UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA 

 
 
 
 
 
 
 

 
USO AUTÓLOGO E XENÓLOGO DA FIBRINA RICA EM 

PLAQUETAS EM ÚLCERAS DE CÓRNEA EM COELHOS 
(Oryctolagus cuniculus) 

 
 
 

 
 
 
 
 

LENISE GARBELOTTI GONÇALVES 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
 
 
 
 
 
 
 

Botucatu, São Paulo 
maio de 2022



 
 

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA  

 
 
 
 
 
 
 
 

USO AUTÓLOGO E XENÓLOGO DA FIBRINA RICA EM 
PLAQUETAS EM ÚLCERAS DE CÓRNEA EM COELHOS 

(Oryctolagus cuniculus) 
 

 
 
 
 
 
 
 

Tese apresentada junto ao Programa de 
Pós-graduação em Biotecnologia 
Animal para obtenção do título de 
Doutor. 
 
Lenise Garbelotti Gonçalves 
 
Orientador: Profa. Assoc. Cláudia 
Valéria Seullner Brandão 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
 
 

 
Botucatu, São Paulo 

maio de 2022 
 
 



ii 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
 
 



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Nome do autor: Lenise Garbelotti Gonçalves 
 

USO AUTÓLOGO E XENÓLOGO DA FIBRINA RICA EM PLAQUETAS EM 
ÚLCERAS DE CÓRNEA EM COELHOS (Oryctolagus cuniculus) 

 

Data da Defesa 25 de fevereiro de 2022 

 

 

COMISSÃO EXAMINADORA 

 

 

 

Profa. Assoc. Cláudia Valéria Seullner Brandão 

Presidente e Orientadora 

Departamento de Cirurgia Veterinária e Reprodução Animal  

FMVZ, UNESP, Botucatu, SP 

 

 

 

Profa. Titular Sheila Canevese Rahal 

Membro titular 

Departamento de Cirurgia Veterinária e Reprodução Animal  

FMVZ, UNESP, Botucatu, SP 

 

 

 

Prof. Dr. Carlos Eduardo Fonseca Alves 

Membro titular 

Departamento de Cirurgia Veterinária e Reprodução Animal 

FMVZ, UNESP, Botucatu, SP 

 

 

 

MV. Dra. Cintia Sesso Perches 

Membro titular 

Médica Veterinária Autônoma  

Piracicaba, SP 

 

 

 

MV. Dra. Micaella Gordon Gandolfi 

Membro titular 

Médica Veterinária Autônoma  

Itu, SP 



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DEDICO esse trabalho, com carinho e gratidão, aos meus amados pais 
Marlete e Laerte Gonçalves. 



v 
 

AGRADECIMENTOS 

Primeiramente a Deus. Obrigada por sustentar minha fé. 

À minha orientadora Professora Cláudia Valéria Seullner Brandão, 

pela confiança e oportunidade da realização deste trabalho, pela paciência e 

principalmente pelos ensinamentos transmitidos. 

Aos Professores Cláudia Helena Pellizon e Carlos Roberto Padovani 

pela contribuição preciosa neste trabalho. 

A equipe do serviço de oftalmologia Inajara Nakamura Hirota, Letícia 

de Andrade Ramos, Annalu Pinton Ferreira, Mariana de Sessa, Mayara 

Chagas, Luís Felipe Reiter, Juliana Bardella, Caroline Geraldi e Juliana 

Marques. A seu modo, todos vocês me ajudaram e ensinaram muito. Sem o 

apoio de vocês eu não teria chegado até aqui. Agradeço de coração toda 

paciência. Torço pelo sucesso de todos. 

À Carolina Hagy Girotto por ter aceitado participar dessa jornada, 

obrigada pelo apoio com as anestesias no projeto. 

A todos os meus familiares, em especial aos meus pais, Marlete A. 

Garbelotti Gonçalves e Laerte Gonçalves, e irmãos Louise G. Gonçalves e 

Leonardo G. Gonçalves, que sempre me incentivaram e estiveram ao meu lado 

em todas minhas escolhas.  

Este trabalho, em pleno ano de pandemia, eu não poderia deixar de 

enaltecer minha querida psicóloga Letícia F. Mistreta Benine, por me orientar 

durante todo esse processo, pelas conversas e ensinamentos. 

Ao CEMPAS, em especial à Mariana, Raphael e Luna, por toda ajuda 

e ensinamentos com os coelhos. 

Ao Dr. Paulo do Biotério que prontamente nos ajudou no projeto, com 

dicas de manejo e contenção, além da marcação dos animais. E também ao 

Marcos da Conicultura, pela ajuda com os coelhos. 

Aos funcionários do Hospital Veterinário da UNESP – Campus 

Botucatu/SP: Kelly, Clara, Léo, Edi, José e Evandro, pelo auxílio tanto nos 

projetos quanto na parte dos atendimentos no setor da Oftalmo. 

Este ano apoio de amigos se fez em sua maioria a distância, mas alguns 

se fizeram presentes. Então também não posso deixar de agradecer a amizade 



vi 
 

e companheirismo da Letícia de Andrade Ramos e Daniel Tozadore. Obrigada 

pelas conversas, desabafos, pelo apoio e compreensão. 

Um agradecimento especial a equipe da secção técnica de pós-

graduação, todos sempre prontamente dispostos a sanar dúvidas e ajudar. 

Eu não teria chegado até aqui sem passar pelo mestrado, então não 

poderei deixar de enaltecer pessoas que de alguma forma estiveram presentes 

nesta jornada acadêmica. As minhas irmãs de república Micaella G. Gandolfi, 

Anna Clara B. Hussein, Mariana F. Borges, Amanda Bega, Amanda Ilkiu e 

Bárbara Correia. Agradeço com todo meu amor, pelo lar que me propuseram. 

As amigas Camila Debastiani, Viviane Codognoto e Isis Pincella pela 

amizade que prevaleceu. Ao Dr. Carlos Alberto Jorge, obrigada por todo 

ensinamento e preciosas sugestões fundamentais para o desenvolvimento deste 

trabalho e também à Ana Amábile Heloísa Barros, por toda paciência e ajuda 

disponibilizada, acompanhadas do seu carisma.  

Ao Professor José Joaquim Titton Ranzani, por todos os 

ensinamentos e por estar sempre disposto a compartilhar. 

Aos animais do meu projeto minha eterna gratidão pelo aprendizado. 

O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de 

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de 

Financiamento 001. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



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“As esquinas que eu dobrei, quando deram errado, depois eu agradeci ter 

dar errado, porque adiante deu tudo certo. E também aprendi isso na vida, às vezes 

você se queixa de algo que não foi...  calma, daqui a pouco a vida reverte aqui”. 

Fernanda Montenegro 

 

 

 

 

 

 

 

 



viii 
 

GONÇALVES, L. G. Uso autólogo e xenólogo da fibrina rica em plaquetas 
em úlceras de córnea em coelhos (Oryctolagus cuniculus). 2022. 74p. Tese 
(Doutorado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade 
Estadual Paulista, Botucatu, 2022. 

RESUMO 

A membrana de fibrina rica em plaquetas e leucócitos (L-PRF) é um biomaterial 

com potencial regenerativo proveniente de preparo rápido e simples do sangue. 

Este trabalho descreveu o uso de membrana autóloga e xenóloga de L-PRF em 

úlceras corneais profundas induzidas em coelhos; correlacionando achados 

clínico-oftalmológicos, histomorfométricos e imuno-histoquímico. Foram 

selecionados 28 coelhos adultos sadios, e o olho direito submetido à indução de 

úlcera de córnea profunda e tratamento com membrana L-PRF xenóloga de 

cães, fixada na conjuntiva bulbar. Constituíram-se dois grupos experimentais 

(n=14), designados: grupo um (G1), tratado apenas com a membrana L-PRF 

xenólogo; e o grupo dois (G2), cujos olhos receberam adicionalmente membrana 

autóloga de L-PRF previamente no leito da úlcera. Os animais foram avaliados 

por exame oftalmológico antes da cirurgia e aos quatro (M4), sete (M7), 14 (M14) 

e 30 (M30) dias de pós-operatório, bem como a análise histomorfométrica da 

córnea no M30. Cinco animais de cada grupo em M4, foram submetidos apenas 

à avaliação histomorfométrica e imunohistoquímica para fator de crescimento 

transformador β1 (TGF- β1) e fator de crescimento de fibroblastos básico (FGF-

2). Os resultados das avaliações clínico-oftalmológicas, histomorfométrico e 

imunohistoquímico foram similares entre os grupos na maioria das variáveis 

analisadas. Inflamação discreta e ausência de vascularização corneal foram 

observadas; a reparação total da lesão verificou-se no M14 com discreta 

opacidade corneal nos dois grupos. No G2, notou-se absorção mais lenta das 

membranas na fase inicial, bem como, maior expressão de TGF-β1 no epitélio. 

No M30, na área da lesão, o número de camadas epiteliais e espessura do 

epitélio foram significativamente maiores, similar à córnea íntegra nos dois 

grupos. Verificou-se, entretanto, que a redução da área da lesão foi superior no 

G1 no período inicial (M7). A metodologia do G2 poderá favorecer o uso clínico 

da membrana autóloga; considerando necessidade de menor volume de sangue 

autólogo coletado, promovendo sua instituição em animais de pequeno porte. A 

aplicação cirúrgica da membrana de L-PRF xenóloga e/ou associada à autóloga 

é exequível e prática, promove a cicatrização de úlceras profundas, e apresenta-

se como alternativa viável na clínica oftalmológica. 

Palavras-chaves: Biomaterial; cicatrização corneal; concentrado de plaqueta; 

fator de crescimento de fibroblastos (FGF); fator de crescimento transformador 

(TGF). 



ix 
 

GONÇALVES, L.G. Autologous and xenogeneic use of platelet-rich fibrin in 

corneal ulcers in rabbits (Oryctolagus cuniculus). 2022. 74p. Tese 

(Doutorado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Faculdade de 

Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 

2022. 

