RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 05/06/2020. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E TECNOLÓGICAS CAMPUS DE DRACENA Ação anti-helmíntica do extrato de Piper cubeba em ovinos Clara de Araujo Sanchez Médica Veterinária Dracena Dezembro/2019 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E TECNOLÓGICAS CAMPUS DE DRACENA Ação anti-helmíntica do extrato de Piper cubeba em ovinos Clara de Araujo Sanchez Orientador: Prof. Dr. Ricardo Velludo Gomes de Soutello Co-orientadora: Prof. Dra. Rosangela da Silva de Laurentiz Dissertação apresentada a Faculdade de Ciências Agrárias e Tecnológicas – Unesp, Câmpus de Dracena como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Ciência e Tecnologia Animal. Dracena Dezembro/2019 DADOS CURRICULARES DO AUTOR Clara de Araujo Sanchez – nasceu em 28 de dezembro de 1990, na cidade de Andradina– SP. Ingressou no curso de Medicina Veterinária da Fundação Educacional de Andradina – SP em março de 2011, graduando –se em janeiro de 2016. Em março de 2018 ingressou no curso de Pós-graduação em Ciência e Tecnologia Animal, na FCAT/Unesp - Faculdade de Ciências Agrárias e Tecnológicas – Câmpus de Dracena. DEDICATÓRIA Dedico a minha mãe, cozinheira, da pele escura e do candomblé que enfrentou todas as barreiras e que trabalhou incansavelmente para eu conseguir me formar e realizar o mestrado. AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus por sempre me guiar, me orientar e me dar forças pra conseguir chegar onde eu quero. Agradeço minha família, minha mãe Néia e meu pai Claudio por sempre me apoiarem em todas as minhas escolhas. Agradeço ao meu namorado João Vitor por me ajudar em todos as coletas e análises e por sempre estar comigo em todos os momentos sendo eles bons ou ruins. Agradeço ao meu orientador, professor Ricardo, pela oportunidade, por me orientar, confiar, transmitir seus conhecimentos e acreditar no meu trabalho. Agradeço a professora Rosangela por ter me ensinado tanto e me ajudado estando perto ou mesmo longe sem medir esforços. Agradeço a todos que me ajudaram nas atividades experimentais, Juliana, Rui, Vinícius, João Carlos e Giulia, principalmente a Juliana e a Giulia, minhas companheiras em todas as situações nesses dois anos de mestrado. Agradeço aos funcionários das fazendas Santa Luzia e Córrego Seco, Mauricio, Iago, Antonio e Ubirajara pela ajuda nos experimentos. Agradeço aos demais professores e funcionários da FCAT Unesp Dracena. Agradeço a todos que de alguma forma contribuíram até o presente momento. Ação anti-helmíntica do extrato de Piper cubeba em ovinos RESUMO - O objetivo do estudo foi avaliar a atividade anti-helmíntica do extrato da Piper cubeba em helmintos gastrintestinais de ovinos naturalmente infectados. Foram realizados três estudos, Estudo 1: eficácia anti-helmíntica do extrato hidroetanólico da Piper cubeba na dosagem de 2,5 mg/kg de peso vivo (PV) fornecidas em três doses, uma a cada 14 dias; Estudo 2: eficácia anti-helmíntica do extrato hidroetanólico da Piper cubeba na dosagem de 5,0 mg/kg de PV em única dose no dia zero e a toxicidade desse produto; Estudo 3: eficácia anti-helmíntica do extrato hexânico da Piper cubeba na dosagem de 5,0 mg/kg de PV. Foram utilizados 33, 30 e 10 animais nos estudos 1, 2 e 3, respectivamente. Nos estudos 1 e 2, um grupo foi mantido sem tratamento anti-helmíntico e os outros dois foram tratados: um com extrato hidroetanólico da Piper cubeba e o outro com fosfato de levamisol em única dose no dia zero (10 mg/kg de PV) via subcutânea. As coletas das fezes foram realizadas nos dias 0, 4, 10, 14, 21, 28, 35 e 42 no estudo 1 e até os 35 no estudo 2 para posterior análises de ovos por grama de fezes (OPG) e culturas de larvas. No estudo 1, o percentual de redução do levamisol foi de 100%, permanecendo até 21 dias após o tratamento. O percentual do extrato foi de 45%, 81% e 93% após a primeira, segunda e terceira dose em relação ao grupo controle, respectivamente. Nas coproculturas os gêneros de larvas encontradas em ordem de prevalência foram Haemonchus, Cooperia, Oesophagostomun e Trichostrongylus. No estudo 2, o percentual de redução do fosfato de levamisol foi de 100% como controle negativo, permanecendo até 21 dias após o tratamento. O percentual de redução do extrato foi de 96,6%, 96,2% e 91,8% aos 14, 21 e 28 dias após a aplicação comparado ao grupo controle respectivamente. Nas coproculturas, os gêneros de larvas encontradas em ordem de prevalência foram Haemoncus, Cooperia., Oesophagostomun Os testes de toxicidade visando função renal e hepática não apresentaram alterações após a administração do extrato. No estudo 3, após 10 dias o extrato hexânico apresentou redução de 56,6% no OPG dos animais. De acordo com os testes realizados, pode-se concluir que o extrato hidroetanólico da Piper cubeba demonstrou atividade anti-helmíntica sem apresentar toxicidade nos animais tratados, porém esta atividade não se dá pelos compostos apolares do extrato como mostrou no teste realizado com o extrato hexânico. Palavras-chave: fitoterápicos, helmintos, resistência, ruminantes. Anthelmintic