1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA CENTRO DE AQÜICULTURA DA UNESP PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQÜICULTURA Suplementação alimentar de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) com 1,3 glicano: atividade respiratória de leucócitos, lisozima e estresse por captura. JANESSA SAMPAIO DE ABREU BIÓLOGA JABOTICABAL - SÃO PAULO 2007 2 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA CENTRO DE AQÜICULTURA DA UNESP PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQÜICULTURA Suplementação alimentar de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) com 1,3 glicano: atividade respiratória de leucócitos, lisozima e estresse por captura. JANESSA SAMPAIO DE ABREU Orientadora: Profª. Drª. Elisabeth Criscuolo Urbinati Tese apresentada ao Programa de Pós- graduação em Aqüicultura, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Aqüicultura. JABOTICABAL - SÃO PAULO 2007 3 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal. Abreu, Janessa Sampaio de A162s Suplementação alimentar de pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) com beta 1,3 glicano: atividade respiratória de leucócitos, lisozima e estresse por captura / Janessa Sampaio de Abreu. – – Jaboticabal, 2007 vi, 123 f. :il ; 29 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Centro de Aqüicultura, 2007 Orientador: Elisabeth Criscuolo Urbinati Banca examinadora: Cleni Mara Marzocchi Machado, Flávio Ruas de Moraes, João Batista Kochenborger Fernandes, Luis Henrique Montrezor Bibliografia 1. Pacu. 2. Resposta imune inata. 3. Estresse. I. Título. II. Jaboticabal-Centro de Aqüicultura. CDU 639.31:612 4 DEDICATÓRIA Dedico esta minha conquista, A minha mãe Jane, amor verdadeiro, suporte de afeto, meu exemplo de fé e perseverança... Ao meu pai Waltemir e meu avô Walter (in memorian), com muita saudade... Ao Marco Aurélio, que acompanhou esta caminhada do início ao fim com amor, paciência e tolerância... “Ainda que falássemos a língua dos homens e dos anjos, sem amor nada seríamos...” (Corintos B:1) 5 AGRADECIMENTOS A Deus pelo que sou, pelo que tenho e por mais esta conquista... A minha orientadora, Profa. Dra. Elisabeth Urbinati, por compartilhar comigo seu tema de pesquisa, estando sempre disposta a oferecer estímulos e, principalmente, a percorrer novos caminhos. Obrigada pela confiança, generosidade e, sobretudo, por sua amizade. Foi uma grande alegria trabalharmos juntas... À grande amiga Damares Perecim Roviero, companheira querida, por ter compartilhado comigo sua vida e sua família, que se tornou um pouco minha. Pela sinceridade de nossa amizade acima de qualquer outra coisa. À Profa. Dra. Cleni Mara Marzocchi Machado que, generosamente, presenteou-me com sua amizade e partilhou comigo todo o processo de produção deste trabalho, sendo uma das minhas mais importantes fontes de apoio intelectual e afetivo, sem a qual certamente esta tese não chegaria ao fim. Ao Prof. Dr. Dalton José Carneiro pelo empréstimo das dependências do Laboratório de Nutrição de Organismos Aquáticos para realização de um dos experimentos deste trabalho. À Profa. Dra. Cláudia Bonini-Domingos e sua equipe que, gentilmente, cedeu as dependências do Laboratório de Hemoglobinas e Genética das Doenças Hematológicas (LHGDH) do IBILCE/UNESP para contagem das lâminas deste experimento. À Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara (FCFAR/UNESP) e de Ribeirão Preto (FCFRP/USP), em especial ao Prof. Dr. Luiz Marcos da Fonseca e à Profa. Dra. Yara Maria Lucisano Valim, respectivamente, por desafiarem comigo a imunologia de peixes abrindo as portas de seus laboratórios e fornecendo valoroso auxílio nas análises imunológicas realizadas. 6 Ao Laboratório de Patologia de Organismos Aquáticos (LAPOA, CAUNESP) em especial aos amigos Eduardo Onaka (Tuim) e Fabiana Pilarski, pela realização das fotos desta tese, pela ajuda na identificação dos leucócitos e, principalmente, pelo auxílio no diagnóstico e tratamento da bacteriose ocorrida durante a realização deste trabalho. Ao Laboratório KS Biotec (Noruega), em especial ao Dr. Rolf Engstad e Dr. Sjur Tveite e ao Laboratório Biorigin (Brasil), em especial à Rosangela Cristina Contieri, pela doação do beta glicano utilizado neste trabalho. À Ana Carolina Urbaczek, da FCFAR/UNESP pela amizade conquistada, apoio e imensa colaboração na padronização e a realização dos ensaios imunológicos. Ao amigo Eduardo Abimorad pelo apoio e valorosa ajuda na formulação das rações experimentais. À Sandra Mara Curtareli e Oswaldo Alves Barbosa (Fábrica de ração, FCAV/UNESP) pelo auxílio durante o processamento das rações. Aos amigos Leonardo Takahashi, Daniel Emygdio de Faria Filho e Karoll Andrea Alfonso pela ajuda nas análises estatísticas. Aos professores, funcionários e amigos do CAUNESP e do Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal (FCAV/UNESP) pelas sugestões e grandiosa ajuda durante todas as etapas deste trabalho. Ao CNPq pelo apoio financeiro que viabilizou este estudo. A todos aqueles que tornaram possível esta conquista. A todos os meus amigos: os de longe, de perto, os antigos, os mais recentes... Os constantes, os itinerantes... Os das horas difíceis e das horas alegres... Os de outra vida... Enfim, a todos aqueles amigos que de alguma forma passaram pela minha existência e contribuíram para torná-la melhor, mais bela, mais iluminada... Meu muito obrigada!!! i ÍNDICE CAPÍTULO 1 - O USO DO IMUNOESTIMULANTE 1,3 GLICANO EM PEIXES: SEUS EFEITOS NA RESPOSTA IMUNE INATA E NA PREVENÇÃO DO ESTRESSE. INTRODUÇÃO GERAL Respostas de estresse em peixes.....................................................................................02 A captura como agente estressor ....................................................................................08 O sistema imune e as respostas não-específicas