ABSTRACT 

Platelet and leukocyte-rich fibrin (L-PRF) is a biomaterial made from blood that 
presents regenerative potential and quick and simple preparation. This study 
describes the use of autologous and/or xenologous L-PRF membrane in deep 
induced corneal ulcers in rabbits; correlating clinical-ophthalmological, 
histomorphometric, and immunohistochemical findings. Twenty-eight healthy 
adult rabbits were selected. A deep corneal ulcer was induced and the animals 
were divided into two groups (n = 14): overlay group (G1) was treated with an 
overlay xenologous L-PRF membrane made from dog blood, fixed in the bulbar 
conjunctiva; inlay group (G2) received autologous L-PRF inlay and an overlay 
xenologous L-PRF membrane. The animals were evaluated on M0, before 
surgery, and on M4, M7, M14, and M30 days postoperatively as well the 
histomorphometric analysis of the cornea in the M30. In M4, five animals from 
each group were submitted to the histomorphometric and immunohistochemical 
evaluation of transforming growth factor-b (TGF-β1) and fibroblast growth factor 
(FGF-2). The results of the clinical-ophthalmological, histomorphometric, and 
immunohistochemical evaluations were similar between the groups in most of the 
variables analyzed. Mild inflammation and low corneal vascularization were 
observed; complete repair of the lesion was observed in M14 with a minor corneal 
opacity in both groups.In G2, slower absorption of membranes was observed in 
the initial phase, as well as greater expression of TGF-β1 in the epithelium. In 
M30, area of the lesion, the number of epithelial layers and the thickness of the 
epithelium were significantly higher, similar to the intact cornea in both groups. 
However, the reduction of the lesion area was superior in G1 in the initial period 
(M7). The G2 methodology may favor the clinical use of the autologous 
membrane; considering the need for a smaller volume of autologous blood 
collected, promoting its institution in small animals. The surgical application of 
xenologous and/or associated with autologous plug L-PRF membrane is feasible 
and practical, promotes the healing of deep ulcers, and presents itself as a viable 
alternative in the ophthalmic clinic. 

Keywords: Biomaterial; corneal healing; FGF; PRF; platelet concentrate; TGF-

β.  

 

 

 

 

 

 

 

 



x 
 

LISTA DE TABELAS 

Tabela 1. Variáveis clínicas analisadas nos diferentes grupos experimentais e, 

momentos de avaliação, em dias. .................................................................... 42 

Tabela 2. Escores observados considerando a reabsorção de membrana de 

PRF, redução da área da lesão e teste de fluoresceína no G1 e G2, e nos 

diferentes momentos de avaliação. .................................................................. 43 

Tabela 3. Escore do número de vasos na córnea, nos diferentes grupos, 

momentos e locais de avaliação, representado por mediana dos escores, 

seguida por valor mínimo e máximo. ............................................................... 44 

Tabela 4. Número de camadas de células epiteliais presentes nos diferentes 

grupos, momentos e locais de avaliação, representada por mediana dos escores, 

seguida por valor mínimo e máximo. ............................................................... 44 

Tabela 5. Espessura epitelial da córnea (µm) nos diferentes grupos, momentos 

e locais de avaliação, representada por mediana dos escores, seguida por valor 

mínimo e máximo............................................................................................. 45 

Tabela 6. Espessura estromal (µm) nos diferentes grupos, momentos e locais de 

avaliação, representada por média, seguida por desvio padrão. ..................... 45 

Tabela 7. Marcação imuno-histoquímica para TGF-β1 (µm²) nos diferentes 

grupos e locais (córnea íntegra, borda, lesão), aos 4 dias pós-operatório. ...... 46 

Tabela 8. Marcação imuno-histoquímica para FGF-2 (µm²) nos diferentes grupos 

e locais (normal, borda, lesão), aos 4 dias pós-operatório. .............................. 46 

 

 

  



xi 
 

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍGLAS 

α-SMA Alfa-actina de músculo liso maduro 

µm Micrômetro 

µm² Micrometro quadrado 

ARVO Association for Research in Vision and Ophthalmology 

ARRIVE Animal Research: Reporting of in Vivo Experients 

BMP-2 Proteína morfogenética óssea 2 

CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais 

cm Centímetro 

EGF Fator de crescimento epidérmico 

FGF Fator de crescimento de fibroblastos 

FMVZ Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia 

G2 Grupo membrana L-PRF autóloga + xenóloga  

G1 Grupo membrana L-PRF xenóloga 

HGF Fator de crescimento de hepatócitos 

IGF-1 Fator de crescimento semelhante à insulina 

IL-1 Interleucina 1 

IM Intramuscular 

IV Intravenoso 

Kg Quilograma 

KGF Fator de crescimento queratinocitos 

PRF Fibrina rica em plaquetas 

L-PRF Fibrina rica em plaquetas e leucócitos 

MEC Matriz extra celular 

M0 Momento de avaliação pré-operatório 

M4 Momento de avaliação aos quatro dias pós-operatório 

M7 Momento de avaliação aos sete dias pós-operatório 

M14 Momento de avaliação aos catorze dias pós-operatório 

M30 Momento de avaliação aos trinta dias pós-operatório 

MMP Matriz Metaloproteínases  

mPRGF Membrana de fibrina rica em fatores de crescimento 

ml Mililitro 

mm Milímetro 

mm² Milímetro quadrado 

mm/min Milímetro por minuto 

mmHg Milímetro de Mercúrio  

mg/Kg Miligramas por quilograma 

m/s Metro por segundo 

NGF Fator de crescimento nervoso 

PDGF Fator de crescimento derivado de plaquetas 

PPP Plasma pobre em plaquetas 

PRP Plasma Rico em Plaquetas 

PIO Pressão intraocular 



xii 
 

PVPI Polivinilpuvoidona 

RBC Glóbulos vermelhos 

rpm Rotações por minuto 

SRD Sem Raça Definida 

TGF Fator de crescimento transformador 

TLS Teste lacrimal de Schirmer 

TNF-α Fator de necrose tumoral α 

TSP-1 Trombospondina 

UNESP Universidade Estadual Paulista 

VEGF Fator de crescimento endotelial vascular 



xiii 
 

APÊNDICES 

Apêndice 1. Tabela demonstrando avaliação pré-operatória da estesiometria, 

TLS, paquimetria e PIO dos coelhos utilizados na avaliação clínica oftalmológica 

pós-operatória (n=18), segundo sexo dos animais, representada pela média, 

seguida por desvio padrão.............................................................63 

Apêndice 2. Tabela demonstrando avaliação pré-operatória da estesiometria, 

TLS, paquimetria e PIO, representada pela média, seguida por desvio padrão, 

onde E1 é composta pelos animais utilizados exclusivamente para avaliação 

histomorfométricas e imuno-histoquímica de M4 (n=10) e, E2, coelhos utilizados 

na avaliação clínica oftalmológica pós-operatória (n=18). ................63 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



xiv 
 

SUMÁRIO 

CAPÍTULO 1 ...................................................................................................... 1 

1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ................................................................. 2 

2. REVISÃO DA LITERATURA .......................................................................... 3 

2.1. Coelho como pet e modelo experimental .............................................. 3 

2.2. Córnea e aspectos anatomofisiológicos ................................................ 4 

2.2.1 Características gerais anátomo-histológicas do olho dos coelhos .. 5 

2.3. Lesões de córnea e mecanismos de reparação corneal ....................... 7 

2.3.1. Fatores de Crescimento .............................................................. 11 

2.4. Fibrina Rica em Plaquetas e fatores de crescimento associados........ 14 

2.4.1 PRF em coelhos ........................................................................... 16 

3. Considerações finais .................................................................................... 17 

4. Hipótese(s) e objetivo(s) geral(s) e específico(s) ......................................... 18 

5. REFERÊNCIAS ........................................................................................... 18 

CAPÍTULO 2 .................................................................................................... 11 

MATERIAL E MÉTODOS................................................................................. 35 

Conformidades Éticas e Seleção dos Animais ........................................... 35 

Grupos experimentais................................................................................ 35 

Preparo das membranas de L-PRF de coelho e cães ............................... 36 

Procedimento cirúrgico e pós-operatório ................................................... 36 

Momentos e avaliações oftalmológicas ..................................................... 37 

Preparação das amostras e análises microscópicas ................................. 39 

Análises Morfométricas ............................................................................. 39 

Imuno-histoquímica ................................................................................... 40 

Análise Estatística ..................................................................................... 40 

RESULTADOS ................................................................................................ 41 

DISCUSSÃO .................................................................................................... 46 

REFERÊNCIAS ............................................................................................... 52 

APÊNDICE ...................................................................................................... 57 

ATESTADO ÉTICA .......................................................................................... 59 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CAPÍTULO 1 

 



2 
 

1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA 

A úlcera de córnea é uma afecção frequente na oftalmologia veterinária 

(WHITLEY; HAMOR, 2021). O processo de cicatrização corneal é dinâmico e 

complexo; envolve a interação de uma variedade de citocinas, fatores de 

crescimento e proteases, no qual desequilíbrios podem acarretar perda de 

transparência (WILSON et al., 2001). A intervenção cirúrgica é indicada quando 

há o risco de comprometimento da integridade do bulbo ocular e da viabilidade 

visual (WHITLEY; HAMOR, 2021). 

Os biomateriais a base de plaquetas estão sendo progressivamente 

utilizados na oftalmologia humana e veterinária no tratamento de doenças da 

superfície ocular (NUGENT; LEE, 2015; YOU et al., 2020). Diversos tipos de 

preparações desenvolvidas, tais como, suspensões, cola, tampão e membrana, 

são empregadas isoladas ou associadas a outras técnicas cirúrgicas em úlceras 

de córnea profundas, descemetoceles e perfurações (HICK et al., 2005; ALIO et 

al., 2013; ARNALICH et al., 2016; CAN et al., 2016a; SANCHEZ-AVILA et al., 

2018).  

Na oftalmologia veterinária, o plasma rico em plaquetas (PRP) como 

suspensão ou tampão mostrou potencial na cicatrização de úlceras de córneas 

induzidas em coelhos e ratos (DONATTI, et al., 2013; PERCHES, et al., 2015; 

GANDOLFI et al., 2021), assim como em úlceras superficiais médias em cães 

(MERLINI, et al., 2014), profundas em gatos (FARGHALI, et al. 2021) e 

indolentes de cães (EDELMANN et al., 2018). O uso de cola de fibrina foi 

relatado em um caso de úlcera profunda com exposição de membrana de 

Descemet em cão e possibilitou a reparação ocular (BARBOSA; WOUK, 2014). 

