BIANCA CARVALHO DE ALMEIDA Avaliação da citotoxicidade de biomateriais nanocompostos de poliamida 6 e nanopartículas de trimetafosfato decoradas com nanopartículas de prata Araçatuba – SP 2023 BIANCA CARVALHO DE ALMEIDA Avaliação da citotoxicidade de biomateriais nanocompostos de poliamida 6 e nanopartículas de trimetafosfato decoradas com nanopartículas de prata Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Faculdade de Odontologia de Araçatuba da Universidade Estadual Paulista (Unesp), como parte dos requisitos para obtenção do título de Cirurgião- Dentista. Orientador: Prof. Alberto Carlos Botazzo Delbem Araçatuba – SP 2023 Dedico este trabalho à Deus por ter me dado sabedoria e direcionamento e aos meus pais, Cinara e Luciano por terem sido meu alicerce durante toda vida. AGRADECIMENTOS Estes agradecimentos são para as pessoas que fizeram parte da minha trajetória ao longo de todas esses anos e que foram indispensáveis para que eu pudesse percorrê-la. A Deus: Obrigada por me dar forças para caminhar todos os dias. O Senhor foi tão generoso comigo, quando me deu sabedoria, saúde e pessoas tão iluminadas. Obrigada, Papai, por guiar meus passos e cuidar de cada detalhe. TUDO foi graças ao Senhor. Aos meus pais: Pai, obrigada por nunca soltar a minha mão e por me apoiar em todas as minhas decisões. Esse sonho só pôde se tornar real, graças à confiança que depositou em mim. Saiba que seu abraço muitas vezes foi meu impulso para continuar. Mãe, obrigada por sempre se fazer tão presente mesmo a quilômetros de distância. Cada passo da minha caminhada tinha por trás uma mulher forte e guerreira, em quem eu sempre pude me espelhar. Obrigada por confiar em mim e sonhar meus sonhos comigo. Ao meu irmão: Lu, você é meu sonho realizado. Minha luta diária sempre tinha uma razão. Você, pequeno, foi meu combustível. Seu jeitinho carinhoso e cheio de amor sempre me fazia enxergar que eu era e precisava ser capaz de vencer. Você via em mim uma figura de exemplo e isso, com certeza, me fez lutar. Eu queria que soubesse que a sua irmã estaria sempre aqui, forte e disponível para você. Aos meus avós: Vovó Bernadete, agradeço por sempre pedir a Deus que me desse sabedoria para que eu pudesse concluir esse ciclo. A senhora foi quem me ensinou a estudar e isso me impulsionou a lutar por minha formação. Obrigada por tantas vezes ter feito do seu colo, meu aconchego. Vovó Ana, sou grata por tantas vezes ter me ouvido. Com a senhora pude ver como existem diferentes formas de demonstrar amor e afeto. Obrigada por fazer de cada uma das minhas tarefas, também as suas. Vovô Jairo, pra mim o senhor é um grande exemplo de que persistir é sempre o melhor caminho para alcançar nossos objetivos. Seu apoio foi indispensável. Obrigada por vibrar por cada uma das minhas vitórias e se orgulhar tanto de mim. Vovô Pepida, o senhor esteve presente em cada segundo, desde que eu ainda estava na barriga da minha mãe. Seu amor é tão puro e especial. Obrigada por me carregar no colo, por cada conversa, mensagem e ligação. Você é alicerce. À minha madrasta: Cássia, obrigada por se fazer presente durante todos esses anos e me presentear com a minha razão de lutar, meu irmãozinho Luciano. Aos meus tios: Tio Leonardo, sou grata por nossas conversas, por me aconselhar e me compreender sempre. Vivi e vivo, ao seu lado, momentos inesquecíveis e de muita alegria. Não troco nossa parceria por nada. Sorte a minha ter você, Peeta. Tia Sônia, obrigada por cada conselho, cada abraço e cada demonstração de amor. Sou grata por confiar em mim, em momentos que nem eu confiava. E por nunca me deixar desistir. Seu abraço é como um lar. Tia Eliana, obrigada por ter cuidado tão bem de mim e ter me dado tanto amor. Alto astral e muitas risadas sempre estiveram presentes nos nossos momentos juntas. Obrigada por ser fonte de alegria. Tio Leandro, obrigada por se alegrar tanto pelas minhas conquistas e pelo seu jeito único de demonstrar carinho e afeto. O sorriso que sempre abre, ao me ver chegar, já diz tudo. Às minhas bisas (in memorian): Maria