em peixes............................................10 O 1,3 glicano como imunoestimulante e seus efeitos nos peixes................................17 Referências Bibliográficas..............................................................................................23 RESUMO GERAL .......................................................................................................36 ABSTRACT .................................................................................................................38 CAPÍTULO 2 - ATIVIDADE RESPIRATÓRIA DE LEUCÓCITOS E LISOZIMA EM JUVENIS DE PACU (Piaractus mesopotamicus HOLMBERG, 1887): METODOLOGIAS DE AVALIAÇÃO. Resumo ...........................................................................................................................41 Introdução.......................................................................................................................42 Material e Métodos Reagentes............................................................................................................44 Animais...............................................................................................................44 Experimento 1: Avaliação da atividade respiratória de leucócitos pelo ensaio de quimioluminescência em pacu........................................................................................45 ii Experimento 2: Avaliação da atividade respiratória de leucócitos pelo ensaio de redução do nitroblue tetrazolium (NBT) em pacu..........................................................47 Experimento 3: Ensaio turbidimétrico da atividade de lisozima em soro e plasma de pacu. ..........................................................................................................................49 Resultados Ensaio de quimioluminescência .........................................................................52 Ensaio NBT ........................................................................................................53 Ensaio de lisozima ..............................................................................................53 Discussão........................................................................................................................58 Referências Bibliográficas..............................................................................................62 Figura 1. Atividade respiratória de leucócitos de pacu avaliada por quimioluminescência induzida por PMA e usando luminol como sonda luminescente ...................54 Figura 2. Leucócito de pacu NBT positivo corado com Leishman. ..............................55 Figura 3. Extensões sangüíneas de pacu com EDTA e heparina ...................................55 Figura 4. Curva de calibração para lisozima. .................................................................56 Figura 5. Curva de calibração para lisozima submetida e não submetida ao tratamento pelo calor .......................................................................................................57 Figura 6. Curva do soro e plasma inativados de pacu com volumes compreendidos entre 150 e 275 l. ...................................................................................................57 Tabela 1. Concentração de lisozima sérica e plasmática de pacu em diferentes volumes de soro e plasma.............................................................................................56 iii CAPÍTULO 3 - SUPLEMENTAÇÃO ALIMENTAR DE PACU (Piaractus mesopotamicus HOLMBERG, 1887) COM 1,3 GLICANO: ATIVIDADE RESPIRATÓRIA DE LEUCÓCITOS, LISOZIMA E ESTRESSE POR CAPTURA. Resumo ...........................................................................................................................67 Introdução.......................................................................................................................69 Material e Métodos Experimento 1: Administração intraperitoneal de 1,3 glicano em pacu..........72 Experimento 2: Suplementação alimentar com 1,3 glicano para pacu... ........73 Experimento 3: Efeito do 1,3 glicano sobre a atividade respiratória de leucócitos, lisozima sérica e respostas fisiológicas de pacus submetidos à captura.......75 Análise de água...................................................................................................77 Amostragem do material biológico ....................................................................77 Reagentes............................................................................................................78 Análises laboratoriais..........................................................................................79 Bacteriose ...........................................................................................................82 Análise estatística ...............................................................................................82 Resultados Análise de água...................................................................................................83 Mortalidade.........................................................................................................83 Quadro hematológico, atividade respiratória de leucócitos e lisozima sérica de pacus injetados intraperitonealmente com 1,3 glicano................................................85 Quadro hematológico, atividade respiratória de leucócitos e lisozima sérica de pacus alimentados com 1,3 glicano.............................................................................89 iv Efeito do 1,3 glicano sobre a atividade respiratória de leucócitos, lisozima sérica e respostas fisiológicas de pacus submetidos à captura ........................................94 Discussão......................................................................................................................102 Referências Bibliográficas............................................................................................112 Figura 1: Monócitos de pacu NBT positivos................................................................ .81 Figura 2: Monócitos de pacu NBT negativos............................................................... .81 Figura 3: Pacu acometido por Flavobacterium columnare nos experimentos 1 e 2. ... .84 Figura 4: Número de eritrócitos e hematócrito de pacu após dois, quatro, sete e dez dias de injeção de 1,3 glicano. ......................................................................... .86 Figura 5. Volume corpuscular médio e concentração de hemoglobina de pacu após dois, quatro, sete e dez dias de injeção de 1,3 glicano. .................................... .87 Figura 6: Atividade respiratória de leucócitos de pacu após quatro, sete e dez dias de injeção de 1,3 glicano. ............................................................................. .88 Figura 7: Número de eritrócitos e hematócrito de pacu após cinco, quinze e trinta dias de alimentação com 1,3 glicano. .................................................................90 Figura 8: Volume corpuscular médio e concentração de hemoglobina de pacu após cinco, quinze e trinta dias de alimentação com 1,3 glicano. .......................91 Figura 9: Proteína total sérica de pacu após cinco, quinze e trinta dias de alimentação com 1,3 glicano. ..........................................................................................92 Figura 10: Atividade respiratória de leucócitos de pacu após cinco, quinze e trinta dias de alimentação com 1,3 glicano. .................................................................93 Figura 11: Número de eritrócitos e hematócrito de pacus alimentados com 1,3 glicano e submetidos à captura. ...................................................................................96 v Figura 12: Volume corpuscular médio e concentração de hemoglobina de pacus alimentados com 1,3 glicano e submetidos à captura. ................................97 Figura 13: Glicemia de pacus alimentados com 1,3 glicano e submetidos à captura. ......................................................................................................................98 Figura 14: Proteína total sérica de pacus alimentados com 1,3 glicano e submetidos à captura. ...........................................................................................................98 Figura 15: Sódio sérico e cloreto plasmático de pacus alimentados com 1,3 glicano e submetidos à captura. .....................................................................................99 Figura 16: Potássio e cálcio séricos de pacus alimentados com 1,3 glicano e submetidos à captura. ...................................................................................100 Figura 17: Atividade respiratória de leucócitos de pacus alimentados com 1,3 glicano e submetidos à captura. .......................................................................... .....101 Tabela 1: Formulação e composição das dietas do experimento 2.................................75 Tabela 2: Formulação e composição das dietas do experimento 3.................................78 Tabela 3: Parâmetros físicos e químicos da água analisados nos três experimentos. ...83 Tabela 4: Taxa de mortalidade média de pacus infectados por Flavobacterium columnare nos experimentos 1 e 2.................................................................84 Tabela 5: Concentração e atividade de lisozima sérica de pacu após quatro, sete e dez dias de injeção de 1,3 glicano. ...................................................................88 Tabela 6: Concentração e atividade de lisozima sérica de pacu após cinco, quinze e trinta dias de alimentação com 1,3 glicano. ................................................93 Tabela 7: Concentração e atividade de lisozima sérica de pacus alimentados com 1,3 glicano e submetidos à captura. ...................................................................101 ANEXO (Soluções) .....................................................................................................121 vi ABREVIATURAS CRP C - reactive protein EDTA Ethylene Diamine Tetracetic Acid EROs Espécies reativas de oxigênio DMSO Dimetilsulfóxido MPO Mieloperoxidase NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato NBT Nitroblue tetrazolium NK Natural killer PAMPs Pathogen-associated molecular patterns PBS Solução salina tamponada com fosfato PBS/Dulbecco Solução salina tamponada em fosfato de Dulbecco PRRs Pathogen recognition receptors PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate SOD Superóxido dismutase CAPÍTULO 1 O USO DO IMUNOESTIMULANTE 1,3 GLICANO EM PEIXES: SEUS EFEITOS NA RESPOSTA IMUNE INATA E NA PREVENÇÃO DO ESTRESSE 2 INTRODUÇÃO GERAL Respostas de estresse em peixes Em todas as fases do processo de produção de peixes é inevitável que ocorram procedimentos considerados adversos e que geram estresse. Fatores como captura, confinamento, transporte, má qualidade da água, entre outros, aumentam a incidência de doenças, a mortalidade e prejudicam o desempenho dos peixes (Pickering, 1981; Barton e Iwama, 1991; Wendelaar Bonga, 1997, Hontela, 1997; Barnett e Pankhurst, 1998). A definição de estresse é bastante ampla. De acordo com Pickering (1981), o estresse pode ser definido como uma condição na qual o equilíbrio dinâmico, ou homeostase, de determinado organismo é perturbado ou influenciado por estímulos internos ou externos, denominados de estressor, sendo que Barton e Iwama (1991) consideram que as respostas estimuladas podem ser quantitativamente determinadas, refletindo o grau ou severidade do estressor. Em resposta ao estressor os peixes desencadeiam alterações bioquímicas e