UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PESQUISA MOLECULAR DE FUNGOS PATOGÊNICOS EM QUIRÓPTEROS DA REGIÃO DE BOTUCATU-SP GISELLE SOUZA DA PAZ Botucatu – SP 2017 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PESQUISA MOLECULAR DE FUNGOS PATOGÊNICOS EM QUIRÓPTEROS DA REGIÃO DE BOTUCATU-SP GISELLE SOUZA DA PAZ Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária para obtenção do título de Mestre. Orientador: Prof. Dr. Helio Langoni Co-Orientadora: Drª. Virgínia Bodelão Richini-Pereira ii iii Nome do Autor: Giselle Souza da Paz Título: PESQUISA MOLECULAR DE FUNGOS PATOGÊNICOS EM QUIRÓPTEROS DA REGIÃO DE BOTUCATU-SP COMISSÃO EXAMINADORA Prof. Dr. Helio Langoni Presidente e Orientador Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública FMVZ – UNESP - Botucatu Prof. Dr. Silvio Alencar Marques Membro Departamento de Dermatologia e Radioterapia FMB – UNESP - Botucatu Prof. Ass. Drª Sandra Moraes de Gimenes Bosco Membro Departamento de Microbiologia e Imunologia IBB – UNESP – Botucatu Data da Defesa: 16 de Fevereiro de 2017. iv DEDICATÓRIA Dedico este trabalho a minha família, que mesmo longe, sempre me deram força para não desistir. v AGRADECIMENTOS Agradeço a minha família (Juliana, tia; Maria Raimunda, avó; Pedro, pai; Juliete, irmã; e Rodrigo, irmão) que mesmo desconhecendo os caminhos que estava traçando em minha vida profissional, sempre me apoiaram de forma incondicional. Agradeço ao meu orientador Helio Langoni, pela confiança e oportunidade de desenvolver este projeto, pelas orientações e auxílio em todos os momentos. Agradeço e minha co-orientadora Virgínia Bodelão Richini-Pereira e a Profª Sandra Moraes de Gimenes Bosco, pelo grande auxílio ao desenvolver está pesquisa, agradeço por sempre estarem dispostas a me ajudarem em todos os momentos. Obrigado aos integrantes do NUPEZO (Núcleo de Pesquisa em Zoonoses) e NUPEMAS (Núcleo de Pesquisa em Mastites) pelo grande apoio durante estes dois anos de trabalho. Agradeço a FAPESP, que nos apoio financeiramente no desenvolvimento desta pesquisa, com aprovações de bolsa de mestrado, iniciação científica, treinamento técnico e auxilio a pesquisa. Agradeço aos animais utilizados nesta pesquisa que nos ofertaram suas vidas para desenvolvermos conhecimento científico e assim ter a possibilidade de desenvolvermos medidas adequadas de prevenção de doenças para o bem-estar animal e humano. Agradeço ao meu namorado, Vinícius, e sua família, Odete e Mariel Boaro, por sempre me apoiarem. Por terem me acolhido da melhor forma possível em Botucatu, e me proporcionarem ótimos momentos juntos. Agradeço a todos os meus amigos da faculdade, de Igarapé-açu, de Botucatu, de Castanhal, que direta ou indiretamente me ajudaram a realizar este trabalho e tiveram do meu lado durantes estes anos. Não vou citar nomes, para não causar indelicadeza de esquecer alguém. Muito obrigada a todos! vi LISTA DE TABELAS Tabela 1 - A list of primers described in the literature for use in PCR and nested PCR. The table shows the microorganism, size of the amplicon in base pairs, sequence, cycling profile, and references.......................................................50 Tabela 2 - Distribution of bats received at the Zoonosis Diagnosis Center, FMVZ- UNESP, in the city of Botucatu, SP, from April 2015 to May 2016, by municipalities where they were found; Botucatu, 2016.................................................................................................................51 Tabela 3- Frequency of bats positive for Histoplasma capsulatum, Cryptococcus spp., or Paracoccidioides brasiliensis according to nested PCR and microbiological culture, along with some other characteristics; Botucatu, 2016.................................................................................................................52 vii LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Histoplasma capsulatum isolated from bats in the municipality of Botucatu, São Paulo, Brazil. (A) The macroscopic aspect of mycelia of H. capsulatum recovered from the spleen of Molossus molossus after 30 days at 26C; (B) The yeast form of H. capsulatum after 15 days in 5% bovine blood agar incubated at 37C; (C) The microscopic aspect of mycelia on a microculture slide stained with the lactophenol cotton blue, 100 magnification; (D) Microscopic of yeast cells of H. capsulatum stained with lactophenol cotton blue, 100 magnification...................................................................................................................42 Figura 2 - Distribution of the collection sites for bats positive for H. capsulatum, Cryptococcus spp., and P. brasiliensis in the municipality of Botucatu, SP..............……………………………………………………………………………44 viii SUMÁRIO CAPÍTULO 1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 11 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................. 13 CAPÍTULO 2 – TRABALHO CIENTÍFICO ................................................................. 34 ABSTRACT .......................................................................................................... 35 CAPÍTULO 3 CONCLUSÕES GERAIS ..................................................................................... 58 BIBLIOGRAFIA ................................................................................................... 59 ix PAZ, G.S. Pesquisa molecular de fungos patogênicos em quirópteros da região de Botucatu-SP. Botucatu, 2017. 72p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista. RESUMO Atualmente dentre as doenças emergentes a maioria são zoonoses, e os morcegos desempenham papel importante como fonte de infecção e transmissão de agentes infecciosos. Histoplasmose e criptococose são doenças fúngicas relatadas em diversas espécies animais, podendo seus agentes serem isolados de grutas, cavernas, solo e fezes de animais. Paracoccidioidomicose, doença fúngica mais importante no Brasil, acomete principalmente populações de baixa renda, na zona rural e já foi relatada em animais silvestres e domésticos. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi realizar a detecção molecular dos fungos Histoplasma capsulatum, Cryptococcus spp. e Paracoccidioides brasiliensis em quirópteros no município de Botucatu e região, SP. O delineamento do estudo foi de série de casos, a partir de morcegos recolhidos e enviados pela Vigilância Epidemiológica municipal de 12 cidades da região Centro- Oeste de São Paulo para o diagnóstico de raiva, no período de abril de 2015 a maio de 2016. Foram coletados pulmão, baço, fígado e intestino de 172 quirópteros, e avaliados pelas técnicas de nested-PCR e cultivo microbiológico. A prevalência encontrada para H. capsulatum foi de 8,14% (14/172), com um morcego positivo somente no cultivo microbiológico, 12 na técnica de nested-PCR, e um animal positivo em ambos os métodos. Dois morcegos foram positivos para Cryptococcus spp. e dois para P. brasiliensis pela técnica de nested-PCR. Como auxílio do software Autocad ® foi realizado georreferenciamento dos pontos de recolhimento dos animais, verificando quirópteros positivos em escolas, praças, residências e hospitais. Conclui-se que a presença de morcegos positivos para fungos patogênicos em áreas urbanas, é um risco para a saúde pública, visto que estes animais podem favorecer a manutenção e transmissão de patógenos em ambientes caseiros. Medidas de manejo ambiental devem ser orientadas a população pelo Serviço de Vigilância Epidemiológica Municipal, visando diminuir a população de morcegos em ambientes domésticos e minimizar os riscos de transmissão de fungos patogênicos. Palavras-chave: Fungos, morcegos, micoses sistêmicas, nested-PCR. x PAZ, G.S. Research molecular of pathogenic fungi in bats from Botucatu region. Botucatu, 2017. 72p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista. ABSTRACT Currently, among the emerging diseases, most are zoonosis, and baths play an important role as source of infection and transmission of infectious agents. Histoplasmosis, criptococcosis and paracoccidioidomicosis are fungal diseases reported in several animal species, and their agents can be isolated in grottos, caverns, soils and feces of animals. Paracoccidioidomycosis, the most important fungal disease in Brazil, affects mainly low-income populations in rural areas and has been reported in wild and domestic animals. Thus, the objective of the present study was performing the molecular detection of the fungi Histoplasma capsulatum, Cryptococcus spp. and Paracoccidioides brasiliensis in bats from the city of Botucatu and region, state of São Paulo.The study was delineated with a series of cases, from bats collected and sent by the Municipal Epidemiologic Surveillance of 12 cities from the Midwest region of São Paulo for the rabies diagnosis, within the time period from April 2015 to May 2016. Lung, spleen, liver and intestine were collected from 172 bats and assessed by nested- PCR and microbiological cultive techniques.The prevalence found for H. capsulatum was 8.14% (14/172), with one positive bath only by culturing the fungus, 12 in the nested-PCR technique and a positive animal in both methods. Two bats were positive for Cryptococcus spp. and two for P. brasiliensis by nested-PCR. With the aid of Autocad ® software, the georeferencing of the animals‟collection spots was performed, verifying positive bats in schools, squares, residences and hospitals. We conclude that the presence of positive baths for pathogenic fungi in urban areas is a risk to public health, since these animals can help on the maintenance and transmission of pathogens in domestic environments. Environmental management measures must be conducted to the population by the Municipal Service of Epidemiologic Surveillance, with the purpose of decreasing the baths population in domestic environments and minimizing the risk of transmitting pathogenic fungi. Key-words: Fungi, bats, systemic mycoses, nested-PCR. 11 INTRODUÇÃO Os morcegos pertencem a Ordem Chiroptera, com dezoito famílias, 202 gêneros e 1120 espécies, sendo considerado um dos grupos de mamíferos mais diversificados do mundo. No Brasil são conhecidas nove famílias: Emballonuridae, Phyllostomidae, Mormoopidae, Noctilionidae, Furipteridae, Thyropteridae, Natalidae, Molossidae e Vespertilionidae, distribuídas em 64 gêneros e 167 espécies (REIS et al., 2007). A presença destes animais no ambiente beneficia os seres humanos em muitos aspectos, tornando os morcegos membros essenciais do ecossistema global. Eles estão envolvidos na dispersão de sementes, na atividade de polinização, na predação de insetos noturnos, incluindo pragas urbanas. Além disso, o guano rico em nitrogênio pode ser utilizado como fertilizante biológico (ALLOCATI et al., 2016). Atualmente, dentre as doenças emergentes a maioria são zoonoses, e os quirópteros desempenham papel importante como fonte de infecção e transmissão de agentes infecciosos (HANCE et al., 2006). Devido às suas características sociais, biológicas e imunológicas especiais, os morcegos fornecem nichos exclusivos para muitos micro- organismos co-evoluirem (HUI-JU et al., 2015). Os fungos representam uma classe importante entre os micro-organismos causadores de doenças infecciosas em todo o mundo. Nos últimos anos houve um aumento crescente da frequência e gravidade das micoses, impulsionado por dois motivos principais: a utilização de imunossupressores ou quimioterapia no tratamento de doenças não infecciosas, como câncer, e a epidemia global por HIV/Aids (BYRNES et al., 2011; KOZEL e WICKES, 2014). Vários fungos patogênicos já foram isolados em morcegos no Brasil como, Exophiala dermatitidis em Manaus (REIS, 1982), Coccidioides posadasii no Ceará (CORDEIRO et al., 2012), Histoplasma capsulatum em São Paulo (DIAS et al., 2011), Aspergillus spp., Microsporum spp., Penicillium spp., Tricophyton spp. Fusarium spp., Rhodotorula spp., Candida spp. e Cryptococcus spp. no Estado de São Paulo (TENCATE et al., 2012). 