UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Química Campus Araraquara MATHEUS GABRIEL GUARDIANO DOS SANTOS Cinética de degradação de Azitromicina e Claritromicina presentes em efluentes domésticos por processo foto-Fenton em meio homogêneo e heterogêneo Araraquara 2023 MATHEUS GABRIEL GUARDIANO DOS SANTOS Cinética de degradação de Azitromicina e Claritromicina presentes em efluentes domésticos por processo foto-Fenton em meio homogêneo e heterogêneo Dissertação apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Química. Orientadora: Profa. Dra. Raquel Fernandes Pupo Nogueira Araraquara 2023 S237c Santos, Matheus Gabriel Guardiano dos Cinética de degradação de Azitromicina e Claritromicina presentes em efluentes domésticos por processo foto-Fenton em meio homogêneo e heterogêneo / Matheus Gabriel Guardiano dos Santos. -- Araraquara, 2023 113 f. : il. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Química, Araraquara Orientadora: Raquel Fernandes Pupo Nogueira 1. Antibióticos. 2. Macrolídeos. 3. Tratamento efluente de águas residuais. 4. Complexos (Química). 5. Cromatografia líquida de alta eficiência. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca do Instituto de Química, Araraquara. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. Impacto potencial desta pesquisa A presente pesquisa apresenta contribuições para entendimento do mecanismo de degradação e recalcitrância de antibióticos macrolídeos frente ao processo Fenton, um processo oxidativo avançado. Desta forma, relaciona-se com o ODS 6 (água potável e saneamento). Além disso, entender os efeitos dos macrolídeos no meio ambiente contribui com os ODS 14 (vida na água) e 7 (energia limpa e acessível), devido aos processos fotoquímicos naturais que ocorrem pela radiação solar. Potential impact of this research The present research presents contributions to the understanding of the degradation mechanism and recalcitrance of macrolide antibiotics to the Fenton process, an advanced oxidative process (AOP). In this way, it relates to SDG 6 (clean water and sanitation). In addition, understanding the effects of macrolides on the environment contributes to SDGs 14 (life below water) and 7 (affordable and clean energy), due to the natural photochemical processes that occur through solar radiation. DADOS CURRICULARES IDENTIFICAÇÃO Nome: Matheus Gabriel Guardiano dos Santos Nome em citações bibliográficas: SANTOS, M. G. G.; GUARDIANO DOS SANTOS, M. G.; SANTOS, MATHEUS GABRIEL GUARDIANO DOS. e-mail: matheus.guardiano@unesp.br FORMAÇÃO ACADÊMICA/TITULAÇÃO 03/2021- Em andamento Mestrado em Química (andamento) Instituto de Química de Araraquara, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP) Orientadora: Profa. Dra. Raquel Fernandes Pupo Nogueira Bolsa: FAPESP (Processo n° 2021/06348-5) 10/2022-03/2023 Mestrado Sanduíche em Química Università degli Studi di Torino (University of Turin, Italy). Título do Projeto: Azithromycin and Clarithromycin degradation products generated in heterogeneous Fenton process using copper-containing magnetites and titanomagnetites as catalysts Orientador: Prof. Dr. Davide Vittorio Vione Bolsa: BEPE FAPESP (Processo n° 2022/07727-2) 03/2021-08/2022 Graduação em Licenciatura em Química Universidade Federal de Itajubá (UNIFEI) Trabalho de Conclusão de Curso: Semeando Cientistas: propostas de oficinas sobre Educação Ambiental e aplicação da metodologia STEM. Orientadora: Profa. Dra. Milady Renata Apolinário da Silva 03/2017-12/2020 Graduação em Bacharelado em Química Universidade Federal de Itajubá (UNIFEI) Trabalho de Conclusão de Curso: Aplicação do processo foto-Fenton solar para degradação de resíduos laboratoriais de determinação de dureza da água. Orientadora: Profa. Dra. Milady Renata Apolinário da Silva ATUAÇÃO PROFISSIONAL 10/2021-02/2022 Estágio docência realizado no IQ-UNESP/Araraquara na disciplina de Química Ambiental ofertada para os cursos de bacharelado em Química/Química Tecnológica sob a supervisão da Profa. Dra. Raquel Fernandes Pupo Nogueira. PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA Artigos completos publicados em periódicos 1) SANTOS, MATHEUS GABRIEL GUARDIANO DOS; GIMENES, ROSSANO; SILVA, MILADY RENATA APOLINÁRIO DA. Construção de uma sequência didática sobre química dos solos usando a metodologia STEM: Análise das competências da BNCC e dos elementos da abordagem CTS. RESEARCH, SOCIETY AND DEVELOPMENT, v. 10, p. e34110515024, 2021. 2) MORETTI, ANA CAROLINA LEITE; DOS SANTOS, MATHEUS GABRIEL GUARDIANO; SOARES, MELINA ESPANHOL; DE FREITAS, JOÃO VICTOR ROCHA; RIOS, LUCIANO; SILVA, FLAVIO SOARES; GIMENES, ROSSANO; KONDO, MÁRCIA MATIKO; DA SILVA, MILADY RENATA APOLINÁRIO. Degradation of Municipal Solid Waste Landfill Leachate Using Ferrites from Spent Batteries as Heterogeneous Solar Photo- Fenton Catalyst. International Journal of Environmental Research, v. 17, p. 33, 2023. Livros e capítulos 1) SANTOS, M. G. G.; SILVA, M. R. A. QUÍMICA DOS SOLOS. In: Milady Renata Apolinário da Silva; Kévila Kelma Nascimento Silva dos Passos. (Org.). SEMEANDO CIENTISTAS: CIÊNCIA CRIATIVA EM SEQUÊNCIAS DIDÁTICAS BASEADAS NAS HABILIDADES E COMPETÊNCIAS DA BNCC. 1ed.Curitiba: CRV, 2022, v. 01, p. 97-109. Trabalhos publicados em anais de eventos científicos 1) SANTOS, M. G. G.; SOUSA, F. B. Caracterização eletrônica e termodinâmica de compostos de coordenação de metais de transição. In: II Simpósio de Iniciação Científica UNIFEI, 2019, Itajubá. Anais do II Simpósio de Iniciação Científica UNIFEI campus Itajubá, 2019. v. 2. p. 194-195. 2) SANTOS, M. G. G.; SILVA, I. A. D.; SILVA, M. R. A. O ensino de inglês como forma de empoderamento e de motivação para ingresso em carreiras de ciências e engenharia. In: 9° Congresso Brasileiro de Extensão Universitária, 2021, Belo Horizonte. Anais do 9° Congresso Brasileiro de Extensão Universitária - Redes para Promover e Defender os Direitos Humanos, 2021. v. 1. p. 1603-1604. 3) NOGUEIRA, R. F. P.; GUARDIANO DOS SANTOS, M. G. Clarithromycin degradation applying homogeneous and heterogeneous photo-Fenton process. In: 5th Iberoamerican Conference on Advanced Oxidation Technologies, 2022, Cuzco. Book of Abstracts - V CIPOA, 2022 v.1. p. 130-131. Apresentações de trabalho e/ou palestras 1) SANTOS, M. G. G.; DE SOUSA, F. B. Caracterização eletrônica e estudo termodinâmico de compostos de coordenação de Níquel. XXXII Encontro Regional da Sociedade Brasileira de Química - MG, 2018. 2) SANTOS, M. G. G.; DE SOUSA, F. B. Caracterização eletrônica e termodinâmica de compostos de coordenação de metais de transição. II Simpósio de Iniciação Científica da UNIFEI campus Itajubá, 2019. 3) SANTOS, M. G. G.; SILVA, M. R. A. Aplicação do processo foto-Fenton solar para degradação do complexo entre Cálcio e Negro de Eriocromo-T. XXXIII Encontro Regional da Sociedade Brasileira de Química - MG, 2019. 4) SANTOS, M. G. G.; SILVA, I. A. D.; SILVA, M. R. A. O ensino de inglês como forma de empoderamento e de motivação para ingresso em carreiras de ciências e engenharia. 9° Congresso Brasileiro de Extensão Universitária (9° CBEU), 2021. 5) SANTOS, M. G. G.; SILVA, M. R. A. Treatment of laboratory residue for determining water hardness using the solar photo-Fenton process. 4to. Congreso Colombiano de Procesos Avanzados de Oxidación, 2021. 6) SANTOS, M. G. G. Compartilhamento de vivências e experiências na construção de um material didático para ensinar Química para o Ensino Médio. Participação em Roda de Conversa com alunos de graduação em Licenciatura em Química da Universidade Federal de Itajubá como convidado, 2022. 7) NOGUEIRA, R. F. P.; GUARDIANO DOS SANTOS, M. G. Clarithromycin degradation applying homogeneous and heterogeneous photo-Fenton process. 5th Iberoamerican Conference on Advanced Oxidation Technologies, 2022. PARTICIPAÇÃO EM BANCAS 1) SANTOS, M. G. G. Avaliador de trabalhos submetidos ao XXXIII Congresso de Iniciação Científica da Unesp - IQ/Araraquara, 2021. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. PARTICIPAÇÃO EM EVENTOS CIENTÍFICOS 1) XXXI Encontro Regional da Sociedade Brasileira de Química - MG. 2017 (organização). 2) XI Ciência em Cena: encontro de teatro e divulgação científica. A fantástica fábrica da química, 2017. 3) Bota pra Fazer, Centro de Empreendedorismo UNIFEI, 2017. 4) XXXII Encontro Regional da Sociedade Brasileira de Química - MG. 2018. 5) XII Ciência em Cena: encontro de teatro e divulgação científica. Alice cientificamente comprovada, 2018. 6) XXXIII Encontro Regional da Sociedade Brasileira de Química - MG. 2019. 7) V Fim de Semana de Gestão e Liderança, 2019 (organização). 8) II Simpósio de Iniciação Científica da UNIFEI campus Itajubá, 2019. 9) 5ª Edição da Semana da Química UNIFEI, 2020 (organização). 10) 9° Congresso Brasileiro de Extensão Universitária, 2021. 11) 6ª Edição da Semana da Química UNIFEI, 2021. 12) 4to. Congreso Colombiano de Procesos Avanzados de Oxidación, 2021. PRÊMIOS E MENÇÃO HONROSA 1) Menção Honrosa na 6ª OBMEP, Olímpiada Brasileira de Matemática das Escolas Públicas, 2010. 2) Medalhista de Prata na OBA (OBA), Olimpíada Brasileira de Astronomia e Astronáutica, 2010. 3) Menção Honrosa na 7ª OBMEP, Olímpiada Brasileira de Matemática das Escolas Públicas, 2011. 4) Menção Honrosa na 8ª OBMEP, Olímpiada Brasileira de Matemática das Escolas Públicas, 2012. 5) Láurea Acadêmica - Licenciatura em Química, Universidade Federal de Itajubá, 2022. AGRADECIMENTOS Gostaria de agradecer primeiramente aos meus pais, seu José e dona Maria. Vocês são minha maior fonte de inspiração, amor, carinho e apoio durante toda minha vida: Sem vocês chorando minhas conquistas e me ajudando nas minhas crises, nada disso seria possível. À minha orientadora Profa. Raquel por todo suporte ao longe desses dois anos e meio, por acreditar em mim desde o começo e me acolher tão bem em Araraquara. Não consigo expressar em palavras o tanto que aprendi e mudei nesse tempo, muito menos serei capaz de um dia agradecer por me incentivar viver um dos meus maiores sonhos, um intercâmbio de pesquisa. Obrigado por tanto! À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2021/06348-5 e 2022/07727-2) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq 230504/2021-1) pelo financiamento da minha pesquisa por meio de bolsas de estudos. À CAPES pelo financiamento da ciência no Brasil como um todo. Aos meus amigos do LAPOA: Thais, Jany, Sayna, Karla e David. Obrigado por todos os cafés, almoços e sorvetes pós almoço juntos. Sentirei falta de vocês no meu dia a dia. Aos meus amigos de graduação e ensino médio que ainda estão presentes na minha vida após tantos anos. Vocês são o verdadeiro significado de para sempre. Um abraço especial para a Mandinha, a qual compartilha comigo as dores e as alegrias do dia a dia. A todos os amigos que fiz durante esse tempo em Araraquara, os quais me apoiaram e me ajudaram desde o começo. Sou grato por ter vocês em minha vida. Agradecimento em especial para a Isabella, Julia, Lucinha, Pere, Luiza, Micuwin, Coral, Sete, Deboche, Marina, Lucas e Bombs... Torço muito por vocês. Ao Prof. Davide Vione e ao Dr. Luca Carena por todo suporte durante meu período na Universidade de Turim. Obrigado por sempre me ajudarem a conseguir o que eu precisava. Ao GFQM-IQ pelas medidas de difração de raios x. A todos professores que me ajudaram no decorrer de todas as disciplinas e a todos os técnicos do IQ que me ajudaram com as caracterizações dos meus catalisadores. Ao Instituto de Química e a Universidade de