e Quintina, vocês foram para mim exemplos de sabedoria e amor e me deixaram ensinamentos que ficarão para sempre em meu coração. Obrigada por terem olhado por mim e me cuidado de longe. Tenho certeza que, de onde estiverem, serão capazes de sentir minha gratidão. Ao meu namorado: Pedro, você esteve comigo em cada segundo dessa jornada. Sem seu apoio e amor, eu jamais conseguiria chegar até aqui. Obrigada por cuidar de cada detalhe, por confiar tanto no meu pontencial e por ter me dado a mão para levantar, o ombro para deitar e o peito para dormir. Sou grata por ter um homem tão incrível ao meu lado. Seu amor foi essencial. À minha sogra: Dona Laura, obrigada por sempre vibrar por mim. Você foi quem confiou que eu era capaz de passar no vestibular da UNESP e me deu todo apoio sempre. Ter sido sua aluna me fez ver o quão lindo e precioso é transmitir amor em nosso trabalho. Obrigada por ser minha confidente, amiga e ser dona de um abraço tão cheio de amor. Ao meu sogro: Neto, obrigada pelo apoio sempre e pelas inúmeras risadas que você conseguiu me arrancar em dias difíceis. Aos meus amigos: Bruna Martins, Bruna Estevão, Rafaella e Matheus Volfe, sou tão grata por ter vocês durante todos esses anos na minha vida. Obrigada por terem sido essenciais para que eu pudesse estar na UNESP. A escola me deu uma família e vocês, com certeza, são os irmãos mais especiais que eu poderia ter. Que bom que o tempo e as trajetórias não foram capazes de apagar o companheirismo e o amor que temos uns pelos outros. Laura Souza, obrigada por cada momento. Ter conhecido você foi, sem dúvida, indispensável para minha permanência em Araçatuba. Obrigada por cada jantinha, cada dia que você tirou para que pudéssemos cultivar essa nossa amizade tão especial e pelo companheirismo sempre. Espero ter você para sempre na minha vida, mesmo que distante. Maria Paula, obrigada por sua dedicação, seus carinho e cuidado. Sou grata por seus abraços, na clínica, em dias difíceis, e por tantas vezes completar meu coraçãozinho. Que o tempo não seja capaz de nos afastar. Emmily, você foi uma das primeiras amigas que fiz em Araçatuba e que, em pouquíssimo tempo, se tornou uma irmã. Obrigada por não ter me deixado desistir e confiado tanto em mim. Sou grata por ter você e por cada memória ao seu lado. Júlia Moro, você foi quem me inspirou e incentivou a permanecer na odontologia. Sempre tive você como exemplo de estudante e profissional. Obrigada por me socorrer tantas vezes em diversas situações e sobretudo por me fazer enxergar o quão longe eu poderia chegar, se me dedicasse. Matheus Fonseca, obrigada por seus abraços calorosos todos os dias de manhã e por ser esse amigo tão alto astral. Little, sou grata por cada risada, cada gesto de carinho e por ser responsável por alegrar as manhãs cinzentas. Geórgia, sua amizade surgiu num momento em que minha vida acadêmica estava tão turbulenta e você, com seu jeitinho carinhoso, se aproximou e me ajudou muito. Obrigada por todas as vezes que esteve ao meu lado e por nossa parceria. Emili, Analigia e Ana, obrigada por terem me acolhido tão bem desde o primeiro dia de aula e por terem aguentado minhas crises no primeiro ano. Doany e Beatriz Costa, vocês foram minhas duplas de clínica, mas, além disso, foram grandes companheiras nessa jornada. Obrigada por nossa parceria e pela oportunidade de evoluirmos juntas a cada procedimento. Sou grata pela compreensão e acolhimento de vocês. À Escola Presidente Vargas: Minha eterna gratidão por tudo o que aprendi e vivi. Para mim, a escola sempre foi um lar. Sem esse ambiente de amor e aprendizado, eu jamais conseguiria chegar até aqui. Obrigada a cada um da família PV, essa conquista é nossa. À minha Banca: Meu Orientador, Profº Alberto Delbem, que foi indispensável para a concretização deste trabalho. Agradeço por me orientar tanto no TCC, quanto nos meus dois anos de Iniciação Científica. Obrigada pela oportunidade de trabalharmos juntos, por cada ensinamento e pela paciência. Leonardo Morais, sou grata por nossa parceria. Obrigada por