RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 18/08/2019. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA UNESP CENTRO DE AQUICULTURA DA UNESP PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQUICULTURA Infecção experimental de tambaqui (Colossoma macropomum) por Aeromonas hydrophila: avaliação de antimicrobianos e da resposta imune do hospedeiro Sílvia Umeda Gallani Médica Veterinária JABOTICABAL – SÃO PAULO 2019 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA UNESP CENTRO DE AQUICULTURA DA UNESP Infecção experimental de tambaqui (Colossoma macropomum) por Aeromonas hydrophila: avaliação de antimicrobianos e da resposta imune do hospedeiro Sílvia Umeda Gallani Orientadora: Dra. Fabiana Pilarski Co-Orientador: Dr. Geert F. Wiegertjes Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Aquicultura do Centro de Aquicultura da Unesp - CAUNESP, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutora em Aquicultura. JABOTICABAL – SÃO PAULO 2019 Gallani, Sílvia Umeda G163i Infecção experimental de tambaqui (Colossoma macropomum) por Aeromonas hydrophila : avaliação de antimicrobianos e da resposta imune do hospedeiro / Sílvia Umeda Gallani. – – Jaboticabal, 2019 xiii, 141 p. : il. ; 29 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Centro de Aquicultura, 2018 Orientadora: Fabiana Pilarski Coorientador: Geert Wiegertjes Banca examinadora: Diogo Teruo Hashimoto, Geovana Dotta Tamashiro, Luiz Carlos Kreutz, Antonio Augusto Mendes Maia Bibliografia 1. Aquicultura. 2. Bacteriose. 3. Imunidade inata. 4. Peixe. 5. Peixe nativo. 6. Septicemia hemorrágica I. Título. II. Jaboticabal- Centro de Aquicultura. CDU 639.3.09 Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP Campus de Jaboticabal/SP - Karina Gimenes Fernandes - CRB 8/7418 Infecção experimental de tambaqui (Colossoma macropomum) por Aeromonas hydrophila: avaliação de antimicrobianos e da resposta imune do hospedeiro iv SUMÁRIO Agradecimentos....................................................................................................................IX Resumo.................................................................................................................................XI Abstract..............................................................................................................................XIII Capítulo 1 – Revisão bibliográfica........................................................................................14 1.1. Aquicultura: cenário atual e tendências para a produção de tambaqui......................14 1.2. Principais enfermidades de peixes de produção no Brasil: destaque para o tambaqui....................................................................................................................16 1.3. Aeromonas hydrophila: etiologia, sinais clínicos, diagnóstico e tratamento............17 1.4. Sistema imune inato dos peixes: principais células e moléculas envolvidas no reconhecimento e destruição do patógeno..................................................................19 1.4.1. Barreiras físicas e químicas.............................................................................21 1.4.2. Barreira celular................................................................................................21 1.4.3. Barreira humoral.............................................................................................24 1.5. Genes imunes............................................................................................................29 1.6. Etosis: uma nova via de morte celular do mecanismo imune inato...........................31 2. Objetivo..........................................................................................................................35 2.1. Geral.........................................................................................................................35 2.2. Específico.................................................................................................................35 3. Referências.....................................................................................................................36 3.1. Capítulo 2- Aeromonosis in tambaqui Colossoma macropomum: pathogenicity, lethality and new insights for control and disinfection in aquaculture………...…….51 Abstract……………………..…………………………………………………….