Atendendo a solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese/dissertação será disponibilizado somente a partir de 11/07/2025. At the author’s request, the full text of this thesis/dissertation will not be available until Jul 11, 2025. 2023 JAQUELINE LEMES RIBEIRO EFEITOS DE PROBIÓTICOS E POSBIÓTICOS NA SAÚDE ÓSSEA São José dos Campos 2023 JAQUELINE LEMES RIBEIRO EFEITOS DE PROBIÓTICOS E POSBIÓTICOS NA SAÚDE ÓSSEA Tese apresentada ao Instituto de Ciência e Tecnologia, Universidade Estadual Paulista (Unesp), Campus de São José dos Campos, como parte dos requisitos para obtenção do título de DOUTOR, pelo Programa de Pós-Graduação em CIÊNCIAS APLICADAS À SAÚDE BUCAL. Área: Patologia e Diagnóstico Bucal. Linha de pesquisa: inflamação, reparação tecidual e patologia do sistema estomatognático. Orientadora: Profa. Assoc. Ana Lia Anbinder Instituto de Ciência e Tecnologia [internet]. Normalização de tese e dissertação [acesso em 2023]. Disponível em http://www.ict.unesp.br/biblioteca/normalizacao Apresentação gráfica e normalização de acordo com as normas estabelecidas pelo Serviço de Normalização de Documentos da Seção Técnica de Referência e Atendimento ao Usuário e Documentação (STRAUD). Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Prof. Achille Bassi e Seção Técnica de Informática, ICMC/USP com adaptações - STATI, STRAUD e DTI do ICT/UNESP. Renata Aparecida Couto Martins CRB-8/8376 Ribeiro, Jaqueline Lemes Efeitos de probióticos e posbióticos na saúde óssea / Jaqueline Lemes Ribeiro. - São José dos Campos : [s.n.], 2023. 68 f. : il. Tese (Doutorado em Ciências Aplicadas à Saúde Bucal) - Pós-Graduação em Ciências Aplicadas à Saúde Bucal - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Ciência e Tecnologia, São José dos Campos, 2023. Orientadora: Ana Lia Anbinder. 1. Probiótico. 2. Posbiótico. 3. Heat-killed. 4. Osteopenia. I. Anbinder, Ana Lia, orient. II. Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Ciência e Tecnologia, São José dos Campos. III. Universidade Estadual Paulista 'Júlio de Mesquita Filho' - Unesp. IV. Universidade Estadual Paulista (Unesp). V. Título. IMPACTO POTENCIAL DESTA PESQUISA A possibilidade de prevenir a perda óssea pós-menopausa com um método natural e não invasivo tem apelo importante. Bons resultados foram obtidos, e o uso de L. reuteri inativado é interessante porque apresentaria menos efeitos adversos, maior facilidade na produção, padronização, estabilidade e tempo de prateleira. POTENTIAL IMPACT OF THIS RESEARCH The possibility of preventing postmenopausal bone loss with a natural and non- invasive method has significant appeal. Good results have been achieved, and the use of inactivated L. reuteri is interesting because it would have fewer adverse effects, easier production, standardization, increased stability, and shelf life. BANCA EXAMINADORA Profª. Assoc. Ana Lia Anbinder (Orientadora) Universidade Estadual Paulista (Unesp) Instituto de Ciência e Tecnologia Campus de São José dos Campos Profª. Assoc. Carla Taddei de Castro Neves Universidade de São Paulo (USP) Escola de Artes, Ciências e Humanidades Campus de São Paulo Profª. Assoc. Cristiane Furuse Universidade Estadual Paulista (Unesp) Faculdade de Odontologia Campus de Araçatuba Profª. Titular Cristiane Yumi Koga Ito Universidade Estadual Paulista (Unesp) Instituto de Ciência e Tecnologia Campus de São José dos Campos Prof. Dr. Felipe Eduardo de Oliveira Universidade Braz Cubas Faculdade de Odontologia Campus de Mogi das Cruzes São José dos Campos, 11 de julho de 2023. DEDICATÓRIA Dedico esta tese a todos os pesquisadores. AGRADECIMENTOS A Deus, por me guiar e dar forças a cada passo da minha vida pessoal e acadêmica. À minha família, pelo apoio em todos os momentos. Aos meus pais, Wander e Sandra, por absolutamente tudo o que já fizeram e fazem por mim; nenhuma palavra seria suficiente para expressar tamanha gratidão que sinto. Aos meus