Campus de Botucatu Instituto de Biociências PG-BGA Detecção do Paracoccidioides spp. em amostras ambientais e diferenciação do complexo P. brasiliensis da espécie P. lutzii por Nested PCR e hibridização in situ THALES DOMINGOS ARANTES Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Doutor no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração Biologia de Parasitas e Micro-organismos. Orientador: Prof. Titular Eduardo Bagagli BOTUCATU – SP 2015 Campus de Botucatu Instituto de Biociências PG-BGA UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU Detecção do Paracoccidioides spp. em amostras ambientais e diferenciação do complexo P. brasiliensis da espécie P. lutzii por Nested PCR e hibridização in situ THALES DOMINGOS ARANTES RAQUEL CORDEIRO THEODORO MARCUS DE MELLO TEIXEIRA SANDRA DE MORAES GIMENEZ BOSCO EDUARDO BAGAGLI Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Doutor no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração Biologia de Parasitas e Micro-organismos. Orientador: Prof. Titular Eduardo Bagagli BOTUCATU – SP 2015 AgradecimentosAgradecimentosAgradecimentosAgradecimentos Agradeço a Deus por toda proteção, saúde, paciência e discernimento para conseguir chegar até o dia de hoje. Em especial, agradeço minha mãe Aparecida, que me deu forças ao longo de toda minha vida. Muito obrigado mãe, eu te amo! Agradeço a minha tia Marlene, por ser mais um ponto de apoio para todos os momentos de minha vida, muito obrigado tia, eu te amo! A minha irmã Talita, obrigado por me apoiar ao longo de tantos anos de dificuldades, alegrias e realizações. Obrigado Talita, eu te amo! Um agradecimento especial a Dra. Raquel, co-orientadora deste estudo, que foi fundamental para a realização desta tese de doutoramento, com total empenho e presteza. Muito obrigado. A minha namorada, Raquel que sempre me apoiou e me ajudou no que foi preciso no caminho até aqui. Te amo! Aos amigos funcionários do Botucatu e do Departamento de Microbiologia e Imunologia: Larissa, Ivana, Lula (presidente), Luiz Alquati, Rafael, Ana, Aline e aos já aposentados Pedro, Tino, Nice e Sônia. Muito obrigado pelos ensinamentos e amizade ao longo da minha estada no Depto., levarei a amizade de vocês para toda a vida. Aos amigos do Laboratório de Biologia de Fungos: Mariana (piruca), Raquel (grozéia), Gabriel (lacrimoso), Tâmara, Ariane, Hans, Marluce, Juliana Rizzo (pagleve), Juliana G. e Marcelo. Muito obrigado pela força, bate papo, risadas e amizade! Sucesso para todos vocês hoje e sempre. Um agradecimento especial ao meu amigo Assis, que me ensinou muitas coisas no começo da minha passagem pelo laboratório. Meu amigo, com muita tranquilidade e paciência você me ajudou a ser um bom aluno e uma pessoa melhor. Obrigado amigão! Gostaria de deixar registrado meu agradecimento a todos os professores do Departamento de Micro/Imuno, que de uma forma direta ou indireta me auxiliaram a traçar minhas atividades acadêmicas ao longo da pós-graduação: Profa. Terue, Profa. Sandra, Prof. Ary, Profa. Vera, Prof. João Pessoa, Prof. João Candeias, Profa. Ângela, Prof. Silvio, Profa. Lurdinha, Profa. Maria Terezinha, Prof. Ramon, Prof. Josias, Prof. Maurício, Profa. Alexandrina e Prof. Montelli. Muito obrigado a todos. Um agradecimento aos amigos e agregados da República Ventania, que sempre foram mais que amigos, foram irmãos! Valeu: Mano Du (negrito), Mano Bolão (Renato), Mano Vinícius (Calazar), Mano Simonilha (Luciano), Mano Tidei (Tinei), Mano Uruta (Thiago), Michele (imbigo), Flávia (e agregados de SP), Natália (dollynha) e aos demais agregados que estiveram por lá em algum momento da vida! A república morre, mas a irmandade permanece! Agradeço ao senhor Ailton Fagundes, que nos recebeu em sua fazenda e em sua casa para a realização deste trabalho. Muito obrigado Delegado. Um agradecimento aos Dr. Nilton da EMBRAPA Arroz e Feijão em Santo Antônio de Goiás, e a todos os funcionários que nos receberam e nos auxiliaram na coleta das amostras nas fazendas. Muito obrigado. Gostaria de agradecer ao Prof. Dr. Luís Marcelo, que nos recebeu em seu laboratório e nos forneceu alojamento durante nossa estadia em Rondônia. Em especial a todos os funcionários do ICB-5/USP e ao funcionário Leomando e ao motorista Muller que nos guiaram durante as incursões nas fazendas e áreas de coleta. Muito obrigado. Agradeço ao Josinaldo e sua família por nos receber para coletas em sua propriedade no município de Monte Negro-RO. Um agradecimento especial ao meu avô Francisco Arantes e minha avó Esmeralda Arantes por me ajudarem na minha estadia em sua fazenda na primeira coleta em Minas Gerais, e ao meu tio Marcos e sua esposa Maria Ângela pela recepção durante nossa breve estadia na segunda passagem por Minas Gerais. Muito obrigado. Agradeço aos professores do programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada pelas disciplinas e demais atividades acadêmicas ao longo dos três anos de curso. Muito obrigado. Obrigado aos amigos pós-graduandos do Programa da BGA, meus sinceros votos de sucesso e felicidades. Gostaria de registrar também meus agradecimentos ao PhD. Green e ao CDC pela disponibilização dos amostradores para as coletas realizadas neste estudo. Thank’s! Aos demais funcionários do campus de Rubião Júnior e da Fazenda Lageado da UNESP de Botucatu, muito obrigado. Ao meu orientador Eduardo Bagagli pela dedicação a esse estudo e em especial sua atenção para o desenvolvimento das árduas atividades em campo. Muito obrigado. Aos membros da banca examinadora agradeço a disponibilidade e atenção na avaliação do trabalho. Muito obrigado! A FAPESP pelo apoio financeiro na forma de bolsa (2012/03233-3) e auxílio à pesquisa (2012/14047-6). Muito obrigado. A CAPES pelo apoio financeiro em forma de bolsa nos primeiros meses do meu doutorado. Muito obrigado. “A vida segue seu rumo com“A vida segue seu rumo com“A vida segue seu rumo com“A vida segue seu rumo como um rio, tudo passa, é o um rio, tudo passa, é o um rio, tudo passa, é o um rio, tudo passa, é carregado, seja leve ou pesadocarregado, seja leve ou pesadocarregado, seja leve ou pesadocarregado, seja leve ou pesado... mas ... mas ... mas ... mas na próxima curva tudo na próxima curva tudo na próxima curva tudo na próxima curva tudo éééé renovarenovarenovarenovadodododo”.”.”.”. SUMÁRIO RESUMO ........................................................................................................................ 1 ABSTRACT .................................................................................................................... 3 I. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 5 II. OBJETIVOS ............................................................................................................ 28 III. REFERÊNCIAS .................................................................................................... 30 IV. ARTIGO 1 - Use of florescent oligonucleotides probes for the detection and differentiation of Paracoccidioides species ................................................................. 37 V. ARTIGO 2 - Environmental mapping of Paracoccidioides spp. by molecular detection in the Southeast, Midwest and North regions of Brazil. .......................... 66 Resumo 1 RESUMO Resumo 2 O solo é o provável habitat do fungo patogênico Paracoccidioides spp., devido à detecção molecular deste patógeno neste tipo de amostra, associada à frequente infecção de trabalhadores rurais e isolamento em animais silvestres (Dasypus novemcinctus e Cabassous centralis). O presente estudo visou detectar e diferenciar as espécies Paracoccidioides brasiliensis (complexo) e Paracoccidioides lutzii no ambiente, pelas técnicas de Nested PCR, FISH, respectivamente, em amostras ambientais aerossóis e solo de tocas de tatus provenientes de áreas endêmicas para a Paracoccidioidomicose nas regiões Sudeste, Centro-Oeste e Norte brasileiras. Além da detecção ambiental de Paracoccidioides sp. por métodos moleculares, foi estudada a ocorrência de tatus infectados com P. lutzii no centro-oeste brasileiro, região de maior prevalência desta espécie, onde nenhum animal havia sido avaliado até o presente momento. Obtivemos a detecção positiva para ambas as espécies de Paracoccidioides por ambas as técnicas de detecção (Nested PCR e hibridização in situ), além da diferenciação por ITS (Internal Transcribed Spacer) pudemos visualizar os espécimes fúngicos em algumas amostras aerossóis. Acreditamos que os dados refletem a real ocorrência dos fungos em seu nicho, no entanto, o isolamento animal em tatus demonstrou-se negativo para 7 animais avaliados no trabalho, o que pode indicar que a relação da espécie P. lutzii com os tatus pode não ser a mesma com os casos de tatus infectados com P. brasiliensis em outras regiões brasileiras. Palavras Chave: Paracoccidioidomicose, Amostrador Ciclônico, TSA-FISH, Paracoccidioides spp., Amostras Aerossóis. Abstract 3 ABSTRACT Abstract 4 Soil is probably the habitat of pathogenic fungi Paracoccidioides spp., due to the molecular detection of this pathogen in these samples, associated with the frequent of infection in rural workers and the isolation in wild animals (Dasypus novemcinctus and Cabassous centralis). This project aimed to detect and differentiate the species P. brasiliensis (complex) and P. lutzii in the environment, by the techniques of Nested PCR and FISH, respectively, in environmental aerosol samples and soil from armadillo’s burrows, from endemic and non-endemic areas to Paracoccidioidomycosis in the Southeast, Midwest and North regions of Brazil. Besides the environmental detection of Paracoccidioides spp. by molecular methods, the occurrence of armadillos infected with P. lutzii the Brazilian center-west region with the highest prevalence of this kind, where no animals were evaluated at the present time will be studied. We achieved positive detection of both species of Paracoccidioides by both detection techniques (PCR and in situ hybridization), and further the differentiation by the ITS (Internal Transcribed Spacer) we could visualize fungal species in some aerosol samples also