Descrita em 2001 por Choukroun, a membrana de fibrina rica em 

plaquetas e leucócitos (L-PRF) destacou-se na medicina regenerativa pela 

preparação simples, sem manipulação bioquímica de sangue (DOHAN et al., 

2006a apud Choukroun et al., 2001; NANDITHA et al., 2017). Apresenta 

arquitetura 3D com a incorporação intrínseca de citocinas plaquetárias, 

leucócitos e células-tronco circulantes, fornecendo fatores de crescimento e 

moléculas bioativas, estimulando a cicatrização, angiogênese e remodelação de 

tecido (DOHAN et al., 2006d). Adicionalmente, promove suporte mecânico 

importante para a regeneração da superfície ocular (CAN et al., 2016a; CAN et 



3 
 

al., 2016b; CAKMAK et al., 2017; DERELI CAN et al., 2020; CAMACHO; LEON-

ROJAS, 2021).  

Considerando que um princípio fundamental na produção do L-PRF é a 

coleta rápida, trata-se de um desafio considerável em animais de pequeno porte 

relacionado ao menor calibre das veias e maior volume relativo de sangue 

necessário quando comparado aos 10 ml coletados em humanos (DOHAN 

EHRENFEST et al., 2010b).  

A aplicação de membrana xenóloga, associada ou não a membrana 

autóloga, pode ser uma alternativa viável no tratamento oftalmológico, tornando-

o acessível também aos animais de espécies ou raças de pequeno porte. 

Entretanto, na literatura consultada não foram encontrados trabalhos avaliando 

compatibilidade interespécies para membrana L-PRF xenóloga. 

Do conhecimento dos autores, os estudos sobre o uso de membrana de 

L-PRF são escassos e inovadores tanto na oftalmologia humana como na 

veterinária. Nosso grupo de pesquisa demonstrou a viabilidade e os benefícios 

do uso de membrana autóloga em coelhos (HIROTA, 2021), incentivando o 

desenvolvimento deste trabalho. 

Este estudo tem por objetivo avaliar clinicamente, o processo de 

reparação de úlceras profundas de córnea, induzidas experimentalmente em 

coelhos, submetidos ao tratamento cirúrgico com membrana de PRF autóloga e 

xenóloga. Adicionalmente, comparar por histomorfometria e imuno-histoquímica 

de fatores de crescimento nos tratamentos instituídos. 

2. REVISÃO DA LITERATURA 

2.1. Coelho como pet e modelo experimental  

O coelho doméstico (Oryctolagus cuniculuns, LINNAEUS, 1758) 

pertence à família Leporidae e ordem Lagomorpha (PESSOA, 2014). Dentre os 

animais de companhia exóticos, estão comumente envolvidos na prática 

veterinária, bem como na oftalmologia, com destaque para as afecções da 

córnea, ductos nasolacrimais e lente (GRAHAM, 2006; GONZÁLEZ-REDONDO; 

CONTRERAS-CHACÓN, 2012; MÄKITAIPALE et al., 2015). Adicionalmente, 

representam a espécie de animais de laboratório amplamente utilizada como 

modelo experimental, incluindo investigações oftálmicas (WERNER et al., 2006; 

EATON, 2021).  



4 
 

A popularidade da espécie pode ser atribuída em grande parte ao 

manejo com relativamente baixo dispêndio econômico, facilidade de manuseio, 

possibilidade de realizar exames sem anestesia e as similaridades notáveis com 

o olho humano em termos de dimensões e volumes anatômicos oculares 

(VALINHOS, 2011; WILLIAMS, 2012; EATON, 2021). Entretanto, essas 

diferenças anatômicas e fisiológicas devem ser levadas em consideração tanto 

para planejar o estudo, determinando a adequação do modelo, e também 

durante a interpretação precisa dos resultados obtidos (WERNER et al., 2006; 

EATON, 2021). 

2.2. Córnea e aspectos anatomofisiológicos 

A superfície ocular é a interface entre o olho e o meio ambiente, sendo 

responsável por proporcionar proteção anatômica, fisiológica e imunológica. A 

córnea representa uma estrutura importante da superfície ocular (HAMRAH; 

SAHIN, 2015). Após o filme lacrimal, é o primeiro tecido que recebe os raios 

luminosos e, devido a sua curvatura e transparência, possui grande capacidade 

de refração e transmissão de luz, representando, em média, 70% do poder óptico 

do olho (SCHOR et al., 2013; OFRI; EKESTEN, 2021). 

A córnea é constituída basicamente por quatro camadas: epitélio e sua 

membrana basal; estroma; membrana de Descemet; e endotélio (MAGGS, 2018) 

(Apêndice 1). O filme lacrimal pré-corneal por vezes também é considerado uma 

camada fisiológica mais externa, por ter uma grande importância tanto na 

refração quanto na proteção, lubrificação e nutrição da córnea (HAMRAH; 

SAHIN, 2015; MEEKINS et al., 2021). 

O epitélio corneal é escamoso, estratificado, não queratinizado, 

constituído por duas ou três camadas de células escamosas superficiais, duas 

ou três camadas de células intermediárias poliédricas; conectada a essas por 

hemidesmossomos, há uma única camada de células basais, que se encontram 

em uma fina membrana basal (MAGGS, 2018; MEEKINS et al., 2021). 

O estroma constitui 90% da espessura da córnea e sua função principal 

é oferecer rigidez e manter a curvatura corneal (MÜLLER et al., 2001). É 

composto principalmente por lamelas organizadas de fibrilas de colágeno; 

ceratócitos, água, glicosaminoglicanos, fibras nervosas amielínicas, raros 

linfócitos, macrófagos, neutrófilos e outros componentes da matriz extracelular 



5 
 

(MEEKINS et al., 2021). A disposição ordenada e regular das fibrilas de colágeno 

é essencial para manter a transparência da córnea (MAGGS, 2018). 

A membrana de Descemet é a membrana basal do endotélio, camada 

delgada, homogênea e acelular (HERRERA, 2008; MAGGS, 2018). Demonstra 

certa elasticidade clinicamente e é composta por uma série de fibrilas de 

colágeno (MEEKINS et al., 2021). Em seguida, em contato com o humor aquoso, 

encontra-se uma única camada de células endoteliais achatadas de formato 

hexagonal (MEEKINS et al., 2021). 

 A espessura corneal varia de acordo com espécies, raças, indivíduos e 

entre as regiões corneais. Na maioria dos animais domésticos encontra-se entre 

0,5 e 0,8 mm, não ultrapassando 1,0 mm e tendendo a ser mais fino em aves, 

répteis e pequenos mamíferos (MAGGS, 2018; MEEKINS et al., 2021). 

A córnea é um dos tecidos mais densamente inervados do corpo e é 

ricamente suprida por fibras nervosas sensoriais. A sensibilidade corneal tem 

importante função protetora, visto pelo piscar involuntário e lacrimejamento 

quando estimulada (MÜLLER et al., 2003; MEEKINS et al., 2021). Ademais, a 

inervação corneal auxilia na transparência, é amielínica e auxilia na cicatrização 

após lesões; ajudam a manter uma córnea saudável por meio da secreção de 

fatores tróficos e manutenção das secreções lacrimais basais (MÜLLER et al., 

2003; MAGGS, 2018). 

2.2.1 Características gerais anátomo-histológicas do olho dos coelhos 

Os coelhos são animais com olhos relativamente grandes quando 

comparados ao seu tamanho, protuberantes e situados lateralmente à cabeça, 

o que lhes permite amplo campo de visão de aproximadamente 360º (PESSOA, 

2014; EATON, 2021). 

A córnea do coelho é excepcionalmente grande, ocupando 

aproximadamente 30% da área da superfície do bulbo; com formato próximo do 

elíptico e notavelmente fina; apresenta diâmetro corneal horizontal médio de 

12,65 ± 0,55 mm (DAVIS, 1929; VALINHOS, 2011; ZHANG et al., 2017). 

Diferente dos humanos, os coelhos não possuem a camada de Bowman 

(DAVIS, 1929). O epitélio escamoso estratificado recobre a superfície corneal 

anterior, composto por aproximadamente seis camadas (DAVIS, 1929). O 

estroma representa cerca de 90% da espessura corneal e é constituído por 



6 
 

camadas organizadas de fibrilas de colágeno, responsáveis pela transparência 

corneal (DAVIS, 1929). O endotélio possui maior capacidade regenerativa do 

que em outras espécies, decorrente da replicação celular em resposta ao 

ferimento, porém esta capacidade regenerativa é reduzida dos 9 aos 12 meses 

de idade sendo encontrado maior incidência de polimegatismo endotelial 

(EATON, 2021 apud VAN HORN et al., 1977). 

Nos coelhos, a espessura central é 370 µm e discretamente maiores 

(450µm) na periferia próxima ao limbo (DAVIS, 1929). Godoy et al. (2007) 

relataram espessura corneal de 356,11±14,34µm em coelhos de 2 a 4 meses, 

da raça Nova Zelândia, com o uso de paquimetria ultrassônica, similares com os 

achados de Davis (1929). Gonçalves et al. (2018) utilizaram tomografia 

computadorizada e observaram uma espessura central de 410.39 ± 20.46 μm 

em coelhos de 14 meses de idade. 

Raça, idade e algumas enfermidades, como diabetes, influenciam 

variáveis do bulbo ocular de coelhos e devem ser considerados (VALINHOS, 

2011; RIAU et al., 2012; BAO et al., 2017; ZHANG et al., 2017). A pressão intra-

ocular (PIO) normal nos coelhos é, no geral, considerada de 13 a 20 mmHg 

(HOLMBERG, 2018; FEATHERSTONE; HEINRICH, 2021).  