……….52 1. Introduction…………………………………………………………………..………..53 2. Material and methods…………………………………………………………..………54 v 2.1. Isolation and identification of Aeromonas hydrophila strain from tambaqui…...…54 2.2. Lethal dose (LD) study and Koch’s Postulate: clinical signs, behaviour changes and mortality……………………………………………………………...…………………55 2.2.1. Fish and experimental conditions…………………......……………………55 2.2.2. Strain and challenge design………………………………...………………56 2.3. Treatment and disinfection of Aeromonas hydrophila: research for antibiotics, disinfectants and herbal medicines……………………………………………………...57 2.3.1. Agar disk-diffusion susceptibility test……………………………...………57 2.3.2. Minimun inhibitory and bactericidal concentrations (MIC and MBC)……..58 3. Results…..…………………………………………………………………………………59 3.1. Isolation and identification of Aeromonas hydrophila strain from tambaqui……....59 3.2. LD50 for analysis of clinical signs, behaviour changes and mortality………………60 3.3. Treatment and disinfection of Aeromonas hydrophila: research for antibiotics, disinfectants and herbal medicines……………………………………………………...63 3.3.1. Agar disk-difussion susceptibility test……………………………………...63 3.3.2. Minimun inhibitory and bactericidal concentrations (MIC and MBC)……..64 4. Discussion……………………………………………………………………………….66 5. Acknowledgements…………………………………...………………….………….….70 6. References……………………………………………...……………………………….70 Capítulo 3- ETosis in tambaqui infected with Aeromonas hydrophila: a new cell death pathway of the innate immune mechanism and approach of leukocytes immune response……………………………………………….…………………………...………76 Abstract……………………………………………………………………………………78 1. Introduction……………………………………………………………………………..79 2. Material and methods………………………………………………………………..…..80 vi 2.1. In vivo study:blood parameters changes in tambaqui infected with Aeromonas hydrophila………………………………………………………………………..……..80 2.1.1. Fish and experimental conditions……………………………………80 2.1.2. Aeromonas hydrophila: cultivation and experimental infection……..81 2.1.3. Blood and serum analysis during different phases of infection……..…82 2.2. ETosis assessment: adapted in vitro protocol for analysis by differential interference contrast (DIC) microscopy and scanning electron microscopy (SEM)….....83 2.2.1. Materials to prepare before starting the procedure…………………...83 2.2.2. Leukocytes isolation from head kidney……………………………...85 2.2.3. Co-incubation: cultivating leukocytes with Aeromonas hydrophila…86 2.2.4. SEM processing……………………………………………………...87 2.3. Statistical analysis……………………………………………………………..88 3.Results………………………………………………………………………………...…89 3.1. Blood and serum analysis during different phases of infection……….....….89 3.2. ETosis assessment: adapted in vitro protocol for analysis by differential interference contrast (DIC) microscopy and scanning electron microscopy (SEM)….....94 4. Discussion……………………………………………………………………………….96 5. Conclusion………………………………………………………………………………99 6. Acknowledgements……………………………………………………………………..99 7. References………………………………………………………………………………99 Capítulo 4 – Patterns of immune response of tambaqui Colossoma macropomum: modulation of gene expression in hemorrhagic septicemia……………………………….105 Abstract……………...……………………………………………………………..…….107 1. Introduction…………………………………………………………………..………..108 2. Material and methods………………………………………..……………………..…..109 vii 2.1. Fish, experimental conditions and sampling…………………………………109 2.2.Experimental disease…………………………………………………………110 2.3. Primers design………………………………………………………………..111 2.4. RNA extraction for relative qPCR……………………………………………115 2.5. Real time PCR (qPCR): relative quantification of immune genes……………115 2.6. Complementary study: serum complement system analysis………………….116 2.7. Data statistics and analysis…………………………………………………...116 3. Results…………………………………………………………………...…………….117 3.1. Gene sequences of tambaqui…………………………………………………117 3.2. Real time PCR (qPCR): relative quantification of immune genes……………123 3.2.1. Spleen………………………………………………………………123 3.2.2. Head kidney………………………………………………………...124 3.3. Complement system analysis…………………………...……………………126 4. Discussion…………………………………………………………………………..