differentiating the two species. We believe of the data reflect the actual occurrence of fungi in their niche, however the animal isolation in armadillo’s showed up negative for 7 animals evaluated at work, which indicated that the ratio of the species P. lutzii with armadillo may not be the same with cases of armadillo’s infected with P. brasiliensis in other regions of Brazil. Key words: Paracoccidioidomycosis, Cyclonic Sampler, TSA-FISH, Paracoccidioides spp., Aerosol Samples. I. Introdução 5 I. INTRODUÇÃO I. Introdução 6 O estudo dos aspectos biológicos e ecológicos de Paracoccidioides brasiliensis (SPLENDORE, 1910; ALMEIDA, 1930) e P. lutzii (TEIXEIRA et al., 2013) vem sendo desenvolvido por vários grupos de pesquisa nos últimos anos, em especial buscando isolar e/ou detectar estes organismos em amostras clínicas e ambientais, de forma a obter dados mais concretos sobre os fatores ecológicos que determinam a distribuição geográfica destes patógenos. Ambas as espécies, pertencentes ao Filo Ascomycota, Família Ajellomycetaceae, são causadoras da mais importante micose sistêmica da América Latina, a Paracoccidioidomicose (PCM) (BRUMMER et al., 1993; SHIKANAI-YASUDA et al., 2006). Trata-se de fungos termodimórficos, com apresentação da forma micelial (saprobiótica) à temperatura ambiente (25-28ºC) e leveduriforme (parasitária) à 37ºC (BAGAGLI et al., 2003). A forma micelial é produtora dos esporos infectantes, chamados artrósporos ou conídios, os quais devem ser aerossolizados antes de infectar hospedeiros susceptíveis pela via inalatória (ARANTES et al., 2012). Após a infecção, se transformam em células individualizadas (leveduras) com multibrotamentos, causando assim a micose (LACAZ et al., 2002). A paracoccidioidomicose, uma micose classificada como sistêmica, é doença de reconhecido impacto socioeconômico, por acometer principalmente trabalhadores rurais do sexo masculino na faixa etária de 30 a 50 anos, faixa esta a mais produtiva no trabalhador, impossibilitando muitas vezes o retorno deste à suas funções normais de trabalho (MENDES et al., 2003; SHIKANAY-YASUDA et al., 2006). A manifestação da doença depende de fatores como imunidade do hospedeiro, predisposição por alcoolismo, tabagismo e doenças de base (tuberculose, aids, etc.), além da carga fúngica (inóculo) e o período de latência do fungo (MENDES, 1994). As principais formas clínicas da PCM são aguda/subaguda e crônica. A forma aguda/subaguda, também chamada juvenil, em geral compromete crianças, adolescentes e adultos jovens, I. Introdução 7 apresentando história clínica de curta duração (mediana de dois meses) (SHIKANAI- YASUDA et al., 2006). Esta forma é responsável por 20 a 25% dos casos, caracteriza-se por apresentar instalação mais rápida da doença, variando de algumas semanas a poucos meses, além de apresentar envolvimentos predominantes do sistema fagocítico mononuclear, sendo estes: baço, fígado, nódulos linfáticos e medula óssea. A forma crônica ocorre em 75% dos casos e apresenta história clínica de longa duração, em geral acima de seis meses. As manifestações pulmonares são muito frequentes, diferentemente da forma aguda onde estas são pouco comuns com elevada ocorrência de lesões em pele e mucosa. Com o acometimento pulmonar na forma crônica, outros órgãos tendem a ser comprometidos, assim como pele e adrenais (MENDES, 1994). Segundo Restrepo et al., (1985) a manifestação clínica e o período de latência do fungo, associado às frequentes migrações das populações de áreas endêmicas, tornam praticamente impossível à identificação dos locais onde a infecção foi adquirida. Baseados nessa afirmação, podemos observar a real necessidade de se identificar o agente diretamente do seu habitat, conhecendo de forma mais clara sua atuação no micro nicho ao qual pertence e interage. Sabe-se atualmente que o Paracoccidioides spp. tem seu habitat (local físico e geográfico de distribuição) localizado no solo, mas seu nicho ecológico (somatório de todas as interações do micro-organismo com os fatores bióticos e abióticos do meio) ainda não foi corretamente determinado, levando a necessidades de estudos a nível ambiental para este fungo (FRANCO et al., 2000). O gênero Paracoccidioides apresenta características típicas de organismos com estratégias k de crescimento (IJDO et al., 2010), ou seja, com baixa taxa de reprodução e pouca produção de esporos, quando em saprobiose. Ainda, comparado com outros fungos de solo, este fungo apresenta crescimento lento em meios I. Introdução 8 laboratoriais, o que dificulta o seu isolamento ambiental, quer seja por cultivo direto, por extinção ou mesmo por recuperação após infecção animal experimental (GEZUELE, 1989; SHOME & BATISTA, 1963; SILVA-VERGARA et al., 1998). Os estudos de distribuição do Paracoccidioides têm focalizado principalmente isolados provenientes de infecções humanas e alguns poucos isolados provenientes de animais silvestres e domésticos, uma vez que são raros os isolados obtidos diretamente de amostras ambientais. Os poucos casos de isolamento direto de amostras ambientais deste patógeno foram obtidos de solo, folhagem, ração de cachorro e de fezes de pinguim, quase que de forma casual, com pouca ou nenhuma repetitividade (FRANCO et al., 2000), limitando a capacidade de compreender tanto a ecologia como a real distribuição do gênero no ambiente de áreas endêmicas e não endêmicas. Sendo parte e/ou a maioria dos isolados usados em estudos filogeográficos das espécies do gênero Paracoccidioides provenientes de amostras clínicas, fatores como a migração do hospedeiro e o período de latência da doença dificultam precisar o local da infecção e a ocorrência de cada espécie críptica na região endêmica de origem do paciente. A identificação das diferentes espécies em seu ambiente saprobiótico, além de demarcar locais de risco, também pode contribuir para uma melhor elucidação da filogeografia do gênero Paracoccidioides (BAGAGLI et al., 2003 e 2008). Os estudos sobre a ecologia do Paracoccidioides spp. ganharam novas perspectivas com a descoberta de hospedeiros naturais silvestres (tatus), pelo desenvolvimento de metodologias de biologia molecular e também pela aplicação de métodos de geoprocessamento (NAIFF et al., 1986; BAGAGLI et al., 1998 e 2003; CORREDOR et al., 2005; THEODORO et al., 2008; BARROZO et al., 2009 e 2010). A ecologia do Paracoccidioides spp. ainda necessita de muitos dados experimentais para ser melhor fundamentada, em especial, dados de isolamento em amostras ambientais I. Introdução 9 que ao longo dos anos após a descrição do fungo, vem sendo apenas esporadicamente realizado (FRANCO et al., 2000). Tendo em vista a necessidade de compreender melhor os fatores ambientais do fungo, um maior número de grupos de pesquisa associados a várias frentes de trabalho (clínica, laboratório e ambiental) deveriam atuar juntos na pesquisa do Paracoccidioides spp., de modo a confluir dados de pesquisa para uma melhor compreensão da especiação, características de virulência e fatores ecológicos de cada espécie críptica do gênero. O primeiro relato de isolamento do solo foi em 1962 e 1963, no Recife, onde pesquisadores descreveram o isolamento de Paracoccidioides spp. em amostras do solo em uma fazenda, no entanto uma posterior identificação micológica do mesmo isolado identificou este como sendo o fungo Aspergillus penicillioides, além da região de isolamento não ser reconhecida como área endêmica para a Paracoccidioidomicose (SHOME & BATISTA, 1963). Em 1967, outro trabalho relatou o isolamento de Paracoccidioides spp. do solo, na cidade de Chaco – Argentina, onde pesquisadores obtiveram 12 amostras do solo da zona rural, isolando o fungo nestas. Este isolado é aceito como verdadeiro, entretanto, seria necessário o envio da amostra para centros de referência para confirmação da identificação micológica do achado (NEGRONI, 1967). O isolamento de Paracoccidioides spp. foi realizado também em 1971, na Venezuela, na cidade de Paracotos, onde pesquisadores isolaram o fungo dentre 87 amostras de solo obtidas em diferentes épocas do ano, sendo um dos primeiros trabalhos a relatar a infecção por via inalatória através da dispersão dos conídios do fungo (ALBORNOZ, 1971). Em 1989 Gezuele, pesquisador uruguaio realizou o isolamento de um fungo com características semelhantes ao Paracoccidioides spp. em fezes de pinguim (Pygoscelis adeliae), características estas comprovadas nos trabalhos sequentes I. Introdução 10 (CALEGARI et al., 1989, CAMARGO et al., 1992; GARCIA et al., 1993), por meio de provas imunoquímicas, produção de antígenos e aspectos micológicos. Em 1990 Ferreira e colaboradores, realizaram o isolamento de Paracoccidioides spp. em ração de cachorro, provavelmente devido ao contato quase que direto do alimento com o solo, como fonte de contaminação (FERREIRA et al., 1990). No ano de 1993 Garcia et al., na sequência dos trabalhos de 1992, realizaram provas de cultivo, imunoquímicas, produção de antígenos, SDS-PAGE e imunoeletroforese, confirmando a identidade do fungo de Gezuele como sendo Paracoccidioides spp., descartando no entanto a proposta uruguaia de classificação desta como sendo uma nova espécie denominada Paracoccidioides antarcticus. Em 1998, Silva-Vergara e colaboradores, isolaram um fungo a partir de amostras de solo de uma plantação de café em Ibiá-MG. O isolado apresentou dimorfismo térmico e com virulência frente inóculo animal por via intraperitoneal no município de Ibiá-MG, caracterizando-o como Paracoccidioides spp. Além do isolamento em amostras ambientais, foram relatados dados de dois casos de PCM em cães (RICCI et al., 2004; FARIAS et al., 2005), onde foi obtida cultura fúngica positiva apenas para o segundo caso. O isolado foi caracterizado molecular e morfologicamente (BOSCO et al., 2005). Este achado é de grande importância para o estudo epidemiológico da PCM, pois representa o primeiro isolamento do P. brasiliensis de um animal doméstico, cujo contato com humanos é infinitamente superior se comparado com animais silvestres. O tatu é um importante marcador para a detecção do Paracoccidioides spp., uma vez