Os coelhos apresentam um sistema lacrimal diferenciado visto pelo 

baixo ritmo de piscar, em torno de uma vez a cada seis minutos, mas seu filme 

lacrimal permanece estável (HOLMBERG, 2018; EATON, 2021). A maior 

estabilidade do filme lacrimal poderia ser explicada pela presença de quatro 

glândulas orbitais, com expressão constitutivamente mais ampla de mucina, e 

também uma camada lacrimal de lipídio mais espessa em comparação com cães 

e humanos, lhe proporcionando resistência à evaporação e a ruptura do filme 

lacrimal (EATON, 2021). Os valores para o teste lacrimal de Schirmer (TLS) 

apresentam uma variabilidade considerável, mas geralmente estão entre 

5±3mm/min (HOLMBERG, 2018; EATON, 2021). Hirota (2021) em um estudo 

com 30 coelhos adultos saudáveis observaram TLS de 9,6±1,2mm/min. 

Ademais, os coelhos apresentam uma taxa mais lenta de eliminação da 

lágrima, facilitada pela ausência do ducto nasolacrimal superior (EATON, 2021). 

Xia et al. (2011) demonstraram uma sensibilidade corneal baixa de coelhos 

brancos Nova Zelândia de aproximadamente 31,93 mm. 



7 
 

2.3. Lesões de córnea e mecanismos de reparação corneal 

A úlcera de córnea é uma afecção, caracterizada por uma solução de 

continuidade sobre a superfície ocular com exposição do estroma ou membrana 

basal epitelial (MAGGS, 2018). O contato direto da córnea com o ambiente torna-

a susceptível a lesões, sendo úlceras de origem traumática frequentes na 

oftalmologia veterinária (MAGGS, 2018, MOREIRA et al., 2018). Outras causas 

descritas são: disfunções palpebrais, corpo estranho, alterações no filme 

lacrimal, ação de agentes infecciosos e químicos, afecções de origem 

metabólicas, ou até neoplasias (HERRERA, 2008; WHITLEY; HAMOR, 2021). 

Entretanto, as propriedades biomecânicas e geométricas da córnea são 

essenciais para que suas funções sejam preservadas (LIU; ROBERTS, 2005). A 

ausência de vasos sanguíneos e pigmentos, seu estado de deturgescência e a 

manutenção da organização das estruturas celulares são fundamentais para sua 

transparência (RIORDAN-EVA; WHITCHER, 2008). Adicionalmente, a superfície 

externa lisa deve ser mantida, considerando processos de reparação contínua 

do epitélio e filme lacrimal saudável, para a formação adequada da imagem na 

retina (MEEKINS et al., 2021). Portanto, as células epiteliais possuem grande 

capacidade regenerativa e a córnea saudável pode reepitelizar em quatro a sete 

dias (HAMRAH; SAHIN, 2015).  

Imediatamente após uma lesão epitelial, ocorre o deslizamento das 

células ao redor da margem sobre a área afetada, instituição de mitose e 

maturidade celular e, por fim, sua fixação à membrana basal por meio de 

hemidesmossomos (MAGGS, 2018). A membrana basal desempenha um papel 

fundamental no processo, e quando ausente, mais tempo é necessário na 

reparação, pois a mesma precisa ser restabelecida, impedindo que o epitélio 

seja facilmente removido do estroma (MEEKINS et al., 2021). 

Nas lesões estromais a cicatrização pode ocorrer de modo avascular, 

vascular ou por ambos. Independentemente do mecanismo, é uma cicatrização 

relativamente lenta e imperfeita, resultando em uma perda na transparência 

(MAGGS, 2018). Frequentemente, como o epitélio cicatriza rapidamente, ocorre 

uma reepitelização sobre a superfície estromal, com o intuito de selar a lesão e 

posteriormente promover remodelação (MEEKINS et al., 2021). 

Segundo Maggs (2018), as feridas estromais descomplicadas tendem à 

cicatrização avascular, na qual ocorrem recrutamento e infiltração de neutrófilos 



8 
 

na lesão; em seguida, ceratócitos circundantes se transformam em fibroblastos 

e migram para a área danificada, onde sintetizam proteínas, colágeno e outros 

componentes junto a sua matriz extracelular para atingir o preenchimento do 

defeito; cerca de 48 horas após a lesão, há a chegada de macrófagos para 

remoção de resíduos celulares. A remodelação tecidual ocorre conforme a 

cicatrização, processo que pode resultar em cicatriz (MAGGS, 2018).  

Em lesões estromais infectadas, profundas ou crônicas o processo de 

remodelação é mais complexo. Geralmente requerem cicatrização 

vascularizada, na qual a infiltração celular é mais extensa e a área é invadida 

por vasos sanguíneos originários do limbo adjacente, o que resulta em maior 

perda na transparência (MAGGS, 2018). A neovascularização corneal ocorre 

devido à liberação de fatores pró-angiogênicos como fator de crescimento de 

fibroblastos (FGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e várias 

outras citocinas (CHEN et al., 2020). 

A membrana de Descemet é produzida e regenerada pelas células 

endoteliais, continuamente ao longo da vida (MEEKINS et al., 2021). As lesões 

de córnea mais profundas e complicadas podem resultar na exposição ou até 

mesmo no rompimento da membrana de Descemet. Nesses casos, o endotélio 

também é comprometido, devido à proximidade dessas estruturas (XIMENES et 

al., 2014; MAGGS, 2018). A capacidade de regeneração endotelial é limitada e 

varia com espécie e idade (MEEKINS et al., 2021). Em suma, após a perda de 

células endoteliais, o defeito endotelial é compensado por meio de uma 

combinação ativa do deslizamento e hiperplasia de células endoteliais vizinhas 

(VAN DEN BOGERD et al., 2017). 

A córnea não possui vasos sanguíneos e, por isso, quando lesionada, 

uma série de eventos se desenvolvem simultaneamente com o intuito de 

promover a proliferação celular, migração, diferenciação, apoptose, quimiotaxia, 

angiogênese e comunicação intercelular (PONTES et al., 2011; WHITLEY; 

HAMOR, 2021). Esses mecanismos de cicatrização são conduzidos por 

intermédio de mediadores inflamatórios, juntamente com os fatores de 

crescimento gerados decorrentes da lesão e também pela ação de proteinases, 

incluindo as matriz metaloproteinases (PERCHES et al., 2015; WHITLEY; 

HAMOR, 2021). 



9 
 

Como mencionado anteriormente, o epitélio da córnea é um tecido de 

auto renovação e, portanto, em casos de lesões leves, como abrasões epiteliais, 

a cicatrização epitelial depende, em grande parte, da migração e diferenciação 

das células-tronco límbicas e da remodelação junto à membrana basal 

(LJUBIMOV; SAGHIZADEH, 2015; WEST et al., 2015).  

Após lesão, as células epiteliais feridas ou mortas da córnea liberam 

interleucina 1 (IL-1) que, ao penetrar no estroma, ligam-se a receptores de IL-1 

expresso por ceratócitos adjacentes à lesão induzindo apoptose (WILSON, 

2020). Em ceratócitos e fibroblastos mais profundos, onde a concentração de IL-

1 é mais baixa do que próximo ao epitélio ferido, no lugar de apoptose, a IL-1 

desencadeia a produção e ativação de outros fatores de crescimento, matriz 

metaloproteínases (MMPs) e quimiocinas, induzindo eventos como a 

proliferação e quimiotaxia (WEST-MAYS; DWIVEDI, 2006; WILSON, 2020). 

Neste momento, a produção dos fatores de crescimento de hepatócitos (HGF) e 

de queratinócitos (KGF) pelos ceratócitos e fibroblastos é aumentada e, dezenas 

de milhares de células derivadas da medula óssea são atraídas ao estroma, 

como monócitos, macrófagos, linfócitos e fibrócitos (WILSON, 2020).  

O HGF e KGF são moduladores das interações estromais epiteliais que, 

junto com fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento 

transformador α (TGF-α) e outros fatores de crescimento produzidos pelo epitélio 

e glândulas lacrimais, regulam a proliferação, motilidade, diferenciação e 

apoptose das células epiteliais defeituosas buscando a cura epitelial 

(LJUBIMOV; SAGHIZADEH, 2015; WILSON, 2020). 

A cicatrização estromal consiste principalmente na transformação dos 

ceratócitos em fibroblastos e miofibroblastos (LJUBIMOV; SAGHIZADEH, 2015). 

As células epiteliais, além de IL-1, também influenciam positivamente na 

secreção e ativação dos fatores de crescimento transformador (TGF) β1 e β2, e 

o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), considerados citocinas 

pró-fibróticas, pois adentram o estroma e acionam a transformação dos 

ceratócitos sobreviventes em fibroblastos que, juntamente com os fibrócitos 

provenientes por intermédio da IL-1, secretam componentes da matriz 

extracelular (WILSON et al., 2017; WILSON, 2020).  

Conforme a resposta de cicatrização e reconstituição da membrana 

basal epitelial há uma diminuição do influxo do TGF-β no estroma, sendo que os 



10 
 

fibroblastos e fibrocitos podem reverter para suas respectivas células 

progenitoras ou sofrer apoptose (WEST-MAYS; DWIVEDI, 2006; WILSON, 

2020). Entretanto, lesões mais graves, danos extensos a membrana basal 

epitelial ou retardo na sua regeneração, levam à penetração contínua TGF-β e 

PDGF que conduzem a transformação dos fibroblastos e fibrócitos em 

miofibroblastos (WILSON, 2020). Estes, por sua vez, expressam grande 

quantidade de alfa-actina de músculo liso maduro (α-SMA) e produzem grandes 

quantidades matriz extracelular desordenada, o que contribui para fibrose e 

diminuição da transparência corneal (DE OLIVEIRA; WILSON, 2020).  

Assim, na córnea não lesada, a produção e ativação epitelial de TGF-β 

e PDGF é relativamente baixa e, esses fatores de crescimento, são impedidos 

de entrar no estroma pela membrana basal epitelial (WILSON, 2020). Quando 

ocorre lesão ao epitélio que inclui danos a membrana basal epitelial, o TGF-β e 

PDGF entram no estroma acionando a transformação de ceratócitos 

sobreviventes em fibroblastos da córnea e, em seguida, ambos os fibroblastos 

da córnea e os fibrócitos são modulados para iniciar o desenvolvimento em 

miofibroblastos maduros (WEST-MAYS; DWIVEDI, 2006; WILSON, 2020).  