irmãos, Ferdinando, Sabrina, Vitória e Elisandra, pelo companheirismo e incentivo. Ao meu melhor amigo, e agora noivo, Rafael, por todo o incentivo, paciência e compreensão. Por me acalmar nos momentos de ansiedade, me aconselhar, me mostrar que as coisas podem ser mais simples do que eu imagino. Por me cuidar e me enxergar com um carinho que às vezes nem eu me enxergo. À família do Rafael, pelo incentivo, apoio, acolhimento e compreensão. À minha orientadora, Ana Lia Anbinder. Obrigada por todos os ensinamentos, apoio e incentivo. A tenho como melhor exemplo de professora, orientadora, pesquisadora e patologista. Muito obrigada por toda a parceria, confiança, preocupação, pela paciência nos meus momentos de estresse, pelas oportunidades que me deu, e pelos conselhos preciosos durante todos esses anos. Por ter me ensinado a ser professora, e a fazer pesquisa de forma ética. Por todos os momentos bons, conquistas, acertos e por ter me ensinado a ser resiliente nos momentos difíceis. Serei eternamente grata. Minha vida acadêmica com toda a certeza não seria a mesma sem a sua liderança. Aos professores da banca, pelo aceite do convite, pelo tempo dedicado a este momento e pelas contribuições científicas valiosas. Ao ICT-Unesp, que tem sido minha segunda casa desde 2010, nas pessoas da diretora Profª Rebeca Di Nicoló e do vice-diretor Prof. Claudio Talge. Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas à Saúde Bucal (CASB), na pessoa do coordenador Prof. Alexandre Luiz Souto Borges. Obrigada pela oportunidade e suporte. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão de bolsa de doutorado no período de março/2020 a julho/2023. Às Profas. Juliana Campos Junqueira e Luana Marotta, por terem aberto as portas do laboratório de Microbiologia e Imunologia e do Laboratório de Estudos Interdisciplinar em Células, respectivamente, para desenvolvimento de parte deste trabalho. À Profa. Cristiane Yumi Koga Ito, por ter cedido gentilmente as células Caco-2. À Biogaia, por ter cedido a cepa de Limosilactobacillus reuteri ATCC PTA 6475. Aos técnicos do Departamento de Biociências e Diagnóstico Bucal, por estarem sempre dispostos a ajudar, em especial ao Sérgio Giovanny Alves, pelos momentos de descontração, conselhos e conversas sobre nossos gatos. Às companheiras de equipe, Renata Mendonça Moraes, Thais Aguiar Santos e Luísa Souza Battistelli, muitíssimo obrigada! Este trabalho não seria o mesmo sem vocês. Sou grata pelo companheirismo, apoio e ajuda nos meses de biotério, dias de laboratório, conversas, conselhos, correções, e pelas nossas pausas para o cafezinho. Às amigas que a pós-graduação me deu e levarei para a vida, Bruna Carvalho, Maíra Garcia e Natália Carvalho, por toda a ajuda direta no trabalho, mas principalmente pelos nossos momentos de descontração e amparo, que com certeza tornou essa jornada mais leve. Em especial à Maíra, minha companheira de almoços, que sempre deu um jeito de adoçar meu dia, fosse com palavras de incentivo e conselhos, ou literalmente com doces caseiros. À Noala Milhan, pela amizade, conselhos, e ajuda, desde o começo do mestrado. Aos colegas de pós-graduação Kamilla Alves, Luis Augusto, Maria Letícia e Mateus Dutra, por toda nossa troca, científica ou pessoal. À Juliani Ribeiro, por toda a ajuda durante a eutanásia dos animais. À Noala e Diego Morais, pela imensa ajuda no início do trabalho in vitro. Aos amigos Adeísa Escobar, Adélia Silva, Bruna Caroline, Daniel Henrique, Diogo Moura, Letícia Rodrigues e Nayara Sá, por serem compreensivos com minhas ausências e ansiedade, pelo companheirismo e apoio. Aos docentes da pós-graduação e funcionários da Universidade, que colaboraram cada um à sua maneira. E a tantas outras pessoas, que auxiliaram direta ou indiretamente, na confecção deste trabalho. RESUMO Ribeiro JL. Efeitos de probióticos e posbióticos na saúde óssea [tese]. São José dos Campos (SP): Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Ciência e Tecnologia; 2023. O envelhecimento da população tem sido acompanhado por um aumento significativo nas doenças crônicas, com destaque para a osteoporose. A busca por tratamentos alternativos tem levado ao estudo dos probióticos para prevenção e tratamento da perda óssea pós-menopáusica, com resultados encorajadores. Embora os benefícios dos probióticos sejam numerosos, eles são bactérias vivas e a administração de organismos vivos não é isenta de riscos. Os posbióticos são probióticos inativados ou seus produtos, e poucos são os estudos que avaliam seus efeitos ósseos. Nós revisamos a literatura sobre probióticos e posbióticos na saúde óssea e avaliamos os efeitos de Limosilactobacillus reuteri 6475 viável e inativado por calor em camundongos ovariectomizados. Mecanismos de ação semelhantes, como modulação da expressão de citocinas e ativação de sistemas de sinalização celular, são observados em probióticos e posbióticos, e os últimos têm vantagens como maior estabilidade e facilidade de incorporação em alimentos, embora seus efeitos a longo prazo, estabilidade e modo de ação ainda precisem ser estudados. Para que estas terapias sejam validadas clinicamente, é fundamental padronizar metodologias, aumentar o tamanho das amostras, realizar estudos randomizados e cegos, e definir detalhes como cepa, dose e duração do tratamento. Em um estudo in vivo, avaliamos os efeitos de L. reuteri (ATCC PTA 6475), e sua forma inativada (heat-killed) na perda óssea induzida por ovariectomia (ovx). Camundongos adultos, fêmeas, foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: controle (sham); Ovx; Ovx + posbiótico; Ovx + probiótico. L. reuteri foi administrado aos grupos (109 UFC/dia) por gavagem. O tratamento se iniciou uma semana após a ovx e teve duração de 28 dias. Na análise por microscopia eletrônica de varredura, o probiótico manteve sua estrutura intacta, e no posbiótico foram observados alguns rompimentos na superfície celular. Foi avaliada a microarquitetura de fêmur, utilizando microtomografia computadorizada. Análise de expressão gênica em íleo foi feita para avaliar junções intercelulares intestinais e citocinas pró-inflamatórias, por meio dos marcadores Ocludina, Tnf-α e Il- 6. Os dados foram submetidos ao teste estatístico mais conveniente (α = 0,05). Os grupos Ovx apresentaram menor porcentagem de volume ósseo (BV/TV), menor número de trabéculas ósseas e maior porosidade total, em comparação ao grupo controle, porém os grupos que receberam L. reuteri apresentaram maior BV/TV quando comparados ao grupo Ovx. O tratamento com L. reuteri em suas duas formas levou à maior espessura trabecular, quando comparados ao controle e ao grupo Ovx. Todos apresentaram semelhança na expressão gênica da Ocludina, Tnf-α e Il-6 em intestino. Ambas as formas, viável e inativada por calor, preveniram a perda óssea induzida por depleção de estrógeno. Palavras-chave: probiótico; posbiótico; heat-killed; osteopenia. ABSTRACT Ribeiro JL. Effects of probiotics and postbiotics in bone health [doctorate thesis]. São José dos Campos (SP): São Paulo State University (Unesp), Institute of Science and Technology; 2023. The aging of the population has been accompanied by a significant increase in chronic diseases, with osteoporosis standing out. The search for alternative treatments has led to the study of probiotics for the prevention and treatment of postmenopausal bone loss, with encouraging results. Although the benefits of probiotics are numerous, they are live bacteria, and the administration of live organisms is not risk-free. Postbiotics are inactivated probiotics or their products, and few studies have evaluated their bone effects. We reviewed the literature on probiotics and postbiotics in bone health and assessed the effects of both viable and heat-killed Limosilactobacillus reuteri 6475 in ovariectomized mice. Similar