fisiológicas na tentativa de enfrentar o desafio imposto. As respostas de estresse são categorizadas em primárias, secundárias e terciárias, de acordo com o nível de organização. Muitas delas são usadas como indicadores da alteração homeostática nos peixes. As respostas primárias representam a percepção de uma alteração e início de respostas neuro-endócrinas incluindo a rápida liberação de catecolaminas e cortisol para a circulação sistêmica (Mazeaud e Mazeaud, 1981; Barton e Iwama, 1991). As respostas secundárias incluem ajustes bioquímicos e fisiológicos e são mediadas, até certo ponto, pelos hormônios do estresse. Entre estas respostas estão os efeitos metabólicos, como alterações na glicemia, no conteúdo de ácido láctico e glicogênio hepático e muscular; efeitos sangüíneos, como alteração no número de células vermelhas e brancas e, ainda, 3 os efeitos hidro-eletrolíticos, como alterações nas concentrações plasmáticas de íons cloro, sódio, potássio, proteínas e na osmolaridade (Eddy, 1981; McDonald e Milligan, 1997; Wendelaar Bonga, 1997; Benfey e Biron, 2000; Wojtaszek et al., 2002). As respostas terciárias representam alterações associadas ao estresse, de indivíduos ou de populações, e incluem mudanças no comportamento, diminuição do crescimento, desempenho reprodutivo e aumento da suscetibilidade à doenças (Wedemeyer e McLeay, 1981). Desta forma, assim como para outros vertebrados, peixes estressados apresentam resposta generalizada, caracterizada por aumento dos hormônios do estresse e mudanças fisiológicas, de indivíduos ou populações. O hormônio glicocorticóide cortisol é secretado como resposta primária de estresse em vertebrados e é amplamente aceito como indicador de estresse em peixes (Barton e Iwama, 1991). Muitos trabalhos relatam aumento nas concentrações sangüíneas de cortisol em peixes submetidos a vários tipos de estressores, como captura (Pottinger, 1998), confinamento (Montero et al., 1999) e transporte (Benfey e Biron, 2000; Sadler et al., 2000), muitas vezes aplicados individualmente ou em conjunto (Barnett e Pankhurst, 1998; Ortuño et al., 2002), com a finalidade de simular o que realmente ocorre nos sistemas de criação. O padrão e a magnitude do aumento dos níveis sangüíneos de cortisol são dependentes da natureza e duração do estresse, enquanto o mesmo tipo de estressor pode promover respostas temporalmente distintas em diferentes espécies. O estresse agudo, como aquele causado por captura e exposição aérea, induz rápido aumento na concentração de cortisol, mas os níveis retornam ao normal dentro de poucas horas (Pottinger, 1998). Arends et al. (1999) submeteram Sparus aurata à exposição aérea por três minutos e verificaram aumento significativo nas concentrações plasmáticas de 4 cortisol trinta minutos após a aplicação do fator estressante, retornando aos valores basais duas horas mais tarde. Em outro trabalho realizado com a mesma espécie, Ortuño et al. (2002) usaram a combinação de quatro diferentes tipos de estressores (distúrbios físicos, adensamento, anestesia e exposição aérea) e encontraram aumento imediato dos níveis séricos de cortisol, com retorno aos níveis basais 24 horas após a aplicação da combinação dos fatores estressantes. Percas (Perca fluviatilis) capturadas e expostas ao ar por um minuto apresentaram típica resposta aguda de estresse, caracterizada pelo aumento imediato dos valores séricos de cortisol, com retorno à condição basal quatro horas após a manipulação (Acerete et al., 2004). Por outro lado, o estresse crônico, como aquele causado por interação social e confinamento, é menos severo e não eleva o cortisol a altas concentrações, mas a elevação persiste por várias semanas (Pickering e Pottinger, 1989). Tort et al. (1996) submeteram Sparus aurata ao adensamento por três semanas e verificaram que, embora o nível plasmático de cortisol tenha sido significativamente mais alto depois de dois dias de adensamento, nas amostragens subseqüentes houve diminuição gradual do hormônio nestes peixes, mantendo valores baixos até o final do experimento. Da mesma forma, em Pagrus pagrus, dois dias de adensamento foram suficientes para provocar aumento moderado na concentração plasmática de cortisol, que, a partir de então, diminuiu, mantendo-se baixa até o final do experimento (Rotlant et al. 1997). O confinamento de Chelidonichthys kumu por 24, 48, 72 e 96 horas não provocou aumento nos níveis plasmáticos de cortisol, sugerindo que os peixes estavam cronicamente estressados quando mantidos em cativeiro por até 96 horas (Clearwater e Pankhurst, 1997). Entretanto, Sparus aurata mantidos em alta densidade de estocagem apresentaram ao final de 15 semanas, níveis plasmáticos de 5 cortisol quatro vezes mais altos que os peixes estocados em baixa densidade, sugerindo a incapacidade dos peixes de se adaptarem àquela condição (Montero et al., 1999). Recentemente, estudo com Melanogrammus anglefinus (Hoyosya et al., 2007) mostrou que a fração livre de cortisol no sangue pode ser um indicador mais sensível das alterações que ocorrem durante o estresse do que a concentração de cortisol total, quer seja estresse induzido por estressor crônico como por agudo. A glicemia é uma das respostas secundárias mais utilizadas para se quantificar estresse em peixes (Mazeaud e Mazeaud, 1981; Morgan e Iwama, 1997; Wendelaar Bonga, 1997). A mobilização de glicose em resposta ao estresse é geralmente aceita como meio de fornecer energia extra, permitindo ao animal superar determinado distúrbio. Da mesma forma que a glicemia, o lactato também pode ser considerado indicador de ativação simpática durante o estresse. Alguns trabalhos relatam que várias espécies de peixes, teleósteos e cartilaginosos, apresentam altas concentrações de lactato plasmático após terem sido submetidas a exercício e hipóxia (Lowe e Wells, 1996; Pottinger, 