12 Por habitarem cavernas, grutas, forros de casas e viverem em grandes grupos, os morcegos apresentam maiores chances de entrar em contato com fungos patogênicos (TENCATE et al., 2012) dentre eles Criptococcus spp. que já foi isolado em cavernas, ocos de árvores e casas abandonadas habitados por morcegos (LAZÉRA et al., 1993; MONTAGNA et al., 2003), Histoplasma capsulatum isolado em diferentes espécies quirópteros (DIAS et al., 2011; VELOSO et al., 2014; GONZÁLEZ-GONZÁLEZ et al., 2014) e P. brasilensis foi isolado naturalmente em três morcegos frugívoros na Colômbia (GROSE & TRAMSITT, 1965). Estes animais por apresentarem hábitat silvestre e urbano, atuam como propagadores de esporos e leveduras no meio ambiente. Desta forma, faz-se necessário a investigação epidemiológica do envolvimento da espécie como possível reservatório e fonte de infecção de fungos patogênicos para humanos e animais em áreas domiciliares de Botucatu e região. 13 REVISÃO DE LITERATURA HISTOPLASMOSE A histoplasmose é uma micose pulmonar primária, causada pela inalação de conídios do fungo Histoplasma capsulatum. A doença foi observada pela primeira vez no Panamá em 1906, pelo patologista americano Samuel Taylor Darling. H. capsulatum é um ascomiceto, que possui reprodução sexuada e haplóide denominada de Ajellomyces capsulatus na fase teleomorfa e H. capsulatum na fase assexuada ou anamorfa (LACAZ et al., 2002). Acreditava-se que H. capsulatum era composto somente por três variedades: var. capsulatum (patógeno humano no Novo Mundo), var. duboisii (patógeno humano Africano) e var. farciminosum (um patógeno de cavalo no Velho Mundo). No entanto, estudos recentes demonstraram que Histoplasma capsulatum é um complexo de oito clados geograficamente distribuídos em: Austrália, Holanda, Eurásia, América do Norte classes 1 e 2 (NAm 1 e NAm 2), América Latina grupos A e B (LAm A e LAm B) e África (KASUGA et al., 2003; THEODORO et al., 2013; TEIXEIRA et al., 2016). H. capsulatum é um fungo dimórfico, que além de ser uma característica fundamental para sua caracterização, é um importante fator de virulência (CRUZ, 2010). No ambiente apresenta a forma saprofíta, e quando cultivado em meio ágar sabouraud- dextrose em temperatura de 25 a 30º C forma colônias variando na cor branca a castanho. Dois tipos de conídios são formados: macroconídios ou conídios tuberculados que medem de 8 a 15 µm de diâmetro e possuem uma parede grossa com projeções distintas na superfície; e os microconídios que são pequenas estruturas lisas, medindo de 2 a 4 µm de diâmetro, caracterizando a forma infecciosa. In vitro a 37° C e nos tecidos, o organismo converte-se para a fase leveduriforme que é composto por pequenas leveduras com brotamento oval medindo de 2-4 µm, sendo encontrados dentro e fora dos macrófagos (KAUFFMAN, 2007). O habitat natural do fungo H. capsulatum é o solo, no entanto, também pode ser encontrado em ocos de árvores, construções abandonadas, forros de casas, cavernas e galinheiros. Excrementos de aves e morcegos favorecem o crescimento e manutenção do 14 fungo no solo, permanecendo viável por até 4 meses (SILVA e BOSCO, 2016). Atividades que perturbam esses locais estão associadas com a exposição ao H. capsulatum, pois correntes de ar podem carrear os conídios por quilômetros, e expor até indivíduos que não entraram em contato com locais contaminados (WHEAT et al., 2007). A contaminação do ar por conídios de H. capsulatum é considerado um fator de risco epidemiológico para novos casos de histoplasmose em viajantes, como descrito após três pesquisadores adquiriram a doença ao realizarem coleta de material em área próxima a entrada de cavernas, no entanto, sem adentrarem no local (JÜLG et al., 2008). Após o isolamento de H. capsulatum em quirópteros demonstrou-se a participação efetiva dos morcegos na disseminação do fungo no ambiente (AJELLO et al., 1962; SCHMIDT et al., 1973), pois auxiliam na dispersão do fungo por meio das fezes (SILVA e BOSCO, 2016). Em estudo realizado em São Paulo foram capturados 2.427 morcegos com isolamento de H. capsulatum em 87 animais após cultivo em ágar de infusão de cérebro- coração com cloranfenicol (DIAS et al., 2011). Por técnicas moleculares foram detectadas 25,3% de amostras de pulmão positivas para H. capsulatum do total de 249 morcegos provenientes do Mato Grosso e Rio Grande do Sul (VELOSO et al., 2014). Em pesquisa realizada em 122 pulmões de morcegos provenientes da Guiana Francesa, Argentina e México detectou-se 45,1%dos animais positivos pela nested-PCR (GONZÁLEZ- GONZÁLEZ et al., 2014). A histoplasmose é uma micose cosmopolita que apresenta alta endemicidade em algumas regiões, como Centro-Oeste e Sudeste dos Estados Unidos. Na América Latina, os países que apresentam as maiores prevalências são Venezuela, Equador, Brasil, Paraguai, Uruguai e Argentina. No Brasil, as áreas endêmicas estão localizadas no Centro-Oeste e partes do Sudeste do país, onde a prevalência varia de 4,4 a 63,1% e 3,0 a 93,2%, respectivamente (GUIMARÃES et al., 2006). Diversos surtos já foram relatados em cavernas frequentadas por turistas e locais desprotegidos que podem servir de abrigo para morcegos (SUZAKI et al., 1995; JÜLQ et al., 2008; SILVA et al., 2016). No Brasil durante os anos de 1958 a 2003 foram descritas 15 24 microepidemias de histoplasmose, sendo 15 no estado do Rio Janeiro. Segundo investigações epidemiológicas sete foram relacionadas com contaminação em grutas/cavernas com presença de morcegos ou guano, cinco em minas abandonadas, um relacionado a morcegos em oco de árvores, um com morcegos em chaminés e um com morcegos em porão (UNIS et al., 2005). Nos Estados Unidos a histoplasmose é a micose mais endêmica do país. Em estudo retrospectivo realizado entre os anos de 1938 a 2013 foram identificados 105 surtos envolvendo 2.850 casos, com média de 27 casos por surto. Em avaliação epidemiológica verificou-se que a presença de morcegos (ou fezes de morcego) foi relatada em 23% dos surtos; presença de aves ou excrementos destas em 56%, presença de qualquer ave ou morcego em 77% dos episódios e a presença de aves e morcegos em 2% dos surtos (BENEDICT e MODY, 2016). A histoplasmose é considerada doença de risco ocupacional, e dentre os surtos ocorridos nos EUA no período de 1938 a 2013 observou-se que 33,3% foram relacionados com o trabalho e a presença de aves, morcegos ou excrementos foram relatadas em 86% dos surtos relacionados com a ocupação (BENEDICT e MODY, 2016). Segundo Lenhart et al. (2005) as ocupações com os maiores riscos de exposição a conídios de H. capsulatum são: inspetor de ponte ou pintor, limpador de chaminé, trabalhador da construção e/ demolição civil, agricultor, jardineiro, instalador de aquecimento e ar condicionado, técnico de laboratório de microbiologia, trabalhador de controle de pragas, restaurador de edifícios históricos ou abandonados, carpinteiro e espeleólogos. A infecção pelo H. capsulatum ocorre quando são inaladas as formas infectantes do fungo, denominadas microconídeos, formados durante a fase micelial. Nos pulmões, estes são fagocitados e no interior dos macrófagos alveolares converte-se para a fase de levedura, sobrevivendo nas primeiras semanas (KAUFFMAN, 2009). O macrófago é responsável pela propagação da levedura para os nódulos linfáticos e subsequente disseminação hemática em todo o sistema fagocítico mononuclear. Somente após algumas semanas, quando a imunidade específica mediada por células se desenvolve, as células T são 16 sensibilizadas, ativando os macrófagos e eliminando o micro-organismo (KAFFMAN, 2006). A extensão da doença é determinada pela quantidade de conídios inalada e a resposta imunitária do hospedeiro frente às formas infectantes do agente (KAFFMAN, 2006). É extremamente comum a exposição ao H. capsulatum em pessoas e animais que vivem em áreas de endêmicas, no entanto a infecção sintomática ocorre em apenas 1% dos indivíduos. A grande maioria das pessoas infectadas apresenta quadro assintomático ou desenvolvem uma doença muito suave que dificilmente é reconhecida como histoplasmose (KAUFFMAN, 2007). Nos humanos, a enfermidade pode ocorrer apresentando três formas clínicas: i) aguda disseminada que além do comprometimento do pulmão, pode-se desenvolver esplenomegalia, hepatomegalia, anemia, leucopenia e morte; ii) forma disseminada crônica, que normalmente ocorre em pacientes portadores de doenças crônicas, que realizam tratamentos com fármacos imunossupressores, podendo comprometer o pulmão e outros órgãos, causando febre, anemia, pneumonia, hepatite, meningite, úlceras na boca, língua, nariz e laringe; iii) forma pulmonar crônica, que apresenta sinais clínicos semelhantes à tuberculose, e ocorre em pacientes portadores de outras doenças pulmonares (CRUZ, 2010). Nos animais a doença é descrita principalmente em equinos, cães e gatos, e alguns casos em suínos, bovinos e camelídeos (SILVA e BOSCO, 2016). Em cães e gatos a enfermidade é mais frequente em animais com menos de quatro anos, ocorrendo na maioria dos casos infecção subclínica. Nos gatos a infecção mantem-se exclusivamente a nível pulmonar, mas em alguns casos pode comprometer o fígado, medula óssea, baço e linfonodos, a forma cutânea é rara. Nos cães, a forma gastrintestinal é a mais comum, mas alterações pulmonares podem ocorrer, apresentando dispnéia, tosse e sibilos. O prognóstico para cães com histoplasmose pulmonar é de razoável a bom. Já para cães com histoplasmose disseminada e para todas as formas da doença em gatos, o prognóstico é de reservado a grave (FERREIRA et al., 2007). 