Turim, minhas casas durante esse período. Enfim, agradeço a todos que direta ou indiretamente tiveram uma contribuição na minha formação e/ou me apoiaram durante esses anos. Muito obrigado! Sentirei saudades. RESUMO A presença de antibióticos em efluentes provenientes de estações de tratamento de esgotos (ETE) após processo convencional tem recebido grande atenção atualmente devido à constatação dos problemas que esses contaminantes podem causar tanto ao ambiente quanto à saúde humana, como a resistência bacteriana. O presente trabalho estudou a cinética de degradação de dois antibióticos macrolídeos, a azitromicina (AZT) e a claritromicina (CLA), por processo Fenton em meio homogêneo e heterogêneo e comparou-a com a degradação do sulfametoxazol (SMX), pertencente à classe das sulfonamidas. Desenvolveu-se e validou-se métodos analíticos para separação e quantificação simultânea dos macrolídeos, isoladamente do método de quantificação do SMX. A formação de complexos de ferro e cobre com os macrolídeos e a influência da complexação no ciclo redox Fe(II)/Fe(II) e Cu(I)/Cu(II) foi avaliada utilizando a espectrofotometria. A degradação dos fármacos foi realizada em água ultrapura e efluente da ETE contendo 1% de acetonitrila devido à baixa solubilidade dos macrolídeos. A concentração dos fármacos foi monitorada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), assim como seus produtos de transformação foram identificados por meio do acoplamento da HPLC com um espectrômetro de massas. Para degradação no processo heterogêneo, foram preparados catalisadores à base de óxido de cobre e ferro. Verificou-se a formação dos complexos de ferro e cobre com os macrolídeos, porém com um efeito redutor dos macrolídeos sobre o Cu(II), gerando complexos de Cu(I) em solução. Embora os complexos de macrolídeos com Fe e Cu influenciem o ciclo redox, apenas os complexos de cobre apresentaram comportamento recalcitrante ao processo foto-Fenton homogêneo. Dentre os catalisadores utilizados no processo heterogêneo, observou-se que o aumento do teor de cobre durante a síntese contribuiu para a maior área específica de CAT1 do que de CAT2, resultando em uma maior atividade de CAT1. A variação do pH afetou a degradação dos macrolídeos, assim como a variação da concentração de H2O2 inicial. Melhores resultados de aplicação do processo foto-Fenton heterogêneo foram obtidos usando 0,125 g L-1 de CAT1, 15 mmol L-1 de H2O2 em pH 5,4. Nos processos em meio homogêneo e heterogêneo, a constante de degradação de SMX foi superior à dos macrolídeos, indicando uma maior recalcitrância dos macrolídeos. Experimentos realizados em efluente de ETE evidenciaram que a matriz não influenciou a degradação de AZT e CLA, porém afetou a degradação do SMX. A matriz interferiu na degradação do SMX por ela ocorrer por combinação dos mecanismos de adição eletrofílica com abstração do átomo de hidrogênio e transferência eletrônica, enquanto os macrolídeos foram menos afetados pela degradação ocorrer por transferência eletrônica apenas. A identificação de produtos de transformação revelou a formação de produtos hidroxilados para os macrolídeos. Experimentos realizados na presença de sequestrantes de radicais hidroxila evidenciaram a importância do •OH na degradação dos macrolídeos, enquanto a degradação do SMX não foi totalmente inibida por não depender apenas do •OH, mas sim de outros radicais como o HO2 •, O2 •- e 1O2. Os resultados obtidos contribuem para o entendimento do mecanismo de degradação e recalcitrância dos macrolídeos ao processo Fenton. Palavras-chave: Antibióticos, Macrolídeos, Tratamento efluente de águas residuais, Complexos (Química), Cromatografia líquida de alta eficiência. ABSTRACT The presence of antibiotics in effluents from wastewater treatment plants (WWTP) after a conventional process has received great attention due to problems that these contaminants can cause both to the environment and to human health, such as bacterial resistance. The present work studied the degradation kinetics of two macrolide antibiotics, azithromycin (AZT) and clarithromycin (CLA), by Fenton process in homogeneous and heterogeneous medium and compared it with sulfamethoxazole (SMX) degradation, belonging to sulfonamides class. Analytical methods were developed and validated for simultaneous separation and quantification of macrolides, separately from SMX quantification method. The formation of iron and copper complexes with macrolides and the complexation influence on the Fe(II)/Fe(II) and Cu(I)/Cu(II) redox cycle was evaluated using spectrophotometry. Pharmaceuticals degradation was performed in ultrapure water and WWTP effluent containing 1% acetonitrile due to the low solubility of macrolides. Pharmaceuticals concentrations were monitored by high performance liquid chromatography (HPLC) and their transformation products were identified through the coupling of HPLC with a mass spectrometer. For heterogeneous process degradation, catalysts based on copper and iron oxide were used. The formation of iron and copper complexes with the macrolides was verified with reducing effect of the macrolides on Cu(II), generating Cu(I) complexes in solution. Although the complexes of macrolides with Fe and Cu influenced the redox cycle, only the copper complexes showed a recalcitrant behavior to the homogeneous photo-Fenton process. Among the catalysts used in the heterogeneous process, it was observed that the increase in copper content during the synthesis contributed to the surface area of CAT1 being greater than that of CAT2, resulting in a greater activity of CAT1. Variation in pH affected macrolide degradation, as well initial H2O2 concentration. The best results of heterogeneous photo-Fenton process application were obtained using 0.125 g L- 1 of CAT1, 15 mmol L-1 of H2O2 at pH 5.4. In all processes (homogeneous and heterogeneous media) the degradation constant of SMX was higher than that of macrolides, indicating greater recalcitrance of AZT and CLA. Experiments carried out on the WWTP effluent showed that the matrix did not influence AZT and CLA degradation, however it affected SMX degradation. The matrix interfered with SMX degradation because it occurs by combining the mechanisms of electrophilic addition with abstraction of the hydrogen atom and electronic transfer, while the macrolides were less affected due to the degradation occurring by electronic transfer only. The transformation products identification revealed the formation of hydroxylated products for both macrolides. Experiments carried out in the presence of hydroxyl radical scavengers showed the importance of •OH in macrolides degradation. SMX degradation was not completely inhibited because it does not depend only on •OH, but also on other radicals such as HO2 •, O2 •- and 1O2. The obtained results contribute to the understanding of the degradation mechanism and the recalcitrance of macrolide antibiotics to the Fenton process. Keywords: Antibiotics, Macrolides, Wastewater effluent treatment, Complexes (Chemistry), High performance liquid chromatography. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1: Número de publicações das pesquisas realizadas nas bases de dados “Web of Science”, “Science Direct” e “Scopus” no período de 1945 a 2021. Palavras-chave: Fenton AND wastewater AND antibiotic (1); e o refinamento dos resultados anteriores com sulfamethoxazole (2) OR clarithromycin (3) OR azithromycin (4), apresentando os resultados com: a) Escala original; b) Ampliação da escala para observação de (3) e (4). ........................................................................................................................................... 20 Figura 2: Estrutura química do Sulfametoxazol. ..................................................................... 24 Figura 3: Estrutura química da molécula de a) azitromicina; b) claritromicina. Diferenças estruturais estão indicadas pelas cores similares. .............................................................. 26 Figura 4: Reações envolvidas no método de quantificação de peróxido de hidrogênio residual utilizado durante o Estágio Pesquisa na Itália. E = peroxidase. ........................................ 39 Figura 5: Cromatogramas de CLA nas concentrações de a) 10 mg L-1; b) 5 mg L-1. Condições: Coluna REZEX ROA Organic Acid; modo isocrático ACN/tampão fosfato monobásico 0,02 mol L-1 pH 7,5 (80:20 v/v); Temperatura de 50 °C;  = 205 nm e vazão = 1,2 mL min- 1.......................................................................................................................................... 42 Figura 6: Cromatogramas de AZT em diferentes concentrações obtidos após derivatização com FMOC-Cl. Condições: coluna LUNA C18 250 mm; modo isocrático metanol/tampão fosfato 0,02 mol L-1; pH 7 (70:30 v/v); 50 °C; vazão = 1,0 mL min-1. Preto = AZT 10 mg L-1; Rosa = AZT 1 mg L-1; Azul = AZT 0,3 mg L-1; Marrom = FMOC-Cl. Detecção por fluorescência nos comprimentos de onda de 265 nm (excitação) e 315 nm (emissão), Vinjeção = 40 L. ............................................................................................................................. 43 Figura 7: Cromatogramas de AZT e CLA nas concentrações de 50 mg L-1. Condições: coluna LUNA C18 150 mm; modo isocrático ACN/tampão fosfato monobásico 0,02 mol L-1 pH 7,5 (80:20 v/v); 50 °C; vazão = 0,5 mL min-1. Detecção em 205 nm e Vinjeção = 40 L. .. 44 Figura 8: Espectros de absorção na região do UV-Vis de a) CLA e b) AZT na presença de diferentes concentrações de [Fe2+] = 0 a 3 mmol L-1, 25% acetonitrila/75% água destilada, pH = 2,5. ............................................................................................................................ 52 Figura 9: Dependência da absorbância em 360 nm com a razão molar metal/ligante para o complexo de Ferro (II) com a) CLA e b) AZT. ................................................................ 53 Figura 10: Espectros de absorção na região do UV-Vis de a) CLA e b) AZT na presença de cobre(II) . [Cu(II)] = 0 to 3 mmol L-1, 25% acetonitrila/75% água destilada, pH = 2,5. .. 54 Figura 11: Dependência da absorbância em 250 nm com a razão molar metal/ligante para o complexo de Cobre (II) com a) CLA e b) AZT ................................................................ 55 Figura 12: Estrutura química das moléculas de a) CLA; b) AZT e pontos de coordenação. . 56 Figura 13: Espectros de absorção na região do UV-Vis para os complexos formados entre a) CLA e b) AZT com ferro(III). [Fe(III)] = 0 to 3 mmol L-1, 25% acetonitrila/75% água destilada, pH = 2,5. ........................................................................................................... 57 Figura 14: Geração de a) Fe(II) e b) Cu(I) nos primeiros minutos do processo foto-Fenton sob lâmpada de luz negra. [CLA] = [AZT] = 5 mg L-1, [Fe(III)] = [FeOx] = [Cu(II)] = 0,2 mmol L-1, [H2O2] = 2 mmol L-1, pH = 2,5. .................................................................................. 58 Figura 15: Difratogramas de raios-X obtidos para a magnetita sintetizada, CAT1 e CAT2 comparados com o difratogramas padrão da magnetita comercial e dos óxidos de cobre ou ferro e cobre. ..................................................................................................................... 61 Figura 16: Imagens de microscopia eletrônica de varredura para a) MAG-S, b) CAT1, c) CAT2 e d) MAG-C. ..................................................................................................................... 