A formação de fibrose corneal vai depender principalmente da 

quantidade de miofibroblastos transformados. Se o epitélio cicatrizar e, sua 

membrana basal for restaurada a tempo, miofibroblastos em desenvolvimento 

sofrem apoptose e há a proliferação de ceratócitos iniciando o processo de 

remoção de matriz extracelular desordenada diminuindo a opacidade corneal, 

evento que pode levar meses ou anos (WILSON et al., 2017; DE OLIVEIRA; 

WILSON, 2020). Entretanto, no caso de secreção acentuada ou contínua de 

TGF-β e PDGF com grande transformação de miofibroblastos maduros 

completam seu desenvolvimento e fibrose é gerada (WILSON et al., 2017; DE 

OLIVEIRA; WILSON, 2020). 

As IL-1 α e β liberados pelo epitélio lesado, juntamente com o fator de 

necrose tumoral alfa (TNF-α), também regulam positivamente a produção de 

metaloproteinases e colagenases por ceratócitos sobreviventes, fibroblastos, 

fibrócitos e miofibroblastos (LI et al., 2001; WILSON, 2020). Essas 

metaloproteinases e colagenases têm um papel crítico na resposta de 

cicatrização de feridas estromais, uma vez que estão envolvidas na 



11 
 

reorganização e degradação da matriz extracelular estromal (OLLIVIER et al., 

2007; WILSON, 2020), tema esse que será abordado mais à frente. 

2.3.1. Fatores de Crescimento 

Os fatores de crescimento são proteínas solúveis consideradas 

mediadores biológicos naturais (TAMHANE et al., 2019). Estão presentes no 

filme lacrimal, humor aquoso e são produzidos constantemente pelas células 

corneais, pois são essenciais para a manutenção e renovação tecidual e na 

prevenção de reações imunológicas ou angiogênicas indesejáveis (KLENKLER; 

SHEARDOWN, 2004; LJUBIMOV; SAGHIZADEH, 2015). No processo de 

reparação corneal, apresentam ação mediadora na proliferação, migração e 

diferenciação de células epiteliais e estromais, além de influenciar na 

remodelação da matriz extracelular (SCALINCI et al., 2011; PONTES et al., 

2011; SUZUKI et al., 2013). 

Uma infinidade de fatores de crescimento foram detectados no 

segmento anterior saudável e associados ao processo de cicatrização corneal, 

dentre os principais encontram-se: TGF α e β, PDGF, EGF, FGF, fator de 

crescimento semelhante à insulina (IGF-I), KGF, HGF, VEGF, fator de necrose 

tumoral (TNF-α) e fator de crescimento nervoso (NGF) (KLENKLER; 

SHEARDOWN, 2004; YU et al., 2010; LJUBIMOV; SAGHIZADEH, 2015).  

A família do TGF-β compreende três isoformas (TGF-β1, TGF-β2 e TGF-

β3) envolvidas em múltiplos processos biológicos da cicatrização, que incluem 

produção de matriz extracelular, proliferação celular, angiogênese, resposta 

imune, apoptose, diferenciação e quimiotaxia celular (ROBERTS, 2002). O TGF-

β1 e o TGF-β2 foram localizados no epitélio, estroma e filme lacrimal, sendo o 

TGF-β1 a principal isoforma capaz de promover a diferenciação de 

miofibroblastos; enquanto o TGF-β3 demonstrou receptores em epitélio e 

endotélio, porém pouco efeito na reepitelização e reparação tecidual (ER; 

UZMEZ, 1998; CARRINGTON et al., 2006 YU et al., 2010). 

Níveis elevados de TGF-β1 foram associadas ao aumento na expressão 

α-SMA no citoplasma de células miofibroblásticas, o que contribui para 

diminuição da transparência corneal (DE OLIVEIRA; WILSON, 2020). O TGF-β1 

também demonstrou ser um potente inibidor do crescimento de células epiteliais, 

podendo haver retardo na reepitelização (CARRINGTON et al., 2006). Foi 



12 
 

crescente a busca por tratamentos que atenuassem a expressão e sinalização 

de TGF-β, fornecendo meios para neutralizar as alterações fibróticas que 

resultam na opacidade estromal; entretanto, a inibição total de TGF-β1 foi 

estudada e, apesar de acelerar reepitelização corneal, reduz ou impossibilita a 

reparação estromal por diminuir a transformação de ceratócitos em fibroblastos 

e, consecutivamente, a produção de matriz extracelular (SONG et al., 2002; 

WANG et al., 2011; DE OLIVEIRA; WILSON, 2020).  

De acordo com Yu et al., (2010, o TGF-β possui grande interação, ou até 

mesmo, estimula a produção de outros fatores de crescimento, citocinas, 

colágeno e outras proteínas associadas à remodelação da matriz extracelular. O 

fator de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF), por exemplo, é regulado 

positivamente por TGF-β nos fibroblastos da córnea, desempenhando um papel 

importante na formação de cicatriz por atuar na diferenciação dos 

miofibroblastos induzidos pelo TGF-β e na síntese de colágeno por fibroblastos 

deposição de matriz extracelular (MEC) excessiva no leito da ferida, que pode 

resultar na formação de cicatrizes.  

No epitélio, quando em excesso, o TGF-β1 demonstrou retardar a 

cicatrização na fase inicial de reparação, por antagonizar e inibir a proliferação, 

adesão e migração das células epiteliais promovidas pelos EGF, KGF e HGF. 

Enquanto nos ceratócitos, aumentou o efeito de promoção do crescimento do 

EGF (YU et al., 2010). O EGF contribui na aceleração do processo de 

cicatrização da lesão e intervém na auto-renovação celular, especialmente em 

úlceras superficiais, pois estimula a proliferação e migração de células epiteliais 

e mesenquimais, atuando na regeneração de múltiplos tecidos (WANG et al., 

2013; SANCHEZ AVILA et al., 2018).  

O PDGF demonstrou ser um potente mitógeno durante o processo de 

transformação de miofibroblastos pelo TGF-β e a combinação desses dois 

fatores é mais potente que qualquer um dos fatores isolados (WILSON, 2020). 

Receptores para PDGF são encontrados nos fibroblastos e células endoteliais 

da córnea (KLENKLER; SHEARDOWN, 2004). A função do PDGF é modular a 

proliferação, migração e diferenciação das células corneais (SINGH et al., 2014).  

Há uma relação íntima entre o TGF-β e o FGF-2, na qual a expressão 

aumentada de FGF-2 influenciou positivamente no crescimento de fibroblastos 

pelo TGF-β e estes fibroblastos produziram tanto TGF-β quanto FGF-2 (KAY et 



13 
 

al., 1998). O TGF-β1 medeia as fases iniciais do reparo de feridas e, além de 

originar células, pode causar um aumento retardado em FGF-2, atuando primeiro 

na síntese e a degradação de proteínas específicas. Por outro lado, o FGF-2 

inibe a expressão de TGF-β1 e o seu aumento desempenha importante papel na 

ação contínua de TGF-β1 durante as fases posteriores do reparo de feridas 

corneanas (SONG et al., 2002). 

O FGF compreende uma grande família de proteínas com alta afinidade 

à heparina; sua atividade é mediada pela ligação a proteoglicanos de sulfato de 

heparano e a tirosina-quinases do receptor da superfície celular de elevada 

afinidade (NUGENT; IOZZO, 2000; BEENKEN; MOHAMMADI, 2009).  Estão 

envolvidos a vários processos biológicos, incluindo proliferação celular, 

diferenciação, migração, angiogênese e cicatrização (NUGENT; IOZZO, 2000).  

Os membros da família FGF, particularmente FGF-1 (ácido) e FGF-2 

(básico), desempenham um papel importante na angiogênese em vários 

tecidos in vivo, mas o FGF-2 é a isoforma mais comum detectada no olho 

(OLADIPUPO et al., 2014; CHEN et al., 2020). Ambos FGF-1 e FGF-2 se 

mostraram mitogênicos para células epiteliais, endoteliais e estromais 

(KLENKLER; SHEARDOWN, 2004). 

Wilson et al. (1994a) demonstraram quantidades significativas de FGF-

1 nas membranas de Bowman, Descement e no endotélio corneal, com pouca 

expressão no epitélio e nenhuma no estroma (KLENKLER; SHEARDOWN, 

2004). O FGF-2 e seus receptores foram expressos por células epiteliais, 

fibroblastos estromais, células endoteliais e também no humor aquoso, podendo 

apresentar funções diferentes em cada região (OLADIPUPO et al., 2014).  

Assim como FGF-2, o VEGF é um potente mediador do processo de 

vascularização e auxilia na cicatrização promovendo proliferação de células 

endoteliais e quimiotaxia; entretanto, na córnea a presença de vascularização 

pode resultar em perda da transparência (SUN et al., 2013). 

As plaquetas possuem muitas proteínas bioativas com uma diversidade 

de isoformas, que promovem a reparação tecidual e influenciam outras células 

sanguíneas na angiogênese e inflamação local (KLENKLER; SHEARDOWN, 

2004). O efeito dos fatores de crescimento depende, em grande parte, da célula 

em que foi produzido, da sua ativação, presença de receptores e sua interação, 

em grande parte, com os componentes da matriz extracelular; mas também dos 



14 
 

efeitos de outros fatores de crescimento e dos mecanismos reguladores das 

células afetadas (KLENKLER; SHEARDOWN, 2004; ETHEREDGE, 2009). 

A cicatrização corneal é um processo dinâmico e complexo, como 

ressaltado anteriormente, seu desequilíbrio pode resultar na perda de 

transparência (WILSON et al., 2001). Um aumento de um biomarcador em uma 

determinada região pode ser paralelo por uma diminuição de outro biomarcador 

em outra região. As diferenças nas atividades dos biomarcadores também estão 

correlacionadas aos substratos e seus ativadores; portanto, a atividade dos 

biomarcadores pode variar durante o curso da lesão (OLLIVIER et al., 2007; 

WANG; KHALIL, 2018; TAMHANE et al., 2019). Compreender como esses 

biomarcadores se comportam na fisiopatologia da doença e frente a um 

tratamento proposto é fundamental, já que a terapêutica demonstra influenciar 

na sua expressão (WANG; KHALIL, 2018; TAMHANE et al., 2019). 

