RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 03/05/2017. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA ANIMAL DEFESA DE DISSERTAÇÃO EFEITO DA COLHEITA FRACIONADA SOBRE A CINÉTICA E VIABILIDADE ESPERMÁTICAS DO SÊMEN REFRIGERADO E CONGELADO DE GARANHÕES. Sidnei Nunes de Oliveira Botucatu – SP Maio/2016 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA ANIMAL EFEITO DA COLHEITA FRACIONADA SOBRE A CINÉTICA E VIABILIDADE ESPERMÁTICAS DO SÊMEN REFRIGERADO E CONGELADO DE GARANHÕES. Sidnei Nunes de Oliveira Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - UNESP, Campus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia Animal, Área de Reprodução Animal. Orientador: Prof. Dr. Frederico Ozanam Papa Botucatu – SP Maio/2016 Nome do autor: Sidnei Nunes de Oliveira Título: EFEITO DA COLHEITA FRACIONADA SOBRE A CINÉTICA E VIABILIDADE ESPERMÁTICAS DO SÊMEN REFRIGERADO E CONGELADO DE GARANHÕES. BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Frederico Ozanam Papa Presidente e orientador Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ – UNESP – Botucatu /SP Prof. Dr. Marco Antonio Alvarenga Membro Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ – UNESP – Botucatu/SP Dr. Marcio Teoro do Carmo Membro Veterinário Autônomo, Botucatu/SP Data da Defesa: 03 de maio de 2016. SUMÁRIO CAPÍTULO I 1. INTRODUÇÃO............................................................................................... 12 2. REVISÃO DE LITERATURA........................................................................ 13 2.1. Anatomia e fisiologia do sistema genital do garanhão................................. 13 2.2. Espermatogênese.......................................................................................... 16 2.3. Fisiologia da ejaculação................................................................................ 16 2.4. Produção e composição do plasma seminal.................................................. 19 2.4.1. Enzimas...................................................................................................... 20 2.4.2. Proteínas.................................................................................................... 21 2.4.3. Eletrólitos................................................................................................... 22 2.4.4. Hormônios................................................................................................. 23 2.5. Efeito do plasma seminal na criopreservação do sêmen equino................... 24 2.6. Principais métodos de colheita do sêmen equino......................................... 29 2.7. Colheita fracionada do sêmen equino........................................................... 30 2.8. Benefício da colheita fracionada do sêmen equino...................................... 32 REFERÊNCIAS.................................................................................................. 35 HIPÓTESE.......................................................................................................... 46 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.............................................................................. 46 CAPÍTULO II ARTIGO I - COLHEITA FRACIONADA E SEUS PRINCIPAIS BENEFÍCIOS NA CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE GARANHÕES... 48 ARTIGO II - INFLUÊNCIA DE DIFERENTES TÉCNICAS DE COLHEITA FRACIONADA DO SÊMEN EQUINO NA RECUPERAÇÃO ESPERMÁTICA: DESCRIÇÃO E MODIFICAÇÃO DE UM MÉTODO........................................................................................................... 57 ARTIGO III - EFEITO DO PLASMA SEMINAL NAS DIFERENTES FRAÇÕES DO EJACULADO EQUINO SOBRE OS PARÂMETROS ESPERMÁTICOS AVALIADOS IN VITRO APÓS O PROCESSO DE CRIOPRESERVAÇÃO................................................................................. 