63 Figura 17: Estabilidade da azitromicina (laranja) e claritromicina (azul) em diferentes valores de pH. [CLA] = [AZT] = 10 mg L-1. ................................................................................. 64 Figura 18: Degradação de a) AZT e b) CLA por processo foto-Fenton heterogêneo e c) consumo de H2O2. [CLA] = [AZT] = 6,6 mol L-1, [CAT1] = 0,125 g L-1, [H2O2] = 15 mmol L-1, [ACN] = 1% (v/v), pH = 6,5. ........................................................................... 65 Figura 19: Degradação de a) AZT e b) CLA aplicando o processo foto-Fenton heterogêneo e c) Consumo de H2O2. [CLA] = [AZT] = 6,6 mol L-1, [CAT1] = 0,125 g L-1, [H2O2] = 15 mmol L-1, [ACN] = 1% (v/v), pH = 5,4. ........................................................................... 67 Figura 20: Efeito da concentração de H2O2 na degradação de a) AZT e b) CLA; c) consumo de H2O2 em razão C/C0 (símbolos fechados) e em mmol L-1 (símbolos abertos). [CLA] = [AZT] = 6,6 mol L-1, [CAT1] = 0,125 g L-1, [H2O2] = 15 mmol L-1, [ACN] = 1% (v/v), pH = 5,4. ............................................................................................................................ 69 Figura 21: a) Degradação de AZT, CLA e SMX aplicando o processo foto-Fenton heterogêneo e b) Consumo de H2O2. [CLA] = [AZT] = [SMX] = 6,6 mol L-1, [CAT1] = 0,125 g L-1, [H2O2] = 15 mmol L-1, [ACN] = 1% (v/v) e pH = 5,4. ..................................................... 71 Figura 22: Efeito da concentração de acetonitrila na degradação do SMX aplicando o processo foto-Fenton heterogêneo com CAT1. [SMX] = 6,6 mol L-1, [CAT1] = 0,125 g L-1, [H2O2] = 15 mmol L-1, pH = 5,4. .................................................................................................. 72 Figura 23: a-c) Degradação de AZT e CLA e consumo de H2O2 utilizando 0,125 g L-1 de CAT2 e 15 mmol L-1 de H2O2; d-f) efeito da concentração de H2O2 na degradação de AZT e CLA utilizando 0,125 g L-1 de CAT2; g-i) efeito da concentração de CAT2 na degradação de AZT e CLA utilizando 15 mmol L-1 de H2O2. [CLA] = [AZT] = 6,6 mol L-1; [ACN] = 1% (v/v), pH 5.4. ............................................................................................................... 73 Figura 24: a) Degradação de AZT, CLA e SMX aplicando o processo foto-Fenton heterogêneo e b) Consumo de H2O2. [CLA] = [AZT] = [SMX] = 6,6 mol L-1, [CAT2] = 0,125 g L-1, [H2O2] = 15 mmol L-1, [ACN] = 1% (v/v) e pH = 5,4. ..................................................... 74 Figura 25: Efeito da concentração de acetonitrila na degradação do SMX aplicando o processo foto-Fenton heterogêneo com CAT2. [SMX] = 6,6 mol L-1, [CAT2] = 0,125 g L-1, [H2O2] = 15 mmol L-1 e pH = 5,4. ................................................................................................. 75 Figura 26: a) Degradação de CLA, AZT e SMX pelo processo foto-Fenton homogêneo; b) Consumo de H2O2. [CLA] = [AZT] = [SMX] = 6,6 mol L-1, [Fe(II)] = 0,2 mmol L-1, [H2O2] = 2 mmol L-1, [ACN] = 1% (v/v), pH = 2,5. ......................................................... 76 Figura 27: Efeito da concentração de acetonitrila na degradação do SMX aplicando o processo foto-Fenton homogêneo. [SMX] = 6,6 mol L-1, [Fe(II)] = 0,2 mmol L-1, [H2O2] = 2 mmol L-1, pH = 2,5. ..................................................................................................................... 78 Figura 28: a) Degradação de CLA, AZT e SMX pelo processo foto-Fenton homogêneo; b) Consumo de H2O2. [CLA] = [AZT] = [SMX] = 6,6 mol L-1, [Fe(II)] = 0,2 mmol L-1, [H2O2] = 2 mmol L-1, pH = 2,5. [%ACN (v/v)] = 1 para AZT e CLA e 0 para SMX. ..... 79 Figura 29: Degradação de a) AZT; b) CLA e c) SMX por fotólise em efluente (-■-) e pelo processo foto-Fenton heterogêneo em água (-●-) e efluente doméstico (-▲-); d) Consumo de H2O2. [CLA] = [AZT] = [SMX] = 6,6 mol L-1; [CAT1] = 0,125 g L-1; [H2O2] = 15 mmol L-1; [ACN] = 1% (v/v); pH = 8. .............................................................................. 80 Figura 30: Evolução dos produtos de transformação em a) água e b) efluente durante aplicação do processo foto-Fenton heterogêneo e comparação com evolução das áreas de AZT e CLA. [CLA] = [AZT] = [SMX] = 6,6 mol L-1, [CAT1] = 0,125 g L-1, [H2O2] = 15 mmol L-1, [ACN] = 1% (v/v), pH = 8, tR = tempo de retenção. .................................................. 83 Figura 31: Espectro de massas da Azitromicina. .................................................................... 84 Figura 32: Cromatogramas obtidos para a AZT antes e após aplicação do processo foto-Fenton homogêneo usando os detectores a-b) DAD  = 230 nm e c-d) ESI/MS (base peak). [AZT] = 6,6 mol L-1, [Fe(II)] = 0,2 mmol L-1, [H2O2] = 2 mmol L-1, [ACN] = 0,5% (v/v), pH = 2,5. Amostragem em 30 min. ............................................................................................ 85 Figura 33: Proposta de produtos de degradação identificados para a AZT aplicando o processo foto-Fenton homogêneo. [AZT] = 6,6 mol L-1, [Fe(II)] = 0,2 mmol L-1, [H2O2] = 2 mmol L-1, [ACN] = 0,5% (v/v), pH = 2,5.................................................................................... 87 Figura 34: Proposta de produtos de degradação identificados para a AZT aplicando o processo foto-Fenton heterogêneo. [AZT] = 6,6 mol L-1, [CAT1] = 0,125 g L-1, [H2O2] = 15 mmol L-1, [ACN] = 0,5% (v/v), pH = 5,4.................................................................................... 88 Figura 35: Espectro de massas da claritromicina. ................................................................... 89 Figura 36: Cromatogramas obtidos para a CLA antes e após aplicação do processo foto-Fenton homogêneo usando os detectores a-b) UV/DAD  = 230 nm e c-d) ESI/MS (base peak). [CLA] = 6,6 mol L-1, [Fe(II)] = 0,2 mmol L-1, [H2O2] = 2 mmol L-1, [ACN] = 0,5% (v/v), pH = 2,5. Amostragem em 30 min. ................................................................................... 90 Figura 37: Proposta de produtos de degradação identificados para a CLA aplicando o processo foto-Fenton homogêneo. [CLA] = 6,6 mol L-1, [Fe(II)] = 0,2 mmol L-1, [H2O2] = 2 mmol L-1, [ACN] = 0,5% (v/v), pH = 2,5.................................................................................... 91 Figura 38: Efeito de diferentes sequestrantes de radicais hidroxila na degradação da a) AZT; b) CLA e c) SMX; d) consumo de H2O2. [CLA] = [AZT] = [SMX] = 6,6 mol L-1; [CAT1] = 0,125 g L-1; [H2O2] = 15 mmol L-1; [ACN] = 1% (v/v); pH = 8; [sequestrantes] = 100 mmol L-1. ........................................................................................................................... 92 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Fórmula molecular e propriedades físico-químicas da AZT e CLA. ...................... 27 Tabela 2: Reagentes utilizados no Brasil e Itália..................................................................... 33 Tabela 3: Condições cromatográficas avaliadas para determinação do método analítico....... 41 Tabela 4: ANOVA para ajuste do modelo de regressão linear para quantificação dos antibióticos. (dados obtidos no Brasil). ............................................................................. 46 Tabela 5: Parâmetros da curva analítica e limites de detecção e quantificação dos fármacos por HPLC/UV em água. .......................................................................................................... 47 Tabela 6: Parâmetros da curva analítica e limites de detecção e quantificação dos fármacos por HPLC/DAD em água na Itália. ......................................................................................... 48 Tabela 7: ANOVA para ajuste do modelo de regressão linear para quantificação dos antibióticos (dados obtidos na Itália). ............................................................................... 49 Tabela 8: Parâmetros de regressão das curvas analíticas (AZT, CLA e SMX inferior) gerados para cada coeficiente de ponderação (Wi) e a soma dos respectivos erros relativos (∑%ER) para os dados dos ensaios. ................................................................................................. 51 Tabela 9: Área superficial específica, porosidade e composição química dos catalisadores sintetizados e da magnetita comercial. .............................................................................. 62 Tabela 10: Parâmetros cinéticos de degradação obtidos dos fármacos aplicando o processo foto-Fenton heterogêneo usando CAT1 em pH 6,5. ......................................................... 66 Tabela 11: Parâmetros cinéticos de degradação obtidos dos fármacos aplicando o processo foto-Fenton heterogêneo usando CAT1 em pH 5,4. ......................................................... 68 Tabela 12: Parâmetros cinéticos de degradação obtidos do SMX aplicando o processo foto- Fenton heterogêneo com CAT2 em pH 5,4 na presença e ausência de ACN no meio. .... 76 Tabela 13: Parâmetros cinéticos de degradação obtidos para os fármacos aplicando o processo foto-Fenton homogêneo usando Fe(II) como catalisador em pH 2,5. ............................... 77 Tabela 14: Parâmetros cinéticos de degradação obtidos dos fármacos aplicando o processo foto-Fenton heterogêneo (usando CAT1) em efluente da ETE de Araraquara e água (pH ajustado para 8). ................................................................................................................ 81 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AZT Azitromicina CLA Claritromicina SMX Sulfametoxazol LC-MS/MS Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas ETE Estações de tratamento de esgotos ERI Eritromicina ROX Roxitromicina log Kow Coeficiente de partição octanol água POA Processos oxidativos avançados DBO Demanda bioquímica de oxigênio UV-Vis Região do ultravioleta-visível CAT1 Catalisador 1 CAT2 Catalisador 2 DRX Difração de raios-X ED-FRX Espectrômetro de fluorescência de raios-X de energia dispersiva MEV Microscopia eletrônica de varredura COT Carbono orgânico total CT Carbono Total CI Carbono inorgânico HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência ESI Ionização por eletrospray ACN Acetonitrila MeOH Metanol FMOC-Cl Cloroformiato de 9-fluorenilmetila tR Tempo de retenção ANOVA Análise de variância LQ Limite de quantificação LD Limite de detecção FeOx Ferrioxalato de potássio MAG-S Magnetita sintetizada MAG-C Magnetita comercial Sumário 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 19 2. OBJETIVOS .................................................................................................................... 22 2.1 Objetivos Específicos .................................................................................................... 22 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ....................................................................................... 23 3.1. Antibióticos no Brasil e no mundo ............................................................................. 23 3.2. Os antibióticos macrolídeos ........................................................................................ 25 3.3. O processo Fenton em meio homogêneo e heterogêneo ............................................ 30 4. PARTE EXPERIMENTAL ............................................................................................ 33 4.1. Reagentes utilizados ..................................................................................................... 