2.4. Fibrina Rica em Plaquetas e fatores de crescimento associados 

Os biomateriais à base de matriz de fibrina são resultantes da ativação 

de plaquetas e, basicamente, classificados em dois tipos principais: as auto 

coaguladas, denominadas fibrina rica em plaquetas (PRF), e as formadas pela 

adição de ativadores exógenos (DOHAN-EHRENFEST et al., 2009; KAWASE; 

TANAKA, 2017). A trombina e o cloreto de cálcio são os principais ativadores 

exógenos utilizados, desencadeiam a ativação plaquetária e polimerização da 

fibrina (DOHAN-EHRENFEST et al., 2009; KAWASE; TANAKA, 2017). 

A fibrina rica em plaquetas (PRF) é um biomaterial proposto pela 

primeira vez por Choukroun et al., em 2001 e destacou-se não só pelas 

propriedades cicatrizantes, mas também por resultar de um processamento 

simples e econômico (CHOUKROUN et al., 2001 apud DOHAN et al., 2006a; 

CHOUKROUN et al., 2006). Neste o sangue é coletado sem anticoagulante em 

tubos de vidro secos e imediatamente centrifugado em baixa velocidade, 

iniciando processo natural de coagulação, com a formação de um coágulo de 

fibrina rico em plaquetas (DOHAN et al., 2006a; DOHAN et al., 2006b). Com 

identificação de inúmeros leucócitos em estudos posteriores, sua denominação 

passou a fibrina rica em plaquetas e leucócitos (L-PRF) (DOHAN et al., 2006c; 

DOHAN-EHRENFEST et al., 2009). 



15 
 

O L-PRF pode ser reproduzido pela centrifugação a 3000 rpm por 10 

minutos ou a 2700 rpm por 12 minutos (DOHAN et al., 2006a NANDITHA et al., 

2017). Na ausência de anticoagulantes, a ativação plaquetária e da fibrina são 

desencadeadas imediatamente, por um processo natural de coagulação, 

desencadeada pelo contato do sangue total com as paredes do tubo de vidro, 

durante todo o processo de centrifugação (MADURANTAKAM et al., 2015). 

Como resultado, três camadas são formadas: a base composta por glóbulos 

vermelhos (RBC); a superior, um sobrenadante de plasma acelular pobre em 

plaquetas (PPP); e o coágulo PRF ao meio, rico em leucócitos e plaquetas 

(DOHAN et al., 2006a; DOHAN EHRENFEST et al., 2009). 

A lenta polimerização da fibrina durante o preparo do PRF resulta na 

formação de um coágulo de fibrina com arquitetura tridimensional complexa 

(CHOUKROUN et al., 2006). Análises histológicas e por microscopia eletrônica 

de varredura do PRF descreveram sua capacidade em concentrar 97% das 

plaquetas e aproximadamente 50% dos leucócitos, com proporções neutrófilas 

e linfócitos significativamente maiores; na rede tetramolecular de fibrina também 

se notou a incorporação intrínseca de citocinas, cadeias glicânicas, 

glicoproteínas e também de células-tronco (CHOUKROUN et al., 2006; DOHAN 

EHRENFEST et al., 2010). Essa constituição presente no PRF promove 

capacidade significativa de secretar e liberar local e lentamente vários fatores de 

crescimento importantes na modulação da inflamação e regeneração de tecidos 

(DOHAN EHRENFEST et al., 2009; FUJIOKA-KOBAYASHI et al., 2017). 

Dentre as citocinas relatadas no PRF encontram-se: TGF-β1, PDGF, 

VEGF, trombospondina-1 (TSP-1) e IGF-1 (DOHAN EHRENFEST et al., 2009; 

FUJIOKA-KOBAYASHI et al., 2017). 

Os leucócitos aprisionados na matriz de fibrina, além de proporcionar ao 

PRF capacidade de regulação imunológica com efeito anti-infeccioso, são 

capazes de secretar progressivamente grandes quantidades de TGFβ1 e VEGF, 

importantes para a promoção da angiogênese e regulação inflamatória (DOHAN 

et al., 2006c; DOHAN EHRENFEST et al., 2009). 

O coágulo de PRF pode ser utilizado na forma de gel; entretanto, a 

aplicação mais comum é na forma de membrana (DOHAN EHRENFEST et al., 

2010; DERELI CAN et al., 2018). Quando pressionado entre duas gazes, o 

coágulo PRF torna-se uma membrana (DOHAN EHRENFEST et al., 2009). 



16 
 

Caixas com instrumentais específicos foram criadas para a manipulação do PRF 

e também compressão (MADURANTAKAM et al., 2015). A membrana de PRF 

demonstrou capacidade de resistência e flexibilidade, podendo receber suturas 

no tecido da lesão (MADURANTAKAM et al., 2015). 

Na oftalmologia humana, o PRF já foi utilizado em estudos sobre pterígio 

(CAKMAK et al., 2017; CAMACHO; LEON-ROJAS, 2021), descemetoceles 

(CAN et al., 2016a), plástica conjuntival (CAN et al., 2016b) e reconstruções 

escleral (DERELI CAN et al., 2020) e demonstrou oferecer suporte mecânico e 

quimiotático tornando-o adequado para reconstrução e manutenção da 

superfície ocular, com pouca reação inflamatória no tecido ocular e melhora no 

tempo de cirurgia (CAN et al., 2016a; CAN et al., 2016b; CAKMAK et al., 2017; 

DERELI CAN et al., 2020; CAMACHO; LEON-ROJAS, 2021). 

Foi documentado que modificações na força, velocidade e tempo de 

centrifugação proporcionam alterações nas propriedades biomecânicas do 

biomaterial e também na capacidade de concentração de plaquetas, leucócitos 

e citocinas, bem como na liberação dos fatores de crescimento, devendo-se ter 

controle adequado no preparo (GHANAATI et al., 2014; FUJIOKA-KOBAYASHI 

et al., 2017; CHOUKROUN; GHANAATI, 2018; EL BAGDADI et al., 2019). 

2.4.1 PRF em coelhos 

A membrana de L-PRF foi descrita em coelhos (DOHAN EHRENFEST 

et al., 2010b; CAN et al., 2016b; DERELI CAN et al., 2020). Entretanto, Dohan 

Ehrenfest et al. (2010b) expuseram a dificuldade em reproduzir o verdadeiro 

biomaterial em coelhos com a técnica de Choukroun. Um dos princípios-chave 

na produção do L-PRF é a coleta rápida com centrifugação imediata, o que é 

facilmente realizado em humanos, no entanto, torna-se desafiador em coelhos e 

outros animais de pequeno porte, pelo calibre das veias (DOHAN EHRENFEST 

et al., 2010b). 

O tempo prolongado de coleta de sangue e sem homogeneidade, pode 

promover a coagulação parcial inicial no tubo previamente a centrifugação; e 

resultam na formação de pequena massa de fibrina semelhante ao PRF, porém 

com arquitetura instável, conteúdo celular e a presença dos fatores de 

crescimento podem ser alterados (DOHAN EHRENFEST et al., 2010b). 



17 
 

Os locais descritos para a punção venosa em coelhos e suas indicações 

e limitações são: (1) veias da orelha, podem formar hematomas, trombose e 

descamação da pele; (2) veia cefálica, preferida para a colocação do cateter 

intravenoso, mas que promove estresse devido proximidade com a cabeça do 

coelho; (3) safena lateral, local ideal para a punção venosa, porém também 

sujeita a hematoma; e (4) veia jugular, que apresenta o melhor fluxo, ideal para 

coletas de volumes maiores de sangue, como para transfusão de sangue. 

Entretanto, a veia jugular torna-se adequada apenas em coelhos muito calmos 

ou sedados, bem como apresenta difícil visualização e localização em coelhos 

obesos ou fêmeas com grandes barbelas (GRAHAM, 2006).  

Can et al. (2016) investigaram o efeito da L-PRF na plástica conjuntival, 

produziram o biomaterial pela coleta de 5 mL da veia femoral de coelhos adultos, 

Nova Zelândia. Descreveram expressões significativas do VEGF, TGF-β e PDGF 

no período pós-operatório, mais especificamente, no 3º e 7º dia. 

Imunorreatividades significativas de colágeno-1, proteoglicano Agrecano, TGF-

β1, proteína morfogenética óssea 2 (BMP-2) e FGF; e expressões leves de 

MMP-2 foram observadas em reconstrução escleral tratadas com L-PRF, tendo 

coelhos como modelo experimental (DERELI CAN et al., 2020). Ambos os 

estudos concluíram que a membrana de L-PRF disponibiliza substâncias 

intrínsecas adequadas para estimular cicatrização do tecido e sua 

macroarquitetura funciona como arcabouço para lesão, estimulando sua 

aplicação na reconstrução e distúrbios debilitantes da superfície ocular (CAN et 

al., 2016; DERELI CAN et al., 2020). 

3. Considerações finais 

A cicatrização corneal é um processo dinâmico e complexo, como 

ressaltado anteriormente, seu desequilíbrio pode resultar na perda de 

transparência e, consequentemente, comprometer a visão (WILSON et al., 

2001). Compreender como um tratamento novo proposto comporta-se frente à 

lesão corneal é fundamental, já que a terapêutica influencia nos processos 

biológicos da cicatrização e interferem na produção de matriz extracelular, 

proliferação celular, angiogênese, resposta imune, apoptose, diferenciação e 

quimiotaxia celular (LJUBIMOV; SAGHIZADEH, 2015; WANG; KHALIL, 2018; 

TAMHANE et al., 2019). 



18 
 

Na oftalmologia, os estudos sobre o uso de membrana de L-PRF são 

escassos e inovadores, demonstrando que a membrana de L-PRF disponibiliza 

substâncias intrínsecas adequadas para estimular cicatrização do tecido e sua 

macroarquitetura funciona como arcabouço para lesão de forma que sua 

aplicação deve ser estimulada na reconstrução e distúrbios da superfície ocular 

(CAN et al., 2016; DERELI CAN et al., 2020).  

As considerações acima estimularam o estudo do L-PRF na reparação 

da córnea, pois ainda há uma lacuna nesse campo de pesquisa, e poderá ser 

extrapolado não somente na clínica oftalmológica de coelhos, como também na 

oftalmologia médica e veterinária. 