80 AGRADECIMENTO Ao grande Deus pela força espiritual que me rege e por iluminar os meus caminhos. A minha família, meu porto seguro, meu pai Sebastião, minha mãe Angelita, minha irmã Alane Kelly, a minha avó Mariazinha, meus Tios Alex, Amarildo, Sônia, Norma e Sonilde “in memoria”, mesmo estando distantes suportando as saudades, são eles meus grandes incentivadores, sem eles todas as minhas conquistas não fariam sentido. Ao grande mestre idealizador e incentivador deste projeto, o Prof. Papa que me acolheu durante todo o mestrado e juntos desenvolvemos um trabalho em equipe. Aos professores Nereu “Néris” pelos ensinamentos e pelos abraços de apoio durante esta etapa, Marco Alvarenga pelas oportunidades, considerações e conselhos, ao Zé Dell’Aqua pelas horas de discussão e incentivo e a todos os outros professores do Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária. Sou grato aos funcionários do departamento pelo apoio no dia a dia a Camila Dell’Aqua, Edvaldo, D. Raquel, Edilson, Felipe, meu muito obrigado. Aos velhos amigos de longas jornadas Luis, Endrigo, Bertiny e aos outros que aqui ganhei durante a residência e no mestrado em especial ao Felipe Dalanezi, Luiz Roberto Jr, Felipe Hartwig, João Alexandre, Rafaella Hayashi, Patricia Papa, Marcio Teoro. À Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – Botucatu-SP, pela oportunidade de cursar o Mestrado. À Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa de estudo concedida para a realização do projeto (Processo FAPESP: 2014/00354-0). Agradeço também aos Haras parceiro que contribuíram para a realização deste projeto: Haras Itapuã, Haras Ogar, Equicenter Central de Reprodução e a Central Lub Breeding. Assim finalizo agradecendo a todos aqueles que de alguma forma contribuíram em mais uma etapa da minha história meu muito obrigado. LISTA DE ABREVIAÇÕES AST aspartato amino transferase PS plasma seminal BG β-glucuronidase RAP espermatozoides rápido cm Centímetro SPTZ espermatozoides Ca ++ Cálcio VA vagina artificial Cl - Cloretos VAP velocidade de trajeto CRIP proteína rica em cisteína VCL velocidade curvilínea Cu + Cobre VSL velocidade linear DNA ácido desoxirribonucleico UFC unidade formadora de colônias ERO espécie reativa de oxigênio UI unidades internacionais FA fosfatase alcalina Zn + zinco FAC fosfatase ácida [ ] concentração Fe + Ferro Fn-2 fibronectína tipo II GGT γ-glutamil transferase G1 grupo 1 G2 grupo 2 HSP proteína do plasma seminal equino IM integridade de membrana K + Potássio kDa kilo Dalton LDH lactato desidrogenase Mg + Magnésio mL Mililitro MP motilidade espermática progressiva MT motilidade espermática total Na + Sódio PGE2 prostaglandina E2 Pi fósforo inorgânico RESUMO OLIVEIRA, S.N. EFEITO DA COLHEITA FRACIONADA SOBRE A CINÉTICA E VIABILIDADE ESPERMÁTICAS DO SÊMEN REFRIGERADO E CONGELADO DE GARANHÕES. Botucatu – SP. 2016, p.103. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. O pênis é o órgão copulador e no garanhão é classificado como sendo músculo cavernoso, em que os espaços cavernosos são preenchidos de sangue durante a ereção. Nos testículos que ocorre a produção espermática, que são transportados pela rete testis até o epidídimo, onde sofrerão maturação, capacidade fertilizante e armazenados até a ejaculação. As glândulas sexuais acessórias são responsáveis pelos fluidos expelidos durante a ejaculação, denominado de plasma seminal, que se misturam às células espermáticas e formam o ejaculado. Cada uma dessas glândulas são responsáveis por uma determinada secreção que vai direcionar o ejaculado equino a ser dividido em três distintas frações: fração pré-espermática, produzida pelas glândulas bulbouretrais e próstata; fração rica em espermatozoides, produzida pelas secreções do epidídimo e por líquidos das ampolas dos ductos deferentes; fração pós-espermática ou fração pobre, formada por espermatozoides remanescentes no canal uretral e líquidos produzidos pelas vesículas seminais, o gel. Durante o processo fisiológico de cópula, ocorrem vários eventos denominados de ereção, em que o garanhão se excita por estímulos, emissão que caracteriza-se pela liberação de espermatozoides dentro da uretra pélvica, seguido da ejaculação com a expulsão do sêmen, o relaxamento e recolhimento do pênis. Normalmente, as