que é um animal sem hábitos migratórios e com uma área de vivência bem delimitada, o que facilita a demarcação do local de infecção do tatu pelo fungo, tornando assim possível caracterizar a área de captura como sendo uma área de I. Introdução 11 ocorrência do fungo. O isolamento em tatus (NAIFF et al., 1986; BAGAGLI et al., 1998 e 2003; CORREDOR et al., 2005; ARANTES et al., 2012) é uma boa metodologia, uma vez que torna possível identificar o isolado ambiental, caracterizando com precisão, assim como em isolados clínicos humanos a correta especiação do isolado fúngico. No trabalho de Trejo-Cháves et al., 2011 além do tatu, outro animal silvestre foi descrito com isolamento positivo para o fungo Paracoccidioides spp., o bicho preguiça Choloepus didactylus, evidenciando a infecção em diferentes hospedeiros silvestres (TREJO-CHÁVES et al., 2011). Enquanto os conhecimentos sobre a ecologia e em particular sobre o nicho ecológico e habitat do Paracoccidioides spp. tiveram poucos avanços nos últimos anos, os conhecimentos sobre o conceito de espécie do patógeno avançaram consideravelmente, principalmente pela aplicação de técnicas de biologia molecular e bioinformática. Matute et al., (2006) e Carrero et al., (2008), realizaram um estudo filogenético por genealogia de multi loci, no qual constatou-se um complexo de quatro espécies em P. brasiliensis. No trabalho de 2006, foram descritos 3 genótipos distintos do gênero (S1, PS2 e PS3), denominados de espécies crípticas, ou seja, espécies com diferenças morfológicas ausentes e/ou imperceptíveis, mas geneticamente distintas e reprodutivamente isoladas (MATUTE et al., 2006; CARRERO et al., 2008; TEIXEIRA et al., 2009). O resultado do estudo realizado por Matute et al., (2006) demonstrou a existência de um grupo parafilético, denominado S1, e dois monofiléticos PS2 e PS3. A ocorrência destes achados fica restrita as áreas geográficas da Argentina, Brasil, Peru, Paraguai e Venezuela (S1 e PS2) e Colômbia (PS3). Dois anos após o estudo de Matute e colaboradores, Carrero et al., (2008), ao analisarem 14 genes de um total de 21 isolados, observaram que o isolado Pb01 I. Introdução 12 proveniente da região centro-oeste brasileira, não se agrupava com nenhuma das três espécies crípticas descritas por Matute et al., (2006). Utilizando um maior número de isolados (17) sendo 16 da região centro-oeste brasileira e um do Equador, Teixeira et al., (2009), determinou que estes novos isolados pertenciam a um grupo que não se agrupava as espécies S1, PS2 e PS3, mas que constituíam uma nova espécie, denominada inicialmente como Pb01-like e mais tarde como P. lutzii, em homenagem ao médico Adolfo Lutz, o descobridor da doença. (TEIXEIRA et al. 2014) Após a descoberta das espécies crípticas, a distribuição geográfica das espécies do complexo P. brasiliensis e da espécie P. lutzii foi atualizada no trabalho de Theodoro et al., 2012, o qual apresenta um mapa da distribuição dos isolados analisados (Figura 01). No entanto, como já mencionado, esta distribuição foi baseada em sua grande maioria por isolados clínicos, o que reflete a problemática da migração dos hospedeiros e fatores ecológicos do fungo. Figura 01. Mapa distribuição segundo Theodoro et al. 2012., demonstrando a disposição dos isolados das 4 espécies crípticas de Paracoccidioides sp. na América do Sul. I. Introdução 13 Ainda na figura 1, o mapa demonstra também as áreas de ocorrência de outro fungo, pertencente à família Ajellomycetaceae, o Lacazia loboi, fungo este filogeneticamente muito próximo ao Paracoccidioides spp., possuindo um ancestral comum, sugerindo uma divergência evolutiva que originou ambas as espécies, sendo o L. loboi um fungo incultivável até o momento e com afinidade pelo meio aquático. Os estudos ecológicos do Paracoccidioides spp. desenvolvidos por nosso grupo de pesquisa, sempre foram formulados de modo a unir dados clínicos aos achados ambientais, gerando assim novos mapas de distribuição e um melhor entendimento da eco-epidemiologia do agente. Porém, esta é uma tarefa árdua, dada a vastidão do nosso território nacional e a difícil obtenção dos dados clínicos e laboratoriais desta doença que não é considerada de notificação compulsória. Em um estudo recente, Vieira et al., (2014) analisaram a distribuição dos casos de PCM no estado de Rondônia, demonstrando um considerável percentual desta micose em pacientes daquela região, demonstrando assim a real situação epidemiológica da doença no estado, e deste modo, caracterizando o estado de Rondônia como uma importante área endêmica para a Paracoccidioidomicose (Figura 02). I. Introdução 14 Figura 02. Mapa de incidência da PCM no estado de Rondônia, distribuição realizada por índice em cada município do estado nos anos de 1997-2012 (100.000 habitante/ano), Fonte SINAN e SINAN NET. Áreas em azul apresentam maior incidência de casos desta micose (Vieira et al. 2014). No ano de 2014, Gegembauer e colaboradores, realizaram um estudo sorológico de pacientes dos estados de Mato Grosso e Mato Grosso do Sul no qual o diagnóstico foi positivo em maior frequência dos soros de pacientes testados da região centro-oeste para detecção com antígenos produzidos com cepas de P. lutzii, demonstrando a necessidade da criação de métodos de identificação ou diagnóstico que de fato sejam hábeis em detectar todas as espécies causadoras da Paracoccidioidomicose. O mapa da figura 03 demonstra os dados clínicos e de diagnóstico laboratorial da PCM nos estados da região Centro-Oeste, Sul e Sudeste neste estudo. Podemos observar que isolados ambientais, os quais não sofrem influência do fator migração, deveriam ser adicionados a este e a outros estudos a fim de atualizar e redefinir o mapa da distribuição das espécies de Paracoccidioides. I. Introdução 15 Figura 03. Mapa das regiões brasileiras de predominância do Paracoccidioides brasiliensis e do P. lutzii segundo Gegembauer et al., 2014. Ainda quanto à relação diagnóstico sorológico versus a genotipagem do Paracoccidioides, Machado et al. 2013, realizaram um estudo sorológico de pacientes das regiões Sudeste e centro-oeste brasileiras, de modo que os soros foram cruzados com antígenos produzidos com cepas originalmente isoladas de cada região, de forma que soros de São Paulo fossem cruzados com antígenos da região Centro-Oeste e vice- versa. Após rápida avaliação sorológica constatou-se que para que a positividade aumentasse no diagnóstico sorológico é necessário produzir antígenos com cepas da região de procedência destes pacientes com doença ativa ou então com um preparado antigênico de várias cepas de todas as espécies crípticas de Paracoccidioides, de modo a evitar falsos negativos, contribuindo para a melhoria no diagnóstico da PCM em cada área endêmica, uma vez que a positividade nos cruzamentos antígenos e soros foram baixos para antígenos de regiões distintas dos soros. I. Introdução 16 Os dados atuais quanto ao diagnóstico da PCM podem refletir a melhoria no diagnóstico laboratorial desta micose e de outras patologias nos últimos 20 anos, no entanto, além da melhoria no diagnóstico laboratorial dessa micose, podemos ressaltar também a atuação do homem em áreas preservadas de vegetação nativa nestas áreas (cerrado, Amazônia e Mata Atlântica), tornando-as áreas de agronegócio. Esse avanço agrícola e a antropofização do solo pode levar ao surgimento de patógenos emergentes, e em especial ao fungo Paracoccidioides spp., levando a uma maior exposição dos trabalhadores rurais destas regiões ao fungo, devido à intensa atividade de manuseio do solo e facilitando assim a aerossolização das partículas fúngicas infectantes. Assim podemos lavar em consideração para taxarmos o grande número de casos de PCM nos estados do Centro-Oeste e Norte não somente por uma melhoria na qualidade diagnóstica, mas também a uma maior taxa de infecção em áreas até então nunca desbravadas pelo homem do campo. Devido a toda problemática do isolamento ambiental deste fungo por técnicas clássicas (isolamento em cultivo e infecção experimental), a detecção por biologia molecular mostrou-se a mais promissora técnica de detecção deste agente nos últimos anos, tanto para amostras biológicas quanto para amostras ambientais. A literatura relata como a principal técnica a PCR (Polymerase Chain Reaction), na qual fragmentos do DNA fúngico, previamente extraído de amostras clínicas e ambientais têm sua amplificação delimitada pela complementariedade de primers espécie-específicos. Os fragmentos amplificados são então identificados segundo seu tamanho em pares de base, em um gel de Agarose ou Poliacrilamida pelo método de eletroforese. Isto vem sendo particularmente realizado utilizando-se do DNA ribossomal (MOTOYAMA et al., 2000; THEODORO et al., 2005a; TERÇARIOLI et al., 2007; ARANTES et al., 2012). Além do material genético ribossomal, o DNA genômico pode também ser I. Introdução 17 utilizado na detecção do Paracoccidioides spp. (RICHINI-PEREIRA et al., 2009), assim como elementos genéticos parasitas, denominados Inteins ou Inteínas, que podem ser utilizados para a caracterização dos isolados de Paracoccidioides spp. (THEODORO et al., 2008). O material que é amplificado pela PCR pode ser também sequenciado para comparação e identificação das espécies. Existem bancos de dados on-line de genes de diversos fungos na internet, por exemplo, o GenBank disponível no site (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) e o Broad Institute (www.broadinstitute.org), ambos com a ferramenta de busca Blastn que se baseia em um algoritmo para identificar sequências de nucleotídeos semelhantes às indicadas pelo pesquisador, informando assim qual o organismo que possui maior identidade para aquela sequencia específica de DNA. Para o Paracoccidioides spp., uma boa técnica de detecção é a Nested PCR, uma variação da PCR original, na qual inicialmente são definidas e amplificadas regiões gênicas relativamente menos específicas, comuns em praticamente todos os fungos estudados atualmente e de maior tamanho, e em uma segunda reação, procede-se a amplificação de uma região menor, interna a primeira reação