4. Hipótese(s) e objetivo(s) geral(s) e específico(s) 

A hipótese do estudo é que aplicação de membrana L-PRF canina 

xenóloga ou associada à autóloga deve ser uma alternativa viável no tratamento 

oftalmológico de úlceras de córnea. Adicionalmente, a associação da membrana 

xenóloga com autóloga tornará mais acessível à utilização da autóloga em 

coelhos, reduzindo o volume de sangue coletado.  

O objetivo geral deste estudo foi avaliar o processo de reparação de 

úlceras profundas de córnea, induzidas em coelhos, submetidos ao tratamento 

cirúrgico com membrana de L-PRF xenóloga ou sua associação à membrana L-

PRF autóloga.  

Adicionalmente, avaliação clínica oftalmológica longitudinal até 30 dias 

da implantação, bem como comparação entre os tratamentos; considerando 

analise histomorfométrica da córnea e imuno-histoquímica dos fatores de 

crescimento TGF-β e FGF-2 no M4, importantes no processo de reparação 

corneal. Presume-se que a associação com membrana L-PRF autóloga diminua 

possíveis rejeições ao biomaterial, além de oferecer níveis superiores de 

citocinas, leucócitos e outros bioativos presentes na membrana. 

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CAPÍTULO 2



33 
 

Trabalho a ser enviado para a revista Veterinary Record 
https://bvajournals.onlinelibrary.wiley.com/hub/journal/20427670/author-guidelines 

USO AUTÓLOGO E XENÓLOGO DA MEMBRANA DE FIBRINA RICA EM 

PLAQUETAS E LEUCÓCITOS EM ÚLCERAS PROFUNDAS DE CÓRNEA EM 

COELHOS 

Lenise Garbelotti Gonçalves1, Cláudia Valéria Seullner Brandão1 

1Departamento de Cirurgia Veterinária e Reprodução Animal, Serviço de Oftalmologia Veterinária, Universidade Estadual 

Paulista, Botucatu, Brasil 

Correspondence: valeria.brandao@unesp.br  

Background: A membrana de fibrina rica em plaquetas e leucócitos (mL-PRF), 

biomaterial de preparo rápido e simples, apresenta potencial regenerativo. Objetivou-se 

analisar o uso da mL-PRF, autóloga e xenóloga, em úlceras corneais profundas em 

coelhos. 

Methods: Vinte-oito coelhos adultos foram submetidos ao tratamento de úlcera corneal 

com mL-PRF xenóloga canina. Constituíram-se aleatoriamente dois grupos 

experimentais (n=14) designados: grupo G1, tratados apenas por recobrimento de 

membrana xenóloga; e grupo G2, previamente com membrana autóloga. Avaliações 

oftalmológicas foram realizadas no M0 e M4, M7, M14 e M30 dias do pós-operatório, 

com análise histomorfométrica corneal no M30. Cinco animais de cada grupo no M4, 

foram submetidos apenas a avaliação histomorfométrica e imuno-histoquímica para os 

fatores de crescimento transformador-β1 (TGF-β1) e de fibroblasto (FGF-b). 

Results: Os resultados das avaliações foram similares entre os grupos na maioria das 

variáveis analisadas. Inflamação discreta e reparação total da lesão verificou-se no M14 

em ambos os grupos com discreta opacidade corneal. A redução da área da lesão foi 

superior no G1 no M7. No G2, notou-se absorção mais lenta das membranas, maiores 

expressões de TGF-β1 no epitélio, e aumento de espessura estromal, com redução 

significativamente no M30.  A espessura e número de camadas do epitélio na região de 

lesão foram significativamente maiores, e similar a córnea íntegra, em ambos os grupos.  

Conclusions: O uso da membrana de L-PRF xenóloga canina foi exequível e prática, 

promoveu a cicatrização de úlceras profundas sem reações adversas, apresentando 

interessante alternativa na oftalmológica veterinária, especialmente em animais com 

restrição na coleta de sangue. O seu uso multimodal com membrana autóloga também é 

uma alternativa terapêutica interessante.

mailto:valeria.brandao@unesp.br


34 
 

INTRODUÇÃO 

A membrana de fibrina rica em plaquetas e leucócitos (L-PRF) é um biomaterial derivado 

de sangue com potencial regenerativo1; destaca-se na oftalmologia humana por fornecer 

suporte mecânico e quimiotático2-6. Foram descritas expressão de importantes fatores de 

crescimento nesse biomaterial, contribuindo para a proliferação, diferenciação e migração 

celular e, portanto, para a regeneração da superfície ocular.4,6 A L-PRF apresenta 

preparação simplificada, economicamente viável e sem manipulação bioquímica de 

sangue.1, 7 

Os autoenxertos córneo-conjuntivais, retalhos conjuntivais e os implantes de 

membranas biológicas, como a amniótica,8,9 pericárdio bovino9 e submucosa do intestino 

delgado suína,10 são empregados comumente em casos graves de úlceras de córnea. 

Entretanto, na rotina oftalmológica veterinária11, em especial no Brazil, observa-se por 

vezes ausência da disponibilidade do biomaterial, associado a elevados custos, ou 

complicações pós-operatórias como perda do enxerto, neovascularização excessiva e 

formação de fibrose corneal.  

Um dos princípios-chave na produção do L-PRF é a coleta rápida e homogênea com 

centrifugação imediata.12,13 Animais de pequeno porte, com veias de pequeno calibre, em 

geral, são desafiadores quanto a obtenção desse padrão, dificultando a produção L-

PRF.12,13 Tais aspectos estimularam desenvolvimento do estudo com aplicação de 

membrana L-PRF de origem xenóloga canina, visibilizando-se seu uso potencial na rotina 

clínica oftalmológica em pequenos animais ou animais com restrição da coleta de sangue, 

e inclusive nos coelhos, principal pet não convencional. 

Na oftalmologia humana, a aplicação do L-PRF foi relatada no tratamento de 

pterígio,2,3 em cirurgias plásticas conjuntivais,4 descemetoceles,5 e na regeneração 

escleral.6 Do conhecimento dos autores, o uso da membrana L-PRF xenóloga ainda não 

foi descrito na oftalmologia veterinária, bem como são escassos na oftalmologia trabalhos 

randomizados com L-PRF. 

Deste modo, este trabalho teve por objetivo avaliar, por meio de exame clínico-

oftalmológico e análise histomorfométrica, o processo de reparação de úlceras de córneas 

profundas induzidas experimentalmente em coelhos, submetidos ao tratamento cirúrgico 

com membrana de PRF autóloga e xenóloga. Adicionalmente, avaliar e comparar nos 

tratamentos instituídos a expressão de TGF-β1 e FGF-b, importantes na reparação 

corneal. 



35 
 

MATERIAL E MÉTODOS 

Conformidades Éticas e Seleção dos Animais 

O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no uso de Animais (CEUA) da Faculdade 

de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista, Campus de 

Botucatu – SP (FMVZ, UNESP), segundo o processo nº 23/2021. O trabalho seguiu as 

normativas de procedimentos da Association for Research in Vision and Ophthalmology 

(ARVO) e as diretrizes da Animal Research: Reporting of In Vivo Experients (ARRIVE). 

Foram utilizados 28 animais da espécie leporina (Oryctolagus cuniculus), adultos 

Nova Zelândia brancos, 11 machos e 17 fêmeas, com peso entre 3,5 e 5 Kg; provenientes 

do Biotério central da UNESP, Campus Botucatu-SP. Os critérios de seleção foram 

animais saudáveis e livres de alterações oculares, após exames clínicos e específicos. 

Todos foram alocados em biotério, com sistema de exaustão de ar, e mantidos em gaiolas 

individuais, com água potável e ração comercial ad libitum.  

Adicionalmente, para a coleta de sangue e preparação da membrana L-PRF xenóloga, 

foram utilizados três cães (Canis lupus familiaris) adultos saudáveis, com peso entre 20 

e 25Kg, um macho e duas fêmeas, sendo um da raça American Pittbul Terrier e dois sem 

raça definida (SRD). Como critério de inclusão, foram selecionados animais dóceis, 

calmos e saudáveis, verificados por um exame físico, hemograma e perfil bioquímico 

completo. 

Grupos experimentais 

Todos os coelhos foram submetidos à ceratectomia lamelar profunda e central no olho 

direito e tratamento com membrana de L-PRF xenóloga de sangue de cão, fixada na 

conjuntiva bulbar. Constituíram-se aleatoriamente dois grupos experimentais designados: 

grupo G1 (n=14) recebeu unicamente a membrana L-PRF xenóloga canina e grupo G2 

(n=14), o qual foi aplicado previamente sobre a úlcera à membrana L-PRF autóloga.  

O experimento foi desenvolvido em duas etapas: na primeira etapa, 05 coelhas de cada 

grupo foram submetidas a avaliação histomorfométricas e imuno-histoquímica aos quatro 

dias do pós-operatório. Na segunda etapa, de forma longitudinal, 09 coelhos, de cada 

grupo, foram avaliados clínico-oftalmológica antes do procedimento cirúrgico (M0) e aos 

quatro, sete, 14 e 30 dias após a cirurgia designados momentos, M4, M7 M14 e M30, 

respectivamente; e submetidos à avaliação histomorfométrica no último momento de 

avaliação (M30). 



36 
 

Preparo das membranas de L-PRF de coelho e cães 

Durante o preparo do biomaterial, foram respeitadas as normas de assepsia e antissepsia. 

A coleta da amostra de sangue foi realizada imediatamente ao procedimento cirúrgico. 

Para isso, todos os coelhos receberam anestesia com cetamina (20 mg/kg, Dopalen, Ceva, 

Paulínia, Brasil), midazolam (1 mg/kg, Dormonid, Roche, Jaguare, Brasil) e morfina (1 

mg/kg, Dimorf, Cristália, Itapira, Brasil), administrada pela via intramuscular. Foram 

coletados 2 ml de sangue da veia jugular de cada coelho do G2, utilizando-se agulha 

20X0,55mm (24G ¾”) e seringa de 3ml. Ato contínuo a coleta, o sangue foi transferido 

para um tubo de vidro seco estéril (sem anticoagulante), e centrifugado a 3000 rpm por 

10 minutos1 usando centrífuga de mesa (Sislab Basic, São Paulo, Brasil). O coágulo de 

L-PRF, formado na parte média do tubo, foi delicadamente recuperado com o auxílio de 

uma pinça tipo anatômica; com a espátula específica, o excesso de hemácias foi 

gentilmente removido. Para confecção da membrana, foi realizado leve compressão do 

coágulo com auxílio de tripla camada de gaze estéril umidificadas com solução fisiológica 

0,9% estéril, e após a compressão em caixa específica do Kit de PRF, objetivando sua 

padronização, o que resultou em membrana fina e semi-transparente (Figura 1). 