33 4.2. Preparo das soluções padrões, testes de solubilidade e coleta dos efluentes .......... 34 4.3. Caracterização espectrofotométrica dos macrolídeos .............................................. 35 4.4. Síntese dos catalisadores ............................................................................................. 36 4.5. Aplicação do processo foto-Fenton homogêneo e heterogêneo ................................ 36 4.6. Caracterizações ............................................................................................................ 37 4.6.1. Difração de Raios-X ................................................................................................ 37 4.6.2. Isotermas de adsorção e dessorção de N2 ................................................................ 37 4.6.3. Fluorescência de Raios-X (ED-FRX) ..................................................................... 37 4.6.4. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ......................................................... 37 4.7. Análises Químicas ........................................................................................................ 38 4.7.1. Carbono Orgânico Total (COT) .............................................................................. 38 4.7.2. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) ................................................ 38 4.7.3. Determinação de H2O2 residual, cobre e ferro ........................................................ 38 4.7.4. Determinação dos produtos de degradação utilizando Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a espectrômetro de massas ........................................................ 40 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 41 5.1. Desenvolvimento e validação dos métodos analíticos utilizados .............................. 41 5.1.1. Quantificação de AZT, CLA e SMX no Brasil ....................................................... 41 5.1.2. Quantificação de AZT, CLA e SMX na Itália ........................................................ 47 5.2. Caracterização espectrofotométrica dos complexos de macrolídeos com ferro e cobre ..................................................................................................................................... 52 5.3. Influência da complexação com macrolídeos nos processos redox de ferro e cobre na presença de H2O2 ........................................................................................................... 58 5.4. Caracterização dos catalisadores sintetizados .......................................................... 60 5.5. Degradação dos macrolídeos por processo foto-Fenton heterogêneo ..................... 63 5.5.1. Utilização de CAT1 como catalisador .................................................................... 64 5.5.2. Utilização de CAT2 como catalisador .................................................................... 72 5.6. Degradação de AZT, CLA e SMX por processo foto-Fenton homogêneo .............. 76 5.7. Degradação de AZT, CLA e SMX em efluente doméstico ....................................... 80 5.8. Produtos de degradação da Azitromicina em água .................................................. 84 5.9. Produtos de degradação da Claritromicina em água ............................................... 89 5.10. Radicais envolvidos na degradação .......................................................................... 91 6. CONCLUSÕES ................................................................................................................... 94 7. PERSPECTIVAS ................................................................................................................ 96 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 97 ANEXO 1 ............................................................................................................................... 107 ANEXO 2 ............................................................................................................................... 108 19 1. INTRODUÇÃO Muita atenção é dada à contaminação do meio ambiente por contaminantes emergentes e seus efeitos, assim como o impacto à saúde humana. Nessa problemática, os antibióticos são contaminantes emergentes muito estudados, tanto quanto à ocorrência como à degradação por diferentes processos, por ocasionarem o desenvolvimento da resistência bacteriana e genes resistentes, gerando um problema de saúde pública grave. Dentre as diversas classes de antibióticos, uma classe muito utilizada no combate de diversas infecções é a dos macrolídeos, os quais apresentam-se como lactonas cíclicas de 14 a 16 membros no anel ligadas a açúcares, apresentando alta massa molecular e baixa solubilidade em água. Exemplos de antibióticos macrolídeos são a azitromicina (AZT) e a claritromicina (CLA). Devido à baixa solubilidade em água e alta bioacumulação, os macrolídeos são contaminantes preocupantes do meio ambiente. Entretanto, devido à estrutura química complexa, a baixa absorção na região do UV-Vis e as dificuldades analíticas associadas na análise desses antibióticos, mesmo por técnicas analíticas de cromatografia, estudos sobre o comportamento no ambiente e processos de degradação desses antibióticos são escassos em comparação a outras classes de antibióticos. Dentre os diferentes processos que podem ser aplicados para remoção dos macrolídeos, como os de oxidação, redução ou adsorção, pouco se estudou sobre a aplicação do processo foto-Fenton (um processo oxidativo avançado) à degradação dessa classe de antibióticos. O processo foto-Fenton apresenta condições operacionais de temperatura e pressão ambiente, apresentando vantagens em comparação a outros processos que requerem materiais ou condições muito específicas. Além disso, o processo foto-Fenton é apresentado na literatura como uma alternativa para a degradação de antibióticos pertencentes a diferentes classes. Um levantamento realizado na literatura no ano de 2021 (Figura 1) apresenta o número de publicações em três bases de dados diferentes no período de 1945 a 2021. Os artigos que aparecem quando se refinam os resultados por AZT e CLA referem-se a artigos de revisão ou artigos que fazem levantamento de dados sobre a presença de antibióticos em efluentes domésticos, apresentando poucos resultados sobre a utilização do processo Fenton para degradação dessas moléculas. Quando se observa os resultados para o Sulfametoxazol (SMX), um antibiótico muito estudado pertencente à classe das sulfonamidas, o número de publicações é bem mais expressivo devido à sua alta prescrição e estrutura química mais simples. 20 Figura 1: Número de publicações das pesquisas realizadas nas bases de dados “Web of Science”, “Science Direct” e “Scopus” no período de 1945 a 2021. Palavras-chave: Fenton AND wastewater AND antibiotic (1); e o refinamento dos resultados anteriores com sulfamethoxazole (2) OR clarithromycin (3) OR azithromycin (4), apresentando os resultados com: a) Escala original; b) Ampliação da escala para observação de (3) e (4). Nos últimos dois anos, durante a realização da pesquisa, o número de dados sobre a degradação de macrolídeos cresceu em comparação ao levantamento realizado em 2021, porém ainda são necessários muitos estudos para compreender o comportamento desses fármacos e sua recalcitrância a diferentes processos, como o foto-Fenton por exemplo. Além disso, os macrolídeos também receberam atenção especial nos últimos anos devido à prescrição de AZT no combate ao COVID-19. Nessa conjuntura, o presente trabalho apresenta o desenvolvimento e validação de um método analítico para separação e quantificação de AZT e CLA, assim como a degradação desses fármacos por processo foto-Fenton em meio homogêneo (usando cobre ou ferro como catalisadores) e heterogêneo (usando óxidos de cobre e ferro como catalisadores). Ademais, também foram realizados alguns estudos que fomentam a discussão sobre a degradação desses fármacos, como a complexação da AZT e CLA com ferro e cobre e o efeito da formação de complexos na degradação por processo homogêneo. Todos os resultados obtidos sobre a degradação dos macrolídeos foram comparados com a degradação do SMX, individualmente ou simultaneamente. Essa comparação foi realizada devido ao mecanismo de inibição de atividade bacteriana, estrutura química mais simples, menor massa molar e a alta densidade eletrônica do SMX em comparação aos macrolídeos, os 21 quais apresentam um diferente mecanismo de inibição, estruturas químicas complexas, altas massas moleculares e baixa densidade eletrônica. Um estudo realizado na Itália verificou que os antibióticos que mais apresentam riscos para o meio ambiente e foram detectados ao longo do Rio Pó (norte da Itália) são a AZT, CLA e SMX (AL AUKIDY et al., 2012). Esse estudo indica uma relevância na comparação da cinética de degradação desses três fármacos por diferentes processos e em diferentes matrizes, foco central da presente dissertação. Em outro estudo realizado na região da Lombardia (Itália), verificou-se que a maior prescrição de azitromicina para tratamento da COVID-19, assim como outros fármacos, ocasionou em um aumento da ocorrência da AZT nas ETE, principalmente nas que recebiam descarte de efluente hospitalar. Além disso, a AZT e outros fármacos foram apresentados como potenciais riscos para o ambiente, devido à suas toxicidades e possibilidade de indução de resistência bacteriana e viral (CAPPELLI et al., 2022). 22 2. OBJETIVOS O objetivo geral deste trabalho foi estudar a cinética de degradação dos antibióticos Azitromicina (AZT) e Claritromicina (CLA) presentes em efluentes domésticos aplicando o processo Fenton (homogêneo e heterogêneo). 2.1 Objetivos Específicos o Estudar a cinética de degradação dos dois antibióticos da classe dos macrolídeos e comparar com um antibiótico de estrutura química mais simples – Sulfametoxazol (SMX); o Estudar a influência da complexação dos macrolídeos com ferro e cobre na degradação por processo homogêneo; o Avaliar a degradação dos antibióticos macrolídeos em amostras de efluentes domésticos; o Identificar os principais produtos da degradação dos antibióticos macrolídeos pela técnica de cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (LC- MS/MS). 