sempre ter me incentivado e por confiar sempre que eu era capaz. Todas as minhas apresentações tinham, na retaguarda, um pós graduando incrível e que me dava todo suporte do mundo. Você esteve presente em cada detalhe deste trabalho e ele é tão seu quanto meu. Profº. Daniela Micheline, agradeço por seu profissionalismo e por ser uma pessoa tão bondosa. Sem dúvidas, levarei para sempre comigo cada ensinamento seu. Não só profissional, mas, também, sobre a forma empática e carinhosa com que trata as pessoas. Me sinto privilegiada por ter sido sua aluna e orientada na clínica. Aos funcionários: Obrigada por estarem sempre dispostos a nos ajudarem e por tornarem nossos dias mais leves. A dedicação de vocês fez com que eu pudesse chegar todos os dias na faculdade e saber que sempre estaria tudo em ordem e que eu sempre poderia contar com o apoio de pessoas tão solícitas. À FOA UNESP: Obrigada por ter sido minha casa durante esses quase 6 anos e por ter me proporcionado momentos felizes e de muito aprendizado. A estrutura da faculdade foi, sem dúvidas, indispensável para meu crescimento pessoal e profissional. Sou grata por fazer com que meu caminho cruzasse com o de profissionais e amigos tão incríveis. ” Tu te tornas eternamente responsável por aquilo que cativas ” O Pequeno Príncipe “ O sucesso nasce do querer, da determinação e persistência em se chegar a um objetivo. Mesmo não atingindo o alvo, quem busca e vence obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis.” José de Alencar ALMEIDA, B. C. Avaliação da citotoxicidade de biomateriais nanocompostos de poliamida 6 e nanopartículas de trimetafosfato decoradas com nanopartículas de prata. 2023. 28 f. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação) - Faculdade de Odontologia, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba, 2023. RESUMO A perda de tecido causado pela cárie dentária ou por traumas incentivam pesquisas na área da engenharia tecidual, com biomateriais, na intenção de regenerar a estrutura e reestabelecer forma e função. Esse estudo avaliou a citotoxicidade de biomateriais nanocomposto de poliamida 6, trimetafosfato de sódio (TMP) e nanopartículas de prata (AgNP) para o desenvolvimento de novos biomateriais. Fibroblastos (NIH/3T3) foram cultivados em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino a 37 ºC, 100% de umidade e 5% CO2. As células foram subsequentemente semeadas em placas de 96 poços (104 células/poço) juntamente com os nanocompostos (P6, P6-2,5% TMP, P6-5% TMP e P6-10% TMP) e incubadas por 24 h, nas mesmas condições descritas acima. A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio do brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5- difeniltetrazólio (MTT), após 24, 48 horas e 72 horas. Os resultados foram submetidos à ANOVA a dois critérios, seguidos pelo teste de Student- Newman-Keuls (p<0,05). Os grupos com P6-TMP apresentaram maior viabilidade quando comparado aos grupos com AgNP, independentemente do tempo (p<0,05). Os grupos com AgNP, mostraram viabilidade celular reduzida para todas as diluições, com maior redução no tempo de 24 h, quando comparado a 48h e 72 horas (p<0,05). Todos os grupos apresentaram um aumento da viabilidade no tempo de 72 horas (p<0,05). Conclui-se que a associação do TMP e a AgNP no período de 72 horas reduz a citotoxicidade dos fibroblastos se mostrando como um composto interessante para o desenvolvimento de novos biomateriais. Palavras-chave: Nanocomposto. Fosfatos. Nanopartículas. prata. ALMEIDA, B. C. Assessment of the cytotoxicity of nanocompounds biomaterials composed of polyamide 6 and trimetaphosphate nanoparticles decorated with silver nanoparticles. 2023. 28 f. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação) - Faculdade de Odontologia, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba, 2023. ABSTRACT Tissue loss caused by dental caries or trauma encourages research in tissue engineering, with biomaterials, with the intention of regenerating structure and reestablishing form and function. This study evaluated the cytotoxicity of polyamide 6 nanocompounds biomaterials, sodium trimetaphosphate (TMP) and silver nanoparticles (AgNP) for the development of new biomaterials. Fibroblasts (NIH/3T3) were cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum at 37°C, 100% humidity and 5% CO2. The cells were subsequently seeded in 96-well plates (104 cells/well) together with the nanocompounds (P6, P6-2.5% TMP, P6-5% TMP and P6-10% TMP) and incubated for 24 h in the same conditions described above. Cell viability was assessed by the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay after 24, 48 and 72 hours. The results were submitted to two-way ANOVA, followed by the Student-Newman-Keuls test (p<0.05). Groups with P6-TMP showed greater viability when compared to groups with AgNP, regardless of time (p<0.05). The AgNP groups showed reduced cell viability for all dilutions, with a greater reduction at 24 h, when compared to 48 h and 72 h (p<0.05). All groups showed an increase in viability at 72 hours (p<0.05). It is concluded that the association of TMP and AgNP within 72 hours reduces the cytotoxicity of fibroblasts, showing itself as an interesting compound for the development of new biomaterials. Keywords: Nanocompounds. Phosphates. Nanoparticles. Silver. LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Imagens de MEV das fibras de P6 e de seus nanocompostos. A: Fibra de P6. B: Nanocomposto P6-TMP2,5%. C: Nanocomposto P6-TMP-5%. D: Nanocomposto P6-TMP-10% 19 Figura 2 - Histogramas das fibras de P6 e de seus nanocompósitos. A: Fibra de P6. B: Nanocompósito P6-TMP-2,5%. C: Nanocompósito P6-TMP-5%. D: Nanocompósito P6-TMP-10% 20 Figura 3 - Histogramas de EDX das fibras de P6 e de seus nanocompósitos. A: Fibra de P6. B: Nanocompósito P6-TMP-2,5%. C: Nanocompósito P6- TMP-5%. D: Nanocompósito P6-TMP-10% 20 Figura 4 - Viabilidade dos fibroblastos NIH/3T3 determinada por um ensaio MTT de acordo com os grupos de P6-TMP com e sem Ag e o tempo de ensaio. Letras minúsculas distintas mostram diferença entre os grupos e tempo de ensaio (p<0,05). Barras verticais indicam desvio-padrão 21 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 14 2 MATERIAIS E MÉTODOS 16 2.1 Preparação dos nanocompostos PA6 e TMP-AgNP 16 2.2 Avaliação da citotoxicidade de nanocompostos PA6 e TMP-AgNP 17 2.3 Análise Estatística 18 3 RESULTADOS 19 3.1 Síntese e Caracterização das membranas P6-TMP-AgNP 19 3.2 Avaliação da citotoxicidade pelo ensaio MTT 21 4 DISCUSSÃO 22 5 CONCLUSÃO 24 REFERÊNCIAS 25 14 1 INTRODUÇÃO O trimetafosfato sódio (TMP) é o ciclofosfato muito estudado para aplicações odontológicas (MANNA et al., 2014) devido a sua ação anticárie (DANELON et al., 2013; GONZALEZ, 1971) por intermédio da adsorção do ciclofosfato na superfície do esmalte dentário (MANARELLI et al., 2014), o qual facilita a difusão de cátions para o esmalte dentário (DELBEM et al., 2012). Reduzir o tamanho das partículas do TMP pode ser uma estratégia eficiente para aumentar o seu potencial anticárie. Estudos recentes demostraram que a adição de nanopartículas de TMP, ao invés do material comercial micrométrico, aos dentifrícios fluoretados foi eficaz no processo de remineralização do esmalte dentário in situ (DANELON et al., 2015). O desenvolvimento destas nanopartículas de ciclofosfatos propiciou o aumento do efeito anticárie, utilizando menores quantidades de fosfatos em dentifrícios fluoretados (TAKESHITA et al., 2015). Recentemente, a Poliamida 6 (P6) passou a ser estudada em engenharia tecidual óssea devido às suas excelentes propriedades mecânicas resultadas a partir da ligação de hidrogênio entre os grupamentos amida presentes nas macromoléculas de P6 (ABDAL-HAY; HAMDY; KHALIL, 2015; SHEN et al., 2010), biocompatibilidade (SHEN et al., 2011), atoxicicidade (PANT et al., 2013a), diferentes morfologias como fibras, baixo custo, estabilidade química e térmica (ABDAL-HAY; TIJING; LIM, 2013). No entanto, características superficiais, como a hidrofilicidade e a baixa funcionalidade da PA6, dificultam a sua aplicação como