1998; Arends et al., 1999; Hoffmayer e Parsons, 2001). Aumento nos níveis de cortisol e glicose em resposta ao estresse também foi registrado em algumas espécies de peixes criadas no Brasil. O estresse de transporte por quatro horas provocou aumento nos níveis de cortisol e glicose do matrinxã (Brycon amazonicus) (Carneiro e Urbinati, 2001a,b; Urbinati et al., 2004) embora, nenhuma mudança significativa tenha ocorrido nestes parâmetros quando esta mesma espécie foi submetida ao confinamento por 24 horas (Rocha et al., 2004). O estresse agudo induzido pela transferência de tanque, provocou em jundiá (Rhamdia quelen) aumento nas concentrações séricas de cortisol (Barcellos et al., 2001; Barcellos et al., 2004) e o transporte por três horas foi suficiente para elevar significativamente as concentrações 6 plasmáticas de cortisol e glicose em tambaqui (Colossoma macropomum) (Gomes et al., 2003). Outro efeito secundário observado em peixes em resposta ao estresse é a dilatação dos vasos sangüíneos branquiais, provocada pela elevação dos níveis de catecolaminas circulantes, resultando no aumento da permeabilidade do epitélio branquial (Wendelaar Bonga, 1997). No caso dos peixes de água doce, a conseqüência deste aumento é a perda de íons sódio e cloreto do sangue para o meio externo, resultando em influxo de água por osmose. O inverso ocorre nos peixes de água salgada. Caso estas alterações permaneçam por período mais longo, ocorrerá hemodiluição ou hemoconcentração que pode ser fatal para o peixe (Wedemeyer, 1996). Desta forma, a partir do momento em que os efeitos na regulação osmótica e eletrolítica são evidentes, a saúde dos peixes já pode estar severamente comprometida (Eddy, 1981; MC Donald e Milligan, 1997; Urbinati e Carneiro, 2004). Embora o distúrbio eletrolítico esteja relacionado com aumentos nas concentrações sangüíneas de cortisol, Tomasso et al. (1980) não observaram diminuição nos níveis de cloreto em híbridos (fêmeas de Morone chrysops x machos de Morone saxatilis) submetidos a estresse por confinamento. O estresse de captura não causou mudanças imediatas na osmolaridade em Perca fluviatis (Acerete et al., 2004). Já Carmichael et al. (1983) encontraram, em Micropterus dolomieui, redução nos níveis de sódio após captura e transporte. Três horas após salmões “smolts” (Salmo salar) terem sido capturados e submetidos a confinamento houve redução nos níveis sangüíneos de cloreto (Carey e McCormick, 1998). Em Sparus aurata, o estresse por exposição aérea provocou rápido aumento na osmolaridade e nos níveis plasmáticos de Na+, Mg+2 e Cl-, enquanto que o 7 confinamento, na mesma espécie, produziu aumento na osmolaridade somente oito horas após ter sido iniciado (Arends et al., 1999). Certas variáveis sangüíneas como hematócrito, concentração de hemoglobina e número ou percentual de linfócitos, são consideradas indicadores hematológicos auxiliares da resposta de estresse e podem ser utilizadas na avaliação do estado de saúde dos peixes (Morgan e Iwama, 1997; Tavares-Dias e Moraes, 2004). O efeito estimulatório das catecolaminas e do cortisol promove o aumento do consumo de oxigênio pelos tecidos (Morgan e Iwama, 1997), havendo, assim, necessidade de rápida diferenciação e proliferação da série eritrocitária. Além disso, o aumento da concentração destes hormônios em resposta ao estressor pode resultar na liberação de eritrócitos no sistema circulatório pelo baço, um dos principais órgãos eritropoiéticos em teleósteos (McDonald e Milligan, 1997). O aumento da hemoglobina, por sua vez, sugere maior capacidade de transporte de oxigênio pelo sangue, na tentativa de suprir o aumento da demanda energética. Assim, durante o estresse, o aumento de parâmetros relativos às células sangüíneas vermelhas (hemoconcentração) é muitas vezes observado (Montero et al, 1999; Benfey e Biron, 2000; Wojtaszek et al., 2002). Quanto às células brancas, os hormônios do estresse atuam nos tecidos hematopoiéticos resultando em bloqueio da produção de linfócitos, monocitopenia e neutrofilia, como resposta imunosupressora (Ellis, 1981). O cortisol parece agir, ainda, alterando o número e afinidade de receptores específicos nos leucócitos sangüíneos periféricos, como verificado na carpa comum (Weys et al., 1998). Em pacu (Piaractus mesopotamicus), a captura e exposição aérea por trinta segundos provocaram aumento no percentual de neutrófilos e diminuição no percentual de linfócitos, reforçando a ocorrência de linfocitopenia e neutrofilia como resposta ao estresse (Martins et al., 8 2000). Resposta semelhante foi encontrada em matrinxã (Brycon amazonicus) submetido ao transporte por quatro horas (Carneiro et al., 2002). Em alguns casos, as alterações decorrentes do estresse não são consistentes com o padrão esperado, tornando complexa a interpretação dos resultados. Para a mesma espécie estudada por Carneiro et al. (2002), Abreu e Urbinati (2006) não observaram diferenças significativas no número total de leucócitos mesmo após terem submetido os peixes à captura e exposição aérea por dois minutos. Tais diferenças ocorrem porque diversos fatores tais como sexo, tamanho, estado nutricional do animal, entre outros, podem contribuir para variação quantitativa das variáveis sangüíneas (Tavares-Dias et al., 1998) e, por esta razão, as respostas hematológicas devem ser consideradas indicadores auxiliares no diagnóstico de estresse. A captura como agente estressor As condições intensivas de criação submetem os peixes a uma variedade de estressores (Wedemeyer, 1996) cujos efeitos resultam, muitas vezes, em prejuízo aos produtores causado por mortalidade e outros problemas de criação, como diminuição nas porcentagens de reprodução e crescimento e maior suscetibilidade à doenças. Várias práticas de manejo são consideradas estressantes (Barton e Iwama, 1991, Wendelaar Bonga, 1997) e, dentre elas, a captura é, provavelmente, uma das mais agressivas (Barnett e Pankhurst, 1998). A captura é um procedimento que ocorre em determinadas situações da criação intensiva como inspeção de rotina, biometria, seleção e transporte, nas quais vários procedimentos estressores são impostos aos animais. É uma ocorrência ocasional, de caráter agudo, severo e de curta duração (Urbinati e Carneiro, 2004). 