorporação dos 415 materiais orgânicos. 416 39 CAPÍTULO 2 EFEITO DE RESÍDUOS ORGÂNICOS E Trichoderma harzianum NO CONTROLE DE Fusarium circinatum EM Pinus radiata Este capítulo foi redigido em formato de artigo de acordo com as normas da revista Chilean Journal of Agricultural Research. 40 Efeito de resíduos orgânicos e Trichoderma harzianum no controle de Fusarium circinatum 1 em Pinus radiata 2 3 Cassiano Forner1*, Daniella A. Valdabenito2, Eugenio Sanfuentes2, Wagner Bettiol3 4 1Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filhoˮ 5 (UNESP), Câmpus Botucatu, CEP 18.610-307 - Botucatu, SP, Brasil. Bolsista CNPq. Autor para 6 correspondência (forner687@hotmail.com). 7 2Universidad de Concepción, Centro de Biotecnología, Casilla 160-C, Concepción, Chile. 8 3Embrapa Meio Ambiente, CP 69, CEP 13.820-000 Jaguariúna, SP, Brasil. Bolsista do CNPq. 9 10 RESUMO 11 Fusarium circinatum, agente causal da Fusariose do pinus, pode atacar tanto mudas quanto plantas 12 adultas, sendo que a ocorrência em viveiros compromete todo o lote de mudas. A utilização de 13 agentes de biocontrole e resíduos orgânicos podem constituir alternativas ao controle. O estudo 14 teve por objetivo avaliar o potencial de resíduos à base de algas, casca de caranguejo, concha de 15 marisco e repolho sobre a germinação de microconídios de F. circinatum, bem como da doença em 16 plântulas de Pinus radiata em viveiro, associados ou não a Trichoderma harzianum. Tanto os 17 resíduos orgânicos, quanto o agente de biocontrole, não inibiram a germinação dos microconídios, 18 nem controlaram a doença. 19 Palavras-chave: controle biológico, supressão, cancro resinoso, matéria orgânica. 20 21 ABSTRACT 22 Fusarium circinatum, the agent that causes the fusariosis of pine, can attack pine seedling and adult 23 plants. In nursery, the pathogen can cause high losses in batches, because had restrictions of 24 transplant in the field. The pathogen control is difficult, and the use of biocontrol agents and 25 organic matter may be an alternative control. In this work we evaluated the potential of seaweed, 26 crab shell, clamshell and cabbage on the microconidia germination of F. circinatum, as well as in 27 the control of pitch canker in seedling of Pinus radiata in nursery, associated or not with 28 Trichoderma harzianum. The organic matter and biocontrol agent did not inhibit the microconidia 29 germination, neither controlled the disease. 30 Keywords: Biological control, suppressiveness, pitch canker, organic matter. 31 32 INTRODUÇÃO 33 O cancro resinoso do pinus, causado por Fusarium circinatum (Gordon, 2006), foi relatado pela 34 primeira vez nos Estados Unidos da América em 1945 (Hepting e Roth, 1946). Atualmente, a 35 doença é encontrada em várias partes do mundo (Gordon, 2006). Especificamente na América do 36 41 Sul, F. circinatum foi identificado no Chile. Ainda que a ocorrência seja restrita em viveiros 37 (Jacobs et al., 2007), são verificadas plantas com sintomas da doença em cultivos comerciais, 38 porém a doença não está estabelecida. Estas ocorrências, provavelmente, são originárias de plantas 39 infectadas nos viveiros. No entanto, o risco do estabelecimento é intensificado pela predominância 40 do cultivo de Pinus radiata, altamente suscetível ao patógeno (Wingfield et al., 2008). O patógeno 41 também foi encontrado em viveiros de mudas de Pinus taeda no Uruguai (Alonso e Bettucci, 2009) 42 em viveiros de mudas e em cultivos comerciais na Colômbia (Steenkamp et al., 2012) e, 43 recentemente, relatado no Brasil, causando doença em viveiro com plantas de Pinus patula, no 44 estado de Santa Catarina (Pfenning et al., 2014). 45 No Chile, não se conhece exatamente o motivo do não estabelecimento do patógeno em cultivo 46 comercial. A ausência de insetos vetores específicos associados à doença é uma hipótese. Fatores 47 ambientais, como o clima seco e temperaturas baixas, desfavoráveis ao estabelecimento ou 48 disseminação do patógeno também são considerados (Wingfield et al., 2008). Na África do Sul, F. 49 circinatum permaneceu restrito em viveiros por, aproximadamente, 15 anos, até surgir o primeiro 50 relato do patógeno causando doença em cultivo comercial de P. radiata. A ocorrência está 51 associada às condições climáticas favoráveis, a associação do patógeno com a infestação do 52 gorgulho Pissodes nemorensis, além dos ferimentos causados pelo manejo de poda que 53 favorecerem o desenvolvimento da doença (Coutinho et al., 2007). 