scaffold (PANT; KIM, 2013). Para minimizar ou solucionar este problema, a funcionalização da PA6 com grupos fosfato tem sido utilizada para iniciar a mineralização in vitro de tecidos ósseos e dentários (WINTGENS et al., 2013). Cheng et al. (2013) mostrou que o nanocomposto de PA6 com nanohidroxiapatita agiu como um template para a adesão, crescimento e proliferação de células. Pant et al. (2013a, 2013b) verificaram que nanocompostos formados a partir de nanofibras de P6 apresentaram atoxicicidade e proliferação de células osteoblásticas. Venkatesan e Kim 15 (2014) relataram que nanocomposto de P6 com fosfato apresentaram osteogênese. Entretanto, nem o P6 e nem o TMP (EREM et al., 2013; MENDES- GOUVÊA et al., 2018) apresentam atividade antimicrobiana. Quando o TMP é impregnado com nanopartículas de prata (AgNP), este composto demonstra significante atividade antimicrobiana contra Streptococcus mutans e Candida albicans (GOUVEA et al., 2016). As AgNP apresentam estabilidade (MENDES-GOUVÊA et al., 2018), baixa toxicidade e atividade antimicrobiana contra Streptococcus mutans e Candida albicans (FERNANDES et al., 2017; SOUZA et al., 2016). Porém, não só o tipo de fosfato (inorgânico ou orgânico) associado à AgNP pode influenciar na ação antimicrobiana (FERNANDES et al., 2017; MENDES-GOUVÊA et al., 2018), mas também a rota utilizada para estas sínteses como a via química ou a via “green” (SAUVESUK et al., 2016). Assim, quando AgNP são associadas a novos compostos é necessária à realização de novos testes para determinar se os compostos sintetizados apresentarão comportamentos biológicos diferentes. Considerando que a cárie na infância é um problema preocupante à saúde pública e tomando como base os recentes avanços na área de novos materiais a partir do advento da nanotecnologia, seria interessante o desenvolvimento de uma nova família de materiais nanocompostos que apresentem ação antimicrobiana e baixa citotoxicidade para serem empregados como scaffold para a regeneração de tecidos dentários baseados na PA6, nanopartículas de TMP e decorados com AgNP. 16 2 MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Preparação dos nanocompostos PA6 e TMP-AgNP As nanopartículas de TMP foram obtidas empregando uma metodologia de moagem otimizada por nosso grupo de pesquisas para a produção de grandes quantidades de TMP nanométrico (23 nm) para a formulação de dentifrícios ativos contra a ação de cáries, como descrito por Danelon et al. (2015). TMP imerso em isopropanol é moído utilizando bolinhas de zircônia durante 48 horas. A síntese das AgNP foi realizada de acordo com o proposto por Lee e Oh (2015). O método consiste na redução dos íons Ag+ utilizando etanol que atuará como solvente e como agente redutor para a formação das AgNP. A produção das nanofibras de P6 foi realizada seguindo a metodologia proposta por Andre et al. (2015). A P6 (MW= 20000 g.mol-1) foi solubilizada em ácido fórmico em uma concentração de 15% (m/v) sob agitação magnética constante por 5 h à 25°C. Em seguida, a solução homogeneizada foi eletrofiada em um aparelho de electrospinning com uma tensão de 25 kV e vazão de 10 µL.hora-1 empregando um substrato coletor de óxido de estanho dopado com flúor (FTO) posicionado a uma distância de 10 cm da seringa. Os nanocompostos de P6 com TMP nanoparticulado foram preparados como descrito por Mi et al. (2014). As amostras de P6 e de TMP foram solubilizadas em ácido fórmico sob agitação magnética constante por 5 horas à 25 °C em que foram variadas as concentrações de TMP em relação a massa de P6 (2,5, 5 e 10%). Posteriormente, a solução foi eletrofiada em um aparelho de electrospinning empregando as condições otimizadas na eletrofiação do P6. A impregnação de AgNP aos nanocompostos de P6-TMP nas concentrações de 2,5, 5 e 10% foi realizada pela imersão das membranas em 15 mL de uma solução de AgNP em concentração de 12 mM, durante 24 horas a temperatura ambiente. Para investigação da morfologia das fibras foram obtidas imagens 17 utilizando-se um microscópio eletrônico de varredura FEG-VP Zeiss Supra 35 (“Field Emission Electron Guns”), após recobrimento da superfície das amostras com ouro (sputtering) visando elevar a condutividade do material. A verificação da incorporação das nanopartículas de TMP e prata nas fibras de P6 foi realizada pela técnica de espectroscopia de raios X por dispersão de energia (EDX). Os diâmetros das fibras foram avaliados utilizando o software ImageJ. Para cada amostra a distribuição e diâmetro médio foi determinado a partir da análise de 200 fibras. 