ISSN 0102-5716 Veterinária e Zootecnia
De Vita B. et al. Anexos fetais: Uma fonte alternativa de células-tronco mesenquimais para a medicina
veterinária equina. Vet. e Zootec. 2012 março; 19(1): 008-022.
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ANEXOS FETAIS: UMA FONTE ALTERNATIVA DE CÉLULAS-TRONCO
MESENQUIMAIS PARA A MEDICINA VETERINÁRIA EQUINA
Bruna De Vita1*
Loreta Lemes Campos2
Amanda Jerônimo Listoni3
Leandro Maia4
Natália Pereira Paiva Freitas5
Fernanda Landim e Alvarenga6
Nereu Carlos Prestes7
RESUMO
A equideocultura tem um papel importante no agronegócio brasileiro gerando divisas e
diversos empregos diretos e indiretos. Por este motivo, a pesquisa científica em prol do
desenvolvimento da produção eqüina brasileira tem refletido a tendência atual induzindo
estudos principalmente nas áreas de medicina esportiva, neonatologia e biotecnologias da
reprodução. Assim, na última década surgiu um grande interesse no estudo das células-tronco
para a medicina eqüina principalmente para o tratamento das lesões musculoesqueléticas e
osteoarticulares dos cavalos atletas, pelo seu alto potencial de aplicação na medicina
veterinária regenerativa. As células-tronco (CT) podem ser classificadas quanto seu grau de
potencialidade como totipotentes, pluripotentes, multipotentes e unipotentes, e quanto a sua
origem como embrionárias ou somáticas. As complicações do uso terapêutico das CTs
embrionárias levaram à identificação de diversas fontes de células-tronco adultas, entre estas
as CT hematopoiéticas e CTs mesenquimais. A fonte mais utilizada de células-tronco
mesenquimais (CTM) é a medula óssea, no entanto, como o seu número e a capacidade de
diferenciação destas células diminuem com a idade, seu potencial terapêutico também declina
com o tempo. Devido a estas limitações outras fontes de células-tronco mesenquimais foram
identificadas, sendo que as células derivadas dos anexos fetais têm recebido bastante
destaque. CTMs derivadas do líquido amniótico, membrana amniótica, sangue do cordão
umbilical e tecido de cordão umbilical humanos já foram isoladas e caracterizadas
demonstrando muitas vantagens em sua utilização, como a coleta não invasiva e indolor, e a
possibilidade de formação de bancos de armazenamento. Além disso, existem muitos relatos
de que as CTMs derivadas de anexos fetais expressam marcadores embrionários como o Oct-
4 e o Nanog, o que demonstra que estas células podem manter características de pluripotência
dos tecidos de onde se originam. Recentemente, pesquisas com CTMs derivadas dos anexos
fetais de eqüinos têm sido realizadas e vêm obtendo excelentes resultados. Esta revisão de
1 Doutoranda do Depto de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária. Distrito de Rubião Júnior S/N,CEP 18618970
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – Universidade Estadual Paulista – Botucatu /SP.
2 Aluna especial de Mestrado do Depto Reprodução Animal e Radiologia Veterinária. Distrito de Rubião Júnior S/N,CEP
18618970. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – Universidade Estadual Paulista – Botucatu /SP.
3 Aluna de Mestrado do Depto de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária. Distrito de Rubião Júnior S/N,CEP
18618970 Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – Universidade Estadual Paulista – Botucatu /SP.
4 Aluno de Doutorado do Depto de Clínica de Grandes Animais. Distrito de Rubião Júnior S/N,CEP 18618970. Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia – Universidade Estadual Paulista – Botucatu /SP.
5 Aluna de Mestrado do Depto de Clínica de Grandes Animais. Distrito de Rubião Júnior S/N,CEP 18618970. Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia – Universidade Estadual Paulista – Botucatu /SP.
6 Professora Titular do Depto de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária. Distrito de Rubião Júnior S/N,CEP
18618970. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – Universidade Estadual Paulista – Botucatu /SP.
7 Professor Adjunto do Depto de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária. Distrito de Rubião Júnior S/N,CEP
18618970. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – Universidade Estadual Paulista – Botucatu /SP.
* Bruna De Vita – Rodovia Antonio Butignolli, KM 10 – Cidade Universitária – BL B1, Apto 42. Rubião Júnior,
Botucatu/SP. CEP 18618970. Tel: 14 8111 7530. E-mail: bruddev@gmail.com
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literatura tem como objetivo reunir os estudos sobre as células-tronco mesenquimais com
origem nos anexos fetais demonstrando-as como uma fonte alternativa, ética, de fácil
obtenção e com grandes vantagens em sua utilização na medicina veterinária eqüina.
Palavras-chave: Células-tronco, anexos fetais, eqüinos
ANEXOS FETALES: UNA FUENTE ALTERNATIVA DE CÉLULAS MADRE
MESENQUIMALES PARA LA MEDICINA VETERINÁRIA EQUINA
RESÚMEN
La cría de caballos tiene un papel importante en la agroindustria brasilera en la generación de
divisas y varios puestos de trabajo directos e indirectos. Por esta razón, hoy en día la
investigación científica para el desarrollo de la producción brasilera equina refleja la
tendencia actual elaborando estudios con énfasis en medicina deportiva, neonatología y
biotecnología de la reproducción. Por lo tanto, en la última década ha surgido un grande
interés en el estudio de células madre para la medicina equina principalmente para el
tratamiento de lesiones osteoarticulares y músculo esquelético de los caballos deportivos,
debido a su alto potencial para aplicación en medicina regenerativa veterinaria. Las células
madre (CM) se pueden clasificar por su grado de potencialidad como unipotentes,
totipotentes, pluripotentes y multipotentes, y cuanto a su origen como embrionarias o
somáticas. Las complicaciones del uso terapéutico de CM embrionarias llevaron a la
identificación de varias fuentes de células madre adultas, entre estas las CMs hematopoyéticas
y mesenquimales. La fuente más común de células madre mesenquimales (MSC) es la médula
ósea, sin embargo, como el número y capacidad de diferenciación de estas células disminuye
con la edad, su potencial terapéutico también se reduce con el tiempo. Debido a estas
limitaciones otras fuentes de células madre mesenquimales fueron identificados, y las células
derivadas de los anexos fetales han recibido mucha atención. CMMs derivados de líquido
amniótico, membrana amniótica, sangre del cordón umbilical y tejido de cordón umbilical
humano fueron aisladas y caracterizadas mostrando muchas ventajas en su uso, tales como la
recogida no invasiva y sin dolor, y la posibilidad de formación de bancos de almacenamiento.