23 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1. Antibióticos no Brasil e no mundo Antibióticos são compostos usados para tratar doenças infecciosas (ZAINAB et al., 2020). Neste século, o consumo global de antibióticos aumentou consideravelmente devido ao aumento da população mundial, da facilidade de acesso a medicamentos e ao aumento da demanda por proteína animal, processo que requer um maior uso de antibióticos com a finalidade de tratamentos veterinários e como promotores do crescimento (KOVALAKOVA et al., 2020). Cabe ressaltar que o uso de antimicrobianos como promotores do crescimento é uma prática que vem sendo banida em diversos países, como os pertencentes à União Europeia. Desde a sua descoberta no século XX, os antibióticos são cada vez mais utilizados e possibilitaram o desenvolvimento de muitos procedimentos na medicina moderna (HUTCHINGS; TRUMAN; WILKINSON, 2019). Nesse cenário, a taxa global de consumo de antibióticos cresceu 39% entre 2000 e 2015, sendo os maiores usuários países de alta renda (como os EUA) e, principalmente, países emergentes pertencentes ao grupo denominado BRICS (Brasil, Rússia, Índia, China e África do Sul), os quais foram responsáveis por 75% desse aumento (KOVALAKOVA et al., 2020). De acordo com o relatório da Organização Mundial da Saúde sobre vigilância do consumo de antibióticos (WHO), em 2016 o Brasil foi o maior consumidor de antibióticos do mundo (2225 toneladas por ano) (WHO, 2018). Dentre todas as classes de antibióticos, as penicilinas são as mais utilizadas no mundo, totalizando 53% dos antibióticos utilizados no Brasil em 2016, 37% dos utilizados na Europa em 2015 e 40% dentre os utilizados na África em 2015. A segunda classe de antibióticos mais utilizados no Brasil e na Europa (15%) são pertencentes à classe dos macrolídeos, lincosamidas e estreptograminas, enquanto na África a segunda classe mais utilizada são antibióticos da classe das sulfonamidas e trimetoprimas. No Brasil, as quinolonas representam 12% e as sulfonamidas e trimetoprimas representam 6% de todo o consumo (WHO, 2018). Devido ao sucesso da utilização de antibióticos na cura de infecções, estes passaram a ser utilizados em larga escala, porém sem técnicas analíticas disponíveis que permitissem a sua detecção em efluentes. Entretanto, a alta utilização dos antibióticos e o desenvolvimento de equipamentos analíticos modernos implicou na diminuição dos limites de detecção e permitiram que os antibióticos fossem detectados em níveis de concentração de ng L-1, recebendo atenção especial como novos contaminantes no ambiente aquático (PATEL et al., 2019). 24 Nesse contexto, muitos estudos foram desenvolvidos nos últimos anos visando a remoção e monitoramento desses contaminantes emergentes do ambiente. A principal fonte relatada desses contaminantes em águas provém das estações de tratamento de esgotos (ETE) devido à baixa eficiência dos tratamentos convencionais aplicados à remoção desses contaminantes (REIS et al., 2019). No Brasil, o cenário é ainda mais grave que em países desenvolvidos considerando a carência dos serviços de tratamento de esgotos, tendo em vista que o percentual de esgotos tratados é igual a 51,2% em relação ao volume total gerado (IN046) e 80,8% em relação ao volume coletado (IN016) (SNIS, 2022). Outra fonte dos contaminantes emergentes provém dos efluentes hospitalares, os quais apresentam uma alta concentração de fármacos que varia de acordo com o uso hospitalar (KHAN et al., 2020). Entretanto, no Brasil, os efluentes hospitalares são descartados na rede de esgotos para tratamento posterior nas ETE. No Brasil, a presença de contaminantes emergentes em diferentes matrizes vem sendo atualizada na literatura (MARSON et al., 2022), entretanto ainda não há uma legislação ambiental específica para esses contaminantes. Aproximando da realidade do estado de São Paulo, um estudo recente realizou o monitoramento da presença de contaminantes emergentes em água potável, superficial e subterrânea durante um período de 10 anos (MONTAGNER et al., 2019). Foi detectada a presença de pesticidas, drogas ilícitas, hormônios, fármacos (como antibióticos) e produtos de cuidados pessoais. Um antibiótico muito utilizado mundialmente e detectado em diferentes matrizes aquosas é o Sulfametoxazol (SMX), o qual é um antibiótico pertencente à classe das sulfonamidas que apresenta aromaticidade (Figura 2). O SMX é muito estudado devido à sua alta prescrição, ocorrência e estrutura química menos complexa em comparação a outros antibióticos. Além disso, o SMX apresenta alta solubilidade em água (610 mg L-1 a 37 ˚C) e um mecanismo de inibição bacteriana dependente de sua estrutura química, ou seja, o SMX apresenta estrutura semelhante ao ácido p-aminobenzoico e atua impedindo a síntese do ácido fólico (necessário para o crescimento bacteriano) através da inibição da enzima di-hidropteroato sintetase (KIELHOFNER, 1990). Figura 2: Estrutura química do Sulfametoxazol. 25 Estudos têm demonstrado que a contaminação de águas por antibióticos pode causar efeitos nocivos para micro-organismos como evolução da estrutura da comunidade bacteriana, alterações gênicas, anormalidade em proteínas e atividades enzimáticas, bem como anomalias animais como no crescimento de peixes, ratos e sapos (FELIS et al., 2020). Dentre esses problemas, atenção especial é dada ao desenvolvimento de resistência bacteriana, um problema muito grave de saúde pública que demanda o desenvolvimento de antibióticos mais complexos devido à adaptação de bactérias no ambiente ocasionada pela presença desses contaminantes. Nesse contexto, infecções bacterianas resistentes a antibióticos resultam em maior mortalidade que infecções comuns, e estima-se que essas infecções possam causar 10 milhões de mortes anuais em todo o mundo em 2050, sendo que a estimativa anual atual é de 700 mil mortes (FELIS et al., 2020; PATEL et al., 2019). A presença de antibióticos no ambiente ocasiona o desenvolvimento de genes resistentes, assunto que tem recebido maior atenção nos últimos anos devido o desenvolvimento de métodos em biologia molecular para detecção desses genes e a sua maior tolerância ao tratamento secundário realizado nas estações de tratamento de esgotos (ETE) (WANG et al., 2020). Nesse sentido, estudos sobre a ocorrência de resistência bacteriana e genes resistentes no meio ambiente são importantes, assim como ações para prevenir ou minimizar estes problemas pela remoção desses contaminantes de diferentes matrizes. 3.2. Os antibióticos macrolídeos Os antibióticos macrolídeos contêm uma lactona cíclica de 14, 15 ou 16 membros com açúcares (geralmente desosamina e cladinose) ligados, sendo utilizados na medicina veterinária e humana (KESKAR; JUGADE, 2015). Os macrolídeos são produzidos através da Saccharopolyspora erythraea (ou Streptomyces erythreus), uma bactéria gram-positiva que produz o macrolídeo eritromicina (ERI), sendo posteriormente modificado por derivatização originando os outros antibióticos desta classe (HU; HU, 2005). Dessa forma, ERI é conhecida como macrolídeo de primeira geração e seus derivados, como azitromicina (AZT), claritromicina (CLA) e roxitromicina (ROX), são conhecidos como antibióticos macrolídeos de segunda geração. Além disso, também existem os macrolídeos de terceira geração que são conhecidos como cetolídeos, como a espiramicina, formados pela derivatização da ERI, porém com a substituição de um dos açúcares ligados ao anel macrolídeo por um grupo ceto (HU; HU, 2005; KESKAR; JUGADE, 2015; YU et al., 2016). 26 Estruturalmente, os macrolídeos também são classificados quanto ao tamanho do anel macrolídeo, sendo a ERI, CLA e ROX antibióticos com anel de 14 membros enquanto a AZT apresenta 15 membros no anel macrolídeo. No presente trabalho estudou-se a AZT e CLA (Figura 3), macrolídeos de 2ª geração mais utilizados com diferentes tamanhos de anel, os quais são geralmente prescritos para tratar infecções do trato urinário (para pessoas alérgicas a penicilinas), trato respiratório superior e inferior, infecções de pele e ouvido ou mesmo infecções da boca, olhos e intestino (KESKAR; JUGADE, 2015). Figura 3: Estrutura química da molécula de a) azitromicina; b) claritromicina. Diferenças estruturais estão indicadas pelas cores similares. Observa-se que a AZT apresenta 15 membros no anel macrolídeo após adição de um átomo de N ao anel (marcação em verde), enquanto a CLA apresenta 14 membros, porém apresenta um grupo cetona na estrutura (marcação em vermelho) que a AZT não possui. Além disso, a CLA apresenta um grupo metoxi enquanto a AZT tem na mesma posição um grupo hidroxi (marcação em rosa). Embora ambos macrolídeos apresentem diferentes estruturas químicas, suas massas moleculares são muito próximas assim como outras propriedades físico- químicas (Tabela 1). 27 Tabela 1: Fórmula molecular e propriedades físico-químicas da AZT e CLA. Azitromicina Claritromicina Fórmula Molecular C38H72N2O12 C38H69NO13 Massa Molar 749 g mol-1 748 g mol-1 Ponto de Fusão 113-115 °C 217-220 °C Solubilidade em água 2,37 mg L-1 a 25°C 1,693 mg L-1 a 25°C pKa 8,5 8,99 log Kow 4,02 3,16 Fonte: PubChem, 2023. Ambos macrolídeos apresentam baixa solubilidade em água e alto valor de coeficiente de partição octanol/água (log Kow), o que indica um alta bioacumulação desses fármacos nos organismos aquáticos. Além disso, a AZT e CLA apresentam valores de pKa altos, demonstrando que os macrolídeos são fármacos com comportamento de bases fortes. Os macrolídeos também são lipofílicos e uma porção deles são metabolizados no corpo humano, sendo excretados principalmente pelas fazes e podendo ser encontrados na forma parental. A AZT e CLA, assim como os outros macrolídeos, atuam inibindo a translação entre o tRNA (RNA transportador) do sítio A (aminoacil) para o sítio P (peptidil) no ribossomo ao se ligarem ao receptor 23S do rRNA (RNA ribossomal), presente na subunidade 50S do ribossomo bacteriano. O sítio P contém a cadeia peptídica em crescimento e o sítio A é responsável por se ligar às moléculas de tRNA, destacando que os macrolídeos atuam inibindo a síntese proteica (BOLHUIS et al., 2011; DOUTHWAITE; CHAMPNEY, 2001; PETERS; FRIEDEL; MCTAVISH, 1992). Esse mecanismo de ação é característico dessa classe de antibióticos tendo em vista que o SMX, antibiótico sulfonamida apresentado na seção anterior, atua impedindo a síntese do ácido fólico consequentemente dificultando o crescimento bacteriano (KIELHOFNER, 1990). Quando presentes no ambiente aquático, os macrolídeos podem formar complexos com os metais de transição como cobre e ferro (SHER et al., 1996; VIONE et al., 2009). A formação desses complexos pode induzir a uma maior estabilidade à degradação por processos naturais, conforme observado em um estudo de fotólise que relatou 40 dias como tempo de meia vida do 28 complexo Fe(III)-CLA em experimentos realizados em amostras provenientes do rio Arc, sul da França (VIONE et al., 2009). A maior estabilidade dos macrolídeos no ambiente é preocupante tendo em vista que a AZT e CLA apresentam valores de concentrações inibitórias médias (CI50) equivalentes a, respectivamente, 0,5 mg L-1 e 0,002 mg L-1 em testes realizados utilizando algas verdes, indicando que esses compostos inibem e interferem no metabolismo do cloroplasto (como fotossíntese e síntese de proteínas), afetando o crescimento celular e perturbando todo ecossistema aquático devido ao papel importante das algas como produtores primários. Além disso, a AZT e a CLA também afetam outros organismos, como as diatomáceas, no caso da AZT que apresenta CI50 equivalente a 0,214 mg L-1, e a microcrustáceos em testes realizados com Daphnia magna, sendo a CI50 da AZT equivalente a 120 mg L-1 e a EC50 (concentração efetiva) da CLA equivalente a 25,72 mg L-1 (FELIS et al., 2020). Assim como outros antibióticos, a presença de AZT e CLA no meio ambiente já foi detectada. Em um estudo no qual se realizou o monitoramento da entrada e saída do efluente de uma ETE na Bratislava (capital da Eslováquia) verificou-se a entrada de altas concentrações de AZT e CLA (1800 ± 200 ng L-1 e 2750 ± 170 ng L-1, respectivamente) e a saída de ambos os macrolídeos ainda em altas concentrações após tratamento secundário, em comparação com os outros fármacos investigados, sendo observadas concentrações de 919 ± 140 ng L-1 de AZT e 680 ± 120 ng L-1 de CLA após tratamento (MACKU’AK et al., 2015). No Brasil, poucos estudos verificaram a presença de AZT e CLA em águas superficiais, sendo relatado que a faixa de concentração em que foram encontrados os macrolídeos varia de 35,9 a 158 ng L-1 para a AZT e de 39,2 a 199 ng L-1 para a CLA (ARSAND et al., 2020; MONTEIRO et al., 2018; REIS et al., 2019). Entretanto, esses estudos de ocorrência são anteriores ao cenário de pandemia causada pelo coronavírus, em que a AZT foi prescrita como parte do tratamento de COVID-19 no Brasil. Essa alta prescrição pode consequentemente ter aumentado a ocorrência de AZT em águas. Dados fornecidos por uma empresa farmacêutica para o nosso grupo de pesquisa sobre o consumo de antibióticos, indicam um aumento da prescrição da azitromicina entre 2016 e 2020, passando de 4327145 para 5412107 unidades prescritas, respectivamente, um aumento de 25% em 4 anos. Nesse cenário, alguns estudos de remoção de AZT e CLA foram publicados nos últimos anos aplicando diferentes processos de oxidação, redução ou adsorção. 