….126 5. Conclusion……………………………………………………………………………..132 6. References……………………………………………………………………………..133 Capítulo 5- Considerações finais…………………………………………………………140 viii AGRADECIMENTOS À minha família, que me ensinou os valores da educação, da fé e da importância do conhecimento. Obrigada pelo apoio e estrutura, por se esforçarem tanto em garantir meu futuro, por me preencherem com amor e alegria e por serem pessoas tão boas. Obrigada por me ensinarem que tudo que eu faço, devo fazer com amor. Devo tudo à vocês. Ao meu oditchan, pelas histórias interessantes e longas conversas, por me ensinar o valor do caráter. Sinto muito sua falta. Agradeço pelo companheiro de vida e profissão, Gustavo Moraes Ramos Valladão. Pra mim você é um exemplo a ser seguido, repleto de bondade e paciência, sábio como profissional e como ser humano. Obrigada por me ajudar a melhorar em tudo e sempre. Sou grata à sua família, por serem tão alegres e bons para mim. Sou grata à minha orientadora Prof. Dra. Fabiana Pilarski, por ter me estimulado a viajar, conhecer novos laboratórios e por me mostrar a importância de investir em qualidade de vida. Obrigada pelos ensinamentos, pela confiança, amizade, carinho, e de toda sua família. Você me ensinou a ver tudo com mais calma e com você eu pude vivenciar os melhores momentos da minha fase inicial de pesquisadora. Agradeço à Suzana e Lindomar por eu nunca ter que pedir ajuda pra vocês, pois sempre faziam tudo, antes de eu pedir. Obrigada por exigirem de mim o melhor, e por executarem as análises até a perfeição. Vocês são grandes amigos e grandes pesquisadores. Agradeço ao Prof. Dr. Diogo, por também me orientar durante todo o doutorado. Obrigada pelos ensinamentos e pela fantástica oportunidade de realizar parte das minhas pesquisas em seu laboratório, um lugar maravilhoso. Agradeço aos alunos e professores que pude conhecer de outras Universidades (Universidade de Passo Fundo, Wageningen University e Universidad del Chile), por me ensinarem tanto, e por me mostrarem outras culturas. Agradeço em especial aos professores ix Dr. Geert F. Wiegertjes e Dr. Luiz Carlos Kreutz, pelas oportunidades e ensinamentos e à Karina Schreiner Kirsten, pelos ensinamentos dos desenhos dos primers, análises e interpretações do qPCR. Sou grata à Jaqueline Custódio e Milene Elissa Hata pelos ensinamentos nas extrações de RNA, ao Inácio Assane pelos ensinamentos sobre antibióticos e ao Raphael Barbetta pelos ensinamentos em isolamento de leucócitos. Agradeço aos demais colegas do Laboratório de Microbiologia e Parasitologia de Organismos Aquáticos pelo auxílio nas análises da presente tese e de diversos outros trabalhos que executamos durante meu doutorado. Obrigada pela amizade de todos vocês. Sou grata aos colegas dos Laboratórios de Fisiologia, Genética e Reprodução, e aos professores e funcionários pelo aprendizado diário. Vocês foram a minha família durante o mestrado e doutorado. Sentirei muito a falta de conviver com a alegria de vocês. Agradecimentos à Dra. Vany P. Ferraz (Departamento de Química – UFMG) pelo auxílio com as análises dos óleos essenciais. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. O presente trabalho foi realizado com apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - Brasil (CNPq) - Código de Financiamento 431713/2016-2 e 305007/2016-5. https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1050464817301250#! x RESUMO As enfermidades têm se destacado como um dos principais entraves para o desenvolvimento da aquicultura, e apesar do tambaqui Colossoma macropomum ser a espécie nativa mais produzida na América do Sul, pouco conhecemos sobre as enfermidades que o afetam e como o seu mecanismo imune reage frente às infecções. A septicemia hemorrágica é causada pela bactéria Aeromonas hydrophila, e se destaca como uma das principais enfermidades na aquicultura, principalmente em espécies tropicais. Por isso, confirmamos a patogenicidade de A. hydrophila pelo Postulado de Koch e estabelecemos as doses letais até 80%, estimando a DL50 em 5, 57 x 107 a 1, 41 x 108 UFC/ml. Não recomendamos o verde malaquita como recurso profilático e indicamos ceftriaxona, florfenicol, oxitetracyclina, sulfazotrim e tianfenicol como potenciais antimicrobianos para o controle desta bactéria, mas consideramos os óleos essenciais de cravo Eugenia caryophyllata e canela Cinnamomum zeylanicum como melhores opções para potencial tratamento da bacteriose, com forte atividade inibitória. Descrevemos um perfil leucocitário incomum de severa leucopenia em período agudo de infecção, devido à liberação de armadilhas extracelulares