54 Os sintomas causados por F. circinatum em viveiros são podridão radicular, do colo e da parte 55 aérea, podendo causar a morte da planta (Fourie et al., 2014), além de murcha (Martín-Rodrigues et 56 al., 2015). Em plantas adultas, observa-se, principalmente, clorose das acículas próximas ao sítio de 57 infecção e consequente morte de ramos (lesões que anelam o ramo). Podem ocorrer repetidas 58 infecções que causam extensos danos à copa do hospedeiro. Uma grande infecção ocupa uma larga 59 extensão do ramo ou tronco, acarretando em grande produção de resina. Lesões próximas ao nível 60 do solo, em plantas jovens, podem causar clorose em todas as acículas, por consequência do 61 anelamento do tronco (Gordon et al., 2001). 62 Plântulas de P. radiata infestadas com F. circinatum apresentam aumento da quantidade de resina 63 exsudada. As plântulas que, aos 21 dias após a inoculação do patógeno, apresentavam exsudação 64 moderada ou elevada de resina, morreram 56 dias após a inoculação. O F. circinatum tolera a 65 resina e utiliza os dutos de resina para colonização vertical em novas zonas (Martín-Rodrigues et 66 al., 2013). 67 Existem relatos de controle de patógenos habitantes do solo com utilização de materiais orgânicos: 68 casca de caranguejo no controle de Fusarium solani f. sp. piperis em pimenta-do-reino (Benchimol 69 et al., 2006); Brassica juncea no solo na redução de Murcha de Fusarium em espinafre (Mowlick et 70 al., 2013); pó de algas (Stokeyia variabile, Spatoglossum variabile e Melanothamnus afaqhusainii) 71 42 no controle de Rhizoctonia solani, F. solani e F. oxysporum em berinjela e melancia (Baloch et al., 72 2013). 73 Outra alternativa crescente disponível para o controle de patógenos habitantes do solo é o controle 74 biológico. Especificamente, para o controle de F. circinatum, Trichoderma isolados UDC-23 e 75 UDC-408 e Clonostachys UDC-A32 e UDC-222, em substrato esterilizado, sete dias antes da 76 infestação com do patógeno, foram promissores no controle da doença (Moraga-Suazo et al., 77 2011). Quatro isolados de Bacillus subtilis (B1, B2, B3 e B4) e um de Burkholderia sp. (B5), 78 endofítico de P. taeda, inibiram quatro isolados de F. circinatum em testes in vitro (Soria et al., 79 2012). Penicillium chrysogenum e Fusarium lateritium, isolados de insetos vetores e não vetores de 80 F. circinatum, competem por recursos com o patógeno. Em elevada concentração do patógeno, o 81 tratamento de sementes com os antagonistas não foi eficaz, porém em baixas concentrações, houve 82 parcial proteção (Romón et al., 2008). 83 Considerando a recente expansão do patógeno pela América do Sul, torna-se relevante o 84 desenvolvimento de técnicas de controle para evitar o alastramento do patógeno para cultivos 85 comerciais. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar o uso de resíduos orgânicos sobre a 86 germinação de microconídios de F. circinatum e de resíduos associados ou não a Trichoderma 87 harzianum na redução de mortalidade de plântulas de P. radiata pelo patógeno. 88 89 MATERIAL E MÉTODOS 90 Multiplicação do patógeno e antagonista 91 O isolado de F. circinatum Pr 444641 (Fc) foi obtido da coleção do Laboratorio de Patología 92 Forestal da Universidad de Concepción, e multiplicado em meio batata-dextrose-ágar (BDA), por 93 sete dias em temperatura de 25 ± 1 ºC. Posteriormente, discos de BDA contendo o micélio do 94 patógeno foram dispensados em meio líquido SNA (1g de KH2PO4; 0,5 g de MgSO4 7H2O; 0,5 g 95 de glicose; 0,2g de sacarose e 1g de KNO3 por litro de água) por um período de 72 h, quando foi 96 padronizada uma suspensão na concentração de 1 x 104 microconídios mL-1 para os testes em casa 97 de vegetação. 