de amplificação, porém específica para o fungo de interesse (THEODORO et al., 2005a; TERÇARIOLI et al., 2007). Para a utilização desta técnica em fungos, os primers genéricos mais utilizados são ITS4 e ITS5, que são complementares as regiões 18S e 28S e amplificam as regiões Internal Transcribed Spacer (ITS) ITS1, 5.8S e ITS2, descritos por White et al., (1990), que é ideal para amplificação por ser multi cópias e por ser extremamente conservada, apresentando pequenas variações intraespecíficas (nas regiões ITS), possibilitando a correta identificação dos fungos estudados. Para a segunda PCR ou Nested PCR, primers internos específicos de Paracoccidioides spp. são utilizados (Pb-ITSE e Pb- ITSR) se anelando nas regiões ITS1 e ITS2. Estes primers vinham sendo usados para a I. Introdução 18 detecção do Paracoccidioides spp. em amostras ambientais e clínicas, em nosso laboratório no Instituto de Biociências de Botucatu (THEODORO et al., 2005a). Contudo, devido à necessidade da tipagem e detecção das espécies crípticas no gênero Paracoccidioides, um novo primer antisense (Pb-ITS-T), foi desenhado (Figura 04) a fim de se detectar qualquer uma das quatro espécies deste patógeno em amostras ambientais, demonstrado em gel de eletroforese com DNAs controle das 4 espécies crípticas do gênero Paracoccidioides (figura 05) (ARANTES et al., 2012). Figura 04. Esquema de região de rRNA fúngico para amplificação com novo desenho de primers específicos para o gênero Paracoccidioides (modificado de THEODORO et al., 2005a). Figura 05. Reação de Nested PCR com novos primers Pb-ITSE e Pb-ITST para amplificação de DNAs controle das 4 espécies crípticas do gênero Paracoccidioides (ARANTES et al., 2012). I. Introdução 19 Na área da biologia molecular, além de técnicas já estabelecidas como a PCR e suas variantes, novas técnicas como as que enfocam o estudo de fungos não cultiváveis em amostras ambientais diversas (água, solo, plantas) vêm sendo desenvolvidas, tornando possível a identificação de fungos até então desconhecidos por meio de marcações fluoróforas in situ. Um exemplo é a técnica de FISH (Fluorescence in situ hybridization) que se baseia na formação duplex, sob condições bem definidas, de um fragmento de ácido nucléico de fita simples modificado (sonda/probe) e sua sequência complementar (sequência alvo) em um espécime biológico fixado. Trata-se de uma técnica de marcação de DNA, RNA ou proteínas. Inicialmente foi descrita na área de citogenética e imunohistoquímica, nas quais isótopos radioativos eram conjugados com as sondas para demarcar estruturas ou regiões gênicas e com o passar dos anos a técnica ganhou novas vertentes, incluindo opções alternativas a marcação radioativa, o que favoreceu sua execução por um número maior de centros de pesquisa, uma vez que ao não necessitar da conjugação de isótopos radioativos para emissão de fluorescência, a torna realizável em qualquer laboratório padrão com material necessário na análise molecular e/ou citogenética (ADAMS, 1992). Na microbiologia e em especial na micologia, a referência no diagnóstico laboratorial é a demonstração dos patógenos em avaliação direta na amostra biológica e/ou seu isolamento em cultura, mas em alguns casos, devido à dificuldade de isolamento ou visualização nas amostras, o micro-organismo pode ser demonstrado por meio de técnicas moleculares, incluindo a de coloração in situ de DNA ou RNA alvo específicos do agente procurado. Esta abordagem in situ facilita sua correlação com a clínica, pois age diretamente na amostra biológica, e desta forma auxilia também a demonstração do agente em amostras ambientais, com a marcação das células fúngicas nesses tipos de amostras, delimitando a existência de fungos viáveis no local de coleta, I. Introdução 20 além de demarcar com precisão a área de ocorrência de possíveis patógenos humanos, como por exemplo, o Paracoccidioides spp. (LIEHR, et al., 2009). De um modo geral e técnico, a detecção in situ de ácidos nucléicos exógenos é mais simples do que a dos ácidos nucléicos endógenos, principalmente porque as moléculas de ácidos nucléicos exógenos são mais acessíveis devido à diminuição de suas interações com as proteínas. Além disso, em muitas situações, o número de cópias dos ácidos nucléicos exógenos é maior do que para os ácidos nucléicos endógenos, simplificando questões de sensibilidade da aplicação desta técnica, no entanto, para ambos os materiais genéticos alvo podem ser feitas adequações da técnica (LIEHR, et al., 2009). Com esta técnica é possível identificar alterações a nível genômico como, por exemplo, microdeleções ou quando um rearranjo cromossômico envolve uma região camuflada na leitura (rearranjo crítico) ou de difícil interpretação (rearranjos no interior do cromossomo), podendo também auxiliar na diferenciação de espécies fúngicas distintas em amostras ambientais (GEORGAKOPOULOS et al., 2009 in LIEHR, et al., 2009), que é uma de nossas propostas neste estudo na pesquisa do gênero Paracoccidioides sp. em amostras aerossóis. O método de FISH se baseia na busca de fungos e outros micro-organismos através de sua marcação com sondas (óligos ou anticorpos) para vários genes e estruturas fúngicas, como por exemplo, o gene codificador da alpha-tubulina, marcado com um agente fluoróforo, esta marcação foi demonstrada em microscópio de fluorescência, o que permitiu o descobrimento de um novo filo dentro do reino Fungi, o Cryptomycota (JONES et al., 2011), estes dados são demonstrados na figura 06. I. Introdução 21 Figura 06. Marcação estrutural de células do filo Cryptomicota e suas diferenças durante o ciclo de vida. Marcações celulares com DAPI (núcleo) e marcações por TSA-FISH com Horseradish Peroxidase (JONES et al., 2011). A maioria das sondas ou probes utilizadas na FISH são derivadas a partir de fragmentos de DNA genômico. Para a marcação em cromossomos, a presença de sequências de repetição centroméricas definidas permite a utilização de pequenos Oligo Desoxi Nucleotídeos (ODN) ou sondas sintéticas (MATERA et al. 1993 in LIEHR, et al., 2009). O uso de ODN sintéticos altamente específicos, os quais têm uma taxa de hibridização superior e menores custos de fabricação em comparação com sondas genômicas tradicionais, é uma abordagem que pode ser utilizada para atender aos requisitos da técnica de FISH. Os ODNs em geral tendem a hibridizar mais rapidamente com seu alvo, além de ser mais consistentes e mais baratos em sua síntese. (MATERA & WARD, 1992 in LIEHR et al., 2009). Uma vantagem significativa das sondas de ODN é o seu pequeno tamanho e baixa complexidade, que é medida pelo número de combinações possíveis das sequências contidas na preparação de uma sonda. Estas características resultam em uma I. Introdução 22 cinética de hibridização mais rápida (em torno de 5 minutos) em comparação com sondas de alta complexidade, que exigem de 8 a 16 horas para completar o ciclo de hibridização. No entanto, o pequeno tamanho das sondas ODNs limita o número de marcadores que podem ser incorporados a elas, e consequentemente sua sensibilidade. A fragmentação do DNA repetitivo elimina alguns problemas de sensibilidade, especialmente se a unidade de sequência repetida está presente em diversas de cópias (NAKAGOME et al. 1991 in LIEHR et al., 2009), como por exemplo, a região ITS (Internal Transcribed Spacer) do rRNA fúngico, que por ser uma região multi cópias, facilita sua marcação na célula fúngica. No entanto, para se obter uma taxa de sensibilidade maior, as sondas devem conter o máximo de moléculas fluorescentes possíveis (PINKEL et al., 1981 in LIEHR et al., 2009). As sondas podem receber marcações fluoróforas tanto na porção 5’ quanto na 3’, e em alguns casos mais de um fluoróforo é incorporado nas sondas. Esta técnica de marcação de DNA alvo é uma abordagem que se mostra como uma nova vertente para pesquisas ambientais do gênero Paracoccidioides e outros fungos de difícil isolamento ambiental, como por exemplo, a espécie Lacazia loboi única espécie patogênica não cultivável da família Ajellomycetaceae (LACAZ et al., 2002). A pesquisa com sondas de DNA ou RNA fúngico, geralmente ribossomal, denominada de tecnologia de fluorescência por hibridização in situ – FISH (do inglês Fluorescence in situ Hybridization) associada à técnica de TSA (Tyramide Signal Amplification) (Figura 07) apresenta melhores resultados em amostras ambientais segundo relatos da literatura (SPEEL et al., 1999; JONES et al., 2011; KUBOTA et al., 2006). I. Introdução 23 Figura 07. Detecção específica de ácidos nucleicos fúngicos em amostras ambientais (BASCHIEN et al., 2008). Esta técnica também tornou possível a detecção de sequências específicas de ácidos nucléicos em cromossomos de células em tecidos morfologicamente preservados, tanto em amostras clínicas para diagnóstico laboratorial clínico quanto para a pesquisa ambiental de espécies fúngicas incultiváveis e/ou de difícil isolamento em laboratório (Figura 07) (MOTER et al., 2000; PERNTHALER et al., 2003; EICKHORST et al., 2008; BASCHIEN et al., 2008). O uso da técnica de FISH associada à técnica de TSA (Tyramide Signal Amplification) é um reforço metodológico na detecção de genes alvo utilizando a união de um segundo fluoróforo que cliva a reação da sonda inicial, potencializando o sinal emitido pela sonda quando visualizada na microscopia de fluorescência. Na figura 08, podemos ver a sonda ligada com HRP (Horseradish Peroxidase), sendo ligada a fluoresceína-tiramida, potencializando o sinal inicial da sonda de Biotina. Desta forma, materiais escassos tendem a ser mais facilmente visualizados após a hibridização in situ. I. Introdução 24 Figura 08. Esquema de marcação das sondas/probes na região do DNA alvo e a reação posterior de amplificação do sinal pela técnica de TSA (Tyramide Signal Amplification). Os estudos filogenéticos prévios originados no trabalho desenvolvido por Arantes et al. (2012) indicaram a presença da espécie P. lutzii em amostras ambientais aerossóis e de solo coletadas na área endêmica da PCM em Botucatu-SP, segundo sequenciamento dos amplicons ambientais obtidos com os primers Pb-ITSE