mechanisms of action, such as the modulation of cytokine expression and activation of cellular signaling pathways, are observed in probiotics and postbiotics, and the latter have advantages such as greater stability and ease of incorporation into food, although their long-term effects, stability, and mode of action still need to be studied. To clinically validate these therapies, it is crucial to standardize methodologies, increase sample sizes, conduct randomized and blinded studies, and define details such as strain, dosage, and treatment duration. In an in vivo study, we evaluated the effects of L. reuteri (ATCC PTA 6475) and its heat-killed form on ovariectomy (ovx)-induced bone loss. Adult female mice were randomly divided into four groups: control (sham); OVX; OVX + postbiotic; OVX + probiotic. L. reuteri was administered to the groups (109 CFU/day) by gavage. Treatment began one week after ovx and lasted for 28 days. Scanning electron microscopy analysis showed that the probiotic maintained its intact structure, while some cell surface disruptions were observed in the postbiotic. Femur microarchitecture was evaluated using computerized microtomography. Gene expression analysis in the ileum was performed to assess intestinal intercellular junctions and pro-inflammatory cytokines, using markers Ocludin, Tnf-α, and Il-6. The data were subjected to the most appropriate statistical test (α = 0.05). The Ovx groups showed a lower percentage of bone volume (BV/TV), a lower number of trabecular bones, and greater total porosity compared to the control group. However, the groups that received L. reuteri showed higher BV/TV compared to the Ovx group. Treatment with both forms of L. reuteri led to greater trabecular thickness compared to the control and Ovx groups. All groups exhibited similarity in the gene expression of Ocludin, Tnf-α, and Il-6 in the intestine. Both viable and heat- killed forms prevented estrogen depletion-induced bone loss. Keywords: probiotic; postbiotic; heat-killed; osteopenia. SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 10 2 ARTIGOS .............................................................................................................. 13 2.1 Artigo 1 - Ribeiro JL, Santos TA, Anbinder AL. Benefícios que até a morte não separa: a promessa dos probióticos e posbióticos para a saúde óssea / Benefits that death does not part: the promise of probiotics and postbiotics for bone health. ....... 14 2.2 Artigo 2 - Ribeiro JL, Santos TA, Garcia MT, Carvalho BFC, Esteves JS, Moraes RM, Anbinder AL. Limosilactobacillus reuteri ATCC PTA 6475 inativado por calor previne a perda óssea em camundongos ovariectomizados / Heat-killed Limosilactobacillus reuteri ATCC PTA 6475 prevents bone loss in ovariectomized mice .......................................................................................................................... 40 3 CONSIDERAÇÕES GERAIS ................................................................................ 60 REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 64 ANEXO ..................................................................................................................... 68 10 1 INTRODUÇÃO A osteoporose é uma doença sistêmica caracterizada pela redução da massa óssea e degradação da microarquitetura do tecido ósseo, resultando em fragilidade óssea e aumento do risco de fratura (National Institutes of Health, 2001). É uma doença altamente prevalente, e estima-se que no Brasil, aproximadamente 33% das mulheres pós-menopáusicas (International Osteoporosis Foundation, 2020) e mais da metade dos indivíduos acima de 50 anos, nos Estados Unidos, apresentem osteoporose ou osteopenia (Wright et al., 2014). Estima-se que uma a cada duas mulheres e um em cada quatro homens acima de 50 anos sofram alguma fratura devido à osteoporose (McCabe et al., 2013). Calcula-se que a prevalência da osteoporose