9 A captura envolve uma seqüência de estímulos que podem ser estressantes por si só ou por acumulação. Tanto o exercício físico da fuga (Milligan et al., 2000), como a hipóxia provocada pela retirada do peixe da água (Arends et al., 1999) e as injúrias na superfície do corpo (Ross e Ross 1999) são estressores isolados e sucessivos que geram respostas acumulativas (Schreck, 2000). O exercício para a fuga é inevitável na captura e, durante esta vigorosa atividade, os peixes podem perder a capacidade de exercê-la aerobicamente, passando então, a executá-la de forma anaeróbica. Como conseqüência, altas concentrações de lactato e íons H+ são acumulados no tecido muscular e podem ser detectados na corrente sangüínea (Barnett e Pankhurst, 1998). Aumento de lactato e diminuição do pH, tanto no músculo como no plasma, está associado ao estresse e exercício em várias espécies (Lowe e Wells, 1996; Pottinger, 1998; Arends et al., 1999; Hoffmayer e Parsons, 2001). Alguns estudos enfocam o impacto da captura como agente estressor. Tomasso et al. (1980) registraram aumento de corticosteróides plasmáticos e hipercloremia em híbridos de fêmeas de Morone chrysops x machos de Morone saxatilis confinados em rede por dez minutos e Carmichael et al. (1983) observaram a ocorrência de estresse em Micropterus dolomieui após captura e transporte. Chopin et al. (1996) estudaram, em Pagrus major, os efeitos da captura por anzol e linha e por rede de arrasto verificando níveis plasmáticos de cortisol mais baixos nos peixes não submetidos à captura. Além disso, 44% dos peixes capturados por rede morreram, fato atribuído ao entrelaçamento nos filamentos da rede, o que seria responsável pelo aumento dos níveis de estresse dos animais. Já Clearwater e Pankhurst (1997) encontraram altos níveis de cortisol plasmático em Chelidonichthys kumu submetidos à captura por anzol e linha e 10 afirmaram, pelos valores obtidos, que todos os peixes foram altamente estressados com o procedimento. Sloman et al. (2001) submeteram exemplares de Oncorhynchus mykiss a estresse por imersão no ar, durante trinta segundos, e observaram os efeitos deste procedimento agudo na proliferação das células cloreto, já que elevações das concentrações plasmáticas do cortisol parecem estar envolvidas na proliferação destas células no epitélio branquial, estrutura envolvida no transporte ativo de íons nas brânquias. Trinta minutos após o procedimento, as concentrações plasmáticas de cortisol foram significativamente maiores nos peixes manipulados quando comparado a animais não manipulados. Apesar de ter ocorrido elevação dos níveis de cortisol, não foram encontradas diferenças significativas na densidade das células cloreto entre os grupos. A captura dos peixes deve sempre ser realizada com cuidado, com o menor manuseio possível, procurando evitar procedimentos que causem escarificações e perda de muco e escamas (Urbinati e Carneiro, 2004). A pele e o muco representam importante mecanismo não específico de defesa já que previnem a entrada de microorganismos no corpo do animal (Verlhac e Gabaudan, 1997). Sua perda deixa os peixes mais susceptíveis às doenças e colabora na disseminação de patógenos. O sistema imune e as respostas não-específicas em peixes A imunologia estuda os mecanismos de defesa do corpo contra agentes agressores e outros distúrbios como doenças auto-imunes. Os principais componentes do sistema imune dos peixes são as células brancas do sangue, os leucócitos, produzidos, principalmente, no rim cefálico, timo e baço (Hrubec e Smith, 2000; Tort et al., 2003). Como os peixes são desprovidos de medula óssea e linfonodos, os tecidos 11 mielóides e linfóides estão, geralmente, associados ao mesmo órgão e podem apresentar função imuno-endócrina, atuando na produção de anticorpos e catecolaminas como faz o rim cefálico (Tort et al., 2003). O sistema imune é dividido em duas partes que se complementam: o sistema imune inato (não específico) e o adquirido (específico) (Roitt et al., 1998). O sistema imune inato é considerado como a primeira linha de defesa, incluindo barreiras físicas (pele e muco) e componentes celulares e moleculares (macrófagos, células killer e fatores solúveis de imunidade, como lisozima, proteínas do sistema complemento, peptídeos antimicrobianos, entre outros). Quando um patógeno penetra no corpo pela primeira vez, os mecanismos inatos são usualmente suficientes para prevenir a infecção. Durante este ato, acionam os mecanismos específicos de defesa que produzirão a memória imunológica, bloqueando o desenvolvimento de nova infecção causada pelo mesmo patógeno (Wedemeyer, 1996; Verlhac e Gabaudan, 1997). As células fagocíticas ou fagócitos (neutrófilos, eosinófilos, monócitos e macrófagos), desempenham papel importante na regulação do sistema imune, já que elas, além de contribuírem com os mecanismos inatos, estão também envolvidas com a parte específica de defesa (Verlhac e Gabaudan, 1997). Como parte das respostas inatas, estas células são capazes de reconhecer patógenos e degradá-los através do mecanismo de fagocitose. O processo de fagocitose tem início com o englobamento do patógeno, pela emissão de pseudópodos e, uma vez que o patógeno encontra-se totalmente incluso dentro de um vacúolo (fagossomo), têm início vários eventos microbicidas que culminam na sua morte e digestão (Roitt et al., 1998). Quando a fagocitose é iniciada, ocorre grande aumento no consumo de oxigênio