colheitas de sêmen equino são realizadas de forma convencional, com vagina artificial fechada, em que todas as frações se misturam. Cada garanhão possui características individuais com relação à manutenção das células espermáticas durante a criopreservação, essas características podem estar relacionadas à produção do plasma seminal, assim como os vários componentes que os compõem. Sabe-se que existe um efeito deletério desempenhado pelos componentes do plasma seminal produzido principalmente pelas vesículas seminais, aos espermatozoides durante o processo de criopreservação, porém, esses fatores ainda são desconhecidos. Várias hipóteses são sugeridas, tais como, a redução na produção de lipídeos e os tipos de proteínas e íons presentes em cada uma das frações do ejaculado. Sabendo disso, a colheita fracionada pode trazer benefícios aos espermatozoides, de forma que as primeiras frações não tenham contato com o plasma seminal produzido pelas vesículas seminais. O presente trabalho objetiva revisar a colheita fracionada de sêmen em garanhões, assim como, seus benefícios para as células espermáticas que serão submetidas à criopreservação. Palavras-chave: equino, refrigeração, congelação, colheita de sêmen. ABSTRACT OLIVEIRA, S.N. EFFECT THE FRACTIONATED COLLECTION ABOUT KINETIC AND SPERM VIABILITY THE SPERM COOLED AND FROZEN STALLION. Botucatu – SP. 2016 p.103. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. The penis is the copulatory organ and in the stallion it is classified as cavernous muscle and the cavernous spaces are filled with blood during erection. In the testicles occurs sperm production, that are transported through the rete testis to the epididymis, where they will suffer maturation, fertilizer capacity and will be stored until ejaculation. The accessory sex glands are responsible for the expelled fluids during ejaculation, named seminal plasma that are mixed with sperm cells and form the ejaculate. Each of these glands are responsible for a certain secretion that will divide equine semen into three distinct fractions: pre-sperm fraction, produced by the prostate and bulbourethral glands; rich fraction in sperm, produced by epididymal secretions and liquids from ampoules of the vas deferens; post-sperm fraction or poor fraction, consisting of sperm remaining in the urethral canal and liquids produced by the seminal vesicles, the gel. During the physiological process of mating, several events occur named erection, in which the stud is excited by stimuli emission which is characterized by the release of sperm into the pelvic urethra followed by ejaculation with the expulsion of semen, relaxation and gathering the penis. Typically, horse semen collections are performed in the conventional way, with a closed artificial vagina, where all the fractions are mixed. Each stud has individual characteristics related to the maintenance of sperm cells during the cryopreservation, these characteristics may be related to production of seminal plasma and to the components that form it as well. What is known is that there is a negative effect played by the seminal plasma components mainly produced by the seminal vesicles, to the sperm during cryopreservation process, however, these factors are still unknown. Several hypotheses are suggested such as the production’s reduction of lipids and proteins and the types of ions present in each fraction of the ejaculate. Knowing this, the fractional collection may be beneficial to sperm, considering that the first fractions do not have contact with seminal plasma produced by the seminal vesicles. This work aims to review the semen fraction harvest in stallions, as well as its benefits for the sperm cells to be submitted to cryopreservation. Key-words: Equine, cooler, freezer, collection sperm. CAPÍTULO I 12 1. INTRODUÇÃO A equinocultura brasileira possui o quarto maior rebanho mundial, com 5,8 milhões de cabeças, ficando atrás dos Estados Unidos, China e México, seu faturamento anual fica em torno de R$ 7,5 bilhões, gerando 642,5 mil empregos diretos e