em mulheres, mundialmente, seja de 18,3% (95% IC 16,2 – 20,7), enquanto nos homens seja de 11,7% (95% IC 9,6 – 14,1) (Salari et al., 2021). Além da alta prevalência, esta doença progride de forma silenciosa, podendo chegar a um estágio grave (geralmente fraturas) sem que o hospedeiro tenha alguma sintomatologia. A osteoporose se tornou um problema de saúde pública em âmbito mundial, causando aproximadamente 8,9 milhões de fraturas, e ainda assim sua magnitude não é totalmente compreendida, devido à variabilidade nos métodos de avaliação (OMS, 2004). Além disso, as despesas com fraturas relacionadas à osteoporose são significantes, custando aproximadamente £4 bilhões por ano no Reino Unido, e US$17,9 bilhões nos Estados Unidos (Clynes et al., 2020). Muitos fatores podem afetar a quantidade de massa óssea, podendo ser fixos ou modificáveis, como idade avançada, disfunções na tireoide e paratireoide, baixo peso (má nutrição), uso prolongado de medicamentos, artrite reumatoide, diabetes, transplantes, deficiência hormonal, deficiência de vitamina D, consumo de álcool e cigarro (Gallagher, Tella, 2014). Quanto à sua classificação, a osteoporose pode ser primária ou secundária. A osteoporose primária pode ocorrer em ambos os sexos, em qualquer idade, mas frequentemente ocorre após a menopausa em mulheres, e em homens de idade avançada. Já a osteoporose secundária ocorre como consequência de uso contínuo de medicamentos (como glicocorticoides), outras condições ou doenças (National Institutes of Health, 2001). A osteoporose pós- 11 menopausa (OPM) é o tipo mais comum, e ocorre em consequência da redução de produção hormonal e estimula a rápida reabsorção de osso trabecular (Dar et al., 2018). Inúmeras terapias têm sido desenvolvidas para o tratamento da osteoporose, com intuito de diminuir a perda óssea, prevenir fraturas e balancear a formação/reabsorção óssea. O tratamento pode ser farmacológico ou não farmacológico. Para indivíduos com baixo risco de fratura, é indicado somente o tratamento não farmacológico, que é baseado na ingestão de cálcio, vitamina D, proteínas, cessação do uso de tabaco e álcool, prática de exercícios físicos, e alterações na dieta. Para indivíduos com médio/alto risco de fratura, além do tratamento não farmacológico, medicamentos antirreabsortivos (como bisfosfonatos) e a terapia de reposição hormonal, nas mulheres, também são indicados (Gallagher, Tella, 2014). A terapia de reposição hormonal é um dos tratamentos mais utilizados para o alívio dos sintomas associados à menopausa e para prevenção de consequências clínicas da deficiência de estrógeno. Entretanto, o uso hormonal prolongado pode causar efeitos adversos (principalmente aumento no risco de acidentes tromboembólicos, infartos e câncer de mama), o que tem levado a diminuição no seu uso, e a um aumento no desenvolvimento de novas possibilidades terapêuticas como o uso de probióticos e vitaminas (Borrelli, Ernst, 2010). Pesquisas realizadas em seres humanos e animais têm demonstrado de maneira consistente que a microbiota presente no intestino desempenha um papel crucial na manutenção da saúde do hospedeiro. Essa função abrange diversas áreas, como o metabolismo (incluindo a produção de hormônios como a dopamina e a serotonina), a absorção de nutrientes essenciais, a proteção contra patógenos por meio da integridade da barreira intestinal, e o fortalecimento do sistema imunológico (Bhardwaj et al., 2022). As junções intercelulares (TJs), estruturas proteicas que selam os espaços entre as células epiteliais intestinais, são responsáveis por essa integridade. Adaptações dinâmicas dessas TJs permitem que respondam a fatores externos, como a presença de resíduos alimentares, bactérias benéficas e patógenos (Ulluwishewa et al., 2011). O estrógeno desempenha um papel vital na preservação dessas junções, ativando vias que aumentam a resistência elétrica 12 através da barreira