98 O antagonista utilizado, Trichoderma harzianum CBF84, foi multiplicado em BDA. Após 99 incubação por sete dias, discos contendo micélio do antagonista foram dispensados em bolsas de 100 polipropileno contendo grãos de arroz, previamente autoclavados. As bolsas foram mantidas a 101 25°C ± 1 ºC, por 21 dias, quando os conídios foram suspensos em frascos de vidro por meio da 102 adição de água destilada autoclavada, seguida de agitação por 1 h, em agitador orbital a 150 rpm. A 103 suspensão foi filtrada em dupla camada de gaze e a suspensão padronizada a 1 x 107 conídios mL-1. 104 105 43 Materiais orgânicos 106 Os materiais orgânicos utilizados nos experimentos foram: concha de marisco (CM), casca de 107 caranguejo (CC), alga (Mazzaella sp.) (AL) e repolho - Brassica oleracea var. capitata - (RE). Os 108 materiais orgânicos marinhos (CM, CC e AL) foram coletados no litoral da VIII Region del Bio 109 Bio (Chile), Playa Blanca, Colcura, Balneáreo El Morro e Cocholgue em setembro de 2013. Estes 110 materiais foram lavados com água de abastecimento da rede pública, pré-secados ao sol e secados 111 em estufa com circulação de ar forçada com temperaturas de 55 ± 5 ºC. Em seguida, os materiais 112 orgânicos foram triturados, com auxílio de um moinho manual, e passados em peneira de 25 mesh 113 (0,71 mm de diâmetro). Os materiais orgânicos foram armazenados em sacos plásticos até o dia da 114 incorporação. O RE foi triturado no dia anterior à incorporação no substrato, com auxílio de um 115 ralador manual, e mantido a 4 ºC até o momento de uso. 116 117 Efeito dos resíduos orgânicos incorporados ao solo sobre a germinação de microconídios. 118 F. circinatum foi multiplicado em meio BDA por sete dias, então foi preparada uma suspensão de 119 microconídios através da dispensa de 10 mL de água destilada esterilizada em cada placa, seguida 120 da raspagem superficial. A suspensão foi filtrada em dupla camada de gaze e calibrada em 2 x 105 121 microconídios mL-1. Em seguida, 150 µL desta suspensão foi dispensada entre as duas membranas 122 de ester de celulose (Millipore 0,45 µm de poro) de 25 mm de diâmetro e fixadas em um suporte de 123 anel de PVC. Os suportes foram preparados com luvas hidráulicas de ¾” de diâmetro e buchas de 124 redução hidráulicas. Dentro de cada suporte foram acomodados sequencialmente: um anel de 125 borracha de vedação, as membranas de Millipore contendo a suspensão de Fola e novamente um 126 anel de borracha de vedação. Em seguida os suportes foram rosqueados para utilização (Figura 1). 127 Simultaneamente, vasos de 500 mL foram preenchidos com uma mistura de areia, proveniente do 128 viveiro Proplantas (localizado no km 22 em Chillán), com os materiais orgânicos, nas 129 concentrações de 0 (testemunha), 1, 2 e 4% v/v. A mistura foi irrigada e depois de duas horas 130 foram colocados dois suportes contendo os microconídios de Fc por vaso, a uma profundidade de 4 131 cm. Os vasos foram mantidos em câmara de crescimento a 25 ± 1 ºC e fotoperíodo de 12 h. Os 132 suportes permaneceram por 24 h nessas condições. Quatorze dias após, no mesmo vaso, outros dois 133 suportes também foram enterrados, permanecendo novamente por 24 h, para avaliar o efeito de 134 uma decomposição por um tempo maior. 135 Após a retirada dos suportes, as membranas (duas por suporte) foram retiradas e dispostas sobre 136 lâminas microscópicas, com a face interna voltada para cima. Circundando as membranas foram 137 colocados anéis plásticos com 2 mm de altura e 22 mm de diâmetro. Dentro de cada anel foi 138 depositado meio ágar-água (AA) a 2%. Imediatamente após a solidificação do meio, o filtro foi 139 retirado e sobre o meio, agora contendo os microconídios de F. circinatum, foi dispensado azul de 140 44 lactofenol para paralisação da germinação dos microconídios. A germinação foi determinada a 141 partir de 100 microconídios amostrados em cada disco. 142 O delineamento foi inteiramente casualizado, com três repetições (vasos), contendo dois suportes 143 com duas membranas em cada suporte, por concentração de cada resíduo. Cada resíduo foi 144 analisado separadamente, sendo que todos os ensaios foram realizados duas vezes. 