17 O diagnóstico da histoplamose pode ser feito por cultivo de tecidos ou fluidos corporais em ágar sabouraud-dextrose com clorafenicol ou ágar Mycosel ® , incubados a 25° C permitindo o crescimento da fase micelial do fungo (SILVA et al., 2016). Um teste definitivo para confirmar o diagnóstico deve sempre ser realizado, pois fungos pertencentes aos gêneros Sepedonium e Rinospora também formam macroconídios tuberculados semelhantes ao H. capsulatum (KAUFFMAN, 2007). Testes de confirmação incluem o teste comercial H. capsulatum Accu Probe (Gen-Probe, Inc., San Diego, Calif.), testes de exoantígeno, e conversão do micélio a levedura induzida pela temperatura (VILLAMIL et al., 2003). No entanto, estes procedimentos são demorados e apresentam baixa sensibilidade (GUIMARÃES et al., 2006). A utilização de colorações especiais, tais como PAS (Ácido Periódico de Shiff), base de prata (Gomori-Grocott) ou coloração de Gram destacam as formas de levedura no exame citológico, bem como sobre os cortes de tecidos, contribuindo assim para a realização de um correto diagnóstico (GUIMARÃES et al., 2006; TYAGI et al., 2016). Em laboratórios com pouca experiência em fungos patogênicos, Candida glabrata, Cryptococcus neoformans, Blastomyces dermatitidis, Penicillium marneffei, Pneumocystis jirovecii, Toxoplasma gondii, Leishmania donovani e artefatos de coloração podem ser identificado incorretamente como H. capsulatum (WHEAT e KAUFFMAN, 2003). Os testes sorológicos desempenham um papel importante no diagnóstico de várias formas de histoplasmose (KAUFFMAN, 2007) com positividade em mais de 90% em pacientes com histoplasmose pulmonar e cerca de 80% em casos de doença disseminada (WHEAT e KAUFFMAN, 2003). A técnica mais utilizada para a detecção de anticorpos é a imunodifusão com sensibilidade entre 70 a 100% e especificidade de 100%, dependendo da forma clínica. O teste de fixação do complemento foi um método amplamente utilizado no passado, porém com menor especificidade (60 a 90%). Reações cruzadas podem ocorrer em pacientes com blastomicose, coccidioidomicose, paracoccidioidomicose, aspergilose, candidíase e criptococose (GUIMARÃES et al., 2006). 18 No diagnóstico diferencial da histoplasmose infecções pulmonares atípicas, como as pneumonias causadas por Mycoplasma, Chlamydia e Legionella podem ser confundidas com a forma pulmonar aguda da histoplasmose, assim como as pneumonias virais comuns, e a síndrome pulmonar por hantavírus (formas graves). A histoplasmose pulmonar crônica muitas vezes é confundida com a tuberculose pulmonar fibrocavitária e erroneamente realizado o tratamento com tuberculostáticos; a paracoccidioidomicose, também deve ser lembrada no diagnóstico diferencial da forma pulmonar crônica (FERREIRA e BORGES, 2009). Os métodos moleculares para a identificação de isolados fúngicos são mais rápidos, apresentam alta especificidade e sensibilidade. O uso de sondas de DNA marcadas com quimioluminescência, Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e suas variações são ferramentas poderosas para a identificação de patógenos causadores de micoses sistêmicas. Além disso, os métodos moleculares são mais seguros, pois limitam a possibilidade de infecção laboratorial, devido à degradação do agente patogênico pela extração do material genético (GUIMARÃES et al., 2006). Apesar da maioria das infecções por H. capsulatum serem assintomáticas e não necessitar de tratamento com antifúngicos, a histoplasmose pode ser grave ou mesmo fatal em pacientes que inalaram uma grande quantidade de conídios, imunodeprimidos, ou pacientes que desenvolveram doença progressiva, porém não receberam tratamento a tempo, devido à falta de diagnóstico (WHEAT e KAUFFMAN, 2003). O tratamento é indicado em pacientes diagnosticados com histoplasmose pulmonar disseminada ou crônica, e em pacientes que apresentam infecção pulmonar aguda que estão dispnéicos com infiltração pulmonar aguda ou que não melhoram espontaneamente (WHEAT e KAUFFMAN, 2003). Os agentes antifúngicos que foram provados mais eficazes e que são de eleição no tratamento da histoplasmose incluem anfotericina B, anfotericina B lipossomal, complexo lipídico de anfotericina B e itraconazol (WHEAT et al., 2007). 19 Por se tratar de um fungo saprofítico, é difícil realizar um programa profilático eficaz. Em áreas endêmicas, a histoplasmose em equídeos requer notificação aos órgãos de saúde animal, que se comprovado a enfermidade, o animal é submetido à eutanásia visando o controle da doença (SILVA e BOSCO, 2016). Nos EUA no intuito de diminuir o risco de exposição aos esporos de H. capsulatum entre trabalhadores de ocupações de risco o National Institute of Occupational Safety and Health (NIOSH) desenvolveu orientações como: excluir pássaros ou morcegos dos edifícios; afixar avisos e comunicar os riscos de saúde para os trabalhadores; controle de pó durante atividades como a construção, demolição e escavação em áreas endêmicas; eliminação correta de resíduos potencialmente contaminados; e seleção adequada e utilização correta dos equipamentos de proteção individual (LENHART et al., 2005). O aumento da consciência sobre os riscos de infecção por H. capsulatum entre os profissionais de saúde pública e de segurança do trabalho, são necessários de modo que os métodos adequados possam ser usados para reduzir a exposição em áreas endêmicas durante trabalhos que envolvam presenças de aves, morcegos, e/ou excrementos ou outros materiais contaminados (BENEDICT e MODY, 2016). CRIPTOCOCOSE Cryptococcus neoformans foi isolado pela primeira vez por Busse e Buschke em 1894 a partir de uma lesão óssea na tíbia semelhante à sarcoma. No mesmo ano Sanfelice isolou o fungo em suco de frutas deterioradas, denominando-o de Saccharomyces neoformans. Historicamente o fungo recebeu diversas denominações: Saccharomyces sp. Busse, 1894; Saccharomyces neoformans Sanfelice, 1894; Cryptococcus hominis Vuillemin, 1901; Torula neoformans Weis, 1902; Torula histolytica Stoddard e Cutler, 1916; Cryptococcus histolyticus Castellani, 1928; Cryptococcus meningitidis Dodge, 1935; e Débaryomyces hominis Todd e Hermann, 1936. No entanto em 1950 após exaustiva revisão morfológica Benham classificou os isolados como pertencentes à mesma espécie, e propôs o nome Cryptococcus neoformans. No Brasil o primeiro caso de criptococose foi 20 descrito por Almeida e Lacaz em 1941 no Estado de São Paulo (GIORGI et al., 1974; KWON-CHUNG et al., 2014). A criptococose conhecida também como tolurose, doença de Busse-Buschke e blastomicose européia é uma micose sistêmica com comportamento oportunista, ocasionada por leveduras encapsuladas pertencentes ao filo Basidiomycota, classe, Basidiomicetes, família Tremellaceae, gênero Cryptococcus (LACAZ et al., 2002; BOSCO et al., 2016). Este fungo possui mais de 30 espécies ubiquamente distribuídas no ambiente (MAZIARZ e PERFECT, 2016). Em vida parasitária tem aparência de célula leveduriforme, capsulada e algumas vezes, com brotamento. A forma encontrada no meio ambiente é a capsulada, com diâmetro menor de 1µm, favorecendo sua penetração nos alvéolos pulmonares (TRABULSI e ALTERTHUM, 2008). Apenas duas espécies são comprovadamente patogênicas para humanos e animais, Cryptococcus neoformans e C. gattii, que era considerado uma variedade de C. neoformans, e foi elevada em 2000 ao nível de espécie (KWON-CHUNG et al., 2002). Anteriormente as espécies eram classificadas em variedades e sorotipos, desta forma C. neoformans apresentava a variedade grubii (sorotipo A) e C. neoformans variedade neoformans (sorotipo D) (HAGEN et al. 2015), e o sorotipo AD que provavelmente pertence a estirpes híbridas, correspondente a organismos diplóides (ENACHE- ANGOULVANT et al., 2007), e Cryptococcus gattii apresentava os sorotipos B e C (KWON-CHUNG et al., 2002). Após estudos moleculares verificou-se que as espécies de Cryptococcus se agrupam em um complexo de oito tipos moleculares que se diferem quanto aos aspectos epidemiológicos, geográficos e a gravidade da doença (TRILLES et al., 2012). C. neoformans, é um agente oportunista e seus tipos são: VNI, VNII, VNIII e VNIV. Já o C. gatti infecta hospedeiros imunocompetentes, seus tipos moleculares são: VGI, VGII, VGIII e VGIV (HAGEN et al., 2015). A fase sexual ou teleomorfa do fungo é denominada de Filobasidiella neoformans para os sorotipos A e D de C. neoformans, e Filobasidiella bacillispora para os sorotipos B 21 e C de C. gattii (ENACHE-ANGOULVANT et al., 2007). Nesta fase observa-se a produção de micélio, que apresenta hifas hialinas, septadas, com média de 3µm de largura, ramificações irregulares, e ligações em ansa (clamp conexions) a cada septo. A formação de basidiósporos dos tipos “alfa” e “a” no interior dos basídios na porção terminal ou lateral da hifa completa o ciclo reprodutivo do agente (BOSCO et al., 2016). O fungo pode ser isolado de madeira em decomposição, frutos, vegetais, ocos de árvores, e solos com excretas de aves, em especial de pombos (SIDRIM e ROCHA, 2004; ZAITZ et al., 2010; SOLTANI et al., 2013). As fezes secas de pombos são um meio de cultura ideal para o crescimento do fungo, devido à presença em excesso de bases nitrogenadas (LACAZ et al., 2002). Habitats de aves em cativeiro no ambiente doméstico, como canários e periquitos também são importantes reservatórios do fungo (FILIÚ et al. 2002; SIDRIM e ROCHA, 2004). Cryptococcus spp. já foi encontrado em parques, praças e ruas de grandes centros urbanos (YAMAMURA et al., 2013). No Brasil fontes ambientais de Cryptococcus neoformans foram progressivamente identificadas em árvores do Rio de Janeiro (RJ), Teresina (PI), Boa Vista, Ilha de Maracá (RR), no interior do Amazonas e na cidade de São Paulo (MORETTI et al., 2008). C. neoformans foi isoladoem cinco morcegos na Colômbia, três da espécie Carollia perspicillata e dois da espécie Pteronotus psiolotis (GROSE et al., 1968). Na Itália isolou- se Cryptococcus neoformans var. neoformans e C. laurentii em três cavernas a partir de amostras de fezes de morcegos, pombos e raposas(MONTAGNA et al., 2003). Em estudo realizado no Rio de Janeiro foi encontrado 10,3% (3/29) de positividade em amostras relacionadas com habitats de morcegos: sendo identificado dois isolados de C. neoformans var. neoformans, um encontrado em um oco de árvore, e outro em uma casa abandonada, o terceiro isolado foi classificado como C. gattii (Sorotipo B) identificado em guano de morcego em um sótão de uma casa antiga (LAZÉRA et al., 1993). Epidemiologicamente C. neoformans pode ser encontrado em todo o mundo geralmente isolado a partir de fezes de aves e casca de árvore e causam doença principalmente em pacientes imunodeprimido. C. gatti por outro lado, são mais restritos à 22 regiões tropicais e subtropicais, comumente isolado a partir de árvores de eucalipto e frequentemente infectam hospedeiros com estado imunológico normal (ENACHE- ANGOULVANT et al., 2007; BYRNES et al., 2011; MAZIARZ e PERFECT, 2016). No entanto, após um surto na ilha de Vancouver, Canadá, causado por C. gattii as convicções sobre a espécie mudaram devido duas particularidades observadas, uma é que ele ocorreu em uma área de clima temperado, atípico para a espécie (STEPHEN et al., 2002) e outra foi o fato do fungo ter sido isolado de cinco espécies de árvores nativas, e negativo nas espécies de eucalipto (KIDD et al., 2004). A criptococose está entre as cinco doenças que causam as maiores taxas de morbidade em pacientes com HIV/Aids em todo o mundo. Sem o uso da terapia anti- retroviral, as taxas de mortalidade são extremamente elevadas em pacientes com HIV e meningite criptocócica. É estimado que ocorra mais de um milhão de casos de meningite criptocócica por ano em todo o mundo, sendo que a maioria das mortes ocorrem na África sub-saariana onde as taxas de co-infecções oportunistas são desproporcionalmente altas. Nesta região, a estimativa de mortes devido a meningite criptocócica excede as mortes por tuberculose e estão atrás apenas de malária, doenças diarreicas e doenças mais restritas a infância (CHANG et al., 2013). Criptococose ocorre principalmente por inalação de propágulos infecciosos (células de levedura encapsuladas ou basidiósporos) de reservatórios ambientais com deposição nos alvéolos pulmonares, de onde há migração para outros locais do corpo, em particular o sistema nervoso central (CHANG et al., 2013; KWON-CHUNG et al., 2014). Os principais fatores de virulência são a formação da cápsula, a produção de melanina, e a termotolerância da cápsula polissacarídica antifagocítica. A cápsula é composta principalmente do polissacarídeo glucuronoxilomanana (GXM), e é consideradaum fator de virulência essencial com múltiplos efeitos na imunidade do hospedeiro e pode aumentar de tamanho com a exposição aos tecidos e fluidos corporais (MAZIARZ e PERFECT, 2016). As infecções causadas por Cryptococcus são clinicamente complexas, e podem resultar em pneumonia, meningite e formação de criptococomas no cérebro e pulmão, e, 23 adicionalmente, podem ocorrer infecções na pele, particularmente em casos de felinos e caninos, mas também em seres humanos (BYRNES et al., 2011). C. neoformans caracteriza-se por causar doença em hospedeiros imunocomprometidos, C. gatti, por outro lado, tem historicamente sido considerado como um agente patogênico em pacientes aparentemente imunocompetentes. A doença causada por C. gattii parece ser mais provável de acontecer do que a doença causada pelo C. neoformans, apresentando-se como uma infecção pulmonar granulomatosa progressiva (MAZIARZ e PERFECT, 2016). Postula-se que a criptococcose causada por C. gattii é mais comumente relacionada a primo-infecção (aguda), do que em uma reativação. Este entendimento patogênico é baseado em duas observações indiretas: 1) estudos sorológicos em crianças mostraram que elas geralmente têm anticorpos para C. neoformans, mas raramente para C. gatti; 2) C. neoformans comumente causa doença quando a imunidade do paciente imunodeprimido diminui e dificilmente ocorre doença por C. gattii em pacientes imunodeprimidos (BYRNES et al., 2011). Infecções por Cryptococcus spp. já foram relatadas em animais domésticos e silvestres como, cães, gatos, equinos, ovinos, lhamas (MCGILL et al., 2009), bovinos (MAGALHÃES et al., 2012) gorilas (MISCHNIK et al., 2014), furões (HANLEY et al., 2006; MCGILL et al., 2009), coalas (KROCKENBERGER et al., 2002), botos (STEPHEN et al., 2002) e golfinhos (MILLER et al., 2002).Os gatos são os animais mais acometidos normalmente associada às infecções virais por FIV e FeLV. As lesões cutâneas são as formas de afecção mais comuns observadas nos felinos, juntamente com linfadenopatia regional, sendo que lesões nas vias nasais podem causar inflamação nos ossos da face (“nariz de palhaço”) (FERREIRA et al., 2007). Nos cães a criptococose é geralmente mais grave, com desenvolvimento da doença disseminada, que se inicia na cavidade nasal e se dissemina por continuidade para outros órgãos, incluindo o SNC (BOSCO et al., 2016). O diagnóstico do agente pode ser realizado a partir de vários materiais suspeitos, como: escarro líquor, lesões muco-cutâneas, líquido pleural, linfa, linfonodo, pele, pulmão 24 e medula (LACAZ et al., 2002; NEGRONI, 2012). Em pacientes com HIV/AIDS o líquor cefalorraquidiano é o espécime clínico que apresenta melhor rendimento, principalmente em casos de meningite criptocócica. Em casos de criptococose disseminada sem acometimento meníngeo, a urina torna-se o espécime clínico de eleição, superior inclusive à hemocultura (PINTO JR et al., 2006). O diagnóstico definitivo da criptococose é feito por isolamento de Cryptococcus em meio de cultura ou a detecção direta do fungo por meio do uso de coloração de Tinta da China em fluidos corporais (LACAZ et al., 2002; MAZIARZ e PERFECT, 2016).O meio de cultura utilizado rotineiramente é o sabouraud-glicose 2% sem cicloheximida, incubados a 28º ou 37º C,observando-se colônias lisas em tons de cor creme em torno de 2 a 3 dias. Outro meio de cultura que pode ser utilizado é o meio ágar com extrato de sementes de niger (Guizotia abyssinica), meio diferencial e indicador, baseado na capacidade da levedura de produzir melanina quando cultivado em substratos contendo produtos difenólicos, devido à ação de uma fenol-oxidase, permitindo a visualização de colônias na cor marrom escura (PINTO JR et al., 2006; NEGRONI, 2012). O canavanina-glicina azul de bromotimol (CGB) é um meio de cultura amplamente utilizado para distinguir entre as espécies de Cryptococcus neoformas e gattii, que realiza a caracterização a partir das diferenças quanto à assimilação de nitrogênio e fontes de carbono. A resistência do C. gatti para L-canavanina e a capacidade de utilizar a glicina como fonte de azoto e carbono (e consequentemente, alteração do pH do meio), permite a identificação desta levedura pela mudança de cor do meio de amarela para azul cobalto a medida que há o crescimento de colônias, enquanto que o ágar CGB inoculado com estirpes de C. neoformans permanece inalterado (KWON-CHUNG et al., 2014). Pesquisa de antígenos capsulares, como o de Aglutinação do Látex (CRUZ, 2010) consegue detectar os principais sorotipos da levedura (A, B, C, D e AD). Estes testes detectam polissacárideos ou proteínas fúngicas, sendo muito utilizado o GXM, encontrado em grandes quantidades no sangue e líquido cefalorraquidiano no curso de meningite criptocócica (KOZEL e WICKES, 2014). 25 Outro teste de detecção de antígeno amplamente utilizado é o ensaio de fluxo lateral-LFA (Crag LFA) construído utilizando anticorpos monoclonais reativos e o polissacarídeo GXM. O CrAg LFA é adequado para uso em ambientes de recursos limitados, pois não requer energia ou água limpa, é barato, não necessita de refrigeração, e pode ser realizado por pessoal com formação limitada. O teste funciona bem com soro ou sangue e fornece o resultado em torno de 10 minutos. A eficácia e desempenho do teste, aliados ao baixo custo tornou possível a realização do diagnóstico e tratamento em pacientes com meningite criptocócica durante a triagem, além do rastreio do agente em pacientes infectados por HIV (GATES-HOLLINGSWORTH e KOZEL, 2013; KOZEL e WICKES, 2014). Foram desenvolvidos testes imunoenzimáticos (ELISA) para detecção tanto de antígenos como de anticorpos, que são detectados em títulos mais baixos e mais precocemente na infecção criptocócica, no entanto, por ser mais demorado e laborioso é pouco utilizado na rotina clínica (MORETTI et al., 2008). No diagnóstico histopatológico as colorações mais utilizadas são P.A.S. e mucicarmin, onde é possível visualizar micro-organismos cercados por um halo incolor, que não é corado por corantes habituais, correspondendo à cápsula do fungo (LACAZ et al., 2002). Métodos moleculares, embora disponíveis e amplamente utilizados para fins de investigação, não são utilizados atualmente na rotina clínica (MAZIARZ e PERFECT, 2016). O diagnóstico diferencial da criptococose depende do local acometido. No caso de criptococose meningoencefalítica os sintomas são semelhantes à meningoencefalite tuberculosa, no entanto quando se apresenta a forma mais aguda pode ser confundido com meningite viral. Criptococomas podem ser confundidos com tuberculomas e gliomas. Clinicamente e radiograficamente a criptococose pulmonar crônica imita tumores pulmonares e a doença aguda pode ser confundida com pneumonia bacteriana aguda. As formas disseminadas são semelhantes à tuberculose sistêmica em pacientes com Aids com baixa contagem de células CD4. Lesões na pele ou mucosas apresentam como diagnóstico 26 diferencial herpes, histoplasmose, tuberculose, infecção por citomegalovírus e sífilis secundária ou terciária. Nas lesões ulceradas, criptococose pode também ser confundida com neoplasias cutâneas (NEGRONI, 2012). A escolha do antifúngico para o tratamento da criptococcose depende da avaliação das estruturas anatômicas acometidas e do estado imunológico do paciente. Atualmente anfotericina B, o fluconazol, o itraconazol, e formulações lipídicas de anfotericina B estão disponíveis. Estes medicamentos podem ser utilizados isoladamente ou em combinação com outros agentes com diferentes graus de sucesso (SAAG et al., 2000). Em casos associados à tuberculose, a interação de triazóis com rifampicina deve ser considerada, devido à baixa biodisponibilidade de ambos os fármacos. O tratamento cirúrgico é indicado no caso de pacientes com criptococomas cerebrais ou pulmonares e em casos de sequestro ósseo (NEGRONI, 2012). Nos animais o tratamento de escolha é intraconazol (CRUZ, 2010). Não existem medidas profiláticas eficazes para controle da criptococose, contudo, pacientes imunocomprometidos devem evitar áreas densamente contaminadas com excrementos de aves (NEGRONI, 2012). Ambientes que possam favorecer o acúmulo de excrementos secos e envelhecidos de aves, como praças, construções urbanas, criadouros de aves domésticas e comerciais devem ser limpos regulamente, mantendo o ambiente iluminado e ventilado. Lavagens sucessivas com solução de hidróxido de cálcio 40g/L associado a hidróxido de sódio 1,5g/L, é capaz de reduzir a quantidade de fungos