transepitelial, efetivamente impedindo a entrada de patógenos. Como resultado, uma deficiência neste hormônio enfraquece a barreira intestinal, aumentando o contato com antígenos e bactérias, o que desencadeia uma resposta inflamatória (Xu et al., 2017). Probióticos são microrganismos não patogênicos, que quando administrados em quantidades adequadas, podem ser benéficos à saúde do hospedeiro (Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food, 2002). Muitos gêneros de bactérias são utilizados devido a seus efeitos probióticos, como Lactobacillus, Enterococcus, Bacilllus, Escherichia e Bifidobacterium. Bactérias probióticas são naturalmente encontradas em membranas mucosas como boca, pele, órgãos genitais, urinários, trato gastrointestinal, e comumente adicionadas a produtos fermentados como laticínios e cerveja (Collins et al., 2017b). O consumo de probióticos tem demonstrado diversas vantagens, como melhora na saúde óssea, manutenção na função da barreira intestinal e na função do sistema imune, resultando em uma melhora sistêmica na saúde do hospedeiro, incluindo saúde óssea (Mccabe, Parameswaran, 2018). O uso de Limosilactobacillus reuteri, em especial, da cepa ATCC PTA 6475, tem sido associado à redução da perda óssea devido à deficiência de hormônios ovarianos em estudo em animais e humanos (Britton 2014, Nilsson 2018). Apesar dos bons resultados obtidos pelo uso dos probióticos, as células vivas contidas nos produtos eventualmente perdem sua viabilidade, e uma quantidade de células inativas permanece (Nighswonger et al., 1996). Devido ao uso de bactérias vivas, a preocupação com a segurança de alguns grupos, como de pacientes pediátricos e populações vulneráveis, tem crescido, levando a um aumento no interesse no uso de bactérias mortas, ou não-viáveis (Piqué et al., 2019). Na literatura têm sido propostos termos como “probióticos não-viáveis”, “paraprobióticos”, “probiótico fantasma”, “probiótico inativado”, e mais recentemente, “posbiótico”, para se referirem ao uso de microrganismos inativados e/ou seus componentes, em quantidade adequada para promover benefícios à saúde (Vinderola et al., 2022). Os posbióticos possuem vantagens como maior facilidade na padronização, armazenagem e transporte (Piqué et al., 2019) em relação ao uso de células vivas. Os possíveis mecanismos de ação 13 pelos quais os posbióticos melhoram a saúde do hospedeiro ainda vêm sendo estudados. A inativação das bactérias pode ser feita de diversas formas, como calor, métodos químicos (formalina), raios ultravioleta ou gama, e sonicação, sendo o calor o método mais utilizado (Deshpande et al., 2018). Os métodos de inativação podem afetar de diferentes formas os componentes estruturais celulares, e influenciar a atividade imunomodulatória (Taverniti, Guglielmetti, 2011). Frente à necessidade de novas alternativas terapêuticas ou adjuntas ao tratamento da osteoporose, doença crônica que pode ser considerada um problema de saúde pública na população com a maior expectativa de vida, e ao crescente uso de probióticos e posbióticos, levantamos a hipótese de que L. reuteri na sua forma viável e inativada, podem ser efetivos na melhora da saúde e prevenção da perda óssea que ocorre pós-menopausa. O estudo dos efeitos de L. reuteri viável e inativado pode esclarecer os mecanismos de ação do probiótico e possibilitar o uso comercial de outras preparações, dado que os posbióticos teriam produção facilitada, maior estabilidade e tempo de prateleira, além de ser um tratamento de fácil acesso à população. 