145 146 Experimento em casa de vegetação 147 O experimento foi instalado em casa de vegetação na cidade de Los Ángeles, província de Bio Bio, 148 Chile. Os resíduos foram incorporados ao substrato nas concentrações de 0 (testemunha), 1, 2 e 4% 149 (v/v), com ou sem a aplicação do antagonista. Cada resíduo foi considerado como um experimento 150 separadamente. O delineamento utilizado foi o de parcelas subdivididas com três repetições. Para 151 tanto, cada parcela foi composta por duas bandejas (com e sem aplicação do antagonista), sendo 152 divididas nas concentrações de cada resíduo. As bandejas continham 88 tubetes, com capacidade 153 para 140 mL de substrato. Para cada repetição das concentrações foram utilizados 16 tubetes (duas 154 fileiras), deixando uma fileira de 8 tubetes livre para separar as concentrações do resíduo. A 155 incorporação dos materiais orgânicos marinhos (CM, CC e AL) no substrato, ocorreu sete dias 156 antes da semeadura de P. radiata, enquanto que RE foi incorporado um dia antes da semeadura. 157 A aplicação do antagonista foi com uma suspensão com 1 x 107 conídios mL-1 até atingir 25% do 158 volume necessário para atingir da capacidade de campo do substrato, três dias antes da semeadura 159 de P. radiata. 160 O substrato foi infestado com o patógeno em uma concentração de 1 x 104 UFC mL-1, um dia antes 161 da semeadura de P. radiata. O volume de suspensão do patógeno utilizado foi para atingir 25% da 162 capacidade de campo do substrato. 163 A desinfestação das sementes de P. radiata foi realizada por imersão em solução de peróxido de 164 hidrogênio, por 15 minutos, e, posteriormente, lavadas duas vezes em água destilada, um dia antes 165 da semeadura. Em cada tubete foi semeada uma semente. 166 As avaliações foram realizadas semanalmente determinando o número de plantas emergidas e o de 167 plântulas mortas. As plântulas mortas foram coletadas e o patógeno foi isolado para confirmação da 168 causa. As variáveis de crescimento (comprimento de raiz, altura de planta, massas fresca e seca de 169 raiz e parte aérea) foram avaliadas no final do experimento a partir de cinco plantas selecionadas 170 aleatoriamente de cada repetição de cada concentração do resíduo. 171 172 Análise estatística 173 Com os resultados de germinação de microconídios foi realizada análise de variância e os dados 174 submetidos à análise de regressão a 5% de significância, utilizando o programa estatístico SAS® 175 9.0. Com os dados dos ensaios em casa de vegetação foi realizada análise de variância e os dados 176 45 de mortalidade foram transformados em x + 0,5. Para essa análise foi utilizado o programa 177 estatístico Sisvar 5.5. Aplicou-se a análise de regressão para o fator concentração de materiais 178 orgânicos. 179 180 RESULTADOS 181 Efeito dos resíduos orgânicos incorporados ao solo sobre a germinação de microconídios 182 Não houve efeito dos resíduos analisados sobre a germinação de microconídios de Fc (Figura 2). 183 Apesar da concha de marisco, após 14 dias de incubação apresentar uma redução da germinação de 184 microconídios com o aumento da concentração. Entretanto, com baixo valor de R2, o que não 185 permite uma conclusão sobre este tratamento. 186 187 Experimento em casa de vegetação 188 Não foram verificadas interações entre o T. harzianum e os materiais orgânicos na emergência e a 189 redução da mortalidade de plântulas para nenhum dos resíduos orgânicos e o antagonista. A 190 aplicação de T. harzianum não interferiu na emergência e mortalidade de P. radiata (Figuras 3 e 4). 191 O aumento da concentração de AL no substrato proporcionou uma redução da emergência de 192 plântulas de Pinus, seguindo um modelo linear (Figura 3A). No entanto, não reduziu a mortalidade 193 de plantas causadas por F. circinatum (Figura 4A). A adição de CC não alterou a emergência de P. 194 radiata (Figura 3B). Tanto a emergência, quanto o controle de F. circinatum não foram 195 significativos para as diferentes concentrações incorporadas de CM e RE (Figura 3CD e 4CD). 196 Para as variáveis de crescimento, não se pode concluir com base nos resultados obtidos devido ao 197 valor de R2 muito baixo (Figuras 5, 6, 7 e 8). 198 199 DISCUSSÃO 200 A metodologia do teste de germinação utilizada permitiu avaliar diretamente o efeito dos resíduos 201 em mistura no substrato sobre a germinação dos microconídios. T