e Pb-ITST. Esta espécie só havia sido reportada, com alta prevalência, no centro-oeste brasileiro, sendo esta incidência baseada apenas em amostragens clínicas. Sendo assim, novos métodos de diferenciação espécie específica e de detecção e visualização deste agente diretamente em amostras ambientais podem auxiliar de forma significativa para uma melhor compreensão da distribuição geográfica das espécies do gênero Paracoccidioides, da relação patógeno-hospedeiro nas variadas formas clínicas da doença, bem como os padrões eco-epidemiológicos. O uso de sondas para a pesquisa ambiental do gênero Paracoccidioides é inédito, sendo apenas referenciada a técnica de ISH (in situ Hybridization) no trabalho de De Brito et al., 1999, que apresentou uma I. Introdução 25 baixa sensibilidade na marcação de células fúngicas de Paracoccidioides sp. (De Brito et al., 1999). O isolamento e detecção ambiental das espécies de Paracoccidioides (P. brasiliensis e P. lutzii) têm grande importância na compreensão dos aspectos ecológicos destes agentes, porém têm sido pouco realizados, dada sua dificuldade metodológica. Neste estudo, visamos realizar a padronização e utilização de técnicas inovadoras para a pesquisa ambiental de Paracoccidioides por hibridização in situ com sondas de DNA espécie específicas, e também por técnicas moleculares já estabelecidas previamente, como a Nested PCR, associadas a amostragens ambientais diversas (solo, aerossol e animais silvestres), buscando assim contribuir tanto para o estudo ecológico como para a elucidação da biogeografia deste(s) fungo(s). Neste estudo foi dada continuidade à pesquisa ecológica deste fungo, com uma abordagem inovadora, ampliando a área até então estudada, incluindo as regiões Sudeste, Centro-Oeste e Norte brasileiras, em busca de novas informações ambientais sobre a distribuição deste fungo em áreas endêmicas e não endêmicas da PCM, gerando assim novos mapas da distribuição deste importante patógeno fúngico. II. Objetivos 26 II. OBJETIVOS II. Objetivos 27 O objetivo geral deste estudo foi a pesquisa da ocorrência do Paracoccidioides sp. em amostras ambientais em áreas endêmicas e não endêmicas nos estados de Minas Gerais, Goiás e Rondônia. Para tal, especificamente objetivou- se: - Padronizar as metodologias de obtenção de amostras tanto aerossóis quanto para coleta de solo aplicadas as metodologia de detecção molecular utilizando as sondas de DNA; - Avaliar a presença do Paracoccidioides spp. em amostras ambientais por métodos de hibridização com sondas de rRNA pelo método de TSA-FISH por detecção da região gênica ITS; - Analisar filogeneticamente os dados de material amplificado na PCR e Nested PCR, visando à diferenciação do complexo P. brasiliensis da espécie P. lutzii; - Isolar o Paracoccidioides spp. em tatus de nove bandas (D. novemcinctus) nas regiões avaliadas no estudo. III. Referências 28 III. REFERÊNCIAS III. Referências 29 ADAMS, J. C. Biotin Amplification of Biotin and Horseradish Peroxidase Signals in Histochemical Stains. The Jour. of Histoch. and Cytoch. v. 40. n. 10. p. 1457- 1463. 1992. ALBORNOZ, M. B. Isolation of Paracoccidioides brasiliensis from rural soil in Venezuela. 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Authors Thales Domingos Arantes1, Raquel Cordeiro Theodoro2, Eduardo Bagagli1* 1- Departamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biociências de Botucatu, Universidade Estadual Paulista - UNESP 2- Departamento de Biologia Celular e Genética, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN *Corresponding author: Dept of Microbiology and Immunology Institute of Biosciences, UNESP Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, Brazil Zip Code: 18618-970 Phone: +551438800418 Email address: bagagli@ibb.unesp.br Key-words: Paracoccidioidomycosis, Fluorescence in situ hybridization, Tyramide Signal Amplification, Paracoccidioides spp. IV. Artigo 1 - Padronização da Técnica de hibridização in situ 36 Abstract FISH (Fluorescence in situ hybridization), associated with TSA (Tyramide Signal Amplification) using oligonucleotides labeled with non-radioactive fluorophores can be used to detect and differentiate fungal species in environmental and clinical samples, being suitable for those microorganisms whose isolation in culture is difficulty or even impossible. In this study, we standardized the differentiation of the two species complexes of Paracoccidiodies spp. using species-specific DNA probes, labeled with different fluorophores, for later application in environmental samples, assisting the studies on ecological aspects of this fungus. For differentiation of the species, we used tree isolates of P. brasiliensis and tree of P. lutzii cultured in Soil Extract Agar, in the two phases of Paracoccidioides (mycelial and yeast), and two different techniques, TSA-FISH for P. brasiliensis with HRP (Horseradish Peroxidase) linked to the 5’ of the probe and FISH for P. lutzii with the fluorophore TEXAS RED-X® also linked to the 5’ of the probe. After testing different protocols, we obtained the best procedure for both techniques in detection and differentiation of the two complexes of Paracoccidioides. For all protocols and samples tested, we used negative controls, such as the fungus Histoplasma capsulatum, which also belongs to the family Ajellomycetaceae and other fungi. We were able to detect and differentiate P. brasiliensis and P. lutzii by using labeled probes without cross-positivity index with controls. TSA-FISH and FISH showed suitable for molecular detection and identification of the Paracoccidioides spp., with high accuracy, sensitivity and specificity, pointing out your potential for a direct and fast PCM diagnosis as well as for molecular detection of this pathogen in environment. IV. Artigo 1 - Padronização da Técnica de hibridização in situ 37 Introduction Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis recognized for being a socioeconomic impacting disease that compromises mainly rural male workers around 30 to 50 years old, their most productive phase, incapacitating them to develop their normal functions [1, 2]. The manifestation of the disease depends on factors such as host immunity, predisposition for alcoholism and smoking, preexisting diseases (tuberculosis, AIDS, etc.), the fungal inoculum and the latency period of this fungus [3]. The main clinical forms of PCM are acute/subacute and chronic. Acute/subacute form, also called juvenile, generally undertakes children, teenagers and young adults [2]. This form is responsible for 20-25% of cases and it is characterized by a fast onset of the disease, ranging from a few weeks to a few months, and presenting a predominant involvement of the mononuclear phagocyte system, namely: spleen, liver, lymph nodes and bone marrow. The chronic form occurs in 75% of cases and it has a history of long lasting, generally over six months. Pulmonary manifestations are very common and other organs tend to be affected, like skin and adrenal glands [3]. The Paracoccidioides isolates, when compared with other soil fungi, present slowly growth in culture, which hinders their environmental isolation by direct cultivation, being necessary experimental animal infection procedures to isolate them [4, 5, 6, 7]. In the field of molecular biology, well established techniques such as PCR and its variants, have being largely used for studying non-cultivable fungi in several environmental samples (water, soil, and plants). Besides the amplification techniques (PCR, Nested PCR) the use of specific probes by Fluorescence in situ hybridization (FISH) has also, making the identification of new fungi species possible. One example is the FISH technique, which is based on duplex formation under well-defined IV. Artigo 1 - Padronização da Técnica de hibridização in situ 38 conditions, by a single strand fluorescent probe and its complementary (target) sequence into a biological specimen. This technique was initially described in the field of cytogenetic and immunohistochemistry, in which radioactive isotopes were combined with the probes to tag structures or gene regions, but over the years the technique, has been acquiring new dimensions, including alternative options, such as fluorophores instead of radioactive and non-radioactive isotopes. All these improvements make it achievable in any standard laboratory [8]. In microbiology and especially in mycology, the reference laboratory method for diagnosis is the demonstration of the pathogen in the biological sample and/or its isolation in culture, but in cases of few pathogen cells in the tissue or impossibility of culturing it, molecular techniques such as in situ staining of specific target DNA or RNA are the best choice. This in situ approach facilitates its correlation with clinical, because it acts directly in the biological sample, and thus it can also be applied for environmental detection of viable cells of the agent, mapping the risk areas [9, 10, 11]. This target DNA labeling technique is a new applied approach to environmental research of Paracoccidioides genus and other fungi known to be difficult or even impossible to isolate from the environment, such as Lacazia loboi, the only uncultivable pathogenic species of Ajellomycetaceae family [12]. The use of probes for environmental research of Paracoccidioides genus is unprecedented and it is only referenced in the work of De Brito et al [13] who used the ISH technique (in situ Hybridization) , which showed a low sensitivity for labeling Paracoccidioides spp. fungal cells. Research on fungi with probes generally is based on protein encoding genes or genes encoding ribosomal RNA, associated with fluorescence in situ hybridization - FISH (Fluorescence in situ Hybridization) technique associated with TSA (Tyramide Signal Amplification). The TSA technique is based on the ability IV. Artigo 1 - Padronização da Técnica de hibridização in situ 39 of peroxidase (HRP), in the presence of low concentrations of H2O2, to convert the labeled tyramide in a substrate containing an oxidized highly reactive free radicals that