pelos leucócitos (ETosis). ETosis é um mecanismo de suicídio leucocitário, ainda não descrito para a maioria dos peixes, e que pode ser considerado como um dos últimos recursos imunes adotado pelo hospedeiro para tentar conter a infecção. Este mecanismo pode ser visualizado através de uma metodologia de baixo custo e de fácil execução em microscopia eletrônica de varredura, desenvolvida nesta tese. Como os estudos genéticos beneficiam substancialmente o desenvolvimento da criação de uma espécie, a sequência parcial genética de peptídios antimicrobianos (HSP70, lisozima e proteínas do sistema complemento), receptor de citocina e citocinas (IRAK 1, IL-1 e IL-10) foram descritas. Padrões de expressões xi genéticas foram caracterizadas quanto a modulação de cada gene, em resposta às diferentes fases de infecção por A. hydrophila. A modulação das expressões dos genes imunes mostrou- se aumentada em peixes infectados, tanto na fase inicial da infecção (principalmente em torno de 6h e 24h) quanto na fase crônica (7d e 14d). Apenas o gene associado à regulação térmica, HSP70, mostrou-se negativamente modulado em peixes infectados. Destacamos o aumento na expressão dos genes de citocinas e lisozima, evidenciando atividade pró e antiinflamatórias. Porém, o maior destaque é dado para os genes HSP70 e proteínas do sistema complemento: C3 e C4. A modulação dos genes de HSP70 foi afetada negativamente em peixes infectados, sugerindo que peixes afetados por A. hydrophila ficam mais propícios à sensibilidade térmica e às infecções secundárias. Com relação às proteínas do sistema complemento, apesar da regulação aumentada na expressão do gene C4, seguindo a tendência pró-inflamatória, o gene C3 surpreendentemente não foi expresso na maioria dos peixes saudáveis e infectados. Adicionalmente, na análise de do sistema complemento no soro, a ausência de atividade hemolítica corrobora com os resultados de expressão gênica, sugerindo provável deficiência no sistema complemento desta espécie, nas condições testadas. A ausência de dados na literatura e as possíveis razões para a regulação da expressão gênica e associação com doenças de peixes são abordadas nesta tese. Palavras-chaves: aquicultura, bacteriose, imunidade inata, peixe, peixe nativo, septicemia hemorrágica xii ABSTRACT Diseases have emerged as one of the main obstacles to aquaculture development, and although tambaqui Colossoma macropomum is the most produced native species in South America, little is known about the diseases that affect this fish and how its immune mechanism reacts to infection. Hemorrhagic septicemia is caused by the bacterium Aeromonas hydrophila, and stands out as one of the major diseases in aquaculture, especially in tropical species. Therefore, we confirmed the pathogenicity of A. hydrophila by the Koch’s Postulate and established the lethal doses up to 80%, estimating the LD50 at 5.57 x 107 to 1.41 x 108 CFU/ml. We do not recommend malachite green as a prophylactic resource and we recommend ceftriaxone, florfenicol, oxytetracycline, sulphazotrin and thiamphenicol as potential antimicrobials for this bacterium control, but we consider the essential oils of clove Eugenia caryophyllata and cinnamon Cinnamomum zeylanicum as the best options for potential treatment of bacteriosis, with strong inhibitory activity. We describe an unusual leukocyte profile with severe leukopenia during acute infection due to the release of leukocyte extracellular traps (ETosis). ETosis is a mechanism of leukocyte suicide, not described yet for most of fish species, and it can be considered as one of the last immune mechanisms adopted by the host to try to contain the infection. This mechanism can be visualized through a low-cost and of easy-execution methodology, developed in this thesis. As the genetic studies substantially benefit the development of a species farming, the genetic partial sequence of antimicrobial peptides (HSP70, lysozyme and complement system proteins), cytokine receptor and cytokines (IRAK 1, IL-1 and IL-10) were described. The patterns of gene expression were characterized for of each gene in response to the different stages of A. hydrophila infection. The immune gene expression was shown to be increased xiii in infected fish, both in the initial phase of infection (mainly around 6h and 24h) and in the chronic phase (7d and 