ambientais em quintais sujos por fezes de aves (BOSCO et al., 2016). PARACOCCIDIOIDOMICOSE A paracoccidioidomicose (PCM) foi observada pela primeira vez por Adolfo Lutz em 1908, em pacientes que apresentavam lesões na boca (LACAZ et al., 2002). Em 1912, Alfonso Splendore classificou o agente etiológico da paracoccidioidomicose dentro do gênero Zymonema, propondo a denominação de Zymonema brasiliense. Após diversos estudos, Almeida em 1930 criou o gênero Paracoccidiodes dentro do reino Fungi, 27 revalidando a espécie brasiliensis, criada por Splendore. A oficialização do termo paracoccidioidomicose foi estabelecida em 1971, em Medellín, Colômbia, durante reunião de micologistas do continente americano, sendo mundialmente aceita até então (MOREIRA, 2008). A PCM anteriormente nomeada de Blastomicose sul-americana é causada por um fungo dimórfico termodependente denominado Paracoccidioides brasiliensis, que pode causar doença pulmonar progressiva com ou sem envolvimento de outros órgãos (MURRAY et al., 2009). P. brasiliensis em temperatura ambiente apresenta a forma de micélio que inicialmente cresce como colônia esbranquiçada e com o envelhecimento da cultura apresenta fissuras e elevações de cor marrom, com aspecto de „pipoca estourada‟. Quando incubadas entre 35 a 37ºC apresenta a fase leveduriforme, com colônias de cor creme e aspecto cerebriforme (LACAZ et al., 2002; BAGAGLI et al., 2016). O micélio, microscopicamente apresenta hifas hialinas delgadas, ramificadas, septadas, multinucleadas, que produzem clamidoconídios terminais ou intercalados. A forma leveduriforme apresenta-se microscopicamente por células arredondadas, de parede celular espessa com diâmetro entre 6 a 30µm, com brotamento único ou múltiplo (BAGAGLI et al., 2016). O principal antígeno secretado por P. brasiliensis é a glicoproteína Gp43, de 43 kDa, sendo o antígeno mais específico utilizado em testes diagnóstico para a infecção por P. brasiliensis. Uma característica adicional de gp43 é a sua atividade proteolítica; capaz de hidrolisar a caseína, colágeno, elastina e, consequentemente, exerce um papel relevante em relação à virulência do agente (SILVA & SARAIVA, 2008). Após estudos de filogenia molecular constatou-se que o gênero Paracoccidioides possui 4 genótipos distintos, sendo considerado um complexo de espécies crípticas, que fenotipicamente são indistinguíveis (BAGAGLI et al., 2016) denominadas: S1 –dividida recentemente em dois clados: S1a e S1b (MUÑOZ et al., 2016), PS2, PS3, e PS4 (MATUTE et al., 2006; THEODORO et al., 2012; SALGADO-SALAZAR et al., 2010), constituindo assim o complexo P. brasiliensis. 28 Recentemente uma nova espécie foi proposta, e em homenagem a Adolfo Lutz denominada Paracoccidioides lutzii (TEIXEIRA et al., 2013). As evidências que levaram a proposta da nova espécie são baseadas principalmente na segregação gênica ocorrida há aproximadamente 24-32 milhões de anos, dados de RAPD, características genômicas, tais como tamanho do genoma e conteúdo genético, famílias de genes e sua expansão e presença de elementos de transposição. Além disso, estirpes produzidas por células de conídios de P. lutzii são mais alongadas do que os de P. brasiliensis e geograficamente, P. lutzii parece ser mais restrito as regiões Centro-Oeste e Norte do Brasil (TEIXEIRA et al., 2013). Dentre as micoses sistêmicas a PCM é considerada a mais importante do Brasil, apresentando prevalência acentuada em populações de baixa renda, principalmente da zona rural (COUTINHO et al., 2002). Em áreas endêmicas a PCM possui grande impacto médico e social, não só por causa do considerável número de casos, mas também por causa da cronicidade da doença, a longa duração do tratamento e as sequelas frequentes que causam incapacidade de trabalhar e má qualidade de vida (MARTINEZ, 2015). Em áreas classificadas como de alta endemicidade, a taxa de incidência anual é estimada em três casos por 100 mil habitantes, sendo que casos autóctones da doença ocorrem exclusivamente em regiões da América Latina (COUTINHO et al., 2002). Em estudo retrospectivo realizado por Belissimo-Rodrigues et al. (2011) que analisaram dados de 1.000 pacientes com PCM confirmada, classificaram Ribeirão Preto, SP, como uma área hiperendêmica para PCM (incidência de 1,6 a 3,7 casos por 100.000 habitantes/ano), atribuindo a alta incidência as condições geológicas e climáticas, bem como a agricultura intensiva na região. As profissões agrícolas ou atividades relacionadas ao manejo do solo, como atividades agrícolas, terraplanagem, preparo de solo, práticas de jardinagens, transporte de produtos vegetais são os principais fatores de risco associados à PCM. A grande maioria dos pacientes que adquiriu a doença exerceu atividade agrícola nas duas primeiras décadas de vida, provavelmente adquirindo à infecção nessa época, e em 90% dos casos as 29 manifestações clínicas foram observadas muitos anos depois (SHIKANAI-YASUDA et al., 2006). O alcoolismo e o ato de fumar são fatores de risco para várias infecções pulmonares em seres humanos devido às mudanças na microestrutura pulmonar provocada pelo fumo e às mudanças no sistema imunológico produzidos pelo consumo abusivo de álcool (BELISSIMO-RODRIGUES et al., 2011). Em estudo de caso-controle de PMC realizado por Santos et al. (2003) observou-se que as chances de adoecer são 14 vezes maiores entre os fumantes e 3,6 vezes maiores entre os que bebem acima de 50g de álcool por dia. PCM em adultos varia entre 10 a 15 homens para uma mulher, o que não ocorre na infância, onde a infecção e a doença se distribuem igualmente entre ambos os sexos (SHIKANAI-YASUDA et al., 2006). Estudos demonstraram que P. brasiliensis apresenta receptores para o 17-β estradiol, assim o estrógeno, hormônio feminino, impede a transformação do micélio em levedura no organismo, uma possível explicação para a maior prevalência da PCM em adultos do sexo masculino (VERONESI e FOCACCIA, 2002). O nicho ecológico de P. brasiliensis ainda não está completamente esclarecido. As principais dificuldades para determinar o habitat do fungo são devido ao prolongado período de latência de PCM e a ausência de surtos da doença, que em conjunto com a migração frequente dos habitantes de áreas endêmicas, torna-se difícil localizar o local onde a infecção foi adquirida (CADAVID e RESTREPO, 1993). Estudos que conseguiram isolar P. brasiliensis de amostras de solo sugerem que o fungo viva saprobioticamente na natureza (RESTREPO et al., 2001; TERÇARIOLI et al., 2007; ARANTES et al., 2013). Anteriormente acreditava-se que os seres humanos eram os únicos hospedeiros naturalmente infectados por P. brasiliensis. Atualmente, há a descrição da infecção natural (SHIKANAI-YASUDA et al., 2006) em tatus (BAGAGLI et al., 1998; BAGAGLI et al., 2003; RICHINI-PEREIRA et al., 2008), cães (RICCI et al., 2004; FARIAS et al., 2011), e animais silvestres como gambás, porco-espinho, preá, cachorro do mato, irara, furão e guaxinim (RICHINI-PEREIRA et al., 2008). 30 Registro do isolamento de P. brasiliensis em quirópteros foi realizado por Grose & Tamsitt (1965) na Colômbia que isolaram o fungo a partir do trato intestinal de três morcegos da espécie Artibeus lituratus. Em estudo para avaliar o potencial de transmissão pelas fezes destes animais, Greer & McMurray (1981) realizaram inoculação intraperitoneal e intranasal da levedura de P. brasiliensis em morcegos e observaram que a patogênese da doença é semelhante ao observado em seres humanos. No entanto, não houve envolvimento intestinal, mesmo com o desenvolvimento da doença sistêmica crônica. Em estudo realizado em comunidade endêmica para P. brasiliensis na Colômbia, verificou-se que o contato com morcegos foi a variável mais fortemente associada com a infecção, despertando a velha controvérsia sobre o papel dos morcegos na ecologia de P. brasiliensis (CADAVID e RESTREPO, 1993). Na natureza, P. brasiliensis apresenta-se como estruturas filamentosas contendo propágulos infectantes chamados conídios. Uma vez inalados, os propágulos dão origem a forma leveduriforme do fungo que constituirão sua forma parasitária nos tecidos do hospedeiro (SHIKANAI-YASUDA et al., 2006). As formas clínicas da PCM humana são classificadas em quatro classes e servem de referência em casos de PCM em animais: PCM infecção, PCM doença, PCM associada a imunossupressão e PCM sequelar. A PCM infecção acontece em casos assintomáticos, caracterizados por indivíduos positivos em testes sorológicos, mas não apresentam manifestações clínicas ou evidências laboratoriais da doença (BAGAGLI et al., 2016). A PCM doença apresenta duas formas principais: PCM aguda/subaguda (juvenil) que afeta principalmente indivíduos jovens, com envolvimento suave a grave dos linfonodos e ainda comprometimento sistêmico. Hepatoesplenomegalia, aumento dos linfonodos mediastínicos, massas intra-abdominais, ascite, lesões osteoarticulares e icterícia podem ocorrer. Membranas de mucosas raramente estão envolvidas e lesões pulmonares ocorrem em menos de 5% dos casos. Comprometimento cutâneo é comum, ocorrendo em 54% dos pacientes (SILVA e SARAIVA, 2008). 