can covalently bind to tyrosine residues at or near to the HRP [8]. This technique gives better results in environmental samples [14, 15]. For instance, this technique was effective in the detection of a new phylum within the kingdom fungi, called cryptomicota [16]. In this study, we propose a new technique for research of Paracoccidioides by in situ hybridization with species-specific DNA probes. We believe this approach is suitable for clinical studies as well as for ecological studies on the distribution of the cryptic species of this genus across the Latin America. Methods Probes design for detection and differentiation of P. brasiliensis and P. lutzii species. For probes design the chosen genomic region was the rRNA coding gene, more specifically the Internal Transcribed Spacer-1 (ITS-1) was used [17]. The rRNA sequences from Paracoccidioides species [18, 19] were aligned in order to select conserved regions within species but able to differentiate between them, so that one probe hybridize to the complex P. brasiliensis and the other to P. lutzii. In addition, sequences from other fungal species were also used to ensure probe specificity. The alignment of the sequences was carried out in MEGA 6.0 program [20]. A total of thirty-eight ITS sequences from P. brasiliensis, nineteen from P. lutzii, 2 from Histoplasma capsulatum and 2 from Emmonsia sp. were used. The designed probes were submitted to the similarity analysis at NCBI site database by the blastn tool to check and confirm their specificity. Two probes were selected, one for P. brasiliensis IV. Artigo 1 - Padronização da Técnica de hibridização in situ 40 ITS (HRP-5’-CTCAAGCGCGGCTTGCGTGTTGGGCCCGCGT-3’) and other for P. lutzii (Texas Red-5’-ATGGACGTGCCCGAAAAGCAGCGGCGGCGT-3’). Fungal isolates used in the standardization of in situ hybridization. In this test, we used three isolates of P. brasiliensis (T16B1, Pb192 and T15LN1) and 3 isolates of P. lutzii (Pb01, Pb66 and PbEE) as positive controls in the standardization phase of hybridization. The isolates were obtained from our mycology collection (Biology Laboratory fungi), Department of Microbiology and Immunology, Biosciences Institute of Botucatu - UNESP and from the mycology collection of the Laboratory of Molecular Biology of fungi the University of Brasilia - UnB. These isolates are from both clinical and armadillo’s samples previously identified as P. brasiliensis or P. lutzii. As negative controls other fungal species were used, such as Histoplasma capsulatum, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus and Trichophyton mentagrophytes [12]. Preparation of reagents for FISH and TSA-FISH methods Reagents The protocol for preparing the reagents was adapted from the TSA PerkinElmer® commercial kit and from the: Sampling-Protocol Analysis: Parasitic-Host Dynamics Study, Nautset Marsh (Salt Pond and Mill Pond). The Cell fixation Solution (4% paraformaldehyde plus 0.1 M phosphate buffer) was used to kill the fungus and keep intact its structure and genetic material. A sequence of 50%, 80% and 100% ethanol solutions were used to remove the cell fixation solution and to dehydrate the cells so that they have the ability to absorb the probes to be used in the hybridization step. After dehydration, 10 mL of pre- IV. Artigo 1 - Padronização da Técnica de hibridização in situ 41 hybridization buffer [2,0 ml of ultra-pure H2O; 4,0 ml of 40% Formamide; 1,8 ml of 5M NaCl; 200μl of 1M Tris (pH 7.5); 100μl of 1% SDS; 2 ml of 10% Buffer Blocking Agent], were added to the samples for stabilization and improvement of their permeability, by differences in osmotic pressure. After this first step, the cells were placed hybridized with probes which were prepared in a solution with hybridization buffer at a final concentration of 50ng/μl. After 16-17 hours of incubation at 42° C, the slides with fungal controls were washed with 50 ml of Washing Buffer [47,54 ml of ultra-pure H2O; 460μl of 5M NaCl, 500μl of 0.5M EDTA, 500μl of 1% SDS and 1 ml of 1M Tris (pH 7.5)] for removal of non-specific binding probes. After washing, the slides were stabilized with 250 ml of TNT buffer [217,315 ml of ultra-pure H2O; 25 ml of 1M Tris (pH 7.5); 7,5ml of 5M NaCl and 0,185 ml of Tween 20]. After equilibrating and washing the slides with TNT buffer, 30 μl of TSA solution of the commercial kit (TSA Plus PerkinElmer®) were added in each slide, for 30 minutes in a humid dark chamber at room temperature. Then, they were washed again, dried at room temperature, prepared with addition of DAPI and covered with a cover slip to be observed under a fluorescence microscope. Standardization of FISH and TSA-FISH techniques in cultured samples of P. brasiliensis and P. lutzii. The standardization of the FISH technique required several experiments for the improvement of cell attachment on microscope slides, fixation step, time for hybridization, and also for minimizing cross-reactions of the probes with other fungi species, in order to ensure maximum reliability of results. The fixing solutions used were initially the methanol free formaldehyde at 4%, and 4% paraformaldehyde associated with 0.1 M phosphate buffer. IV. Artigo 1 - Padronização da Técnica de hibridização in situ 42 The protocol used for hybridization with the P. brasiliensis probe was performed according to the commercial TSA-Plus kit from Perkin Elmer®, using pure mycelia of T16B1 isolate. Unlike synthesized probe for the detection of P. brasiliensis, which consisted of a link with Horseradish Peroxidase (HRP), P. lutzii probe was synthesized with the 5' portion labeled with fluorophore with Texas Red, which has a signal emission at 615 nm and a maximum excitation of 596 nm. Since commercial synthesis of HRP-labeled probes no longer exists and also there is no TSA commercial kit for probes labeled with Texas Red-X, only the FISH steps were applied for P. lutzii detection. Fifty slides with P. brasiliensis (25 slides) and P. lutzii (25 slides) mycelial fragments were prepared. To complement these experiments, tests with the yeast phase of Paracoccidioides (P. brasiliensis and P. lutzii) were also carried out, to ascertain the use of FISH and TSA-FISH in possible clinical diagnostic methods, using the same isolates previously cited. The probes were commercially synthesized by the GE LifeSciences®, both being individually diluted in TE (elution buffer) to final concentration at 50ng/µl. After the execution of the FISH and TSA-FISH protocols, the slides were prepared with Calcofluor or DAPI and observed under a fluorescence microscope (Olympus BX60 model) in WB, WU and WG filters. Fungal cell attachment on microscope slides For the standardization of hyphae attachment to microscope slides, conidia and chlamydospores of the mycelial phase of the P. brasiliensis (isolate T16B1) were used. The mycelial colony of five Soil Extract Agar (SEA) plates (0,2% Glicose; 0,1% Yeast Extract; 1,5% Agar and 50% v/v of Soil Extract) were scraped and fragmented. These fragments were maintained in 15 ml Falcon type tubes containing formaldehyde IV. Artigo 1 - Padronização da Técnica de hibridização in situ 43 solution (1%), paraformaldehyde Ultra-Pure (Sigma Aldrich©) at 36.5 to 38%, distilled Water and 100 ml of PBS (NaCl [10% w/v]; Na2HPO4 [0,15% w/v] and NaH2PO4 [0,023% w/v] at pH 7,2-7,4) at concentrations of 10, 5 and 1X were used for different incubation periods (12 and 24 hours) at -20°C, followed by vortex shaking for two minutes centrifugation at 13,000 G for 10 minutes for sedimentation. Then, 10 and 50 µl of the fragments deposited in the pellet were arranged in conventional microscope slides previously cleaned with alcohol-chloroform solution (1: 1). The layout of the fungal pellet on the slides followed the diagram in Figure 1. Once prepared, the slides were placed in a dry box and incubated at 42° C for 30 minutes and then at 37° C overnight, for drying and fixing the fungal pellet on the slides to allow further hydration with hybridization solution, containing the fluorescent probes. After drying, the slides were washed with ethanol solution of 70 to 100%, for dehydrate the fungal structures. For this test, 25µl of Calcofluor were added for binding to the fungal structures for fluorescence emission (560nm), and the slide were covered with a cover slip and observed under a microscope (Olympus model BX60) on fluorescence filter WU. Sampling of aerosol mycelial phase of P. brasiliensis: positive control in flow chamber and subsequent labeling with dye Calcofluor. The mycelial phase of P. brasiliensis is the infective form of the agent and therefore requires extreme caution in its implementation. For this procedure, all biosecurity protocols were followed in biological safety cabinet Class II to prevent contamination of the user and the environment. We sought in this experiment to mimic environmental aerosol collection of fungal spores in the armadillo burrow, so we developed an in house system, to capture the fungal spores by the cyclonic sampler IV. Artigo 1 - Padronização da Técnica de hibridização in situ 44 (NIOSH, model Cyclone 251 BC, developed by the Centers for Diseases Control - CDC [Morgentown, USA]) [21], using mycelial cultures on SEA medium of Paracoccidioides spp. (isolate T16B1). This experiment was conducted in a Styrofoam box, in which the cyclonic aerosol sampler was suspended inside, but without creating an atmosphere of vacuum. To carry out this control experiment, 5 SEA plates containing the P. brasiliensis mycelial phase were attached to the bottom of the box and opened. A mechanical stirring was done to release fungal propagules (Figure 2). The cyclone sampler was placed about 10 cm above the plates and then turned on for 32 hours. The volume collected by the sampler within this period was approximately 6720 liters of air. The stages of the sampler (Falcon and Eppendorf® tubes, 15 ml and 1.5 ml respectively), were then washed with 100μl of Calcofluor dye and each stage was evaluated separately. Later, 20 slides (10 for each stage) were prepared with 10 μl each and analyzed under a fluorescence