Además, hay muchos informes de que las CMMs derivadas de los anexos fetales expresan
marcadores embrionarios, como Oct-4 y Nanog, lo que demuestra que estas células pueden
mantener las características de pluripotencialidad de los tejidos de donde provienen.
Recientemente, la investigación con CMMs derivadas de anexos fetales de equinos están
siendo hechas y están obteniendo excelentes resultados. Esta revisión pretende reunir a los
estudios sobre células madre mesenquimales procedentes de los anexos fetales muestrando
como una fuente alternativa, ética, de fácil obtención y con grandes ventajas en su uso en
medicina veterinaria equina.
Palabras-clave: Células madre, anexos fetales, equino
FETAL ANNEXES: AN ALTERNATIVE SOURCE OF MESENCHYMAL STEM
CELLS FOR EQUINE VETERINARY MEDICINE
ABSTRACT
The horse breeding industry has an important role in the Brazilian agribusiness generating
wealth and many direct and indirect jobs. For this reason, the scientific research for the
development of Brazilian horse production has reflected the current trend leading to studies
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focusing on sports medicine, neonatology and biotechnology of reproduction. Thus, in the last
decade, the study of stem cells has come in scope to equine medicine primarily for the
treatment of osteoarticular and musculoskeletal injuries of athletic horses, because it’s high
potential for application in veterinary regenerative medicine. Stem cells (SC) can be classified
by degree of potential as totipotent, pluripotent, multipotent and unipotent, and by its origin as
embryonic or somatic. Complications of the therapeutic use of embryonic SCs leaded to the
identification of several sources of adult stem cells, as the hematopoietic SC and
mesenchymal SC. The most common source of mesenchymal stem cells (MSCs) is bone
marrow, however, as their number and differentiation capacity decrease with age, their
therapeutic potential also declines with time. Because of these limitations other sources of
mesenchymal stem cells were identified, and the cells derived from fetal annexes have
received much attention. MSCs derived from amniotic fluid, amniotic membrane and
umbilical cord blood and tissue have been isolated and characterized showing many
advantages in its use, such as non-invasive, painless collection and the possibility of
formation of storage banks. In addition, there are many reports that MSCs derived from fetal
annexes express embryonic markers such as Oct-4 and Nanog, which demonstrates that these
cells can maintain pluripotency characteristics of the tissue from which they arise. Recently,
several studies using MSCs derived from fetal annexes of horses have been carried out with
excellent results. This review aims to gather studies on mesenchymal stem cells derived from
horse fetal annexes showing them as an alternative, ethical source, easy to obtain and with
great advantages to be used in equine veterinary medicine.
Key words: Stem cells, fetal annexes, equine
INTRODUÇÃO
O Brasil ocupa lugar de destaque na equideocultura mundial sendo que o agronegócio
do eqüino movimenta cerca de R$7,5 bilhões e gera cerca de 3,2 milhões de empregos em
nosso país. O segmento do esporte eqüestre movimenta cerca de R$705 milhões e emprega
cerca de 20500 pessoas (1). Neste contexto, muitas pesquisas científicas estão sendo
realizadas para o incremento da produção eqüina nacional. Estas pesquisas refletem a
tendência atual da indústria eqüina, com enfoque na medicina esportiva, neonatologia,
diagnóstico clínico, novas tecnologias da reprodução e sanidade dos eqüinos (2).
Sendo assim, o interesse na pesquisa com células-tronco na medicina veterinária
cresceu muito nos últimos anos devido ao seu alto potencial na regeneração de tecidos e
órgãos lesados e aplicação no campo terapêutico (3). Pesquisas que utilizam animais como
modelos experimentais são de extrema importância para medicina humana, sendo descritas
como pré-requisito no caminho da aprovação de sua utilização clínica (4-6). Na medicina
eqüina, os estudos com células-tronco tem se dedicado principalmente ao tratamento de lesões
músculoesqueléticas e osteoarticulares, particularmente em cavalos atletas, a fim de melhorar
a arquitetura e constituição do tecido cicatricial, visando a produção de uma qualidade
tecidual o mais próxima do normal possível. Porém, alguns poucos estudos em
desenvolvimento também visam utilizar esta tecnologia para diminuir perdas econômicas
relacionadas ao potencial reprodutivo de alguns animais.
As células-tronco diferem de outras células do organismo por serem indiferenciadas
sendo capazes de se multiplicar por longos períodos ou ainda sendo capazes de se diferenciar
em células especializadas de um tecido em particular. Estas células podem ser classificadas
quanto seu grau de potencialidade como totipotentes, pluripotentes, multipotentes e
unipotentes, e quanto a sua origem como embrionárias ou somáticas (7,8).
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Como as células-tronco embrionárias são capazes de diferenciação em todos os tipos
celulares encontrados no indivíduo adulto, a utilização destas células em sua forma
indiferenciada pode seguir um programa desorganizado de diferenciação dando origem a
tumores (teratomas). Este fato, e as implicações éticas na utilização de células embrionárias
limitam a utilização das mesmas como instrumento de pesquisa (7,9).
Pesquisas nas últimas décadas resultaram na descoberta de uma grande variedade de
células-tronco adultas, sendo as células-tronco hematopoiéticas da medula óssea as
conhecidas há mais tempo. Entre as células-tronco adultas, destacam-se as células-tronco
mesenquimais com capacidade de diferenciação em muitas linhagens de células maduras (10).
A fonte mais utilizada de células-tronco mesenquimais é a medula óssea, no entanto,
como o seu número e a capacidade de diferenciação destas células diminuem com a idade, seu
potencial terapêutico também declina com o tempo (11). Devido a estas limitações outras
fontes de células-tronco mesenquimais foram identificadas (12), sendo que as células
derivadas dos anexos fetais tem recebido bastante destaque por se apresentarem como uma
fonte de obtenção não invasiva, de tecidos normalmente descartados, com grande
possibilidade de coleta ao nascimento para formação de bancos de armazenamento para uso
posterior (13-18).
Além disto, as células-tronco mesenquimais derivadas dos anexos fetais como o líquido
amniótico, a membrana amniótica e o cordão umbilical, preservam características dos tecidos
embrionários de que se originam e muitos estudos estão indicando que estas células exibem
características de células embrionárias como a expressão do marcador Oct-4, grande
capacidade proliferativa sem demonstrar imunogenicidade e tumorgenicidade e ainda
capacidade de diferenciação em diversos tecidos, inclusive extra mesenquimais (14,19,18).
Células-Tronco Mesenquimais Derivadas dos Anexos Fetais
Na última década houve um crescente interesse na investigação quanto à presença de
células-tronco mesenquimais em tecidos fetais como na placenta, líquido amniótico, sangue
do cordão umbilical, matriz extravascular de cordão umbilical e membrana amniótica
(20,14,21,18). Este fato se deve a busca de novas fontes ricas de células-tronco em alternativa
a utilização da medula óssea e à possibilidade da formação de bancos de armazenamento de
células coletadas ao nascimento e congeladas para uso posterior (20,14,15,22,18).