29 A remoção de AZT já foi investigada aplicando processo sonoquímico utilizando óxido de zinco como catalisador (YAZDANI; SAYADI, 2018), adsorção (MEHRDOOST et al., 2022) , UV/H2O2 utilizando radiação solar simulada ou lâmpada de vapor de mercúrio (CANO et al., 2020; SHOKRI et al., 2020), UV/SO4 •- (OSPINO-ATEHORTÚA; ZÚÑIGA-BENÍTEZ; PEÑUELA, 2021; SADEGHI et al., 2018), fotocatálise heterogênea (ČIZMIĆ et al., 2019; NARAGINTI et al., 2019) e processo foto-Fenton heterogêneo utilizando um catalisador magnético com estrutura MnFe2O4 (QIN et al., 2021). Dentre esses estudos, cabe ressaltar a degradação por UV/H2O2, em que a degradação da AZT foi favorecida em valores de pH maiores, entre 6 e 9, em comparação a valores em meio mais ácido (CANO et al., 2020). Além disso, cabe ressaltar que a degradação aplicando processo foto-Fenton heterogêneo atingiu 92,6% de remoção de AZT (concentração inicial de 100 g L-1) após 240 min de aplicação do processo em pH 3,0, porém com lixiviação de aproximadamente 5 mg L-1 de Fe2+ do catalisador com estrutura MnFe2O4 para a solução (QIN et al., 2021). A remoção de CLA foi menos investigada do que a da AZT, com estudos sobre a degradação de CLA aplicando o processo eletro-Fenton (BASTURK et al., 2021), sono-Fenton (HOSSEINI et al., 2018), foto-Fenton solar (KARAOLIA et al., 2014) e a degradação de CLA utilizando ozônio (LANGE et al., 2006) e por fotólise solar (RODRÍGUEZ-LÓPEZ et al., 2021). Dentre esses estudos realizados, cabe ressaltar a degradação por foto-Fenton solar que atingiu 70% de remoção de CLA e 95% de SMX em efluente com pH 7,4, simultaneamente, em um reator usando 50 mg L-1 de H2O2 e 5 mg L-1 de Fe3+, com concentrações iniciais de 100 g L-1 de cada antibiótico (KARAOLIA et al., 2014). Os poucos estudos de detecção e degradação dos macrolídeos em comparação a outros antibióticos deve-se provavelmente às dificuldades analíticas de detecção devido à baixa absorção na região do UV-Vis, e propriedades físico-químicas da AZT e CLA, como baixa solubilidade em água. Entretanto, os macrolídeos mostraram-se como antibióticos bioacumuláveis no ambiente e estudos de degradação tornam-se essenciais. 30 3.3. O processo Fenton em meio homogêneo e heterogêneo Devido aos problemas que a presença de antibióticos causam ao ambiente, à saúde humana e a não remoção destes contaminantes após tratamento convencional nas ETE, diferentes estudos têm sido realizados visando removê-los após tratamento nas ETE utilizando técnicas como adsorção, nanofiltração, osmose reversa e técnicas avançadas de oxidação (PATEL et al., 2019). Os processos oxidativos avançados (POA), que são definidos como processos em que são formados radicais hidroxila (HO˙) que, devido ao alto potencial padrão de redução (E0 = 2,730 V), podem oxidar várias classes de compostos orgânicos a CO2, H2O e íons inorgânicos (MIKLOS et al., 2018; NOGUEIRA et al., 2007). O processo Fenton é um POA que vem sendo muito usado devido às suas condições de operacionalidade à temperatura e pressão ambiente, alta eficiência de remoção de matéria orgânica e custos baixos devido à utilização de baixas concentrações de reagentes. O processo consiste na oxidação de matéria orgânica em meio aquoso contendo sais ferrosos (que atuam como catalisadores) e peróxido de hidrogênio (Equação 1), o qual inicia o processo de oxidação por mecanismos de adição eletrofílica do radical hidroxila gerado na decomposição de peróxido de hidrogênio, abstração de átomos de hidrogênio ou por transferência eletrônica (RAHIM POURAN; ABDUL AZIZ; WAN DAUD, 2015). Fe2+ + H2O2  Fe3+ + ˙OH + OH- (1) O mecanismo de adição eletrofílica ocorre com compostos com alta densidade eletrônica devido à aromaticidade ou ligações  em sua estrutura química, enquanto a degradação envolvendo a abstração de átomo de hidrogênio ocorre geralmente com hidrocarbonetos alifáticos. Quando a degradação envolvendo esses mecanismos não é favorecida, como em compostos clorados, a degradação pode ocorrer por transferência eletrônica com a geração de diferentes radicais em solução provenientes do composto alvo (NOGUEIRA et al., 2007). A reação de Fenton apresenta maior eficiência quando irradiada devido a uma foto redução do aquacomplexo de ferro em solução por transferência de carga ligante-metal, reduzindo o íon metálico e oxidando o ligante. Essa foto redução gera íons ferrosos, os quais participam novamente da reação de Fenton, e um radical hidroxila que participa da oxidação da 31 matéria orgânica (Equação 2), encetando um processo cíclico que é conhecido como processo foto-Fenton (THOMAS; DIONYSIOU; PILLAI, 2021). Fe(OH)2+ + hv  Fe2+ + ˙OH (2) A degradação aplicando o processo homogêneo apresenta seu valor ótimo de pH em torno de 3 devido a uma maior presença de Fe(OH)2+ nesse valor de pH, o que é confirmado de acordo com o diagrama de especiação de Fe2+ e Fe3+ em função do pH. Ao aumentar o valor do pH da solução, a tendência é que o ferro seja hidrolisado e precipite como hidróxidos (PIGNATELLO; OLIVEROS; MACKAY, 2006). Embora o ferro seja o reagente clássico da reação de Fenton, existe a possibilidade de sua substituição completa ou parcial por outro metal de transição (Fenton-like), como cobre (Equações 3-4), manganês, cério e cobalto, os quais também podem reagir com H2O2 e participar da reação de Fenton, liberando um radical hidroxila para a solução (BOKARE; CHOI, 2014). Cu+ + H2O2  Cu2+ + HO• + OH- (3) Cu2+ + H2O2  Cu+ + HO2 • + OH- (4) Além disso, os metais utilizados nas reações do tipo Fenton podem complexar com os compostos-alvo e interferir no processo de degradação, seja acelerando ou reduzindo a formação de radicais hidroxila devido à formação ou não de um complexo fotoativo (BATISTA; NOGUEIRA, 2012). Verificou-se, por exemplo, que o complexo de ferro com o herbicida tebutiuron impede a reação de Fenton por formar um complexo não fotoativo (SILVA et al., 2010). Embora muito eficiente para degradação de diferentes classes de contaminantes emergentes, o processo foto-Fenton homogêneo apresenta algumas desvantagens, como geração de lodo de ferro, necessidade de controle rigoroso do pH do meio e a perda do catalisador no efluente. Nesse sentido, estudos recentes visam o desenvolvimento de um 32 catalisador sólido para superar as desvantagens do processo convencional, ou seja, processo Fenton heterogêneo (MUNOZ et al., 2015). Os principais materiais que são aplicados como catalisadores em fase sólida são os óxidos de ferro (como magnetita e hematita) e materiais dopados com óxidos de ferro, tendo alguns trabalhos relatado as vantagens na utilização resíduos que contêm grandes quantidades de ferro (AYALA-DURÁN; HAMMER; NOGUEIRA, 2020; NIDHEESH, 2015). Esses óxidos também permitem a aplicação do processo foto-Fenton heterogêneo em valores de pH mais próximos de 7 devido a uma utilização de um material à base de ferro ou com imobilização de Fe3+ e/ou Fe2+ na superfície do catalisador (MIRZAEI et al., 2017). A magnetita (Fe3O4) tem sido muito utilizada devido à sua estrutura octaédrica que acomoda íons de Fe(II) e Fe(III), demonstrando a fácil reversibilidade da oxidação e redução dos íons de ferro na mesma posição e destaque entre outros catalisadores devido a sua aplicabilidade vantajosa de apresentar em sua fase ativa íons ferrosos e férricos, ao contrário da hematita (Fe2O3) que contém somente íons férricos (LAI et al., 2021; MUNOZ et al., 2015). A modificação da magnetita com cobre (Fe3-xCuxO4) apresenta vantagens em comparação à magnetita (Fe3O4) para a degradação de contaminantes. Um estudo de degradação de medicamentos anticâncer observou uma remoção de mais de 95% de 5- fluorouracil e ciclofosfamida utilizando uma magnetita modificada com cobre por processo Fenton heterogêneo, utilizando-a na concentração de 0,125 g L-1 com valor de x otimizado em 0,25 (Fe2,75Cu0,25O4) e concentração de H2O2 igual a 15 mmol L-1 durante 150 min de irradiação artificial em pH igual a 6,5 (EMÍDIO; HAMMER; NOGUEIRA, 2020). Em outro estudo, a imobilização de magnetita modificada com cobre em argila, visando a degradação de SMX e Trimetoprim em efluente da ETE resultou em 41% e 52% de remoção, respectivamente, após 150 min de aplicação do processo foto-Fenton heterogêneo sob irradiação solar, demonstrando uma boa atividade catalítica do material após 3 ciclos de uso (DE JESUS; LIMA; NOGUEIRA, 2022). Os mecanismos envolvidos na geração de radicais hidroxila por processo heterogêneo são a reação de Fenton na superfície do catalisador, a lixiviação de ferro do catalisador para o meio com posterior reação do ferro com H2O2 em meio homogêneo e a geração de radicais hidroxila por combinação dos processos homogêneo e heterogêneo (HE et al., 2016). 33 4. PARTE EXPERIMENTAL 4.1. Reagentes utilizados Os reagentes utilizados, companhias fornecedoras e grau de pureza ao longo de toda pesquisa estão apresentados na Tabela 2. Tabela 2: Reagentes utilizados no Brasil e Itália. Reagente Fornecedor, pureza ou teor Brasil Itália Claritromicina Supelco, Sigma-Aldrich, ≥ 98% Supelco, Sigma-Aldrich, ≥ 98% Azitromicina Supelco, Sigma-Aldrich, ≥ 98% Supelco, Sigma-Aldrich, ≥ 98% Sulfametoxazol Sigma-Aldrich, ≥ 98% Sigma-Aldrich, ≥ 98% Peróxido de Hidrogênio Synth, 29% (v/v) AppliChem Panreac, 30% (v/v) Fosfato Monopotássico (KH2PO4) J. T. Baker, ≥ 99% Carlos Erba, ≥ 99% Hidróxido de Potássio (KOH) Êxodo Científica, ≥ 90% Sigma-Aldrich, 98% Acetonitrila para HPLC (gradiente) Êxodo Científica ou Carlo Erba VWR Chemicals BDH Metanol para HPLC (gradiente) Êxodo Científica ou Carlo Erba VWR Chemicals BDH ou Carlo Erba Ácido Fórmico J. T. Baker, 88% - Sulfato de Cobre Fmaia, 98,0 – 102,0% Carlo Erba Sulfato de Ferro(II) Synth, ≥ 99% Sigma-Aldrich, ≥ 99% Cloreto de Ferro(III) anidro VETEC, ≥ 98% - Nitrato de Ferro(III) Êxodo Científica, ≥ 98% - Iodeto de Potássio Synth, ≥ 99% - Hidróxido de sódio Êxodo Científica, ≥ 97% - Hidróxido de Amônio Synth, 27% - Metavanadato de Amônio VETEC, ≥ 99% - Ácido Sulfúrico Synth, 95,0 – 98,0% Synth, 95,0 – 98,0% 34 Hidroxilamina Êxodo Científica, ≥ 96% - Acetato de sódio Êxodo Científica, ≥ 98% - 1,10-Fenantrolina VETEC, ≥ 99,5% - Ácido clorídrico Scharlau, 37% - Citrato de sódio Sigma-Aldrich, ≥ 99% - Ácido batocuproinodissulfônico Sigma-Aldrich - Cloroformiato de 9- fluorenilmetila (FMOC- Cl) Sigma-Aldrich - Fosfato Monossódico (NaH2PO4) - Sigma-Aldrich, ≥ 99% Fosfato Dissódico (Na2HPO4) - Sigma-Aldrich, ≥ 99% Fenol 99% pureza - VWR Chemicals BDH 4-Aminoantipirina - Sigma-Aldrich Peroxidase(VI) - Sigma-Aldrich Ácido Fosfórico 85% - AppliChem Panreac Acetato de Amônio - Carlo Erba 4.2. Preparo das soluções padrões, testes de solubilidade e coleta dos efluentes Foram realizados testes de solubilidade variando entre 0 a 50% a proporção de acetonitrila/água ultrapura para a dissolução de 500 mg L-1 de AZT e CLA. As soluções padrões de AZT e CLA 500 mg L-1 (6,67 x 10-4 mol L-1) foram preparadas isoladamente utilizando água ultrapura (Millipore Direct-Q) e Acetonitrila (grau HPLC) na proporção 50:50 (v/v), seguido por 30 min no ultrassom para completa solubilização. A solução padrão de SMX 100 mg L-1 foi preparada em água ultrapura, seguido por 30 min no ultrassom para completa solubilização. Os experimentos de degradação foram realizados variando a faixa de concentração dos antibióticos entre 5000 e 200 µg L-1, escolhida de acordo com a sensibilidade na análise cromatográfica com o detector DAD. Para estudo do efeito da matriz na cinética de degradação dos antibióticos foi realizada uma coleta do efluente da Estação de Tratamento de Esgotos de Araraquara 35 (DAAE/Araraquara) em maio/2023. O tratamento de efluentes da estação de Araraquara baseia- se em lagoa de aeração + lagoa de sedimentação e serve uma população de 242228 habitantes, de acordo com o censo de 2022. O efluente foi coletado em frasco de vidro âmbar e mantido refrigerado até a chegada no laboratório, quando foi filtrado com papel filtro qualitativo para remover sólidos suspensos, e posteriormente armazenado por um máximo de 5 dias a 4 ˚C até a realização dos experimentos de degradação. Parâmetros como DBO, oxigênio dissolvido, nitrogênio e fósforo totais, entre outros, foram obtidos junto à companhia de saneamento (Anexo 1). A determinação de Carbono Orgânico Total e pH foram feitas no laboratório para caracterização do efluente. 