31 A forma crônica é diagnosticada em mais de 90% dos casos, principalmente em pacientes do sexo masculino entre 30 e 60 anos. A doença progride lentamente, de forma silenciosa, podendo levar anos até que seja diagnosticada (SHIKANAI-YASUDA et al., 2006). Em 80% a 90% dos casos há comprometimento pulmonar normalmente bilateral e localizado na metade inferior dos pulmões, apresentando sintomatologia inespecífica. Pacientes podem apresentar expectoração, dispnéia, dor torácica e hemoptise, e sintomas sistêmicos associados, tais como perda de peso, febre e anorexia. Casos assintomáticos também podem ocorrer. Tuberculose pulmonar está associada em cerca de 12% dos casos (SILVA e SARAIVA, 2008). A PCM canina foi descrita na literatura em três fêmeas adultas, duas da raça Doberman e uma da raça Labrador, todas com linfadenopatia (RICCI et al., 2004; FARIAS et al., 2011; HEADLEY et al., 2016). O primeiro caso foi diagnosticado em região endêmica do Estado de São Paulo com comprometimento dos linfonodos submandibulares e apatia. No exame histopatológico revelou PCM ativa com visualização de numerosas formas de leveduras únicas ou com múltiplos brotamentos, patognomônicos de P. brasiliensis. Identificação do agente foi confirmada pela Coloração de Gomori, imunoistoquímica e PCR da gp43 (RICCI et al., 2004). No segundo caso o cão apresentou emagrecimento, linfadenomegalia generalizada e hepatoesplenomegalia. A PCM foi diagnosticada pelos achados clínicos, cultura, imunoistoquímica, e histopatologia do linfonodo poplíteo (FARIAS et al., 2011). Recentemente foi relatado o terceiro caso, em uma cadela no sul do Brasil com aumento de linfonodos e dermatite, com confirmação do diagnóstico por achados clínicos, citológicos, micológicos, sorológicos e moleculares (HEADLEY et al., 2016). O diagnóstico de P. brasiliensis pode ser feito pelo isolamento do fungo em cultura, por exame micológico direto, histopatologia, citopatologia, ou por métodos sorológicos (SILVA e SARAIVA, 2008). Como em outras micoses, o isolamento do agente em cultura é considerado padrão- ouro. Para o isolamento de P. brasiliensis podem ser utilizados meios de cultura 32 enriquecidos com extrato de levedura, contendo antibióticos ou, ainda, ágar infusão de cérebro e coração (BHI), ágar sabouraud-dextrose, Micosel ® , ou glucose-peptone- yeastextract ágar (GPY). Quando incubadas a 25ºC, crescem em torno de 15 a 30 dias, sob a forma de micélio, apresentando colônias brancas a amarronzadas, cotonosas ou glabrosas (MOREIRA, 2008; BAGAGLI et al., 2016). O exame micológico direto é método mais barato e mais simples, podendo ser realizado a partir de raspado cutâneo ou lesão em mucosa, aspirado de linfonodo, abcesso, ou fluido sinovial (SILVA e SARAIVA, 2008). Ao microscópio observa-se o agente como uma célula arredondada envolta por uma espessa parede celular hialina, birrefringente. Pode-se observar ainda um ou múltiplos brotamentos ligados à célula-mãe, apresentando o típico aspecto de „roda de leme‟ (BAGAGLI et al., 2016). A sorologia além de ajudar a fazer o diagnóstico, tem aplicação durante e após o tratamento para acompanhamento do caso. O exame deve ser feito em todas as variantes clínicas para fornecer informações importantes sobre o prognóstico e atividade da doença. Atualmente, a imunodifusão dupla, ensaio imunoenzimático (ELISA), contra imunoeletroforese e immunoblotting estão disponíveis em vários serviços de referência (SILVA e SARAIVA, 2008). Carcinoma de células escamosas é o principal diagnóstico diferencial de lesões na mucosa oral e laringe, no entanto, leishmaniose mucocutânea, tuberculose, sífilis e outras neoplasias, também devem ser consideradas. As formas linfáticas da PCM podem simular a tuberculose e a doença de Hodgkin. Massas ganglionares intra-abdominais podem sugerir neoplasia visceral. Erupções difusas na pele podem simular sífilis, psoríase e linfomas. Se localizado, devem ser diferenciada de leishmaniose, esporotricose, tuberculose e cromomicose (SILVA e SARAIVA, 2008). P. brasiliensis, diferente de outros fungos patogênicos, é sensível à maioria dos antifúngicos. Vários fármacos e associações podem ser utilizados para o tratamento da PCM, tais como anfotericina B, sulfadiazina, associação sulfametoxazol/trimetoprim, cetoconazol, fluconazol e itraconazol (SHIKANAI-YASUDA et al., 2006). O tratamento é 33 de longa duração, para permitir o controle das manifestações clínicas da micose e evitar as recidivas. O paciente deve permanecer em tratamento e acompanhamento até a obtenção dos critérios de cura, com base nos parâmetros clínicos, radiológicos e sorológicos. Além do tratamento antifúngico específico, o paciente deve receber assistência para as condições gerais como desnutrição, tratamento odontológico, doença de Addison e co-morbidades (tuberculose, aids, enteroparasitoses, infecções bacterianas pulmonares) (SHIKANAI- YASUDA et al., 2006). Como ainda há lacunas sobre o nicho ecológico de Paracoccidioides spp. no ambiente e não há vacinas disponíveis até o momento, torna-se difícil traçar um plano de medidas profiláticas para controle da PCM. No entanto, recomenda-se o uso de máscaras em ambientes fechados como cavernas, áreas com elevada umidade, ou relacionadas com o habitat de tatus (BAGAGLI et al., 2016). 34 CAPÍTULO 2 – TRABALHO CIENTÍFICO “Trabalho a ser enviado para a revista Medical Mycology” As normas de submissão encontram-se disponíveis em: https://academic.oup.com/mmy/pages/Manuscript_Preparation INFECTION BY Histoplasma capsulatum, Cryptococcus spp., AND Paracoccidioides brasiliensis IN BATS COLLECTED IN URBAN AREAS ZOONOSIS BY FUNGI IN BATS Giselle Souza da Paz 1 ; Brunna Mayla Vasconcelos Adorno 1 ; Virgínia Bodelão Richini- Pereira 2 ; Sandra Moraes Gimenes Bosco 3 ; Helio Langoni 1* . 1- Núcleo de Pesquisa em Zoonoses, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, SP. 2- Departamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, SP. 3- Divisão de Laboratórios Regionais, Instituto Adolfo Lutz, Bauru, SP * Corresponding Author: Núcleo de Pesquisa em Zoonoses, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista Distrito de Rubião Jr. S/N, CEP: 18618-681, Botucatu, SP. E-mail: hlangoni@fmvz.unesp.br https://academic.oup.com/mmy/pages/Manuscript_Preparation mailto:hlangoni@fmvz.unesp.br 35 ABSTRACT We confirm the natural infection by Paracoccidioides brasiliensis, atready reported in 1965, but not reproduced in later studies, in two insectivorous bats. The relation among bats and fungi was already confirmed by studies on Histoplasma capsulatum in the last decades. Studies on other endemic fungi can be improved with the advent of molecular biology, by elucidating the role of bats as reservoirs and vectors of pathogenic fungi to other animals and humans. The objective of this study was to explore the presence of H. capsulatum, Cryptococcus spp., and P. brasiliensis in bats collected in urban areas. We analysed 172 bats collected by the Epidemiological Surveillance Agency in 12 municipalities of the Midwest region of the state of São Paulo, Brazil. Spleen, liver, intestine, and lung samples were subjected to microbiological culture and nested PCR analyses. Prevalence of H. capsulatum infection was 8.1% (14/172), with only one fungus- positive bat in the microbiological culture, 12 in nested PCR, and one animal positive for both methods. Two bat specimens tested positive for Cryptococcus spp., one with spleen infection, and the other with spleen and lung infection. Natural infection by P. brasiliensis was confirmed in two insectivorous bats, with one positive result in the spleen of a male and one in the spleen and liver of a female, both collected in the urban perimeter. The importance of bats as fungal dispersants with a pathogenic potential for the human population is highlighted. Keywords: Systemic mycoses, fungi, Chiroptera, nested-PCR 36 INTRODUCTION Fungi are a clinically important group of microorganisms that cause infectious diseases worldwide. In recent years, there has been a continuous increase in the frequency and severity of mycoses, driven mainly by the use of immunosuppressants or chemotherapy for the treatment of non-infectious diseases such as cancer, and the global HIV/AIDS epidemic. Opportunistic mycoses are a constant challenge for clinicians and mycologists owing to the complexity of patients at risk and the increasing number of fungal strains that can cause infection in these individuals 1, 2 . Because bats live in caves, caverns, under house roofs, and in large groups, they are more likely to come into contact with a greater variety of microorganisms 3 . Order Chiroptera plays an important role as a source of infection and transmission of a variety of infectious agents because of its special social, biological, and immunological characteristics 4 . In Brazil, several pathogenic fungi have been isolated from bats, for example, Coccidioides posadasii 5 , Histoplasma capsulatum 6 , Aspergillus spp., Microsporum spp., Penicillium spp., Tricophyton spp., Fusarium spp., Rhodotorula spp., Candida spp., and Cryptococcus spp. 3 Bats live in wild and urban areas; therefore, they can spread spores and yeast in the environment, making it necessary to epidemiologically study the involvement of bat species as a possible reservoir and source of infection with fungi pathogenic for humans and animals in domiciliary areas. Thus, the objective of this study was to perform molecular 37 and microbiological detection of fungi H. capsulatum, C. neoformans, and P. brasiliensis in bats of the urban areas in the Midwest municipalities of the state of São Paulo, Brazil. MATERIALS AND METHODS The study protocol was approved by the Ethics Committee on Animal Use (CEUA) of the School of Veterinary Medicine and Animal Science, UNESP, Botucatu, under protocol No. 183/2014. Samples were excised from bats collected and sent by the Municipal Epidemiological Surveillance Agency of Botucatu and region for the diagnosis of rabies at the Zoonosis Diagnosis Center, FMVZ, UNESP, Botucatu Campus, from April 2015 to May 2016. The study design was a series of cases, with analysis of the frequency of the identified species, animals‟ feeding habits, age, sex, and the locations where they were found. A total of 172 bats were evaluated, from 10 species and three families, collected in 12 cities in the Midwest region of the state of São Paulo, with 79.6% coming from the municipality of Botucatu (Table 1). Of these, 80 animals arrived alive at the Zoonosis Diagnosis Center and were euthanised with overdose of inhalatory anestesia in a CO2 chamber, following the guidelines for small mammals 7 . After the brain material was removed for the diagnosis of rabies, we collected the liver, lungs, spleen, and intestine aseptically under a laminar flow. Among the animals euthanised in the laboratory, a half of the collected material was stored in DNase- and RNase-free microtubes and kept at 20°C until DNA extraction, and the rest was subjected 38 to microbiological culture. As for the animals that arrived dead, all the material was stored at 20C before DNA extraction. Microbiological culture Samples were processed in a biological safety cabinet, rapidly immersed in 70% alcohol and next in sterile 0.85% NaCl (saline). These tissue samples were then cut into small pieces, which were seeded in Petri dishes containing Sabouraud-dextrose agar supplemented with chloramphenicol (50 μg/ml). The culture of Cryptococcus spp. involved organ fragments placed in Niger seed agar supplemented with chloramphenicol (400 mg/l) and amikacin sulphate (200 mg/l). The plates were incubated at 26°C and evaluated weekly for up to 60 days. Colonies that macroscopically resemble one of the fungi studied were picked and grown in 15-ml tubes containing the same medium and then evaluated microscopically. DNA extraction and nested-PCR reactions DNA extraction from tissue samples was performed using the Illustra Tissue & Cells genomic Prep Mini Spin Kit (GE Healthcare), as instructed by the manufacturer. The solution was stored for 24 h in a refrigerator, for stabilisation, and then the DNA was quantified using a NanoVue (GE Healthcare). 