Os anexos fetais são fontes de células-tronco extra-embrionárias, com grande potencial
de aplicação na medicina regenerativa e perinatal. Células tronco derivadas das membranas
placentárias, líquido amniótico, cordão umbilical ou tecidos fetais aparecem em maior
quantidade e possuem maior potencial de expansão e de diferenciação do que as derivadas de
adultos (15). Fauza (23) descreveu as membranas placentárias e o líquido amniótico como
únicas fontes que contém diferentes populações de células-tronco, apresentando
subpopulações mesenquimais, hematopoiéticas, trofoblásticas e possivelmente células-tronco
embrionárias ainda mais primitivas e indiferenciadas.
O uso dos anexos fetais como fonte de células-tronco tem inúmeras vantagens em
potencial. Além da grande quantidade de células, grande potencial de expansão e
diferenciação, permite uma forma de coleta não invasiva de tecidos que, normalmente, seriam
descartados após o parto. Este fato permite que o uso dessas células na medicina humana seja
mais eticamente aceitável, fazendo dessas fontes um grande atrativo para medicina
regenerativa (18).
As células-tronco derivadas dos anexos fetais preservam características dos tecidos
embrionários de onde se originaram e muitos estudos estão indicando que as mesmas exibem
algumas características de células-tronco embrionárias como a expressão de alguns
marcadores de superfície como o Oct-4 e grande capacidade proliferativa, sem demonstrar
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imunogenicidade e tumorogenicidade (não foi demonstrada a formação de teratomas após sua
aplicação). Entretanto, o potencial de diferenciação destas células seria intermediário, ou seja,
entre a pluripotencialidade das células embrionárias e as multipotencialidade das células
adultas. Estas características abriram uma nova perspectiva no estudo da biologia do
desenvolvimento e na medicina regenerativa, não só para humanos, mas também para animais
(18).
Células-Tronco Derivadas do Líquido Amniótico
O líquido amniótico é formado por uma grande quantidade de células em suspensão,
derivadas do embrião ou de origem extra-embrionária. Esta população celular varia com a
fase gestacional e traduz as mudanças ocorridas no feto e seus anexos, estando bastante
vinculada com a maturidade fetal (24). As células presentes no líquido amnioótico apresentam
tamanho variável de 6 a 50 µm, e morfologia variando de escamosas a arredondadas (25).
A detecção de células progenitoras no líquido amniótico humano foi inicialmente
relatada em 1993, quando células arredondadas, pequenas e nucleadas, foram encontradas
antes da 12ª semana de gestação sendo identificadas como progenitoras hematopoiéticas,
possivelmente provenientes da vesícula vitelínica (26). Hoje, sabe-se que três tipos celulares
são encontrados no líquido amniótico: Células Epitelióides (E), com origem na pele e trato
urinário do feto; Células Amnióticas (AF) propriamente ditas, originadas nas membranas
placentárias e trofoblasticas (produtoras de estrógenos, progesterona e gonadotrofina
coriônica humana); e células fibroblastóides (F), originadas dos tecidos conjuntivos,
apresentando características e marcadores para CTMs as quais devem ser chamadas de CTMs
derivadas do líquido amniótico (15). As células dos tipos AF e E aparecem no início do
cultivo enquanto as células F aparecem posteriormente, porém somente AF e F persistem
enquanto as células do tipo E desaparecem com o passar do tempo (27).
Na medicina humana o líquido amniótico possui como vantagem a facilidade de
obtenção, uma vez que a amniocentese é procedimento de rotina como modo de propedêutica
fetal e associado a um baixo número de complicações, podendo também ser coletado em
cesarianas eletivas (16,15,18). Já na medicina veterinária podem ser facilmente obtidos no
momento do parto normal ou em cesarianas e também em frigoríficos abatedouros, já que
úteros gravídicos são considerados como descarte (18,28,21,17).
Células derivadas do líquido amniótico, isoladas e cultivadas in vitro têm expressado,
frequentemente, marcadores de pluricelularidade e capacidade de diferenciação em tecidos
das três camadas germinativas (20,13,29,21). De Coppi et al. (30) observaram a diferenciação
de CT do líquido amniótico em até 6 diferentes linhagens: osteogênica, adipogênica,
miogênica, endotelial, neurogênica e hepática. Visando determinar se as células do líquido
amniótico abrigam potencial de diferenciação em células neurogênicas, Prusa et al. (20)
observaram que células cultivadas em meio padrão apresentaram a expressão de marcadores
neurogênicos esporadicamente, no entanto, quando cultivadas em meio de indução de
diferenciação neurogênica a expressão destes marcadores aumentou consideravelmente.
Tsai et al. (13) também obtiveram sucesso no isolamento e na cultura de CMTs
provenientes do líquido amniótico a partir da amniocentese no segundo trimestre da gestação
de 20 mulheres. Além disso, uma subpopulação das células cultivadas expressaram
positivamente o gene de pluricelularidade OCT-4. Quando as CMTs foram cultivadas em
meio acrescido de dexametasona, insulina, isobutilmetilxantina e indometacin, foram
diferenciadas em osteócitos. A osteogênese foi confirmada pela coloração de Von Kossa para
acúmulo de mineralizações de cálcio. Já quando cultivadas em meio acrescido de ß-
mercaptoetanol e bFGF foram diferenciadas em células neuronais, a confirmação foi realizada
por ensaio imunocitoquímico. Em 2006 os mesmos autores reafirmaram a expressão de
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marcadores de pluricelularidade Oct -4 e NANOG-, e verificaram a expressão de diversos
marcadores neurogênicos como NES, TUBB3, NEFH, NEUNA60 GALC E GFAP antes e
depois da indução da diferenciação neurogênica (31).
Cabral et al. (16) concluíram que as CTMs do líquido amniótico humano obtidas por
amniocentese no segundo terço da gestação foram capazes de se diferenciar em células
miogênicas quando cultivadas em meio acrescido de DMSO, e em células adipogênicas
quando cultivadas em meio acrescido de dexametasona, teofilina, insulina e indometacina. A
diferenciação celular foi avaliada pela dosagem de triglicérides no caso da diferenciação
adipogênica, e da dosagem de creatinofosoquinase, desidrogenase lática e aldolase para
diferenciação miogênica, ambos com o método enzimático colorimétrico utilizando o
aparelho ADVIA 2400 (Bayer®). A cariotipagem a fim de demonstrar se a cultura celular
induziu alterações cromossômicas demonstrou resultados compatíveis com o cariótipo obtido
antes da cultura celular.