14d). Only the gene associated with thermal regulation, HSP70, was shown to be down-regulated in infected fish. We highlight the modulation of cytokine and lysozyme genes, evidencing pro and antiinflammatory activities. However, a great prominence is given to the genes related to HSP70 and complement system proteins: C3 and C4. The HSP70 gene was down-regulated in infected fish, suggesting that fish affected by A. hydrophila are more susceptible to thermal sensitivity and secondary infections. Regarding complement system proteins, although C4 gene regulation follows a pro- inflammatory trend, the C3 gene was surprisingly not expressed in most healthy and infected fish. Additionally, in the analysis of the complement system in the serum, the absence of hemolytic activity corroborates with the results of gene expression, suggesting a probable deficiency in the complement system of this species, under the conditions tested. The lack of data in the literature and the possible reasons for the regulation of gene expression and association with fish diseases are addressed in this thesis. Key-words: aquaculture, bacteriosis, fish, hemorrhagic septicemia, innate immunity, native fish. 14 Capítulo 1 1. Revisão bibliográfica 1.1. Aquicultura: cenário atual e tendências para a produção de tambaqui Os últimos dados divulgados pela FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations) em Sofia (2018) demonstram que o continente Americano é o segundo maior produtor mundial de peixes, atrás apenas do continente Asiático (composto por países como a China, que é o maior produtor mundial) (Sofia, 2018). Por isso, se excluirmos as regiões geográficas abrangidas pelo continente Asiático, a América do Sul passa a ser a maior produtora mundial de peixes (Sofia, 2018). E, dentre os países Americanos, o Brasil se destaca como o 13° maior produtor mundial. Ainda, se considerarmos apenas as espécies produzidas em águas continentais, o Brasil passa a ser o 8° maior produtor mundial (Sofia, 2018) e principal produtor do continente Americano (Valladão et al., 2018). A piscicultura no Brasil é favorecida pela diversidade de espécies de peixes, disponibilidade de recursos naturais, condições climáticas propícias para a produção das espécies continentais, além da disponibilidade de insumos em quase todo o país. Nos últimos dados divulgados pelo IBGE (referentes à 2017), o Brasil produziu mais de 485 mil toneladas de peixes no ano, correspondendo quase 70% da produção aquícola. Dentre uma enorme variedade de peixes exóticos e nativos com potencial para a aquicultura, o tambaqui, Colossoma macropomum se destaca por ser o peixe nativo mais produzido no Brasil (Valladão et al., 2018), totalizando 18,2% da piscicultura nacional (IBGE, 2017). No Brasil, espera-se que nos próximos anos, a tendência de crescimento na produção de espécies nativas ultrapasse a de espécies exóticas, assim como ocorreu historicamente em outros países representativos em produção de peixes (Valladão et al., 2018). O tambaqui C. macropomum, descrito como black pacu nas estatísticas da FAO, ou conhecido por cachama em diversos países da América Latina, é um peixe caraciforme, 15 nativo da Bacia Amazônica. Adaptado às águas quentes, é um animal sensível às variações térmicas (Hashimoto et al., 2012; Fernandes et al., 2018; Valladão et al., 2018), mas se destaca quanto ao potencial produtivo devido seu hábito zooplanctófago, fácil reprodução (Moro et al. 2013) e por ser resistente às situações de hipóxia extrema e baixo pH (Wood et al., 2017). Por ter a carne muito apreciada pelos consumidores, este peixe apresenta um alto valor cultural e comercial para diversos países da América do Sul, com destaque para o Brasil, Colômbia, Peru, Venezuela, Bolívia e Equador (Valladão et al., 2018). A produção do tambaqui cresce anualmente no país, com destaque para o estado de Rondônia, que é o maior produtor, seguido do Amazonas, Maranhão, Roraima, Pará e Tocantins, e atualmente, sua criação tem se expandido para outros estados, principalmente aqueles de clima quente, como Norte, Nordeste e Centro-Oeste (IBGE, 2017). Como um fato comum e histórico em diversos países, a tendência futura é de que a produção de peixes nativos ultrapasse a dos peixes exóticos na América do Sul (Valladão et al., 2018), assim como a produção de tambaqui que já ultrapassou a dos ciprinídeos