molecular, conhecido como burst oxidativo. O oxigênio é reduzido via sistema nicotinamida adenina dinucleotídeo 12 fosfato (NADPH oxidase) a ânion superóxido que, ao sofrer a ação da enzima superóxido dismutase (SOD), é transformado em peróxido de hidrogênio (H2O2). A liberação da enzima mieloperoxidase (MPO) pelos leucócitos granulares transforma o peróxido de hidrogênio em hipoclorito levando à produção de cloraminas. Todas estas espécies reativas de oxigênio (EROs) são altamente oxidantes aos microorganismos e contribuem ativamente para sua destruição. A produção de EROs durante o burst pode ser detectada por ensaio simples baseado na redução do corante nitroblue tetrazolium (NBT). Apesar do nome, a forma oxidada do NBT é amarela. Este corante é capaz de captar elétrons de uma variedade de espécies doadoras, dentre elas o superóxido, convertendo-se à forma reduzida. Como conseqüência desta redução, precipitados de material insolúvel com coloração azul escuro são formados no interior do fagócito, os quais são denominados grânulos de formazan (Klein, 1990). No que diz respeito ao sistema imune adquirido, macrófagos e, especialmente, as células dendríticas agem como “células apresentadoras de antígenos”, apresentando antígenos aos linfócitos T. Estes agem liberando fatores solúveis (citocinas) que ativam os fagócitos, os quais, por fagocitose, destroem os patógenos. Em outro tipo de interação, fagócitos utilizam anticorpos liberados pelos plasmócitos derivados de linfócitos B a fim de permitir o reconhecimento mais eficiente dos elementos agressores pelas células de defesa (Wedemeyer, 1996). Uma conseqüência destas interações é que a maioria das respostas imunes a agentes infecciosos é realizada por uma variedade de mecanismos inatos e adquiridos, ou seja, nas fases iniciais da infecção, há predomínio das respostas inatas, e nas fases mais tardias, os linfócitos passam a gerar respostas imunes adquiridas. Os linfócitos são capazes de memorizar a estrutura do patógeno e 13 passam a elaborar respostas mais rápidas e eficientes no caso de re-infecção (Roitt et al., 1998). Embora os linfócitos T citotóxicos sejam importantes na destruição de outras células, outros sub-tipos celulares apresentam esta capacidade. A célula “exterminadora natural” (células NK, do inglês natural killer) reconhece alterações na superfície de células infectadas por vírus e células tumorais e libera substâncias que rompem a membrana dessas células infectadas e inibem a replicação do vírus (Roitt et al., 1998). Os eosinófilos constituem um grupo especial de leucócitos, com capacidade de apreender e lesar patógenos extracelulares maiores, como parasitos que são muito grandes para serem eliminados por fagocitose (Klein, 1990). Além de células, existem várias moléculas envolvidas na resposta imune conhecidas como mediadores solúveis. Normalmente estão presentes no soro e suas concentrações elevam-se rapidamente durante infecção (Verlhac e Gabaudan, 1997). O sistema complemento compreende um grupo de aproximadamente 35 proteínas envolvidas nas respostas imunes inespecíficas e específicas. Tal sistema pode ser ativado pela superfície do patógeno por meio da via alternativa, reação inata e inespecífica, que resulta no revestimento do patógeno pelas proteínas do sistema complemento facilitando sua ingestão pelo fagócito. Entretanto, o sistema complemento também pode ser ativado pela chamada via clássica, por complexo antígeno (Ag) - anticorpo (Ac), e este constitui um mecanismo de resposta específica. Há ainda a terceira via de ativação, a via lectina do sistema complemento, que em vez de ser ativada por complexo antígeno-anticorpo como na via clássica, a ativação é iniciada por complexo protéico de lectina ligante à manose (Holland e Lambris, 2002). As três vias 14 de ativação foram identificadas em peixes, exceto nos não mandibulados que não apresentam a forma clássica de ativação (Nonaka, 2001). Independente da via a ativação do sistema complemento envolve uma cascata de reações enzimáticas, culminando com aparecimento de peptídeos que podem lisar o agente infeccioso pela ruptura de sua membrana, atrair fagócitos para o local da infecção (quimiotaxia) ou ainda revestir os microorganismos patogênicos (opsonização) facilitando sua aderência à membrana dos fagócitos para sua subseqüente destruição (Roitt et al., 1998; Holland e Lambris, 2002). As proteínas do sistema complemento, como o próprio nome diz, “complementam” o papel dos anticorpos e fagócitos na destruição dos patógenos e, uma vez ativas, causam sérios prejuízos às células. Desta forma, é importante que as próprias células do organismo invadido (hospedeiro) se protejam da ação de proteínas do sistema complemento. Mamíferos possuem numerosas proteínas reguladoras que controlam o grau de ativação do complemento, mas pouco se sabe sobre a ação destas proteínas reguladoras em vertebrados mais simples (Holland e Lambris, 2002). Embora os peixes apresentem proteínas do sistema complemento estruturalmente semelhantes àquelas encontradas em mamíferos, a principal diferença está no fato que os peixes possuem uma grande variedade delas, com múltiplas isoformas, sugerindo que esta diversidade contribuiria para expandir seu repertório de reconhecimento imune inato (Holland e Lambris, 2002). Em sua revisão, Nonaka (2001) relatou que componentes do sistema complemento foram encontrados em vertebrados mandibulados, incluindo peixes ósseos e cartilaginosos, e também em alguns invertebrados deuterostômios existentes, sugerindo que o sistema complemento é uma das respostas mais antigas e altamente organizadas do sistema imune inato. 