39 DNA amplification was conducted using universal primers for fungal ITS4 and ITS5 8 from H. Capsulatum 9 , Cryptococcus spp. 10 , and Paracoccidioides brasiliensis 11 (Table 2). PCR reactions were run in 0.2-ml microtubes. The total reaction volume was 25 μl, and this included 10 ng of genomic DNA, 1 μl of each primer (10 pmol/μl), 7.5 μl of ultrapure water, and 12.5 μl of the GoTaq® Green Master Mix (Promega). Incubation was carried out in a Mastercycler gradient thermal cycler (Eppendorf). In the case of nested PCR for H. capsulatum, 0.5 μl of each primer and 1 μl of DMSO were used. The amplicons were visualized in electrophoresis gel and then prepared for sequencing. The amplicon of the nested PCR reactions were purified by enzyme Exo/Sap (Exonuclease I/Shrimp Alkaline Phosphatase) and the sequencing reactions were performed on both strands in a MegaBace TM1000 (Amersham Biosciences). Sequences were compared to the NCBI database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Georeferencing Georeferencing of the fungus-positive samples was carried out, using as a base a spreadsheet containing the locations (addresses) where the bats were collected. The mapping was done using the AutoCAD® software (Autodesk). Maps (raster images) of the state of São Paulo from the Geographic and Cartographic Institute and the vector map of the city of Botucatu were included in the analysis. After adjustment of the scale and 40 positioning between the two maps, the collection points of fungus-positive bats were documented. Statistical analysis The distribution and frequency of the relevant characteristics of the animals were presented as follows: species, categorical age, sex, food habits, and city where the bats were collected. Statistical analyses were conducted by the Chi-square or Fisher‟s exact tests, and the results were obtained by means of the GraphPad Prisma 5.0 software, with a significance level of 5%. RESULTS Animals When evaluating the dietary habits of the species, we noticed that 95.4% of the specimens were insectivorous (Eptesicus spp., Eumops spp., Histiotus velatus, Lasiurus cinereus, Molossus spp., Myotis nigricans, and Nyctinomops spp.), 2.3% frugivorous (Artibeus spp.), 1.7% nectarivorous (Glossophaga soricina), and 0.6% were hematophagous (Desmodus rotundus). Regarding sex, 59.9% were males and 40.1% females; 77.3% were adults, 22.1% were young, and 0.6% were pups. 41 Microbiological culture Two insectivorous bats tested positive for the microbiological isolation of H. capsulatum in microbiological culture (Figure 1). No animals proved to be positive for Cryptococcus spp. or P. brasiliensis isolations. The first fungus-positive animal was found lying on the stairs of a psychiatric hospital in the municipality of Botucatu: an adult female insectivorous bat of the species Molossus molossus (Figure 1A). There was growth of white cottony colonies on the plates seeded with spleen and liver pieces, after 11 days of incubation. The second fungus-positive animal was collected in the backyard of a household in the municipality of Botucatu, an adult female of the species Eptesicus brasiliensis. The growth of the mycelium was observed only on a spleen plate, after 7 days of incubation. A slide prepared with the lactophenol cotton blue dye was used for optical microscopic confirmation, showing septate and branched hyaline hyphae, with abundant microconidia, and tuberculate macroconidia (Figure 1C), characteristic of the fungus H. capsulatum. Because it was a dimorphic fungus, a colony was picked and seeded in a 5% bovine blood agar medium and incubated at 37C and 5% CO2 for conversion of the yeast phase, yielding bright white colonies after 2 weeks of incubation (Figure 1B and 1D). Identification was confirmed by sequencing the ribosomal DNA (rDNA) region. 42 FIGURE 1. Histoplasma capsulatum isolated from bats in the municipality of Botucatu, São Paulo, Brazil. (A) The macroscopic aspect of mycelia of H. capsulatum recovered from the spleen of Molossus molossus after 30 days at 26C; (B) The yeast form of H. capsulatum after 15 days in 5% bovine blood agar incubated at 37C; (C) The microscopic aspect of mycelia on a microculture slide stained with the lactophenol cotton blue, 100 magnification; (D) Microscopic of yeast cells of H. capsulatum stained with lactophenol cotton blue, 100 magnification. 43 Molecular diagnosis According to the nested-PCR technique, 88.85% of bats (153/172) tested positive for fungi in general in at least one of the evaluated organs. Thirteen bats were positive for H. capsulatum. Of these, nine animals showed infection in only one of the organs (three animals with intestinal infection, three with spleen infection, two with liver infection, and one with lung infection), and four bats showed a systemic infection: two bats in the lungs and intestine, one in the liver and intestine, and one with spleen and lung infection (Table 3). Two animals tested positive for Cryptococcus spp.: one bat of the M. molossus species with infection in the spleen and in the lung and another of the Nyctinomops species with infection only in the spleen. Two bats of the M. molossus species tested positive for P. brasiliensis, one with spleen and liver infection, and another with infection of the spleen only (Table 3). One bat, positive for H. capsulatum culture, was negative according to the nested PCR. In the one sample that showed mycelial growth only in the spleen, it was possible to detect H. capsulatum DNA in the spleen and lungs. There was no statistical association between the positivity for the fungi and the variables analysed. 44 Georeferencing FIGURE 2. Distribution of the collection sites for bats positive for H. capsulatum, Cryptococcus spp., and P. brasiliensis in the municipality of Botucatu, SP. 45 DISCUSSION Bats offer favourable conditions for maintenance of several pathogens in their body 12 , these pathogens are associated with the increased prevalence and severity of mycoses in Latin America 13 . This observation reinforces the importance of epidemiological studies on these animals, with the aim to uncover the role of Chiroptera in the transmission of fungal diseases, especially in urban areas. The association of pathogenic fungi and bats, judging by the animals and excrements found mainly in caves and forest areas, has been documented by different authors 14, 15, 16 . The main result of this study is the detection of the natural infection with H. capsulatum, Cryptococcus spp., and P. brasiliensis in bats collected only in urban areas, with fungus-positive animals in households, squares, and municipal public buildings (Figure 2), thus posing a threat to public health. The prevalence of H. capsulatum was 8.1% (14/172), with one bat positive only in microbiological culture, 12 in nested PCR, and one according to both methods, a result that is superior to those reported in other studies on bats, in the State of São Paulo 3, 6 . It is noteworthy that the only technique used in these two studies was the microbiological culture, which has low sensitivity when compared to other diagnostic methods, such as molecular ones. This fact was confirmed in the present study, which showed a prevalence of 2.5% (02/80) when only the microbiological culture was used, a result similar to that obtained by Dias et al. 6 : 3.6% positivity (87/2,427). 46 Sample viability is important for mycological research, and laboratory processing should happen immediately after harvesting of the material to substantially increase the sensitivity of the microbiological culture. Tencante et al. 3 used thawed organs for microbiological culture, and the results were negative for H. capsulatum, suggesting that a fresh culture prepared right after the collection of the material should increase the sensitivity of the technique. Only the animals that arrived alive at the Zoonosis Diagnosis Center were subjected to microbiological culture in the present study because the exact time between the death of the animal and the arrival at the laboratory was unknown. Thus, we believe that the results obtained indeed represent the true role of Chiroptera as a reservoir of the fungi under study. In this study, one fungus-positive bat was identified by the microbiological culture showing cottony colonies from the spleen and liver samples, confirmed as H. capsulatum, and tested negative in the nested-PCR technique in all the organs analysed. On the other hand, eight bats showed to be positive only in nested PCR and negative for culturing (Table 3). We emphasise the importance of using concomitant diagnostic techniques, with the aim to reduce the possibility of misdiagnosis. Bats captured in urban areas usually have lower prevalence of histoplasmosis when compared to the results of studies conducted in caves and forest areas 15, 16 , owing to some characteristics that favour fungal growth in these environments. Nevertheless, a result similar to the finding in the present study was reported by Taylor et al. 14 , with 8.2% positivity for fungal isolation in bats collected from caves in Mexico, an area considered endemic for histoplasmosis. According to georeferencing, the presence of green areas was 47 confirmed at most collection points where fungus-positive bats were found (Figure 2). These data suggest that these animals may live in large colonies in these areas, and eventually migrate to other locations in the urban area in search of food. One of the bats positive for molecular detection of H. capsulatum and Cryptococcus spp. were respectively found in public squares in the cities of Bauru and Botucatu (Figure 2). Studies have already shown isolation of virulent strains of Cryptococcus spp. from excrement and soil samples in public areas, most associated with pigeons 17, 18, 19 . The detection of fungus-positive bats at these sites suggests that they may also contribute to the transmission of these fungi in open places. Many public squares in Brazil serve as a shelter for birds and bats, and the concentration of dry excrement poses a health risk for regular visitors, especially children and immunocompromised people. Therefore, it is recommended that the urban cleaning service act regularly in these places, in order to reduce the risk of infection. Bats positive for H. capsulatum were also found in residential yards (Figure 2), indicating the risk that these animals represent to humans and domestic animals in a domestic environment. The presence of bats in households is common in urban areas, especially in spring and summer, because bats breed in this period 20 . Accordingly, microenvironments contaminated with bat faeces can be a source of infection for animals and humans. There have been reports of animals and humans with acute histoplasmosis, with bat faeces in households assumed to be the most probable transmission route, as already described in other Brazilian cities 21, 22 . 