action of Piper cubeba extract on sheep ABSTRACT - The present work aimed to evaluate the anthelmintic activity of Piper cubeba crude extract in gastrointestinal helminths of naturally infected sheep raised on pasture by in vivo testing. Two tests were performed, one to evaluate the anthelmintic efficacy of Piper cubeba crude extract, one to evaluate the anthelmintic efficacy of Piper cubeba hexane extract and to evaluate the toxicity of the tested product. Study 1 was conducted in a naturally infected herd using 33 Santa Inês sheep. One group was maintained without anthelmintic treatment and the other two were treated, one with 2.5 mg / kg PV extract in 3 doses every 14 days and the other with Levamisol phosphate 10 mg / kg PV in single dose. on D0. Stool collections were performed on days 0, 4, 10, 14, 21, 28, 35 and 42. The percentage reduction of Levamisol was 100%, remaining until 21 days after treatment. The percentage of the extract was 45% at 14 days after the first dose, 81% at 14 days after the second dose and 93% 14 days after the third dose compared to the control group. In coprocultures the genera of larvae found in order of prevalence were Haemoncus , Cooperia, Oesophagostomun and Trichostrongylus sp. Study 2 was conducted in another naturally infected herd using 30 sheep of the breed. One group was maintained without anthelmintic treatment and the other two were treated, one with 5 mg / kg single dose PV extract on D0 and the other with 10 mg / kg PV single dose levisol phosphate on D0. Fecal collections were performed on days 0, 7, 14, 21, 28 and 35. The percentage of reduction of Levisol phosphate was 100% as negative control, remaining until 21 days after treatment. The percentage of extract reduction was 96.6% at 14 days after application, 96.2% at 21 days and 91.8% at 28 days, compared to the control group. In coprocultures, the genera of larvae found in order of prevalence were Haemoncus., Cooperia, Oesophagostomun. Toxicity tests with the parameters Urea, Creatinine and AST showed no changes after the administration of the extract. In study 3, the anthelmintic efficacy test was performed to evaluate the action of Piper cubeba hexane extract in 10 animals at a single dose of 5mg / kg in D0. After 10 days the extract obtained partial efficacy with a reduction of 56.6% in the opg of the animals. The crude extract of Piper cubeba showed anthelmintic activity without toxicity in treated animals but this activity is not due to the nonpolar compounds of the extract as shown in the test performed with hexane extract. Keywords: herbal medicines, helminths, resistance, ruminants. SUMÁRIO CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS ............................................................. 10 1.1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 10 1.1.1. Objetivo Geral ........................................................................................................... 11 1.1.2. Objetivos específicos ................................................................................................ 11 1.2. REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................... 12 1.2.1. Desenvolvimento dos Helmintos Gastrintestinais nos Ovinos ............................. 12 1.2.2. Controle Anti-Helmíntico ..................................................................................... 13 1.2.3. Fitoterápicos e Fitoconstituintes no Controle Anti-Helmíntico ............................. 14 CAPÍTULO 2 – AÇÃO ANTI-HELMÍNTICA DO EXTRATO DE PIPER CUBEBA EM OVINOS ........................................................................................................... 22 Resumo ...................................................................................................................... 22 Abstract ...................................................................................................................... 23 1.1. INTRODUÇÃO ................................................................................................ 24 1.2. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................ 25 1.2.1. Preparo dos extratos hidroetanólicos da Piper cubeba .............................................. 25 1.2.2. Preparo do extrato hexânico ..................................................................................... 25 1.2.3. Estudo 1: Extrato hidroetanólico com múltiplas doses..................................... 26 1.2.4. Estudo 2: Extrato hidroetanólico em dose única .............................................. 27 1.2.4.1. Análise dos parâmetros bioquímicos ........................................................ 28 1.2.5. Estudo 3: Extrato hexânico em dose única ..................................................... 28 1.2.6. Análise estatística ............................................................................................ 29 1.3. RESULTADOS ................................................................................................ 29 1.3.1. Estudo 1 .......................................................................................................... 