microscope (Olympus BX60 model) in WU filter. The Styrofoam boxes was sealed, sterilized and discharged safely. To demonstrate and verify spores morphology in this culture medium, we performed a control test by scraping the surface of the colonies, staining the fragments with 25μL Calcofluor and analyzing them under a microscope IV. Artigo 1 - Padronização da Técnica de hibridização in situ 45 Results Standardizations of FISH and TSA-FISH techniques in Paracoccidioides spp. mycelial cultures Fungal cell attachment on microscope slides The fungal structures were well fixed on slides even after washing and staining steps (Figure 3). In both provisions, 50 and 10μl, conidia and chlamydospores of P. brasiliensis (T16B1 isolate) of were visualized. Fixation with formaldehyde, paraformaldehyde and labeling of genetic material with DAPI The fixation and genetic staining with DAPI were effective, clearly demonstrating that the fungal structures were preserved by fixation by all solutions, but the paraformaldehyde showed the best results for fixation of Paracoccidioides spp., because the fungal cells were more preserved and with a higher resolution (Figure 4). Aerosol mycelial phase of P. brasiliensis as positive control For the test performed directly with the T16B1 mycelial culture, a large number of chlamydospores and/or yeast cells not translated into mycelium and few hyphae and conidia were observed (Figure 5). For the test with the aerosol sampling of fungal spores, three out of five slides presented mycelial fragments or conidia in the first and second stages of the cyclonic sampler (Figure 6). FISH for P. lutzii culture The probe for detection of P. lutzii successfully hybridized with cells of the Pb01 isolate, , whose genetic material was labeled with DAPI (Figure 7). IV. Artigo 1 - Padronização da Técnica de hibridização in situ 46 The best fixing solution was the 4% paraformaldehyde, because it best preserved cells after the incubation time. Hybridizations with P. lutzii isolates Pb01, Pb66 and PbEE were positive, showing red points (Texas Red – X) together with the genetic material with DAPI in WU filter showed with help of Image J software (Figure 8). Similarly to the samples of the mycelial phase, the yeast phase tests showed positive hybridization cells with the Texas Red probe for P. lutzii (Figure 9). TSA-FISH in culture samples of P. brasiliensis. After reading the slides, fungal genetic materials were evidenced by DAPI dye. The mycelial structures can be seen in the views in Figure 10, which for the WB filter some cells indicate increased signal in the cytoplasm which can lead to a false positive for an indication of these structures due to the background of the fluorophore with TSA Plus Kit (PerkinElmer®), because showed no genetic material marking stained with DAPI when viewed with WB filters. The HRP probe hybridized to the three P. brasiliensis isolates used in this experiment (T16B1, T15LN9 and Pb192) showing green points together with the genetic material labeled with DAPI in merged images with Image J software (Figure 11). The yeast phase tests showed positive hybridization cells with the labeled probe HRP (green cells) and genetic material with DAPI (Figure 12). Probes specificity Figures 13 and 14 show the lack of cross-reaction of the Texas Red-probe (used in FISH for P. lutzii detection) and the HRP-probe (used in TSA-FISH for P. IV. Artigo 1 - Padronização da Técnica de hibridização in situ 47 brasiliensis) when tested against P. brasiliensis and P. lutzii isolates respectively. No cross-reaction was also observed for the test of both probes against Histoplasma capsulatum, (Figure 15) and other fungi, such as Aspergillus flavus, A. fumigatus and the dermatophyte Trichophyton mentagrophytes. A total of 24 slides were prepared for these test (six for each isolate), and after the observation on fluorescence microscope, no point of hybridized cells were visualized for both probes, that indicated the specificity of the probes for detection of Paracoccidioides spp. However, in just one slide of A. flavus the fungus showed retention of Texas Red probe within the hyphae (Figure 16). Discussion In this study, we modified existing protocols in order to use HRP- and Texas Red labeled oligonucleotides probes, for the identification of Paracoccidioides spp. cells (mycelial and yeast phase). The adaptation of these protocols required a great effort, because the commercial synthesis of these probes was not available in Brazil and for this reason, we opted for use two different fluorophores (HRP and Texas Red) for differentiation of the species complex of P. brasiliensis and P. lutzii, respectively. During the optimization of FISH and TSA-FISH techniques, we adapted a final protocol joining several protocols available in the literature, from commercial protocols until those involved in similar researches. As a result, we obtained a satisfactory data for the differentiation of the species of Paracoccidioides spp. (complex P. brasiliensis and P. lutzii species), since both probes were able to perform hybridization to its target and showed no cross-reactivity within the genus. By the specificity test of the probes against other fungi, we could notice some false points of hybridized cells, because is no showed genetic material stained with DAPI when viewed IV. Artigo 1 - Padronização da Técnica de hibridização in situ 48 with WB filters, due to the accumulation of material retained during hybridization step, in which some dried slides presented intracellular crystallization probes. Therefore, we believe that for both the tested probes, the specificity was very similar to that obtained in silico. Evaluating the signal intensity of the probes issued by exposing the slides under a fluorescence microscope, we observed a significant difference between the signal emitted by HRP-labeled probe (P. brasiliensis) and the Texas Red-labeled probe (P. lutzii), since of the TSA-FISH technique significantly increases the signal emission of hybridized probes. Despite of this signal difference, only the application of FISH technique using a probe labeled with Texas Red, showed good results, mainly because its methodology is easier to apply and it exhibits good signal emission of the hybridized fungal structures. However, the fluorescence incidence tends to be difficult to measure and interpret, depending on the observer's experience, which requires time and patience to identify the hybridized target cells. Aiming to use the in situ hybridization technique in our ecological studies of Paracoccidioides, an experiment control was conducted to confirm the ability of the cyclonic sampler to capture intact fungal structures in these samples, and so, reproducing the environmental collection methodology (in forests and armadillo’s burrows), in which the molecular detection is possible by Nested PCR [19]. The results presented here reflect the positivity of the aerosol sample, since fungal structures of Paracoccidioides spp. were viewed on slides stained with Calcofluor. The technique of in situ hybridization demonstrate to be an alternative for the molecular detection of Paracoccidioides spp. and also for the in situ differentiation between P. brasiliensis and P. lutzii. IV. Artigo 1 - Padronização da Técnica de hibridização in situ 49 In general, the display of fungal structures in biological samples and the ability to differentiate P. brasiliensis and P. lutzii, directly in the material analyzed, is a potential tool for clinical diagnosis or environmental research of these pathogens. Furthermore, compared with traditional molecular detection technique (Nested PCR), which is well outlined in our laboratory, the in situ hybridization technique shows promise for future environmental and clinical studies, given the ability to differentiate the fungus directly into the host tissue, while maintaining the classic diagnostic standard reference for any mycosis, which consists in displaying the fungal agent in the biological sample. This approach may also be applied to address the progress clinical studies of the manifestations of each of the cryptic species, assisting therefore to a better choice of antifungal treatment of paracoccidioidomycosis. Acknowledgments This work was supported by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP grant number 2012/03233-3 and 2012/14047-6) and by the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). We thank to the co-authors and employees of this study, and to the Biosciences Institute of Botucatu-SP. References [1]MENDES, R. P.; SHIKANAI-YASUDA, M. A. Paracoccidioidomicose. In: Cimerman, S.; Cimerman, B. Medicina Tropical. São Paulo: Atheneu. p.505-45. 2003. [2]SHIKANAI-YASUDA, M. A. et al. Guidelines in paracoccidioidomycosis. Rev Soc. Bras. Med. Trop. v. 39. p. 297-310. 2006. [3]MENDES, R. P. The gamut of clinical manifestations. In: Franco, M.; Lacaz, C. S.; Restrepo-Moreno, A.; Del Negro, G. Paracoccidioidomycosis. Boca Raton: CRC Press. p.233-58. 1994. IV. Artigo 1 - Padronização da Técnica de hibridização in situ 50 [4]GEZUELE, E. Aislamiento de Paracoccidioides sp. de heces de pinguino de la Antartida. In: San-Blas G, ed. 