Para a confecção da membrana de L-PRF xenóloga canina, não foram necessárias 

medidas de contenção químicas durante a coleta. No momento imediatamente anterior a 

cirurgia dos coelhos, foram coletados 10 ml da veia jugular, utilizando agulha 30X0,7mm 

(22G1 ¼”) e seringa de 20 ml. A seguir, institui-se o mesmo protocolo admitido para a 

preparação da membrana L-PRF autóloga descrito anteriormente.1 As preparações das 

membranas L-PRF foram realizadas de forma simultânea ao procedimento cirúrgico. 

Procedimento cirúrgico e pós-operatório 

Após protocolo de anestesia a base de cetamina, midazolam e morfina, descrito 

anteriormente, e anestesia tópica com colírio de cloridrato de proximetacaína 0,5% 

(Anestalcon, Alcon, Genebra, Suíça), todos os coelhos foram mantidos anestesiados com 

isofluorano (Cristália, Itapira, Brasil) via máscara, na taxa de concentração alveolar 

mínima de 1,4 vol%. O procedimento cirúrgico foi realizado por cirurgião único. 

Realizou-se a tricotomia palpebral do olho direito e, após a anti-sepsia com solução de 

polivinilpirroidona (PVPI 1:50), foi utilizado pano de campo cirúrgico estéril sobre as 

pálpebras, e posterior aplicação do blefarostato Barraquer infantil. 



37 
 

Sob microscópico cirúrgico, o bloqueio subtenoniano foi realizado com lidocaína 

(0,3ml) objetivando a centralização corneal. As úlceras foram confeccionadas 

centralmente, utilizado-se um trepano a vácuo (Surgistar vacum trephine, Surgistar, 

Califórnia, EUA) com regulador de profundidade, padronizado com 7,25mm de diâmetro 

e 313µm de profundidade. Utilizando-se bisturi crescente a córnea foi delaminada 

cuidadosamente (Figura 2). 

Apenas nos coelhos do G2, foi feita a aplicação da membrana L-PRF autóloga, 

posicionada previamente sobre área ulcerada,5 mantendo-se a parte vermelha da 

membrana posicionada em quadrante temporal-lateral, sem fixação. Em todos os coelhos, 

independente do grupo, foi aplicada membrana de L-PRF xenóloga recobrindo toda 

superfície corneal e limbo,5 com sua parte vermelha em quadrante temporal-lateral, e 

fixada na conjuntiva bulbar cerca de oito pontos simples interrompidos de náilon 10.0 

(Figura 2). 

No transoperatório e após 24 e 48 horas, foi administrado em todos os coelhos, anti-

inflamatório à base de meloxicam (0,5mg/Kg/IM/SID; Maxicam® injetável 2%, 

Ourofino, Cravinhos, Brasil) e morfina (2mg/Kg/IM/SID; Dimorf, Cristália, Itapira, 

Brasil) nas primeiras 24 horas e, conforme necessidade, visando maximizar analgesia 

pós-operatória. Todos os coelhos foram tratados topicamente com colírio a base de 

tobramicina 0,3% (Tobracin®, Latinofarma, Cristália, Cotia, Brasil), quatro vezes ao dia, 

durante 10 dias. 

Os animais foram mantidos com colar elizabetano durante o período de quatro dias 

pós-operatório,14 higienizados diariamente. Durante este período, os animais foram 

observados, pelo mesmo avaliador, atentando-se à presença da membrana L-PRF e 

qualquer evidência de infecção ou dor. Sempre que necessário, os olhos foram 

higienizados com solução fisiológica a 0,9%. No quarto dia pós-operatório, foram 

retirados os pontos conjuntivais remanescentes, sob anestesia ocular tópica, e o colar 

protetor. 

Momentos e avaliações oftalmológicas 

Todos os animais foram avaliados pelo mesmo examinador: antes do procedimento 

cirúrgico (M0) e aos quatro, sete, quatorze e trinta dias após a cirurgia designados 

momentos, M4, M7, M14 e M30, respectivamente.  

O exame oftalmológico foi realizado em todos os momentos sob contenção física. Foi 

realizada biomicroscopia com lâmpada de fenda (Kowa SL-15, Kowa Optimed, Inc., 



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Torrance, Califórnia) para avaliação dos reflexos pupilares e das estruturas oculares. 

Foram analisados a hiperemia conjuntival, opacidade e vascularização corneal e 

blefaroespasmo e, utilizados escores quali-quantificados subjetivamente, como: ausente 

(0), leve (1), moderada (2) e severo (3). 

O grau de opacidade corneal foi classificado em escore de 0 a 3, sendo: ausente (0), 

córnea totalmente transparente; leve (1), opacidade nebular discreta, visibilizada por 

iluminação com biomicroscopia; moderada (2), opacidade macular semi-densa, porém 

sem afetar a visibilização de câmara anterior; e intenso (3), com formação de leucoma 

branco denso, dificultando ou impossibilitando visibilização de câmara anterior. A 

neoformação vascular foi avaliada com lâmpada de fenda e os vasos presentes 

quantificados em escores (0) ausente, (1) 1 a 3 vasos, (2) 4 a 6 vasos, (3) 7 ou mais. 

No M0 e M30, a estesiometria (estesiômetro Cochet-Bonnet, Luneau Ophthalmologie, 

França) e o teste lacrimal de Schirmer foram realizados, aplicando-se toques suave na 

região central da córnea com o monofilamentoso de náilon do equipamento, com diâmetro 

de 0,12 mm e comprimento ajustável variando de 0,5 cm a 6 cm; foi iniciado com o maior 

comprimento, o qual foi reduzido a cada 0,5 cm até obter resposta positiva ao estímulo, 

ou seja, ato de piscar. Para o teste lacrimal de Schirmer (Ophthalmos, Rohto®, São Paulo, 

Brasil), a tira foi introduzida no saco conjuntival, na parte média da pálpebra inferior, 

durante um minuto, com leitura imediata. 

Em todos os momentos foi realizada a pressão intraocular (PIO) utilizando-se 

Tonometria de rebote (Tonovet Plus, Icare®, Carolina do Norte, EUA), no modo coelho. 

Foram efetuadas cinco medidas consecutivas, considerando um erro máximo de 5%, e o 

resultado final representado pela média. O teste com tiras de fluoresceína (Ophthalmos, 

Rohto®, São Paulo, Brasil) foi realizado para avaliação da integridade do epitélio corneal 

pela coloração da área alterada. Os escores utilizados foram: teste de fluoresceína com 

escore negativo (0) na ausência de coloração ou positivo (1).  

A evolução da área da lesão foi avaliada no M0, imediatamente após a realização de 

úlcera cirúrgica experimental e nos M7, M14 e M30. Devido a presença de membrana 

corada por fluoresceína, interferindo na análise da área de lesão no M4, este resultado foi 

excluído da análise. Para tal, foi realizada aplicação de fluoresceína e fotodocumentação 

com uso de uma câmera fotográfica digital (Canon®, Tóquio, Japão), obedecendo à 

distância de 10 cm e sempre com métrica para referência. Em seguida, as imagens foram 

analisadas utilizado o software ImageJ (National Institute of Health -NIH) e a área da 

lesão corada foi calculada em mm² (Figura 3) pelo mesmo observador. 



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Em M0 e M30 também foram realizados os exames para avaliar a espessura corneal 

central, com auxílio de paquímetro ultrassônico (SP-100, Tomey, Japão) calibrado com 

velocidade do som para córnea em 1640m/s; por meio de suaves toques na córnea com a 

probe do paquímetro, foram aferidas oito medidas consecutivas e obtida automaticamente 

a média e o desvio padrão. 

A evolução da absorção da membrana de L-PRF em relação à superfície corneal, foi 

realizada em todos os momentos de avaliação pós-operatórios, por fotodocumentação e 

classificada utilizando-se os escores: leve (1), ausência de cobertura corneal pela 

membrana em 40%; moderada (2), ausência de cobertura entre 40 a 80%; e intensa (3), 

ausência total da membrana ou acima 80%. 

Preparação das amostras e análises microscópicas 

A eutanásia dos coelhos foi realizada utilizando-se protocolo de anestesia IM descrito 

anteriormente, seguido da aplicação de tiopental (20mg/kg/IV) e cloreto de potássio 

19,1% (2ml/kg/IV, Equiplex, Goiás, Brasil). Os olhos tratados foram enucleados e 

fixados em formaldeído tamponado a 10% durante 72 horas e, posteriormente, mantidos 

em álcool 70%. As amostras foram seccionadas de forma longitudinal em sua porção 

média e submetidas à inclusão em parafina. Seções com espessura de 4μm foram cortadas, 

montadas em lâminas histológicas e/ou eletrostáticas e, desparafinizadas e processadas 

para os diferentes métodos de análise.  

Para análise morfométrica da córnea, as lâminas foram coradas pelo método de 

hematoxicilina e eosina (HE) e para a imunomarcação anti-TGF-β1 (fator de crescimento 

transformador-β1-Abcam ab66043) e FGF-b (fator de crescimento de fibroblasto- Abcam 

-ab8880) foram utilizadas lâminas eletrostáticas. Todas as amostras foram analisadas no 

microscópio Olympus BX 57® associado à Câmera Olympus DP73® e associado ao 

Software cellSens Standard 1.12 copyright 2009-2014- Olympus Corporation, sempre 

pelo mesmo histologista. 

Análises Morfométricas  

Foram padronizadas três regiões: córnea íntegra, onde não houve indução de lesão; a 

borda da lesão e o centro da lesão induzida. Três pontos em cada região foram analisad