60 3 CONSIDERAÇÕES GERAIS Nas últimas décadas, a população brasileira tem envelhecido consideravelmente, com associação ao aumento na prevalência de doenças crônicas (Baccaro et al., 2015). A osteoporose é uma das doenças mais relacionadas ao envelhecimento da população (Zeng et al., 2021). Sendo um problema de saúde pública em âmbito mundial, a busca por novas possibilidades terapêuticas vem sendo explorada, e dentre elas, o uso de probióticos. O uso de probióticos tem sido extensivamente testado, e demonstrado resultados promissores na prevenção e tratamento da perda óssea pós-menopausa (Jansson et al., 2019; Lambert et al., 2017; Nilsson et al., 2018; Takimoto et al., 2018), assim como o uso de posbióticos (Jang et al., 2021; Jhong et al., 2022; Montazeri- Najafabady et al., 2021; Myeong et al., 2023; Yeom et al., 2021). Os mecanismos e os efeitos na saúde exercidos pelos posbióticos têm se mostrado bastante semelhantes aos observados nos probióticos, como a estimulação/supressão da expressão de citocinas e a ativação do sistema de sinalização celular, além de efeitos antimicrobianos. Essa similaridade sugere que a perda de viabilidade devido à inativação celular não compromete suas funções benéficas (Siciliano et al., 2021). Em nosso estudo, a administração diária de L. reuteri ATCC PTA 6475, em sua forma viável e inativada, levou a uma menor perda óssea em camundongos ovariectomizados. Esses resultados estão alinhados com a compreensão existente sobre a conexão entre o intestino e os ossos e a influência da microbiota intestinal na saúde óssea (Ohlsson, Sjögren, 2018). Entretanto, o mecanismo pelo qual isso acontece, ainda é incerto. Sabendo que a deficiência hormonal pós-menopausa leva a um aumento da permeabilidade da barreira intestinal (Li et al., 2016), avaliamos um marcador intestinal de junção intercelular, Ocludina, no íleo. Entretanto, não obtivemos diferença estatística entre os grupos. Embora não tenhamos encontrado diferença significativa, existem várias famílias de proteínas juncionais que não foram avaliadas (Claudinas, Jam-3, Zônula ocludens, por exemplo). Esta foi uma limitação do nosso estudo, onde apenas avaliamos uma proteína juncional, em um determinado período (28 dias) e em 61 um segmento intestinal. Segundo Collins et al. (2017), as alterações induzidas pela Ovx são região- e tempo-dependentes (Collins et al., 2017a). Além da Ocludina, avaliamos em íleo as citocinas pró-inflamatórias Tnf-α e Il- 6. Estudos já demonstraram que os probióticos possuem influência na expressão de citocinas inflamatórias (Britton et al., 2014; Collins et al., 2016; McCabe et al., 2013). Não houve diferença estatística entre os grupos, porém os gráficos exibiram um padrão coerente, mostrando uma tendência a diminuição da expressão dessas citocinas nos grupos que receberam L. reuteri. Nosso principal desfecho confirmou nossa hipótese inicial: o posbiótico teve um efeito positivo na manutenção da saúde óssea após ovariectomia. Embora sejam considerados reguladores do metabolismo ósseo, o papel dos probióticos como tratamento adjuvante e preventivo para a osteoporose tem gerado debate devido à falta de consenso sobre sua eficácia (Zeng et al., 2021), e ainda não há estudos clínicos randomizados com o uso de posbióticos. Em nosso estudo, a administração de L. reuteri inativado levou a uma menor perda óssea, quando comparado ao grupo Ovx, aumentando BV/TV e Tb.Th, com efeito similar ao do probiótico na microarquitetura óssea. Nossos resultados estão em concordância com o obtido por outros pesquisadores (Jang et al., 2021; Jhong et al., 2022; Kimoto-Nira et al., 2009, 2007; Montazeri-Najafabady et al., 2021; Myeong et al., 2023). O uso de L. reuteri inativado nos trouxe bons resultados como opção terapêutica e ajuda a confirmar que bactérias vivas nem sempre são necessárias para obter efeitos benéficos. Entretanto, o modo de ação dos posbióticos, seu impacto no sistema imunológico do hospedeiro e no metabolismo ósseo ainda foram pouco explorados. O próprio processo de inativação pode introduzir propriedades únicas ou modulações nos componentes bacterianos (Akter et al., 2020), exigindo uma avaliação e padronização dos métodos utilizados. A inativação pode ser feita por diferentes métodos: aplicação de calor, químicos, raios