Células do líquido amniótico obtidas durante o pré-natal de mulheres mantiveram suas
características iniciais como a aderência ao plástico, morfologia fibroblastóide, a expressão
dos marcadores CD73, CD105, CD44, CD29, CD90 e CD13, a não expressão dos marcadores
CD45 e CD34 bem como viabilidade de 80% mesmo após a criopreservação pelo período de
5 meses, quando foram descongeladas e recultivadas com sucesso após ao nascimento do
bebê, visando sua aplicação na medicina regenerativa neonatal (22). A expressão de Oct-4,
SSEA4, CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 e as diferenciações nas linhagens osteogência,
adipogênica e neurogênica também foram demonstradas por Phermthai e colaboradores em
2010 (32).
Uma robusta deposição mineral de cálcio em um molde biodegradável foi obtida pelo
cultivo 3D de células do líquido amniótico, sugerindo grande potencial da utilização destas
células na ortopedia (33). Outro estudo demonstrou o isolamento e cultivo de células-tronco
do líquido amniótico, bem como sua diferenciação osteogênica quando as células foram
cultivadas diretamente em meio acrescido de ß-glicerofosfato, ácido ascórbico e
dexametasona, dispensando-se a fase de cultivo primário em meio padrão e acelerando-se o
processo. A produção de nódulos mineralizados de cálcio pôde ser observada após 18 dias de
cultivo, pela coloração Alizarin Red. Este trabalho também evidenciou, via RT-PCR, que
estas células expressaram todos os marcadores de osteogênese a partir do 30º dia de cultivo
(34).
Antigamente pensava-se que as melhores amostras de células-tronco do líquido
amniótico estavam presentes no segundo terço da gestação e eram obtidas por amniocentese
no período pré-natal. No entanto, o estudo das características biológicas de CMTs do líquido
amniótico do terceiro terço da gestação de mulheres obtidos durante cesariana de fetos a
termo demonstrou que as células podem ser isoladas e cultivadas com grande sucesso. Além
da facilidade de expansão estas células não apresentaram propriedade tumorgênicas, e foram
induzidas a diferenciar-se em osteócitos no cultivo adicionando-se de ácido ascorbico e ß-
glicerofosfato. A diferenciação foi comprovada ao observar-se a expressão do gene
osteopontina por RT-PCR. Os antígenos de superfície específicos das CTMs foram
caracterizados por citometria de fluxo e, da mesma forma, observou-se a expressão do gene
de pluripotência OCT-4 (22).
You et al. (29) também concluíram que as células coletadas no momento do parto são
facilmente expandidas e induzidas à diferenciação em muitos tipos celulares. As células
expressaram o marcador de pluricelularidade Oct-4 e os marcadores CD29, CD73, CD90 e
CD 105, não expressando os marcadores CD31, CD45 e CD61. Além disto, quando
transplantadas em músculos de ratos não produziram a formação de tumores. Os autores
concluiram que, no futuro, o líquido amniótico será uma providencial e conveniente fonte
para formação de um banco de células-tronco.
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Na medicina veterinária eqüina, ainda são poucos os estudos realizados com células-
tronco derivadas do líquido amniótico. No entanto, alguns autores já descreveram o
isolamento e caracterização de células desta fonte coletadas durante o parto de eqüinos. A
população de células de fluido amniótico demonstrou ter maior taxa de crescimento e
proliferação do que populações de células adultas e outras células fetais. Estas células
apresentaram diferenciação avançada para diversas linhagens celulares como adipogênica,
osteogênica, miogênica e neurogênica, bem como outras características marcantes: a
expressão de marcadores de pluripotência como o Oct-4 (17). Recentemente, CTMs do
líquido amniótico eqüino foram novamente isoladas com sucesso, demonstrando grande
capacidade de proliferação e apresentarando a expressão de marcadores típicos de CTMs e
capacidade de diferenciação em três diferentes linhagens celulares (28).
Em nosso laboratório, obtivemos CTMs do líquido amniótico de úteros gravídicos de
diferentes idades gestacionais coletados em abatedouro. As células foram isoladas e
expandidas, apresentando morfologia fibroblastóide, e caracterizadas imunofenotipicamente
sendo coradas para vimentina, CD44, PCNA, e não coradas para citoqueratina e Oct-4
demonstrando sua origem mesenquimal e seu potencial de multiplicação. A não observação
da expressão de Oct-4 difere dos resultados demonstrados na literatura e pode ser explicada
pela heterogênicidade da população celular encontrada em cada amostra colhida (35). Além
disso diferenças na metodologia de avaliação não podem ser descartadas uma vez que em
nosso estudo foi realizada a marcação in situ por imunofluorescencia e não uma avaliação
quantitativa por citometria de fluxo. Em concordância com os demais trabalhos da literatura,
as células isoladas demonstraram capacidade de diferenciação nas linhagens osteogênica e
adipogênica (36).
Células-Tronco Derivadas da Membrana Amniótica
A membrana amniótica demonstra propriedades antiinflamatórias, antibióticas e de
proteção às feridas. Estas propriedades, combinadas com a ausência ou baixa
imunogenicidade, levaram ao uso clínico da membrana amniótica como curativo para
queimaduras de pele, úlceras nos membros inferiores e diversas lesões oftálmicas. No entanto,
nos últimos anos um novo foco de pesquisa quanto às células derivadas da membrana
amniótica surgiu: Sua utilização na terapia celular e medicina regenerativa em transplantes
alogêncios ou xenogênicos (37).
Na membrana amniótica estão presentes dois tipos celulares de diferentes origens:
células epiteliais amnióticas derivadas do ectoderma embrionário e células amnióticas
mesenquimais derivadas do mesoderma embrionário (38). As células epiteliais amnióticas
humanas desenvolvem-se a partir do epiblasto, 8 dias após a fertilização e antes da
gastrulação do embrião, abrindo a possibilidade de que essas células possam manter a
plasticidade das células embrionárias. Células epiteliais amnióticas foram isoladas e
apresentaram marcadores de superfície característicos de células pluripotentes como NANOG
e Oct-4. Sob certas condições de cultivo formam estruturas esféricas de aglomerados celulares
que retém características de células-tronco. Estas células possuem a vantagem de não
necessitar de feeder como as células-tronco embrionárias e apesar de demonstrar possuir
capacidade de diferenciação in vitro nos tecidos endodermais (células do fígado e pâncreas),
mesodermais (cardiomiócitos) e ectodermais (células neurais), não produziram tumores após
o transplante em ratos (14).