2.2 Avaliação da citotoxicidade de nanocompostos P6 e TMP-AgNP As células de fibroblastos da linhagem NIH/3T3 foram cultivadas em meio de cultura DMEM, suplementado com 10% soro fetal bovino (SBF), penicilina G (100 U/mL), estreptomicina (100 µg/mL), anfotericina B (25 µg/mL) e incubadas em estufa a 37 ºC, com 5 % de CO2. As células foram sub-cultivadas a cada 5-7 dias, usando solução salina 0,9 % para lavá-las e tripsina 0,25 % para desagregá-las do frasco. Após desagregação, as células foram centrifugadas a 3000 rpm por 5 minutos a 15ºC, ressuspendidas em meio DMEM completo (suplementado com SBF). Os meios de cultura e demais reagentes utilizados no cultivo das células foram adquiridos da Gibco®. Os fibroblastos, sub-cultivados foram inoculados em microplacas de 96 poços a uma densidade de 1x104 células/poço. Em seguida, os nanocompostos P6 e TMP com e sem AgNP foram adicionadas aos poços da placa contendo as células e incubadas em estufa a 37 ºC, com 5 % de CO2. A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio do brometo de 3- (4,5- dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT), após 24, 48 e 72 horas. Para tanto, foram retirados o meio de cultura com os nanocompostos e adicionados em cada poço 10 μL de solução de MTT (0,5 mg / mL) em DMEM sem SBF (1:10). A solução de MTT foi removida após 4 horas de incubação, os cristais de formazan foram dissolvidos em 100 μL de álcool isopropílico. 18 A placa foi deixada em temperatura ambiente em uma câmara escura por 30 minutos em um agitador rotativo. A absorbância das placas foi avaliada a 550 nm usando uma leitora de microplacas (Eon Microplate Spectrophotometer; Bio Tek, Winooski, EUA). Todos os ensaios foram realizados em triplicata. 2.3 Análise Estatística A análise estatística foi realizada utilizando o software SigmaPlot 12.0 (Systat Software Inc., San Jose, USA) (p<0,05). O experimento foi realizado em triplicata, em três momentos diferentes. A normalidade dos dados foi verificada pelo teste de Shapiro - Wilk, seguido por ANOVA bidirecional a dois critérios, seguidos pelo teste de Student-Newman-Keuls (Software SigmaPlot 12.0, Systat Software Inc., San Jose, CA, EUA). A análise foi realizada com um nível de significância de 5%. 19 3 RESULTADOS 3.1 Síntese e Caracterização das membranas P6-TMP O processo de eletrofiação das membranas produziu fibras homogêneas, sem porosidades ou defeitos na superfície (Figura 1). No entanto, uma análise detalhada da imagem de MEV do nanocompósito P6- TMP-10% mostrou a presença de fibras com largura muito pequena, conhecida como spider-net. Figura 1 - Imagens de MEV das fibras de P6 e de seus nanocompostos. A: Fibra de P6. B: Nanocomposto P6-TMP-2,5%. C: Nanocomposto P6-TMP- 5%. D: Nanocomposto P6-TMP-10% Fonte: Autor, 2023 O diâmetro das fibras (Figura 2) mostra que com a inserção de TMP o diâmetro médio das fibras tende a aumentar variando de 140 ± 37 nm à 433 ± 74 nm. Os elementos químicos sódio (Na) e fósforo (P) e prata (Ag) foram detectados pela análise do EDX (Figura 3). Figura 2 - Histogramas das fibras de P6 e de seus nanocompósitos. A: Fibra de P6. B: Nanocompósito P6-TMP-2,5%. C: Nanocompósito P6-TMP-5%. 