4.3. Caracterização espectrofotométrica dos macrolídeos Conforme relatado na literatura (KHOSHNOOD; ZAKARIA; ESHAGHI, 2013; VIONE et al., 2009), os macrolídeos podem formar complexos com metais de transição e portanto foi realizado um estudo para avaliar a possível complexação entre os macrolídeos e os metais de transição utilizados no processo Fenton. Fixou-se as concentrações dos fármacos (0,5 mmol L-1) e variou-se a concentração dos metais de transição entre 0 e 3 mmol L-1, buscando aumentar gradualmente a concentração dos metais e atingir diferentes proporções estequiométricas. Todos os experimentos foram realizados em balões volumétricos de 5 mL com a mesma concentração das soluções dos fármacos. Os balões continham 50:50 acetonitrila/água ultrapura devido à baixa solubilidade dos macrolídeos (< 2,5 mg L-1) e o pH foi ajustado para 2,5 (pH ótimo de aplicação do processo Fenton). Diferentes volumes de soluções estoques com concentração de 10 mmol L-1 de FeSO4.7H2O, CuSO4.5H2O e Fe(NO3)3.9H2O foram adicionadas. Os espectros de absorção molecular foram registrados entre 200 nm e 800 nm em um espectrofotômetro Shimadzu UVmini-1240 utilizando uma cubeta de quartzo com caminho óptico de 1 cm. Realizou-se uma análise dos dados obtidos com a finalidade de verificar a estequiometria dos complexos a partir de um gráfico que relaciona a razão molar metal/ligante com os comprimentos de onda de absorção máxima dos complexos que foram identificados experimentalmente (POZDNYAKOV et al., 2015). 36 4.4. Síntese dos catalisadores A magnetita e magnetitas modificadas com cobre foram sintetizadas pelo método da coprecipitação em condições otimizadas, conforme já relatado (EMÍDIO; HAMMER; NOGUEIRA, 2020). Utilizou-se sal de Fe(III) (0,0119 mol) como precursor e iodeto de potássio (0,004 mol) como agente redutor, sendo as duas soluções misturadas à temperatura ambiente com agitação por uma hora para permitir que fosse atingido o equilíbrio químico (Equação 5). Adicionou-se sal de Cu(II) em proporção estequiométrica Cu/Fe2+ de 1:1 (CAT1) ou 1:4 (CAT2) antes da precipitação da magnetita modificada utilizando NaOH 2 mol L-1 (ou NH4OH 27% v/v, no caso da magnetita pura) até atingir o pH 9,5 (Equação 6). Após precipitação, os materiais foram filtrados, lavados até a água de lavagem atingir um valor próximo de 7 e secos a 80 °C por 12 h em uma mufla. A magnetita pura sintetizada e comercial foi utilizada para comparar suas características com CAT1 e CAT2. 3Fe3+ (aq) + I- (aq) → 2Fe3+ (aq) + Fe2+ (aq) + ½ I2(s) (5) ¼ Cu2+ (aq) + Fe2+ (aq) + 2Fe3+ (aq) + 8OH- (aq) → FeIII 2FeII 0,75CuII 0,25O4(s) + 4H2O(l) + ¼ Fe2+ (aq) (6) 4.5. Aplicação do processo foto-Fenton homogêneo e heterogêneo A degradação de AZT, CLA e SMX foi estudada por processo foto-Fenton em meio homogêneo e heterogêneo. No processo homogêneo, utilizou-se sais de Fe(II) ou Cu(II) como catalisadores, sendo o pH do meio ajustado para 2,5 antes da aplicação do processo. No processo heterogêneo, utilizou-se CAT1 e CAT2 como catalisadores e o pH foi ajustado para 6,5 ou 5,4. Em ambos os processos, H2O2 foi utilizado como agente oxidante. A degradação, no Brasil, foi realizada em um reator equipado com duas lâmpadas de luz negra de 15 W, com máximo de emissão em 365 nm. O volume inicial de solução foi de 300 mL (contendo 1% v/v de acetonitrila) e alíquotas foram retiradas em 0, 20, 40, 60, 90 e 120 min para análise e filtradas em filtro de seringa de nylon (0,45 µm) antes da injeção no cromatógrafo. O reator utilizado apresenta diâmetro de 10,1 cm (externo) e 9,3 cm (interno). Além disso, a profundidade da solução no reator durante aplicação do processo foi de 4,5 cm, sendo posiciona a 4,5 cm abaixo da lâmpada de luz negra. Além disso, utilizou-se CAT1. Na Itália, os experimentos foram realizados utilizando CAT2 em um reator equipado com apenas uma lâmpada de luz negra de 15W e as alíquotas para análise foram filtradas em 37 filtro de seringa de PTFE (0,45 µm) antes da injeção no cromatógrafo. O reator utilizado foi o mesmo do Brasil bem como a distância da solução em relação à lâmpada de luz negra. 4.6. Caracterizações 4.6.1. Difração de Raios-X Os catalisadores foram caracterizados por difratometria de raios X (DRX) em equipamento modelo SmartLab SE (Rigaku) usando a radiação Cu-Kα em λ = 1,54186 A°. Utilizou-se uma voltagem de 40 kV e corrente de 20 mA. Os difratogramas foram coletados com passo de 0,02° e velocidade de scan de 2° min-1 entre os ângulos (2θ) 10° e 100°. 4.6.2. Isotermas de adsorção e dessorção de N2 A área específica e porosidade das amostras foram determinadas por meio de isotermas de adsorção e dessorção de nitrogênio em um equipamento ASAP 2010 (Micromeritics). As amostras foram previamente desgaseificadas à 383 K por 12 horas sob vácuo antes da análise. Os valores de área específica foram calculados por meio do modelo de Brunauer Emmett-Teller (BET). 4.6.3. Fluorescência de Raios-X (ED-FRX) As análises de FRX foram realizadas em um espectrômetro de fluorescência de raios-X de energia dispersiva da marca PANalytical modelo MiniPal 4 com tubos de raios-X com ânodo de Ródio (Rh). A quantificação foi realizada por meio de métodos de correção de influência, no qual o equipamento de ED-XRF mede as intensidades da emissão dos raios-X dos elementos presentes em amostras-padrão, cujos elementos e suas concentrações são conhecidos, e com o uso de um software dedicado, usa tais intensidades e uma série de interações matemáticas para fornecer as concentrações dos elementos químicos presentes em uma amostra desconhecida por meio da comparação. 4.6.4. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) As imagens de MEV dos catalisadores foram obtidas em um equipamento Hitachi Dual - Beam FIB-SEM NB5000. 38 4.7. Análises Químicas 4.7.1. Carbono Orgânico Total (COT) A quantificação da matéria orgânica do efluente coletado, após filtração com papel qualitativo, foi determinada por análise de carbono orgânico total em um analisador de carbono Shimadzu TOC-LCSH. Nesse equipamento, a amostra é injetada em um tubo de combustão a 680 ºC contendo platina suportada em alumina onde ocorre a oxidação catalítica a CO2 e determina-se o carbono total (CT). Determina-se também o carbono inorgânico (CI) quando a amostra injetada reage com o reagente CI (ácido fosfórico 10%), sendo todo carbono inorgânico convertido a CO2 e detectado por absorção no infravermelho. A concentração de COT é dada pela diferença entre CT e CI. 4.7.2. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) No Brasil, a concentração dos antibióticos durante a degradação foi monitorada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) em um instrumento Shimadzu LC-20AT equipado com um detector de arranjo de diodos (SPD-M20A). Na Itália, realizou-se o monitoramento utilizando um equipamento de HPLC VWR-Hitachi LaChrom Elite equipado com desgaseificador à vácuo (Duratec) e detector de arranjo de diodos (L-2455). 4.7.3. Determinação de H2O2 residual, cobre e ferro Em experimentos realizados no Brasil, a decomposição do peróxido do hidrogênio durante aplicação do processo Fenton foi monitorada espectrofotometricamente por meio de uma reação entre metavanadato de amônio e peróxido de hidrogênio, formando peroxovanádio (Equação 7), com máximo de absorção em 450 nm (NOGUEIRA; OLIVEIRA; PATERLINI, 2005). A faixa linear para este método variou de 0,05 a 10 mmol L-1, com limite de quantificação (LQ) de 50 µmol L-1 e limite de detecção (LD) de 20 µmol L-1. VO3 ̄+ 4H+ + H2O2 → VO2 3+ + 3 H2O (7) Durante o período de Estágio de Pesquisa na Itália, outro método espectrofotométrico de quantificação de peróxido de hidrogênio foi utilizado (METELITZA; LITVINCHUK; SAVENKOVA, 1991). Esse método utiliza peroxidase, fenol e 4-aminoantipirina para gerar 39 um cromóforo que, em pH 7 (tamponado com fosfato, no caso dos experimentos realizados), absorve em 505 nm. O método consiste na oxidação do fenol com o peróxido de hidrogênio na presença de peroxidase, formando um radical que se estabiliza por ressonância. Posteriormente, o radical formado reage com a 4-aminoantipirina, gerando o radical 4-aminoantipirina (AmṄH2). O radical AmṄH2 reage novamente com o radical formado a partir do fenol por meio da formação de uma ligação C-N entre os radicais, ocasionando na formação de um composto (reagente), que é oxidado na presença de H2O2 e forma um produto que apresenta um grupo cromóforo (Figura 4). Utilizou-se um espectrofotômetro Varian CARY 100 Scan de duplo feixe para determinação espectrofotométrica de H2O2 residual. A faixa linear para este método variou de 10 a 500 mol L-1, com LQ de 10 mol L-1 e LD de 4 mol L-1. Figura 4: Reações envolvidas no método de quantificação de peróxido de hidrogênio residual utilizado durante o Estágio Pesquisa na Itália. E = peroxidase. A concentração de íons cobre em solução após aplicação do processo heterogêneo foi determinada por meio do método espectrofotométrico da batocuproína ( = 484 nm), enquanto a concentração dos íons de ferro foi determinada espectrofotometricamente utilizando 1,10- fenantrolina ( = 510 nm) (APHA, 2017). A faixa linear para a curva de cobre variou de 1 a 50 mol L-1, com LQ de 1 mol L-1 e LD de 0,4 mol L-1. A faixa linear para a curva de ferro variou de 1 a 100 mol L-1, com os mesmos LQ e LD obtidos para a curva de cobre. 