Células-tronco mesenquimais da placenta humana foram capazes de se diferenciar nas
linhagens osteogênica, adipogênica e condrogênica (39). Estes resultados foram confirmados
(40), que mostraram que as células-tronco derivadas da placenta apresentaram marcadores de
superfície de células-tronco mesenquimais e celular como SSEA-4, TRA-1-61, TRA-1-80 e
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9, que também são capazes de sofrer diferenciação neurogênica. Os mesmos autores
documentaram uma taxa proliferativa significativamente maior das células derivadas da
placenta do que das células derivadas de medula óssea.
Recentemente estudos demonstraram o isolamento eficiente de células-tronco da
membrana amniótica de humanos, sendo que as mesmas expressaram marcadores de
superfície característicos de células mesenquimais como CD44, CD90 e vimentina e não
expressaram CD45 (41). Díaz-Prado et al. (42) demonstraram que ambas as células epiteliais
e as células mesenquimais da membrana amniótica humana apresentaram o perfil
imunofenotípico e o potencial de diferenciação na maioria das linhagens mesodermais
similares, propondo a utilização de células derivadas deste tecido como boas candidatas para a
terapia celular e medicina regenerativa.
Os estudos com células-tronco provenientes da membrana amniótica de eqüinos são
ainda mais escassos do que os estudos com células derivadas do líquido amniótico. No
entanto, obtivemos sucesso no cultivo e na caracterização de células-tronco mesenquimais
derivadas da membrana amniótica canina e eqüina. Estas células foram obtidas pela digestão
enzimática em solução de colagenase que após o cultivo demonstraram habilidade de
aderência ao plástico, morfologia fibroblastóide, e foram marcadas positivamente para
vimentina e não coradas para citoqueratina por meio de imunocitoquímica, além de expressar
os marcadores característicos de células mesenquimais CD44 e CD 90 e não expressarem o
CD34 (43,44.).
Células-Tronco derivadas do Cordão Umbilical
1) Células-Tronco derivadas do Sangue do Cordão Umbilical
Na medicina humana o sangue de cordão umbilical é utilizado há mais de 20 anos como
fonte de células-tronco hematopoiéticas para transplante. Além disto, as células do sangue de
cordão umbilical e as células derivadas do tecido extravascular do cordão já demonstraram
potencial de diferenciação pluripotente, ou seja, para diversas linhagens celulares das três
camadas germinativas in vitro e in vivo, o que as torna uma fonte de células-tronco rica, ética
e interessante (19).
O sangue do cordão pode ser recuperado ao nascimento utilizando-se um kit estéril de
coleta que consiste em uma bolsa de coleta contendo um anticoagulante (citrato ou heparina)
conectados a uma ou várias agulhas de coleta. Estas amostras podem ser coletadas in útero,
antes da liberação da placenta ou ainda, ex útero, em partos normais ou em cesarianas sem
causar dor à criança ou à mãe (19).
O potencial clonogênico de células hematopoiéticas do cordão umbilical humano foi
observado pela primeira vez em 1974 por Knuddtzon (45) e em 1989 Broxmeyer e
colaboradores (46) reportaram a confirmação da presença de células-tronco hematopoiética no
sangue do cordão umbilical. A partir de então muitos outros estudos foram realizados sobre o
potencial clonogênico, a propriedade de auto-renovação e a capacidade de expansão in vitro
destas células (19) e o transplante de células-tronco hematopoiéticas do sangue de cordão
umbilical vem sendo utilizado com sucesso no tratamento de inúmeras doenças malignas e
benignas (47).
Além disto, em 2004 foi relatada a descoberta de células-tronco não hematopoiéticas,
pluripotentes chamadas de células-tronco embrionic-like (48) que foram capazes de se
diferenciar in vitro em células neuronais, hepatobiliares, pancreáticas, endoteliais, do músculo
liso, adipócitos, condroblastos e osteoblastos (49,50,47).
Na medicina veterinária eqüina ainda são poucos os estudos sobre as células-tronco do
sangue de cordão umbilical e seu armazenamento comercial para futuros transplantes
autólogos. No entanto, CTMs do cordão umbilical eqüino foram isoladas, utilizando-se
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amostras a fresco, coletadas no momento do parto, pela primeira vez em 2007. Estas células
apresentaram rápida aderência a placa de cultivo e expansão, morfologia fibroblastóide, e
foram eficientemente diferenciadas in vitro em osteócitos, condrócitos e adipócitos (51). No
mesmo ano, foi demonstrado que uma população de, CTMs do sangue de cordão umbilical
eqüino coletados ao nascimento, expressaram os marcadores de pluricelularidade Oct-4,
SSEA,-I, Tra I-60 e Tra I-8. Estas células também foram diferenciadas para condrócitos,
osteócitos, hepatócitos, adipócitos e miócitos (52).
Ao comparar o potencial condrogêncico de CTMs do sangue do cordão umbilical e da
medula óssea de equinos, observou-se que ambas foram capazes de se diferenciar em
condrócitos, coradas positivamente para proteoglicanos e expressando marcadores para
cartilagem. No entanto, as células de origem no sangue de cordão umbilical apresentaram
alteração na morfologia de cartilagem hialina em menor tempo (6 dias). Já, a expressão de
colágeno tipo 21, aggrecan, CD-RAP e Sox9 foi alta em ambos os tipos celulares utilizados
(53).
Schuch et al. (54) demonstraram que 80% das 79 amostras de células do sangue de
cordão umbilical eqüino, coletadas no momento do parto, foram isoladas, expandiram e foram
capazes de diferenciação in vitro em diferentes linhagens celulares. Os autores sugerem que a
utilização de fibronectina nas placas de cultivo e a redução da tensão de oxigênio de 20% para
5% na estufa melhoram a taxa de isolamento destas células, e ainda que a senescência das
mesmas é atingida após a vigésima passagem.
2) Células-Tronco Derivadas da Matriz Extravascular do Cordão Umbilical
O cordão umbilical é recoberto pelo epitélio amniótico que protege uma matriz
gelatinosa e elástica de mucopolissacarídeos (ácido hialurônico e sulfato de condroitina)
chamada de ¨Wharton´s Jelly¨ após sua descrição por Thomas Wharton em 1856. O âmnion e
a gelatina de Wharton protegem três importantes vasos sanguíneos, essenciais para o
desenvolvimento do feto: um grande vaso sanguíneo que supre o desenvolvimento fetal com
sangue placentário, rico em nutrientes e oxigênio e dois vasos menores, que retornam o
sangue fetal, com dióxido de carbono, resíduos e outras toxinas (19).
Muitos estudos da medicina humana têm reportado a possibilidade de obtenção de
CTMs não apenas do sangue do cordão umbilical, como também da gelatina de Wharton. Em
1991 a possibilidade de isolamento de células fibroblastóides derivadas da gelatina de
Wharton foi relatada pela primeira vez (19). A academia francesa de medicina, em 2010,
relatou que consideram as pesquisas com células derivadas do cordão umbilical extremamente
promissoras, podendo fornecer novas ferramentas para o tratamento de inúmeras doenças
(19).