ultravioleta ou gama, entre outros. O método mais utilizado para inativação dos probióticos é o calor (geralmente entre 70-100 °C) (Piqué et al., 2019). Em nosso estudo, utilizamos temperatura acima de 100 °C, porém, ao avaliarmos a estrutura bacteriana através de microscopia eletrônica de varredura, constatamos que os posbióticos mantiveram sua estrutura, apresentando apenas algumas rupturas na superfície celular. Tratamentos térmicos 62 normalmente causam danos à membrana celular, perda de alguns nutrientes e íons, além de inativação de algumas enzimas essenciais e coagulação proteica (Akter et al., 2020). Entretanto, mesmo com essas alterações, obtivemos resultados semelhantes entre as formas viável e inativada. Manter a viabilidade do probiótico em produtos é um fator crítico, tornando o uso de posbióticos de extremo interesse financeiro, uma vez que possuiria maior tempo de prateleira, estabilidade em maior faixa de pH e temperatura, além da incorporação em alimentos antes do processo térmico, sem a perda da funcionalidade (Siciliano et al., 2021). Explorar a estabilidade e o prazo de validade dos posbióticos é crucial para suas aplicações práticas. Compreender a estabilidade e a eficácia desses produtos a longo prazo será essencial para sua implementação bem-sucedida em ambientes clínicos. Com os numerosos estudos associando o uso de probióticos com saúde óssea, podemos aprender com os erros. Algumas limitações em estudos existentes impedem que a terapia probiótica seja validada e tenha recomendação clínica. Os estudos clínicos são muito heterogêneos, o que impede a comparação dos resultados entre si (Zeng et al., 2021). Em pesquisas futuras, a metodologia deve ser padronizada, com amostras maiores e adequadas, randomização, cegamento, métodos de análise de alta qualidade, estabelecer o desfecho principal, dose, cepa, maior duração do tratamento (superior a 12 meses) (Billington et al., 2021; Zeng et al., 2021), métodos de inativação (no caso de posbióticos), e descrição de eventos adversos ou efeitos colaterais. Outro ponto importante é a padronização da descrição dos métodos – como doses, concentrações, volume administrado por animal, que devem estar descritos de forma precisa, para que os experimentos sejam reprodutíveis. O uso de posbióticos representa uma grande oportunidade para o desenvolvimento de novas terapias, principalmente para os grupos de risco. Os resultados positivos obtidos com o uso de L. reuteri, tanto viável quanto inativado, destacam suas aplicações potenciais na prevenção e no tratamento da perda óssea pós-menopausa. Isso abre caminhos para pesquisas adicionais, com implicações teóricas e práticas. Estudos futuros devem se concentrar em ensaios clínicos randomizados padronizados e de alta qualidade, além de elucidar os mecanismos de ação específicos tanto para as formas viáveis quanto inativadas de L. reuteri, e otimizar suas aplicações práticas em ambientes clínicos. Ao fazer isso, os estudos 63 podem ampliar nosso conhecimento sobre o papel dos probióticos na saúde óssea e desenvolver estratégias inovadoras para prevenir e tratar a perda óssea pós- menopausa. 64 REFERÊNCIAS Akter S, Park JH, Jung HK. Potential health-promoting benefits of paraprobiotics, inactivated probiotic cells. J Microbiol Biotechnol. 2020 Apr 28;30(4):477–81. doi: 10.4014/JMB.1911.11019. PubMed PMID: 31986247. Baccaro LF, Conde DM, Costa-Paiva L, Pinto-Neto AM. The epidemiology and management of postmenopausal osteoporosis: a viewpoint from Brazil. Clin Interv Aging. 2015 Mar 20;10:583–91. doi: 10.2147/CIA.S54614. PubMed PMID: 25848234. Bhardwaj A, Sapra L, Tiwari A, Mishra PK, Sharma S, Srivastava RK. “Osteomicrobiology”: the nexus between bone and bugs. Front Microbiol. 2022 Jan 25;12:812466. doi: 10.3389/fmicb.2021.812466. PubMed PMID: 35145499. Billington EO, Mahajan A, Benham JL, Raman M. 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