US$ 27,4 milhões em exportação (GUERRA, 2010). Tendo em vista este crescente mercado, faz- se necessário o uso das biotecnologias reprodutivas relacionadas a fêmeas e também aos machos: inseminação artificial, transferência de embrião, transferência intrafalopiana de gametas, injeção intracitoplasmática de espermatozoides e refrigeração de sêmen e congelação de sêmen. Dentre as biotécnicas citadas, a inseminação artificial vem se tornando um pilar de sustentação e evolução na criação de equinos, tendo em vista que seu uso traz grandes benefícios na difusão do material genético de animais classificados como superiores, dentre eles, campeões em diversas modalidades de competição equestre. Apesar do avanço no uso das biotécnicas reprodutivas, ainda há grandes desafios para melhorar os índices reprodutivos na equinocultura, principalmente quando estão relacionadas à criopreservação das células espermáticas em garanhões. Estudos realizados indicam que em alguns garanhões, o plasma seminal (PS) acarreta danos aos espermatozoides, culminando em prejuízos na qualidade espermática durante a refrigeração e a congelação (KARESKOSKI; KATILA, 2008), podendo diminuir os índices de fertilidade. Embora o plasma seminal possua um efeito negativo durante a criopreservação, existem também evidências do seu papel protetor às células espermáticas (KARESKOSKI et al., 2006), dentre elas a prevenção da capacitação prematura que pode ser induzida durante o processo de congelação e descongelação (SCHEMBRI et al., 2002), afirmando que, a presença de pequenas quantidades de PS parece ser necessária. Segundo Alghamdi et al. (2002), a motilidade espermática é maior quando a proporção de PS é ≤ 5% antes da refrigeração e congelação, quando comparada a amostras com proporções entre 10-30% no volume do ejaculado. Por outro lado, Jasko et al. (1992) demonstram que a proporção ideal de PS no ejaculado seja em torno de 5 a 20%, sem que haja um efeito prejudicial durante a criopreservação. Portanto, a centrifugação para retirada do PS faz-se necessária, principalmente para 13 aqueles garanhões cujos ejaculados possuem baixa tolerância à criopreservação (KARESKOSKI; KATILA, 2008). Assim, pressupõe-se que exista uma variação individual do efeito do PS entre garanhões (AKCAY et al., 2006) e da sua produção, existindo variações na composição do PS nas diferentes frações do ejaculado (KATILA et al., 2004). Contudo, em estudos realizados, demonstrou-se que a fração rica em espermatozoides do ejaculado possui uma tolerância maior a criopreservação quando comparada às demais frações (SIEME et al., 2004; KARESKOSKI et al., 2006). Durante a colheita de sêmen de forma convencional, utilizando-se as vaginas artificiais modelo Missouri, Nishikawa, Hannover, Colorado ou Botucatu, todas as frações do ejaculado se misturam e não há possibilidade de separação destas. Diante disto, Varner et al. (1987) sugerem que a colheita fracionada poderá reduzir o efeito deletério do PS ao colher apenas a fração rica em espermatozoides do ejaculado, correspondente a 75% do total de espermatozoides. Desta forma, uma alternativa para minimizar as injúrias provocadas pelo PS em garanhões que produzem sêmen com tolerância limitada à criopreservação, seria a colheita de sêmen fracionada, possibilitando, com isso, identificar as diferentes frações e separar a fração espermática com maior percentual de espermatozoides em menor contato com o PS. O presente trabalho tem por objetivo revisar a colheita fracionada de sêmen em garanhões, assim como, seus benefícios para as células espermáticas que serão submetidas à criopreservação. 35 REFERÊNCIAS AITKEN, R. J.; BAKER, M. A. Oxidative stress and male reproductive biology. Reproduction Fertility and Development, v.16, p.581–588, 2004. AKCAY, E.; REILAS, T.; ANDERSSON, M.; KATILA, T. Effect of seminal plasma fractions on sperm survival after cooled storage. Journal of Veterinary Medicine, v.53 p.481-485, 2006. ALGHAMDI, A. S.; TROEDSSON, M. H.; XUE, J. L.; CRABO, B. G. 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