Um simples fragmento de 5 a 10 mm3 de gelatina de Wharton tem o potencial de render
a produção de mais de um bilhão de CTMs em 30 dias (19). Considerando-se o tamanho
médio do cordão umbilical de humanos de 50cm e, o ainda mais longo cordão umbilical
eqüino, pode-se prever que esta fonte será cada vez mais clinicamente relevante com os
avanços das pesquisas médicas e veterinárias.
Recentemente inúmeros estudos da medicina humana relataram o isolamento e a
capacidade de diferenciação das células derivadas do tecido extravascular do cordão umbilical
em células ósseas, da pele, endotélio, hepáticas e em linhagens neurogênicas (55-58).
A medicina veterinária eqüina também tem demonstrado interesse nesta fonte de CTMs.
O Isolamento e cultivo de CTMs obtidas da gelatina de Wharton de cordões umbilicais
eqüinos foram realizados com sucesso. As células demonstraram morfologia fibroblastóide e
apresentaram a expressão de marcadores embrionários como Oct-4, SSEA-4 e c-Kit, bem
como a expressão de c-Myc (proliferação celular), CD54, CD90, CD105 e CD146. Não
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expressaram os marcadores CD34, CD45 e CD133. Além disso, as células demonstraram
potencial de diferenciação in vitro para linhagens osteogência, adipogênica, condrogênica e
neurogênica (59).
Em 2008 Cremonesi et al. (60) consideraram a obtenção de CTMs do tecido do cordão
de eqüinos um procedimento não invasivo, em que as células são caracterizadas por alta taxa
de proliferação e capacidade de diferenciação, com expressão dos marcadores Oct-4 e Sox-2.
Estas células também mostraram a habilidade de formar esferas de aglomerado celular já
reportadas na literatura (14).
Em nosso laboratório isolamos CTMs por meio da digestão enzimática em solução de
colagenase da matriz extravascular do cordão umbilical canino e equino e, após o cultivo, as
mesmas demonstraram capacidade de aderência ao plástico, morfologia fibroblastóide, e
foram marcadas positivamente para vimentina, não sendo coradas para citoqueratina através
de imunocitoquímica, além de expressar os marcadores característicos de células
mesenquimais CD44 e CD 90 e não expressarem o CD34 (43,44).
Ao comparar as CTMs derivadas de medula óssea, tecido de cordão umbilical e do
líquido amniótico eqüino, observou-se que todos os tipos celulares expressaram os mesmos
marcadores: positivas para CD105, CD29, CD44 e negativos para CD34, também
expressaram Oct-4, SSEA-4 e TRA I-60, apresentando ainda a capacidade de diferenciar-se
na linhagem osteogência. No entanto, as células derivadas da medula óssea e do líquido
amniótico apresentaram uma taxa de proliferção significativamente maior do que as células
derivadas do tecido do cordão umbilical (17). No entanto, observou-se que a suplementação
com EGF (fator de crescimento epidermal) no meio de cultivo de CTMs derivadas do tecido
de cordão umbilical eqüino promoveu um aumento considerável na taxa de proliferação das
mesmas, sem afetar a diferenciação condrogênica e adipogênica, promovendo o aumento da
deposição de matriz de cálcio extra celular durante a diferenciação osteogênica (61). Também
foi observado que a utilização de componentes como cálcio e calciomimético NPS R-476 no
meio de cultivo de células derivadas do tecido de cordão umbilical eqüino podem aumentar
consideravelmente a taxa de proliferação destas células (62), demonstrando que CTMs de
origens diferentes podem requerer diferentes nutrientes para seu total desenvolvimento in
vitro.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Levando em consideração que o agronegócio do eqüino é uma parcela de grande
importância na economia Brasileira gerando riquezas e empregos em nosso país, podemos
concluir que as pesquisas no intuito de incrementar a produção nacional e diminuir perdas
econômicas são de extrema relevância.
Neste sentido, os estudos relativos à utilização de células-tronco na medicina veterinária
eqüina são de grande interesse devido ao seu enorme potencial de uso na regeneração de
tecidos e órgãos lesados e aplicação no campo terapêutico, incluindo a cirurgia regenerativa,
principalmente no estabelecimento de novas terapias para as lesões osteomusculares e
condroarticulares dos cavalos atletas.
Baseando-se nas pesquisas realizadas na medicina humana e nos resultados obtidos
recentemente na medicina eqüina, também podemos ressaltar que os anexos embrionários são
uma fonte ética de células-tronco mesenquimais, de fácil obtenção e coletadas de maneira não
invasiva. Além disto, estas células apresentam grande capacidade de proliferação e potencial
de diferenciação em linhagens celulares mesodermais, endodermais e ectodermais,
apresentando-se como uma alternativa vantajosa de obtenção de células-tronco para a
medicina veterinária equina.
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18
REFERÊNCIAS
1. Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Produção da pecuária municipal. 2011.
[cited 2011 Abr 20]. Available from:
2. Almeida FQ, Silva VP. Progresso científico em equideocultura na 1a década do século
XXI. Rev Bras Zootec. 2010;39(supl esp):119-29.
3. Violini S, Ramelli P, Pisani LF, Gorni C, Mariani P. Horse bone marrow mesenchymal
stem cells embryo stem cell markers and show the ability for fenogenic differentiation by
in vitro exposure to BMP-12. BMC Cell Biol. 2009:10:172-80.
4. Meisner R. Preclinical studies of a somatic stem cell therapy: pathway to clinical approval.
In: Proceedings of the ACVP/ASVCP Concurrent Annual Meetings; 2009, Monterey.
Monterey: IVIS; 2009.
5. Barry F, Murphy M, Dwyer R, O’brien T, Kavanagh C, Duffy G. Stem cell therapy for
tissue repair: the stem cell-host interaction. In: Proceedings of the 15º ESVOT Congress;
2010, Bolonha. Bolonha: IVIS; 2010. p.43.
6. Gandolfi F, Vanelli A, Pennarossa G, Rahaman M, Acocella F, Brevini TAL. Large animal
models for cardiac stem cell therapies. Theriogenology. 2011;75:1416-25.
7. Zago MA, Covas DT. Células-tronco: a nova fronteira da medicina. São Paulo: Atheneu;
2006.
8. Mingroni-Netto RC, Dessen EMB. Células-tronco: o que são e o que serão? Genet Esc.
2006;1:12-5.
9. Pereira LV. A importância do uso das células-tronco para a saúde pública. Cienc. Saude
Colet. 2008;13:7-14.