48 In urban centres, cryptococcosis is closely related to the presence of pigeon excrements 17, 18, 23, 24 . In the present study, two bats positive for Cryptococcus spp. were found: one animal was found in a household yard of a residential neighbourhood, and the other was lying in a public square next to the city‟s Shopping Mall, a place frequently crowded. The results obtained in this study support the active role of bats as a source of Cryptococcus spp. in residential areas, as demonstrated by Lazéra et al. 25 , who isolated Cryptococcus from bat faeces collected in urban areas of Rio de Janeiro. In Rondônia, there is a report of a death due to cryptococcal meningitis, with bat faeces as the probable source of infection. The patient contracted the infection by cleaning his house basement without the use of adequate individual protective equipment 26 . The relation between bats and P. brasiliensis was first reported in Colombia, in 1965, in the intestinal tract of three frugivorous bats of the species Artibeus lituratus 27 although this finding has not been reproduced in later studies. In the present work, it was confirmed that bats may host the fungus naturally in their body, as verified in other species of wild animals 28 . In both P. brasiliensis positive bats here, the presence of the fungus was verified only in the spleen and liver, indicating that there was no involvement of the intestine, which would be a possible elimination route of the infectious agent through. The role of bats in the epidemiological chain of paracoccidioidomycosis needs to be further investigated, to elucidate whether these animals are an infection source (i.e. carriers) or merely susceptible to the infection in question. Systemic infection was identified in six animals, four with H. capsulatum, one with Cryptococcus spp., and one with P. brasiliensis, whose molecular detection was shown in 49 two organs (Table 3). The infection was confirmed to be predominant in the spleen (nine cases), followed by the intestine (six), liver (five) and lungs (five cases). Grose et al. 29 also diagnosed systemic infection in bats, with the isolation of Cryptococcus neoformans from the liver and small intestine of three specimens and from the spleen and large intestine in two specimens. Mók et al. 30 studied the fungal microbiota in bats and found no predilection of fungal colonisation for any of the internal organs, indicating similar predisposition of bat tissues to serve as a suitable substrate for fungal development. Those authors proposed that there is a commensal relation between fungi and bats. As for sex, male predominance was observed in the evaluation of positivity for H. capsulatum, Cryptococcus spp., and P. brasiliensis, in contrast to the findings of Dias et al. 6 Reproduction and lactation are expensive physiological processes for females in terms of energy 31 ; males, on the other hand, show greater dispersion in search of food and breeding areas 32 ; consequently, they come into contact with different ecosystems, becoming more susceptible to infection by a greater variety of microorganisms. Among the species evaluated, 95.3% (164/172) of the specimens were insectivorous, as were 85.7% (12/14) of the bats positive for H. capsulatum and 100% (02/02) of the bats positive for Cryptococcus spp. and P. brasiliensis. These data are different from what was reported by Tencante et al. 3 , who found an equal proportion of frugivorous and insectivorous species captured in Araçatuba, SP. In nature, ~70% of the species of bats are insectivorous 33 . Public lighting distributed along the streets and avenues becomes a great attraction for insectivorous animals with a nocturnal lifestyle; these public 50 lighting devices thus become a timely source of food because of the high concentration of insects around light poles 34 . Molossus molossus was the species with the highest positivity for H. capsulatum, with two bats positive for P. brasiliensis and one specimen positive for Cryptococcus spp., in agreement with the findings of Corrêa et al. 35 , who reported that M. molossus and A. lituratus are the species infected with the largest number of pathogens. Molossids are described by ZCCs as the most frequently bats found in buildings 34 , especially under roofs, in various structures, and in tree hollows 33 , in line with the data of the present study, where of the 172 animals collected, 146 were molossids. Environmental imbalance resulting from anthropic action on ecosystems has forced bats to develop synanthropic habits, adapting very well to large urban centres 34 . It would be opportune if the Epidemiological Surveillance Agency, as it already has done for the control of rabies in urban bats 36 , also carried out regular research on other diseases, such as histoplasmosis, thus offering an important tool for monitoring the distribution of fungi in urban perimeters, besides helping to control the relevant diseases in humans and animals. It is worth noting that bats are part of the Brazilian fauna; therefore, they have been protected by law since 1998, and the use of chemical substances for population control is prohibited, as used to be done to control hematophagous bats 36 . Therefore, management measures should be guided by the Epidemiological Surveillance Agency, with the aim to reduce the population of bats in the domestic environment and to minimise the risk of transmission of severe fungal infections, among other zoonotic diseases. 51 TABLE 1. Distribution of bats received at the Zoonosis Diagnosis Center, FMVZ-UNESP, in the city of Botucatu, SP, from April 2015 to May 2016, by municipalities where they were found; Botucatu, 2016. FAMILY/SPECIES CITIES* 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Total Phyllostomidae Artibeus spp. 4 4 Desmodus rotundus 1 1 Glossophaga soricina 3 3 Vespertilionidae Eptesicus spp. 5 5 Histiotus velatus 4 1 5 Lasiurus cinereus 1 2 3 Myotis nigricans 4 1 5 Molossidae Molossus spp. 1 1 3 79 4 1 4 1 1 95 Eumops spp. 1 1 4 31 5 2 2 1 47 Nyctinomops spp. 4 4 Total 1 1 2 8 137 9 1 7 2 1 1 2 172 *Cities: 1 = Anhembi; 2 = Bariri; 3 = Barra Bonita; 4 = Bauru; 5 = Botucatu; 6 = Dois Córregos; 7 = Igaraçu do Tietê; 8 = Itatinga; 9 = Lençóis Paulista; 10 = Pardinho; 11 = Pereiras; 12 = São Manuel 52 TABLE 2: A list of primers described in the literature for use in PCR and nested PCR. The table shows the microorganism, size of the amplicon in base pairs, sequence, cycling profile, and references. Microorganism Amplicon primers Sequence cycling profile References Fungi in general 634 bp ITS4 5‟-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3‟ 94C/5min 94C/1min 25X 60C/2min 72C/2min 72C/7min WHITE et al., 1990 ITS5 5‟-GGAAGTAAAAGTCGTAACAACG-3‟ Histoplasma capsulatum 391 bp HCI 5‟-GCGTTCCGAGCCTTCCACCTCAAC-3‟ 94C/5min 96C/45s 20X 55C/1 min 72C/1 min 72C/10 min NORKAEW et al., 2013 HCII 5‟-ATGTCCCATCGGGCGCCGTGTAGT-3‟ 210 bp HCIII 5‟-GAGATCTAGTCGCGGCCAGGTTCA-3‟ 94C/5 min 96C/45s 30x 55C/1min 72C/1 min 72C/10 min HCIV 5‟-AGGAGAGAACTGTATCGGTGGCTTG-3‟ Cryptococcus spp. 415 bp ITS1 5‟-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3‟ 94ºC/5 min 94ºC/1 min 30x 62ºC/1 min 72ºC/2 min 72ºC/10 min RAPELLI et al., 1998 CN4 5‟- ATCACCTTCCCACTAACACATT -3‟ 115 bp CN5 5‟- GAAGGGCATGCCTGTTTGAGAG-3‟ 94ºC -5 min 94ºC-1 min 35x 61ºC-1 min 72ºC- 2 min 72C-10 min CN6 5‟- TTTAAGGCGAGCCGACGTCCTT -3‟ Paracoccidioides brasiliensis Nested PCR 387 bp PbITSE 5‟-GAGCTTTGACGTCTGAGACC-3‟ 94C-5min 94C-1min 30X 62C-2min 72C-2min 72C-10min THEODORO et al., 2005 PbITSR 5‟-AAGGGTGTCGATCGAGAGAG-3 ‟ 53 TABLE 3. Frequency of bats positive for Histoplasma capsulatum, Cryptococcus spp., or Paracoccidioides brasiliensis according to nested PCR and microbiological culture, along with some other characteristics; Botucatu, 2016. Fungi analyzed Species/Feeding habits Sex/Age City Microbiological culture Nested- PCR Histoplasma capsulatum Eumops glaucinus/ Insectivorous Male/ adult Botucatu - + (S) Eumops glaucinus/ Insectivorous Male/ adult Botucatu - + (S) Molossus molossus/ Insectivorous Female/ young Itatinga ND + (I) Artibeus lituratus/ Frugivorous Male/ young Botucatu - + (L; I) Eumops auripendulus/ Insectivorous Male/ adult Botucatu - + (I; Lu) Glossophaga soricina/ Nectarivorous Male/ adult Botucatu ND + (I) Molossus molossus/ Insectivorous Male/ adult Botucatu - + (I) Molossus molossus/ Insectivorous Male/ adult Botucatu - + (S) Eumops glaucinus/ Insectivorous Female/ adult Botucatu - + (Lu) Molossus molossus/ Insectivorous Male/ adult Botucatu ND + (I; Lu) Molossus molossus/ Insectivorous Female/ adult Botucatu + (S; L) - Eumops auripendulus/ Insectivorous Male/ young Bauru ND + (L) Eumops glaucinus/ Insectivorous Male/ young Botucatu - + (L) Eptesicus brasiliensis/ Insectivorous Female/ adult Botucatu + (S) + (S; Lu) Cryptococcus spp. Molossus molossus/ Insectivorous Male/ adult Botucatu ND + (S; Lu) Nyctinomops spp./Insectivorous Male/ adult Botucatu - + (S) Paracoccidioides brasiliensis Molossus molossus/ Insectivorous Female/ young Botucatu ND + (S; L) Molossus molossus/ Insectivorous Male/ adult Botucatu - + (S) *S = Spleen; L = Liver; I = Intestine; Lu = Lung; + =Positive; - = Negative; ND = Not done 54 ACKNOWLEDGMENTS This work was supported by São Paulo State Research Foundation - FAPESP (Grants 2014/23234-0 and 2015/07627-4). 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A cadeia epidemiológica deste agente não está completamente definida, e estudos envolvendo espécies silvestres é de extrema importância para elucidar possíveis fontes de infecção deste fungo. Desta forma, medidas de manejo ambiental devem ser orientadas pelo Serviço de Vigilância Epidemiológica Municipal, para diminuir a população de morcegos no ambiente doméstico e assim minimizar os riscos de transmissão de infecções fungícas graves. Ressalta-se, portanto, a importância do monitoramento efetivo de quirópteros, detectando áreas com maior aglomeração desses animais no perímetro urbano e assim diminuir as chances de transmissão de agentes patogênicos oriundos destes animais. A associação de técnicas diagnósticas é uma medida que deve ser realizada sempre que possível, limitando a possibilidade de resultados falso-negativos. 59 BIBLIOGRAFIA AJELLO, L.; GREENHALL, A.M.; MOORE, J.C. Occurrence of Histoplasma capsulatum on the Island of Trinidad, B. W. 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