29 1.3.2. Estudo 2 .......................................................................................................... 31 1.3.4. Estudo 3 .......................................................................................................... 34 1.4. Discussão ........................................................................................................ 35 1.4.1. Estudo 1: ......................................................................................................... 35 1.4.2. Estudo 2: ......................................................................................................... 36 1.4.2.1. Análise dos parâmetros bioquímicos ....................................................... 38 1.4.3. Estudo 3: ......................................................................................................... 38 1.5. CONCLUSÃO .................................................................................................. 39 1.6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 40 10 CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS 1.1. INTRODUÇÃO A criação de ovinos (Ovis aries) é uma atividade executada mundialmente, com produção de carne anual de 14 milhões de toneladas, o que constitui cerca de 3% da produção mundial de carne (FAO, 2016). Os países tropicais e subtropicais comportam a maioria da população ovina, devido a fatores geoclimáticos aos quais os animais são adaptados Jimenez – Sanz et al. (2016). O Brasil vem ao longo dos anos se estabelecendo no cenário agropecuário global e a ovinocultura não se torna exceção nesse mercado, sendo uma atividade de grande rentabilidade por meio da carne, couro, leite e lã, possuindo menores exigências de extensão de pastagem com menos animais por área comparada a produção bovina (GIANLOURENÇO et al., 2013). Segundo a FAO (2016), o Brasil ocupa a 18º posição na classificação mundial de ovinos e a utilização das áreas de pastagens vem sendo cada vez mais exploradas como fonte primária de energia na dieta de ruminantes, proporcionando papel importante na pecuária de corte e incrementando a oferta de produtos Euclides et al. (2002). Porém sistemas que incluem pastejo de animais contribuem para o aumento de infecções por helmintos gastrintestinais (MENDONÇA et al., 2014). As doenças parasitárias representam impacto negativo em potencial para a produção animal, comprometendo, muitas vezes, o processo de transformação dos produtos de origem animal Stotzer et al. (2014), com perdas estimadas em 13,96 bilhões de dólares/ano, sendo mais da metade (U$ 7,10 bilhões) relacionadas somente aos nematoides gastrintestinais (GRISI et al., 2014). A sensibilidade desses animais a estes parasitas tornou-se grande problema na produção devido a estas helmintoses ocorrerem por meio de infecções de várias espécies de parasitas do trato gastrintestinal. Além disso, causam sérios problemas sanitários como perda de peso, anemia, letargia, anorexia e até a morte, levando a prejuízos como diminuição da produção e aumento do valor do produto final. (TAYLOR et al., 2007). O controle dessas parasitoses é basicamente feito por meio de 11 desverminações que permanece essencialmente com bases químicas. Decorrente do insuficiente repasse de tecnologia, ou mesmo de informações inadequadas referentes à frequência de tratamento e à utilização incorreta das drogas antiparasitárias em ovinos, foi observada grande diminuição da eficácia desses produtos nas principais regiões produtoras brasileiras, inclusive, com o aparecimento de cepas resistentes a vários grupos químicos disponíveis no mercado (MOLENTO et al., 2004) Neste sentido, as pesquisas estão cada vez mais direcionadas à busca por tratamentos alternativos como, por exemplo, a fitoterapia (MOLENTO et al., 2004). Trabalhos preliminares com Piper cubeba indicaram que a pimenta apresenta atividades biológicas importantes como antioxidante, antimicrobiana e anti-helmíntica Carlis et al. (2019). Produtos naturais quando vindos de espécies vegetais, apresentam grande importância no desenvolvimento de novos medicamentos. A fitoterapia pode trazer grandes benefícios ao produtor, consumidor e meio ambiente. No entanto, estudos in vivo são escassos e carecem de informações. 18 1.3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA ALBUQUERQUE, J. M. Plantas medicinais de uso popular. Brasília: Ministério da Educação, 1989. AMARANTE, A. F. T.; BRICARELLO, P. A.; ROCHA R. A.; GENNARI, S. M. Resistance of Santa Ines, Suffolk and Ile de France lambs to naturally acquired gastrointestinal nematode infections. Veterinary Parasitology, v. 120, p. 91-106, 2004. AMARANTE, A. F. T.; SALES, R. O. Controle de endoparasitoses dos ovinos: uma revisão. Revista Brasileira de Higiene e Sanidade Animal, v. 1, n. 2, p. 25-47, 2007. AMARANTE, A. F. T. Atualidades no controle de endoparasitoses ovinas. In: SIMPÓSIO PAULISTA DE OVINOCULTURA, Campinas. Anais [...]. Campinas: CATI/SAA, 1995. p. 33- 49. ANDRONICOS, N. M.; MCNALLY, J.; KOTZE, A. C.; HUNT, P. W.; AARON, I. 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