20 D: Nanocompósito P6-TMP-10% Fonte: Autor,2023 Figura 3 - Histogramas de EDX das fibras de P6 e de seus nanocompósitos. A: Fibra de P6. B: Nanocompósito P6-TMP-2,5%. C: Nanocompósito P6- TMP-5%. D: Nanocompósito P6-TMP-10% Fonte: Autor, 2023 21 3.2 Avaliação da citotoxicidade pelo ensaio MTT Os grupos com P6-TMP apresentaram maior viabilidade quando comparado aos grupos com AgNP, independentemente do tempo (p<0,05). Os grupos com AgNP, mostraram viabilidade celular reduzida para todas os grupos, com maior redução no tempo de 24 h, quando comparado a 48 e 72 horas (p<0,05). Todos os grupos apresentaram um aumento da viabilidade no tempo de 72 horas, (p<0,05). (Figura 4). Figura 4 - Viabilidade dos fibroblastos NIH/3T3 determinada por um ensaio MTT de acordo com os grupos de P6-TMP com e sem Ag e o tempo de ensaio. Letras minúsculas distintas mostram diferença entre os grupos e tempo de ensaio (p<0,05). Barras verticais indicam desvio-padrão Fonte: Autor, 2023 Grupos V ia b il id ad e ce lu la r (% ) 22 4 DISCUSSÃO O avanço tecnológico tem impulsionado a pesquisa e o desenvolvimento de novos biomateriais para o tratamento e recuperações de lesões ocasionadas por traumas e doenças degenerativas (O'BRIEN, 2011; ZADPOOR, 2013). No campo da odontologia, o foco tem sido o combate à doença cárie (GU et al., 2010). O presente estudo sintetizou membrana de P6 impregnadas com nanoparticulas de TMP decoradas com AgNP, mostrando que os grupos com AgNP são citotóxicas para os fibroblastos e os grupos com nanopartículas de TMP apresentaram menor citotoxicidade se mostrando como um composto interessante para o desenvolvimento de novos biomateriais. De acordo a síntese e caracterização das membranas este apresentou resultados promissores, visto que as fibras se apresentaram homogêneas, sem porosidade e defeitos superficiais, além da incorporação do TMP e a presença das AgNP, quando decoradas. Os grupos com AgNP, mostraram viabilidade celular reduzida para todas os grupos, com maior redução no tempo de 24 h, quando comparado a 48 e 72 horas. Após 24 horas, houve um aumento da viabilidade celular. A diminuição na redução de MTT para formazan no tempo de 24 horas mostra a maior sensibilidade das células às AgNP. No entanto, no presente estudo, foi observado um aumento de células viáveis remanescentes em 48 e 72 h, sugerindo que a capacidade proliferativa foi preservada, no entanto, no tempo de 48 horas os grupos com AgNP ainda se mostraram com menor viabilidade celular do que os grupos com P6-TMP. Ainda assim, em 72 h, a viabilidade celular aumentou para todos os gupos, nao havendo diferença estatistica entre eles. Apesar de seus efeitos citotóxicos e genotóxicos produzidos pelo contato direto dos nanocompositos nas células, estes podem ser clinicamente atenuados ou neutralizados, que atua como barreira física dependendo de sua espessura ou mesmo a interação do AgNP com os componentes do meio pode interferir nos resultados. Dutra-Correa et al. (2018), demonstou isso em seu estudo com AgNP associada a 23 adesivos que também houve um aumento da viabilidade celular no tempo de 72 horas, podendo ser causado pela barreira fisica do adesivo com as celulas testadas, levando a uma possivel neutralização do efeito citotoxico das AgNPs. Apesar dos resultados citotóxicos serem promissores mais estudos ainda se fazem necessários para melhor avaliar a ação remineralizadora e citotóxica desses nanocompostos como a utilização de testes mais precisos e amplos avaliando também outros componentes. 24 5 CONCLUSÃO A síntese dos nanocompostos obtidos por eletrofiação se mostraram estáveis com potencial aplicação para biomateriais odontológicos. Conclui- se que os grupos com AgNP são citotóxicos para os fibroblastos e os grupos com nanopartículas de TMP apresentaram menor citotoxicidade se mostrando como um composto interessante para o desenvolvimento de novos biomateriais. 25 REFERÊNCIAS Abdal-Hay A, Hamdy AS, Khalil KA. 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Materials Today. 2013;16:408-9. https://www.karger.com/Journal/Home/224219 1 INTRODUÇÃO 2 MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Preparação dos nanocompostos PA6 e TMP-AgNP 2.2 Avaliação da citotoxicidade de nanocompostos P6 e TMP-AgNP 2.3 Análise Estatística 3 RESULTADOS 3.1 Síntese e Caracterização das membranas P6-TMP 3.2 Avaliação da citotoxicidade pelo ensaio MTT 4 DISCUSSÃO 5 CONCLUSÃO REFERÊNCIAS