10. Nardi NB. Células-tronco: fatos, ficção e futuro. Genet Esc. 2007;2:25-9.
11. Muller S. Age-related decline in the osteogenic potencial of human bone marrow cells
cultured in three dimentional collagen sponges. J Cell Biochem. 2001;86:583-90.
12. Minguell J, Erices A, Congent P. Mesenchymal stem cells. Exp Biol Med.
2001;(226):507-20.
13. Tsai MS, Lee JL, Chang YJ, Hwang SM. Isolation of human multipotent mesenchymal
stem cells from second-semester amniotic fluid using a novel model two-stage culture
protocol. Hum Reprod. 2004;19:1450-6.
14. Miki T, Lehmann T, Cai H, Stolz DB, Strom SC. Stem cell characteristics of amniotic
epithelial cells. Stem Cells. 2005;23:1549-59.
15. Gucciardo L, Lories R, Ochsenbeiri-Kölble N, Done E, Zwijsen A, Deprest J. Fetal
mesenchymal stem cells: isolation, properties and potencial use in perinatology and
regenerative medicine. Int J Obstet Gynaecol. 2008;16:166-72.
ISSN 0102-5716 Veterinária e Zootecnia
De Vita B. et al. Anexos fetais: Uma fonte alternativa de células-tronco mesenquimais para a medicina
veterinária equina. Vet. e Zootec. 2012 março; 19(1): 008-022.
19
16. Cabral ACV, Ângelo PC, Leite HV, Pereira AK, Lpoes APBM, Oliveira MB, et al.
Isolamento, diferenciação e aspectos bioquímicos de células-tronco de líquido amniótico.
Rev Assoc Med Bras. 2009;54:489-93.
17. Lovati AB, Corradetti B, Consiglio AL, Recordati C, Bonacina E, Bizzaro D, et al.
Comparison of equine bone marrow, umbilical cord, and amniotic fluid- derived
progenitor cells. Vet Res Commun. 2010;35:103-21.
18. Cremonesi F, Corradetti B, Lange CA. Fetal adnexa derived stem cells from domestic
animals: progress and perspectives. Theriogenology. 2011;75:1400-15.
19. Forraz N, Mcguckin CP. The umbilical cord: a rich and ethical stem cell source to
advance regenerative medicine. Cell Prolif. 2010;44(Suppl 1):60-9.
20. Prusa AR, Marton E, Rosner M, Bettelhein D, Lubec G, Pollack A, et al. Neurogenic
cells in human amniotic fluid. Am J Obstet Gynecol. 2004;191:309-14.
21. Uranio FM, Valentini L, Lange-Consiglio A, Caira M, Guaricci AC, L’abbate A, et al.
Isolation, proliferation, cytogenetic, and molecular characterization and in vitro
differentiation potency of canine stem cells from adnexa: A comparative study os
amniotic fluid, amnion and umbilical cord matrix. Mol Reprod Dev. 2011 doi:
10.1002/mrd.21311.
22. Steigman SA, Armant M, Bayer-Zwirello L, Kao GS, Silberstein L, Ritz J, et al.
Preclinical regulatorynvalidation of 3-stage amniotic mesenchymal stem cell
manufacturing protocol. J Pediatr Surg. 2009;43:1164-9.
23. Fauza D. Amniotic fluid stem cells. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2004;18: 877-
91.
24. Gosden CM. Amniotic fluid cell types and culture. Br Med Bull. 1983;39:348-54.
25. Bydlowski SP, Debes AA, Duarte SA, Janz FL, Cavaglieri RC, Maselli LM. Células-
tronco do liquido amniótico. Rev Bras Hematol Hemoter. 2009;31:45-52.
26. Torricelli F, Brizzi LB, Bernabei PA. Indentification of hematopoietic progenitors cells in
human amniotic fluid before 12th week of gestation. Ital J Anat Embryol. 1993;98:118-
26.
27. Prusa AR, Hengstschlager M. Amniotic fluid cells and human stem cell research: a new
connection. Med Sci Monit. 2002;8:RA253-RA7.
28. Park SB, Seo MS, Kang JG, Chae JS, Kang KS. Isolation and characterization of equine
amniotic fluid-derived multipotent stem cells. Cytotherapy. 2011;13:341-9.
29. You Q, Tong X, Guan Y, Zhang D, Huang M, Zhang Y, et al. The biological
characteristics of human third semester amniotic fluid stem cells. J Int Med Res.
2009;37:105-12.
ISSN 0102-5716 Veterinária e Zootecnia
De Vita B. et al. Anexos fetais: Uma fonte alternativa de células-tronco mesenquimais para a medicina
veterinária equina. Vet. e Zootec. 2012 março; 19(1): 008-022.
20
30. De Coppi P, Bartsch Jr G, Siddiqui MM, Xu T, Santos CC, Perin L, et al. Isolation of
amniotic stem cell lines with potential for therapy. Nat Biotechnol. 2007;25:100-6.
31. Tsai MS, Hwang SM, Tsai LY, Cheng FJ, Lee JL. Clonal Amniotic Fluid-derived stem
cells express characteristics of both mesenchymal and neural stem cell. Biol Reprod.
2006;74:545-51.
32. Phermthai T, Odglun Y, Julavijitphong S, Titapant V, Chuenwattana P, Vantanasiri C, et
al. A novel method to derive amniotic fluid stem cell for therapeutic purposes. BMC Cell
Biol. 2010;11:1-9.
33. Peister A, Deutsch ER, Kolambbkar Y, Hutmacher DW, Guldberg RE. Amniotic fluid
stem cells produce robust mineral deposits on biodegradable Scaffolds. Tissue Eng Part
A. 2008;15:3129-38.
34. Antonucci I, Iezzi I, Morizio E, Mastrangelo F, Pantalone A, Mattioli-Belmonte M, et al.
Isolation of osteogenicprogenitors from human amniotic fluid using a single step cultura
protocol. BMC Biotechnol. 2009;9:1-9.
35. De Vita B, Maia L, Martin I, Freitas NPP, Listoni AJ, Campos LL, et al. Éxito en la
caracterización inmunocitoquimica de células madre masenquimales del líquido
amniótico equino. In: Anais do Primer Curso Congreso Internacional de Ingeniería de
Tejidos y Medicina Regenerativa; 2011, Bogotá. Bogotá: Universidad Nacional De
Colombia; 2011. p.860.
36. De Vita B, Maia L, Martin I, Freitas NPP, Pardo M, Monteiro BA, et al. Aislamiento y
diferenciación de celulas madre mesenquimales de liquido amniotico equino en linaje
adipogenico y osteogenico. In: Anais do Primer Curso Congreso Internacional de
Ingeniería de Tejidos y Medicina Regenerativa; 2011, Bogotá. Bogotá: Universidad
Nacional de Colombia; 2011. p.890.