no Brasil e em breve poderá alcançar a produção da tilápia-do-Nilo Oreochromis niloticus. No entanto, com a intensificação da produção do tambaqui, assim como de qualquer outra espécie, ocorre o surgimento de problemas sanitários que podem afetar economicamente a produção, inviabilizando sua comercialização dentro e fora do país. Pesquisadores concordam que o aparecimento de enfermidades infecciosas na aquicultura está frequentemente associado a elevada quantidade de matéria orgânica nos viveiros de produção, decorrente da alta densidade de estocagem e elevado arraçoamento (uso massivo de ração comercial), além de ser facilitado pelo manejo inadequado e estressante. Assim, baseado nos aspectos atuais da produção do tambaqui e as perdas ocasionadas pelas doenças, o conhecimento sobre agentes etiológicos e a relação destes com o hospedeiro se faz necessário. 36 3. Referências Abbas, A.K., Lichtman, A.H., Pillai, S. (2014). Em: Basic immunology: functions and disorders of the immune system. Elsevier Health Sciences, 5th Edition. 352p. Abbas, A.K., Lichtman, A.H., Pillai, S. (2018). Em: Cellular and molecular 37 immunology. Elsevier Health Sciences, 9th Edition. 608p. Abdelhamed, H., Ibrahim, I., Baumgartner, W., Lawrence, M.L., Karsi, A. (2017). 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Por isso, nossos estudos foram baseados na atual necessidade de informações para a criação do tambaqui. Na tese destacamos que o tambaqui é o peixe nativo mais produzido na América do Sul, e que é comum produtores terem problemas de mortalidade em sua produção. Apesar disto, na literatura, não foram encontrados dados que confirmassem a identidade e patogenicidade da Aeromonas neste peixe. O nosso primeiro estudo confirmou, através do cumprimento do Postulado de Koch e estudo de letalidade, que a Aeromonas hydrophila causa doença e septicemia hemorrágica em tambaqui. Além disto, baseado na confirmação da presença desta importante doença para o tambaqui, no primeiro estudo realizamos experimentos para encontrar moléculas promissoras para o controle da aeromonose. Como o uso de substâncias off-label é comum no tratamento de enfermidades na aquicultura, nesta tese, esclarecemos porque o uso de medicamentos deve ser previamente estudado, e mostramos o potencial dos óleos essenciais de plantas medicinais, antimicrobianos e desinfetantes no controle de Aeromonas no tambaqui. Conforme citado ao longo do trabalho, apesar do sistema imune inato dos peixes ser um dos principais mecanismos de proteção contra patógenos, a resposta, que é intrínseca à cada espécie, não foi caracterizada no tambaqui até o momento. Por isso, no segundo estudo, avaliamos a imunidade inata (atividade antimicrobiana humoral e celular) no tambaqui, e os achados em peixes infectados incluíram principalmente uma leucopenia grave. Isto proporcionou novos estudos devido a suspeita da ocorrência da 141 morte celular de leucócitos para liberação de armadilhas extracelulares (ETosis), um mecanismo imune do hospedeiro para contenção da infecção. Ao ser investigado, desenvolvemos uma metodologia adaptada para visualização desta formação de armadilhas extracelulares por leucócitos em microscopia de varredura. Com este segundo estudo, descrevemos o mecanismo de ETosis pela primeira vez em um peixe nativo da América do Sul, e presumimos que este é um dos últimos recursos executados pelo tambaqui para conter a infecção. Evidenciamos que após essa estratégia, ele retorna a produção e liberação de um número elevado de células fagocitárias na circulação periférica. Por fim, no terceiro estudo , estabelecemos os padrões de resposta imune inata do tambaqui, desvendando trechos parciais da sequência de 7 genes imunes chaves, o que poderá auxiliar futuros estudos de expressão gênica para esta espécie. A modulação da expressão gênica foi estabelecida em diferentes fases da infecção por Aeromonas pela primeira vez para este peixe nativo. A partir dos próximos anos, a literatura sobre os peixes nativos será mais robusta e esta tese pode prover subsídios para a formulação de vacinas e tratamentos contra aeromonose na aquicultura, além de prover mais discussão sobre aspectos básicos da imunidade dos peixes sul-americanos abrindo portas para estudos mais aprofundados sobre o suicídio celular e sobre a expressão de genes imunes chaves em diferentes condições.