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C and D: Slide with 10 µL volume of fungal sediment 10μL per circle. Figure 4. Fungal structures (hyphae, chlamydospores, conidia) (400x) in slides with P. brasiliensis (T16B1) sedimented, fixed with 4% formaldehyde (left) and 4% paraformaldehyde (right) and stained with DAPI (25μL each). Nuclear staining is more intense. IV. Artigo 1 - Padronização da Técnica de hibridização in situ 54 Figure 5. Chlamydospores of the mycelial phase of P. brasiliensis (isolate T16B1) (400x) scraped from the fungal culture and stained with 15μL Calcofluor solution (0.5%) observed under a fluorescence microscope in WU filter. Figure 6. Mycelial structures from P. brasiliensis T16B1 isolate (400x) observed for the first (left) and second (right) stages of the cyclonic sampler after staining with 50µL of calcofluor solution (0.5%), under a epifluorescence microscope, using WU filter. IV. Artigo 1 - Padronização da Técnica de hibridização in situ 55 Figure 7. P. lutzii isolate Pb01 (400x) after hybridization of the ITS Texas Red probe by FISH technique (red). The cell genetic material visualized with DAPI (blue) under a fluorescence microscope in WG, WU and WB filters. Figure 8. Merging images of P. lutzii mycelia from isolates Pb01, Pb66 and PbEE (400x) subjected to hybridization with the ITS Texas Red-X probe for P. lutzii, visualized in WG filter (red layer), and with DAPI (for cellular structures), visualized in WU filter (blue layer) under a fluorescence microscope. IV. Artigo 1 - Padronização da Técnica de hibridização in situ 56 Figure 9. Yeasts from isolate Pb01 (400x) hybridized with the ITS Texas Red-X probe for P. lutzii (observed in WG filter) (B and D) and stained with DAPI (genetic material - blue observed in WU filter) (A and C). Merged image in layers (E): Yeasts structure cell with DAPI (blue) and signal output of hybridized probes (red). IV. Artigo 1 - Padronização da Técnica de hibridização in situ 57 Figure 10. P. brasiliensis isolate T16B1 (400x), subjected to hybridization with ITS HRP-probe by TSA-FISH technique. The hybridized cells are labeled with HRP and fluorescein (green) visualized in WB filter. The cell genetic material visualized with DAPI (blue) in WU filter (D) under a fluorescence microscope. The red circle is an amplification of fungi cell hybridized, indicated by the red arrows. IV. Artigo 1 - Padronização da Técnica de hibridização in situ 58 Figure 11. Merging images of slides with mycelia from P. brasiliensis (isolates T16B1, T15LN9 and Pb192) (400x) subjected to hybridization with the ITS HRP probe for P. brasiliensis visualized with DAPI (cellular structures) in WU filter (blue layer) and labeled with HRP in WB filter (green layer) under a fluorescence microscope. IV. Artigo 1 - Padronização da Técnica de hibridização in situ 59 Figure 12. Yeast cells from isolate T16B1 (400x) hybridized with the ITS HRP probe for P. brasiliensis (B, D and F, observed in WB filter) and stained with DAPI (genetic material - blue observed in WU filter) (A, C and E) under a fluorescence microscope. Merged image (1000x) (G): Yeast cells hybridized with HRP probes (green) and genetic material visualized with DAPI (blue). IV. Artigo 1 - Padronização da Técnica de hibridização in situ 60 Figure 13. P. lutzii isolate Pb01 (400x), subjected to specificity test for hybridization with ITS HRP probe by TSA-FISH technique. No points of hybridized cells are present in the WB filter (HRP probe). The cell genetic material is visualized with DAPI (blue) under a fluorescence microscope in WU filter. Just points of non- hybridized cells are demonstrated in the WG filter image. Figure 14. P. brasiliensis isolate T16B1 (400x), subjected to specificity test for hybridization with ITS Texas Red probe by FISH technique. No points of hybridized cells are present in the WG filter (Texas Red probe). The cell genetic material is visualized with DAPI (blue) under a fluorescence microscope in WU filter. IV. Artigo 1 - Padronização da Técnica de hibridização in situ 61 Figure 15. Specificity test of TSA-FISH technique (A, B, C and D) and FISH (E and F): slides with H. capsulatum subjected to hybridization with the ITS HRP probe for P. brasiliensis (B and D) (400x). The ITS Texas Red-probe for P. lutzii (E and F) (400x), and the cell genetic material was visualized with DAPI (blue) in WU filter (A, C and E), under a fluorescence microscope. IV. Artigo 1 - Padronização da Técnica de hibridização in situ 62 Figure 16. Specificity test of FISH (using ITS Texas Red-probe for P. lutzii) and TSA-FISH (using ITS HRP-probe for P. brasiliensis) technique against to Aspergillus flavus; A. fumigatus and T. mentagrophytes (400x). No points of hybridized cells are present in the WG filter (Texas Red probe) and in WB filter (HRP probe). The cell genetic material is visualized with DAPI (blue) in WU filter, on fluorescence microscope. V. Artigo 2 – Ecologia do Paracoccidioides spp. 63 V. Artigo 2 – Environmental mapping of Paracoccidioides spp. by molecular detection in the Southeast, Midwest and North regions of Brazil. V. Artigo 2 – Ecologia do Paracoccidioides spp. 64 Title: Environmental mapping of Paracoccidioides spp. by molecular detection in the Southeast, Midwest and North regions of Brazil. Authors Thales Domingos Arantes1, Raquel Cordeiro Theodoro2, Marcus de Mello Teixeira3, Sandra de Moraes Gimenez Bosco1, Eduardo Bagagli1* 1- Departamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biociências de Botucatu, Universidade Estadual Paulista - UNESP 2- Departamento de Biologia Celular e Genética, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN 3- Departamento de Biologia Celular, Universidade de Brasília - UnB *Corresponding author: Dept of Microbiology and Immunology Institute of Biosciences, UNESP Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, Brazil Zip Code: 18618-970 Phone: +551438800418 Email address: bagagli@ibb.unesp.br Key-words: Paracoccidioidomycosis, Cyclonic Sampler, TSA-FISH, Paracoccidioides spp., Aerosol Samples. V. Artigo 2 – Ecologia do Paracoccidioides spp. 65 Abstract Soil is probably the habitat of the pathogenic fungus Paracoccidioides spp., due to its molecular detection in these samples, associated with the frequent infection of rural workers and its isolation from wild animals (Dasypus novemcinctus, Cabassous centralis). This work aimed to detect and differentiate the species complex P. brasiliensis and P. lutzii in the environment, by the techniques of Nested PCR and FISH, in aerosol and soil samples from armadillo’s burrows, from endemic and not endemic areas of paracoccidioidomycosis in the Southeastern, Midwestern and Northern Brazil. Besides the environmental detection of Paracoccidioides spp. by molecular methods, the occurrence of armadillos infected with P. lutzii in the Center-Western Brazil, where this species is prevalent, had never been evaluated until the present time. We detected both species of Paracoccidioides in soil by PCR of ITS region and in situ hybridization. This updated data reflect the actual occurrence of the Paracoccidioides species in their niche, despite their absence/non detection, in seven armadillos evaluated in regions with high prevalence of PCM infection by P. lutzii. These results may indicate a possible ecological difference between P. brasiliensis and P. lutzii concerning their wild hosts. V. Artigo 2 – Ecologia do Paracoccidioides spp. 66 Introduction The study of biological and ecological aspects of Paracoccidioides spp. [1,2] and P. lutzii [3] has being developed by several research groups in recent years, in particular seeking to isolate and/or detect these pathogens in clinical and environmental samples, in order to obtain more concrete data on the ecological factors that determine their geographical distribution. It is known that Paracoccidioides spp. has its habitat (physical and geographical distribution site) located in the soil, but its ecological niche (sum of all interactions of the microorganism with the biotic and abiotic factors of the environment) has not been properly determined, demanding more environmental studies for this fungus [4, 5, 6]. The studies of Paracoccidioides distribution have focused mainly in isolates from human infections and in a few isolates from wild and domestic animals, since there are rare isolates obtained directly from environmental samples. The few cases of direct pathogen isolation from environmental samples were obtained from soil, foliage, dog food and penguin feces, almost casually, with little or no repeatability [4, 7, 8, 9]. The isolation of Paracoccidioides spp. from armadillos represents an excellent source for environmental isolation and for mapping the areas of Paracoccidioides spp. occurrence, since this pathogen has been frequently isolated from this mammal host, which shows a very limited home range. The difficulties faced in these environmental studies, limits understanding about the ecology and real distribution of this genus in endemic and not endemic areas for PCM. Since the majority of the isolates used in phylogenetic studies of the genus Paracoccidioides are from clinical specimens, which may have been influenced by factors such as the migration of host and latency period of this mycosis, it is very hard to specify the local of infection and the occurrence of each cryptic species in the V. Artigo 2 – Ecologia do Paracoccidioides spp. 67 endemic and not endemic regions where the patients are from. The identification of risk areas, with the different species in can also contribute to a better understanding of the phylogeography of the Paracoccidioides genus and also indicate preventive methods [10, 11]. The environmental isolation or detection of Paracoccidioides (P. brasiliensis and P. lutzii) has a great importance to understanding the ecological aspects of these agents; however, little has been done, given its methodological difficulty. In this study, an environmental research and mapping of new areas of PCM occurrence was performed, by using a new approach based on a in situ hybridization technique with the species-specific DNA probes, as well as in the previously established molecular techniques, such as Nested PCR, in order to detect the pathogen in different environmental samples, such as soil, aerosol and wild animals (armadillo). In this study we continued previously ecological studies of our group, expanding the collection area, including the Southeastern, Midwestern and Northern Brazil in search for ecological biogeographic information of these fungi, thus generating a new map of the distribution of this important fungal pathogen. Material and Methods Selection of the study areas and environmental samples collection For the collection of environmental samples, two states (Rondônia-RO and Goiás-GO), with a PCM incidence higher than São Paulo State [12, 13] were selected together with a third region with no apparent cases of PCM (Minas Gerais-MG). S