40 4.7.4. Determinação dos produtos de degradação utilizando Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a espectrômetro de massas Os produtos de degradação de AZT e CLA por processos foto-Fenton homogêneo (usando Fe(II)) e heterogêneo (usando CAT1) foram identificados durante estágio na Itália por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de arranjo de diodos e um espectrômetro de massas (HPLC-DAD-MS, do inglês high performance liquid chromatography, coupled with diode array detection and mass spectrometry). Utilizou-se um equipamento Thermo Scientific Accela equipado com injetor automático (20 L de volume de injeção), com uma bomba quaternária Accela e com um detector de arranjo de diodos Accela. Utilizou-se uma coluna Luna® C18 100 Å (150 x 3 mm x 3 µm da Phenomenex) em temperatura de 30 °C. A fase móvel consistiu em solução aquosa de acetato de amônio 0,005 mol L-1 em pH 7,5 ajustado com KOH 10% (eluente A) e acetonitrila (eluente B). Realizou-se um gradiente com vazão de 0,2 mL min-1 para identificação dos produtos de transformação (tempo, %A/%B): 0 min, 97%/3%; 3 min, 97%/3%; 25 min, 0%/100%; 30 min, 0%/100%; 30,5 min, 97%/3%; 35 min, 100%/0%. A detecção utilizando o DAD foi realizada em 230 nm devido à instabilidade da linha de base em 205 nm ao se utilizar um gradiente. O espectrômetro de massas acoplado ao sistema de HPLC foi um Thermo LCQ Fleet (ion-trap) equipado com ionização por eletrospray (ESI, do inglês electrospray ionisation). A análise inicial “Full Scan MS-MS” foi realizada no modo de operação positivo e a energia de colisão foi de 35 eV. O software Xcalibur (Thermo Scientific, Milão, Itália) foi utilizado para aquisição e tratamento dos dados, sendo escolhido usar o “base peak” no lugar do “total ion chromatogram (TIC)” para identificação dos produtos de transformação devido ao melhor sinal obtido. As amostras foram coletadas após 30 min (homogêneo) e 60 min (heterogêneo) de aplicação dos processos, individualmente para cada fármaco. Esses tempos foram escolhidos por corresponderem a aproximadamente 45% de degradação dos macrolídeos por ambos os processos, o que permite a comparação dos produtos gerados em cada caso. Amostras também foram coletadas após 120 min de aplicação do processo heterogêneo. Cabe ressaltar que o equipamento de massas utilizado foi de baixa resolução, sendo usado o tempo inicial (0 min) dos experimentos como controle. 41 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1. Desenvolvimento e validação dos métodos analíticos utilizados 5.1.1. Quantificação de AZT, CLA e SMX no Brasil A concentração dos antibióticos durante a degradação foi monitorada por cromatografia líquida de alta eficiência. Para definir as melhores condições de análise para os macrolídeos de forma simultânea, avaliou-se diferentes colunas e o efeito da variação da composição da fase móvel, temperatura da coluna, pH da amostra, modo de eluição e o detector empregado para separação e quantificação dos macrolídeos (Tabela 3). Tabela 3: Condições cromatográficas avaliadas para determinação do método analítico. DETECTOR DAD FLU Colunas LUNA OMEGA POLAR C18 150 x 4,6 mm, 5 m LUNA C18 150 x 4,6 mm, 5 m LUNA C18 250 x 4,6 mm, 5 m EVO Kinetex C18 150 x 4,6 mm, 5 m REZEX ROA-ORAGANIC ACID H+ (8%) 300 x 7,8 mm GEMINI C18 150x4,6 mm, 5 m  (nm) 205 e 210 Excitação: 265 Emissão: 315 Fase Móvel (FM) ACN ou MeOH / Ácido Fórmico 0,1% ou tampão fosfato (monobásico / dibásico) nas concentrações 0,01 e 0,02 mol L-1 ACN ou MeOH / tampão fosfato (monobásico/ dibásico) nas concentrações 0,01 e 0,02 mol L-1 Temperatura (ºC) 30, 40 e 50 Vazão (mL min-1) 0,3; 0,5; 0,8; 1,0; 1,2 Modo de Eluição Isocrático: porcentagens de 50, 60, 70, 80 e 90% de solvente orgânico na composição da FM. Gradiente: de 20% a 90% de solvente orgânico em um intervalo de 1 hora para identificar se apareciam picos e em qual porcentagem aproximada de solvente orgânico, antes de realizar a análise em modo isocrático. Concentração dos Fármacos (mg L-1) 1; 2; 10; 50 e 100 0,3; 1 e 10 42 Os macrolídeos não foram detectados com as colunas Kinetex e GEMINI por UV-DAD, mesmo ao variar a temperatura entre 30 e 50 °C e testar duas fases móveis diferentes: ácido fórmico 0,1% e tampão fosfato 0,02 mol L-1 pH 7. Em todas as colunas avaliadas, a utilização de ácido fórmico na composição da fase móvel prejudicou a detecção pois os cromatogramas não mostraram picos, o que pode ser atribuído à baixa absorção da espécie protonada dos macrolídeos em meio ácido, uma vez que apresentam valores de pKa iguais a 8,5 (AZT) e 8,99 (CLA) (PubChem, 2023). Além disso, métodos oficiais descritos em farmacopeias evidenciam a necessidade da realização das análises em meio básico (European Pharmacopoeia, 2016). Realizou-se testes utilizando tampão fosfato (monobásico ou dibásico) em pH 7,5 (próximo ao pKa da azitromicina) como fase móvel. Os testes nas colunas LUNA POLAR e LUNA 250 mm mostraram-se insatisfatórios após a variação de parâmetros como temperatura, vazão ou aumento da porcentagem de acetonitrila para 90% na composição da fase móvel em modo isocrático. Utilizando a coluna REZEX ROA, foi possível identificar um pico em 210 nm que pode ser atribuído à CLA, porém o método não se mostrou sensível à variação da concentração deste fármaco (Figura 5). Uma particularidade desta coluna é a sua utilização para a separação de açúcares, sendo esperado que tanto a AZT quanto a CLA apresentassem picos com tempos de retenção muito próximos, pois os açúcares ligados ao anel macrolídeo é o mesmo em ambas as moléculas: desosamina e cladinose. Não se observou pico para a AZT utilizando esta coluna e seu uso foi descartado para desenvolvimento e validação do método analítico. Figura 5: Cromatogramas de CLA nas concentrações de a) 10 mg L-1; b) 5 mg L-1. Condições: Coluna REZEX ROA Organic Acid; modo isocrático ACN/tampão fosfato monobásico 0,02 mol L-1 pH 7,5 (80:20 v/v); Temperatura de 50 °C;  = 205 nm e vazão = 1,2 mL min-1. 43 Utilizando a coluna LUNA 150 mm, foi possível detectar AZT e CLA por UV-DAD em concentração inferiores a 0,5 mg L-1 e em um baixo comprimento de onda (205 nm), próximo do limite do detector do equipamento. Com o objetivo de viabilizar a quantificação dos macrolídeos em concentrações abaixo de 0,5 mg L-1, realizou-se experimentos para a derivatização dos macrolídeos com cloroformiato de 9-fluorenilmetila (FMOC-Cl), seguida da posterior detecção por fluorescência (BAHRAMI; MIRZAEEI; KIANI, 2005; WILMS et al., 2005). O FMOC-Cl é um derivatizante capaz de formar compostos estáveis com grupos funcionais amina e com hidroxilas, sendo um reagente utilizado para derivatização de aminoácidos e macrolídeos (TORAÑO; GUCHELAAAR, 1998). Além disso, a sensibilidade dos métodos que derivatizam macrolídeos com FMOC-Cl é aumentada de acordo com a presença de um maior número de hidroxilas na estrutura do anel macrolídeo, sendo apresentado, por exemplo, uma maior sensibilidade na reação do FMOC-Cl com a AZT do que com a CLA (BAHRAMI; MOHAMMADI, 2007). O cromatograma com detecção de fluorescência obtido para a AZT após a derivatização mostra o aparecimento de picos cromatográficos sobrepostos (Figura 6). Nenhum desses picos variou linearmente com a variação da concentração de AZT, o que indica que os picos observados são o resultado de uma decomposição do derivatizante e/ou do fármaco durante o processo de derivatização, o qual ocorre a 40 °C por 40 min. Variações para vazões na faixa entre 0,3 e 1,2 mL min-1 não foram suficientes para a separação destes picos. A derivatização de CLA resultou em comportamento análogo ao observado para a AZT. Figura 6: Cromatogramas de AZT em diferentes concentrações obtidos após derivatização com FMOC-Cl. Condições: coluna LUNA C18 250 mm; modo isocrático metanol/tampão fosfato 0,02 mol L-1; pH 7 (70:30 v/v); 50 °C; vazão = 1,0 mL min-1. Preto = AZT 10 mg L-1; Rosa = AZT 1 mg L-1; Azul = AZT 0,3 mg L-1; Marrom = FMOC-Cl. Detecção por fluorescência nos comprimentos de onda de 265 nm (excitação) e 315 nm (emissão), Vinjeção = 40 L. 44 A quantidade de impurezas detectadas dificulta o desenvolvimento de um método analítico simultâneo para detecção de AZT e CLA. Além disso, as impurezas tornam este método inviável para monitoramento da concentração dos macrolídeos durante os experimentos de degradação, os quais podem interferir no método analítico por gerar produtos de degradação. Optou-se por aumentar a concentração dos macrolídeos para valores acima de 0,5 mg L-1 com a finalidade de permitir a detecção com o detector DAD e descartou-se a possibilidade de derivatização. O melhor resultado foi obtido com a coluna LUNA C18 (150 mm x 3 mm x 5 μm da Phenomenex) após variação da temperatura do forno, vazão e porcentagem de ACN na composição da fase móvel. Para detecção dos macrolídeos, realizou-se uma eluição isocrática com ACN/tampão fosfato monobásico 0,02 mol L-1 ajustado para pH 7,5 (80:20). Utilizou-se uma vazão de 0,5 mL min-1, o volume de injeção foi de 40 L, a temperatura foi fixada em 50 °C e a detecção foi realizada no comprimento de onda de 205 nm. Observou-se um pico com tempo de retenção (tR) em 9,5 min referente à CLA, e um pico em 11,9 min referente à AZT (Figura 7), o que está coerente com a polaridade dos dois fármacos. Figura 7: Cromatogramas de AZT e CLA nas concentrações de 50 mg L-1. Condições: coluna LUNA C18 150 mm; modo isocrático ACN/tampão fosfato monobásico 0,02 mol L-1 pH 7,5 (80:20 v/v); 50 °C; vazão = 0,5 mL min-1. Detecção em 205 nm e Vinjeção = 40 L. 45 Os picos apresentam uma boa separação entre eles (resolução de 2,22) que permitiu o desenvolvimento e validação de um método analítico para detecção desses fármacos. O método desenvolvido permitiu a determinação simultânea de ambos os fármacos, com picos simétricos, baixo tempo de análise e ausência de impurezas nas condições adotadas e no tempo de retenção dos analitos. Em paralelo, montou-se uma curva analítica para quantificação de SMX segundo um método já desenvolvido pelo nosso grupo de pesquisa (DE JESUS; LIMA; NOGUEIRA, 2022). Utilizou-se a coluna LUNA POLAR C18 (150 mm × 4 mm × 5 μm da Phenomenex). Realizou- se uma eluição isocrática com metanol/ácido fórmico 0,1% (25:75). Utilizou-se uma vazão de 0,8 mL min-1, o volume de injeção foi de 40 L, a temperatura foi fixada em 40 °C e a detecção foi realizada no comprimento de onda de 270 nm. Observou-se o aparecimento de um pico que pode ser atribuído ao SMX em 11,3 min e construiu-se duas curvas de calibração para o SMX nas faixas de concentração entre 0,05 a 0,6 mg L-1 (inferior) e 0,6 a 2,0 mg L-1(superior). A linearidade das curvas analíticas para quantificação de AZT, CLA e SMX foi verificada empregando a análise de variância (ANOVA) que consiste em realizar um teste estatístico para verificar se as variâncias em y são independentes dos níveis de concentração em x (ALMEIDA; CASTEL-BRANCO; FALCÃO, 2002; CHUI; ZUCCHINI; LICHTIG, 2001; PIMENTEL; NETO, 1996). Empregando a ANOVA (Tabela 4), compara-se os valores de Ftab (obtido por meio de uma tabela de distribuição F) para o grau de confiança de 95% com o valor de Fcalc obtido através do cálculo da razão das médias quadráticas para os modelos avaliados. 46 Tabela 4: ANOVA para ajuste do modelo de regressão linear para quantificação dos antibióticos. (dados obtidos no Brasil). Fármaco Fonte G. L.c Média Quadrática Fcalc Ftab AZT Regressão 1 1,86x1010 1071,21 4,67 Resíduo 13 1,74x107 Falta de Ajuste 3 6,20x106 2,19 3,26 Erro Puro 13 4,09x106 CLA Regressão 1 2,45x1010 6968,09 4,49 Resíduo 16 3,51x106 Falta de Ajuste 4 1,45x106 0,34 3,26 Erro Puro 12 4,20x106 SMXa Regressão 1 1,25x1011 44186,65 4,67 Resíduo 13 2,82x106 Falta de Ajuste 3 6,34x106 3,58 3,71 Erro Puro 10 1,77x106 SMXb Regressão 1 2,14x1010 20139,69 4,67 Resíduo 13 1,06x106 Falta de Ajuste 3 1,59x105 1,06 3,71 Erro Puro 10 1,50x105 a = curva superior para o SMX; b = curva inferior para o SMX; c = graus de liberdade. Observa-se que os valores de Fcalc>Ftab para todos os fármacos no que se refere à regressão e Fcalc