37. Parolini O, Caruso M. Review: preclinical studies on placenta-derived cells and amniotic
membrane: an update. Placenta. 2011;32(Suppl 2):S186-95.
38. Sakuragawa N, Kakishita K, Kikuchi A, Okano H, Uchida S, Kamo I, et al. Human
amnion mesenchyme cells express phenotypes of neuroglial progenitor cells. J Neurosc
Res. 2004;78:208-14.
39. Igura K, Zhang X, Takahashi K, Mitsuru A, Yamagushi S, Takashi TA. Isolation and
characterization of mesenchymal progenitor cells from corionic villi of human placenta.
Cytotherapy. 2004:6:543-53.
40. Yen BL, Huang HI, Chien CC, Jui HY, Ko BS, Yao M, et al. Isolation of multipotent
cells from human placenta. Stem Cells. 2005;23:3-9.
41. Shuang-Zhi H, Ping S, Xi-Ning P. Culture and indentification of human amniotic
mesenchymal stem cells. Chin Med Sci J. 2010;25:211-4.
ISSN 0102-5716 Veterinária e Zootecnia
De Vita B. et al. Anexos fetais: Uma fonte alternativa de células-tronco mesenquimais para a medicina
veterinária equina. Vet. e Zootec. 2012 março; 19(1): 008-022.
21
42. Díaz-Prado S, Muiños-López E, Hermida-Gomez T, Cicione C, Rendal-Vázquez ME,
Fuentes-Boquete I, et al. Human amniotic membrane as na alternative source of stem
cells for regenerative medicine. Differentiation. 2011;81:162-71.
43. De Vita B, Maia L, Freitas NPP, Alvarenga FCL, Amorim RL, Prestes NC. Isolation and
culture of amniotic membrane and umbilical cord mesenchymal stem cells of canine
foetus. In: Proceedings of Annual International Meeting of the Portuguese Society for
Stem Cells and Cellular Therapies; 2010, Guimarães. Guimarães: Portuguese Society for
Stem Cells and Cellular Therapies; 2010.
44. De Vita B, Maia L, Freitas NPP, Campos LL, Alvarenga FCL, Prestes NC. Isolamento e
cultivo de células-tronco mesenquimais derivadas da membrana amniótica e gelatina de
wharton de equinos. In: Anais do 5º Congresso Brasileiro de Células-tronco e Terapia
Celular; 2010, Gramado. Gramado: ABTCel; 2010.
45. Knudtzon S. In vitro growth of granulocytic colonies from circulating cells in human
cord blood. Blood. 1974;43:357-61.
46. Broxmeyer HE, Douglas GW. Human umbilical cord blood as a potential source of
transplantable hematopoietic stem⁄ progenitor cells. Proc Natl Acad Sci. 1989;86:3828-
32.
47. Broxmeyer HE. Umbilical cord blood transplantation. In: StemBook. Cambrigde:
Harvard Stem Cell Institute; 2010. [cited 2011 Abr 28]. Available from:
.
48. Mcguckin C, Forraz N, Baradez MO. Embryonic-like stem cells from umbilical cord
blood and potential for neural modeling. Acta Neurobiol Exp. 2006;66:321-9.
49. Bieback K, Kern S, Kluter H, Eichler H. Critical parameters for the isolation of
mesenchymal stem cells from umbilical cord blood. Stem Cells. 2004;22:625-34.
50. Kogler G, Sensken S, Airey JA, Trapp T, Muschen M, Feldhahn N, et al. A new human
somatic stem cell from placental cord blood with instrinsic pluripotent differentiation
potential. J Exp Med. 2004;200:123-35.
51. Koch TG, Heerckens T, Thomsen PD, Betts DH. Isolation of mesenchymal stem cells
from equine umbilical cord. BMC Biotechnol. 2007;7:1-9.
52. Reed SA, Johnson SE. Equine umbilical cord blood contains a population of stem cells
that express Oct4 and differentiate into mesodermal and endodermal cell types. J Cell
Physiol. 2008;215:329-36.
53. Berg L, Koch T, Heerkens T, Bessonov K, Thomsen P, Betts D. Chondrogenic potential
of mesenchymal stromal cells derived from equine bone marrow and umbilical cord
blood. Vet Comp Orthop Traumatol. 2009;22:363-70.
54. Schuh EM, Friedman MS, Carrade DD, Li J, Heeke D, Oyserman SM, et al.
Identification of variables that optimize isolation and culture of multipotent mesenchymal
stem cells from equine umbilical-cord blood. Am J Vet Res. 2009;70:1526-35.
ISSN 0102-5716 Veterinária e Zootecnia
De Vita B. et al. Anexos fetais: Uma fonte alternativa de células-tronco mesenquimais para a medicina
veterinária equina. Vet. e Zootec. 2012 março; 19(1): 008-022.
22
55. Xu HH, Zhao L, Detamore MS, Takagi S, Chow LC. Umbilical cord stem cell seeding on
fast-resorbable calcium phosphate bone cement. Tissue Eng Part A. 2010:16:2743-53.
56. Caballero M, Reed CR, Madan G, Van Aalst JA. Osteoinduction in umbilical cord- and
palate periosteum-derived mesenchymal stem cells. Ann Plast Surg. 2010;64:605-9.
57. Zhang YN, Lie PC, Wei X. Differentiation of mesenchymal stromal cells derived from
umbilical cord Wharton’s jelly into hepatocyte-like cells. Cytotherapy. 2009;11:548-58.
58. Zhang HT, Fan J. Human Wharton’s jelly cells can be induced to differentiate into
growth factor-secreting oligodendrocyte progenitor-like cells. Differentiation.
2010;79:15-20.
59. Hoynowski SM, Fry MM, Gardner BM, Leming MT, Tucker JR, Black L.
Characterization and differentiation of equine umbilical cord-derived matrix cells.
Biochem Biophys Res Commun. 2007;362:347-53.
60. Cremonesi F, Violini S, Consiglio-Lange A, Ramelli P, Ranzenigo G, Mariani P.
Isolation in vitro culture and characterization of foal umbilical cord cells at birth. Vet Res
Commun. 2008;32(Suppl 1):S139-42.
61. Passeri S, Nocchi F, Lamanna R, Lapi S. Isolation and expansion of equine umbilical
cord-derived matrix cells (EUCMCs). Cell Biol Int. 2009;33:100-5.
62. Martino NA, Lange-Consiglio A, Cremonesi F, Valentini L, Caira M, Guaricci AC, et al.
Functional expression of extracellular calcium sensing receptor (CaSR) in equine
umbilical cord matrix size-sieved stem cell. PloS One. 2011;6:1-9.
Recebido em: 12/08/11
Aceito em: 06/10/11