15 Outro componente do sistema imune é a lisozima, importante agente bacteriolítico encontrado em várias espécies de peixes marinhos e de água doce (Lie et al., 1989). Ela é produzida durante as infecções e é capaz de lisar a parede celular de bactérias, atuando nas ligações beta 1,4 glicosídicas entre o ácido N-acetilmurâmico e o ácido N-acetilglicosamínico (Paulsen et al., 2003). Esta propriedade torna esta enzima capaz de lisar algumas bactérias gram-positivas e, agindo em conjunto com as proteínas do sistema complemento, podem destruir também algumas bactérias gram-negativas (Verlhac e Gabaudan, 1997; Paulsen et al., 2001). Os leucócitos são os principais produtores de lisozima em peixes e o tecido renal parece apresentar os maiores índices de atividade enzimática, devido à alta concentração de leucócitos em seu interior, especialmente, na porção anterior, conhecida como rim cefálico (Balfry e Iwama, 2004). Por outro lado, a atividade desta enzima já foi detectada no fígado, brânquias, ovário e em ovos (Sankaran e Gurnani, 1972; Lie et al., 1989; Takemura e Takano, 1995). Outros fatores solúveis mediadores de imunidade, como proteína C reativa (CRP, do inglês, C - reactive protein), transferrima, lectina e interferon, estão envolvidos nos mecanismos não específicos de defesa (Verlhac e Gabaudan, 1997). A proteína C reativa é conhecida como “proteína de fase aguda”, porque suas concentrações séricas elevam-se rapidamente após a exposição à bactérias (Roitt et al., 1998). Quando ligada à bactéria, promove a ligação das proteínas do sistema complemento, favorecendo a ingestão da bactéria pela célula fagocítica (opsonização). A transferrina tem papel protetor e como o ferro é transportado na corrente sangüínea ligado a esta proteína, a quantidade de ferro livre que circula no sangue é limitada, tornando este metal indisponível às bactérias durante a infecção. A ceruloplasmina é 16 também uma proteína de fase aguda, encontrada em mamíferos e descrita em peixes. As lectinas são importantes já que neutralizam componentes tóxicos (exotoxinas) liberados pelos patógenos, facilitando a fagocitose e os interferons são proteínas produzidas durante infecções virais, constituindo a primeira linha de resistência dos peixes a muitas viroses (Verlhac e Gabaudan, 1997). De acordo com Fletcher (1997), em peixes de cativeiro, o sistema imune pode ser influenciado por vários fatores, tais como estressores ambientais de origem natural, além de alguns nutrientes e micronutrientes. Os autores relataram os efeitos sazonais, nutricionais e hormonais sobre o sistema imune não específico de peixes, descrevendo, principalmente, as respostas do Pleuronectes platessa. Dependendo do tipo, quantidade e duração da exposição a estes fatores, os efeitos sobre o animal podem ser negativos ou positivos (Verlhac e Gabaudan, 1997). Efeitos negativos foram encontrados por Iida e Kurogi (2001) que investigaram estresse social em Oreochromis niloticus e observaram redução da atividade respiratória e fagocítica dos neutrófilos nos peixes subordinados. Ortuño et al. (2002) também encontraram diminuição na atividade do complemento e redução da atividade respiratória de leucócitos em Spaurus aurata submetidos a diversos fatores estressantes. Ainda nesta espécie, Tort et al. (1996) relataram redução significativa dos níveis de linfócitos circulantes e no título de aglutinação após três semanas de adensamento, enquanto Rotllant et al. (1997) observaram imunodepressão semelhante em Pagrus pagrus submetidos ao adensamento. Já efeitos benéficos podem ser observados utilizando-se moduladores que estimulem o sistema imune, como o uso de imunoestimulantes (Anderson, 1992; Raa, 2000). Várias substâncias podem ser consideradas imunoestimulantes, indo desde 17 agentes químicos, componentes bactericidas e polissacarídeos até extratos de animais e vegetais, fatores nutricionais e citocinas (Sakai, 1999). Assim, em sistemas de criação de peixes a melhor maneira para se garantir altas taxas de sobrevivência e melhorar o crescimento é aquela que combina uma mistura ótima de nutrientes com imunoestimulação e bom manejo (Verlhac e Gabaudan, 1997). O 1,3 glicano como imunoestimulante e seus efeitos nos peixes Uma grande variedade de componentes com as mais diversas estruturas químicas é capaz de interagir com os leucócitos e estimular sua atividade biológica. Estes componentes, comumente conhecidos como imunoestimulantes, ao ligarem-se a receptores altamente específicos na superfície das células brancas de defesa, iniciam sua ativação, aumentando a resistência à infecções por vírus, bactérias, fungos e parasitos (Anderson, 1992; Sakai, 1999; Raa, 2000). Em piscicultura, algumas técnicas são utilizadas para minimizar o estresse como uso de anestésicos (MacAvoy e Zaepfel, 1997; Griffiths, 2000; Urbinati e Carneiro, 2001; Carneiro e Urbinati, 2001b) e sal (Wurts, 1995; Carneiro e Urbinati, 2001a). Porém, o uso de imunoestimulantes tem ganho importância pelo fato de induzirem a proteção contra doenças e estimularem mecanismos não específicos de defesa (Anderson, 1992; Sakai, 1999). De acordo com Sakai (1999) várias substâncias podem ser usadas como imunoestimulantes, desde substâncias químicas sintéticas (levamisol) e compostos derivados de bactérias (lipopolissacarídeos) até componentes da própria dieta (vitaminas B, C e E). Em relação às vitaminas, algumas delas estão entre os mais importantes nutrientes que influenciam o sistema imune. Vários trabalhos relatam, por exemplo, o 18 papel da vitamina C nas respostas imunológicas específicas e não específicas em peixes (Waagbo et al., 1993; Martins, 1995; Verlhac e Gabaudan, 1997; Verlhac et al., 1998). Considerando a ação desta vitamina nos mecanismos não específicos de defesa, Wahli et al. (2003) observaram em O. mykiss, através de análise histológica, que melhor cicatrização estava correlacionada com a quantidade de vitamina C presente na dieta. Além disso, aumento na atividade fagocítica foi observado por Roberts et al. (1995) em Scophthalmus maximus e por Johnson e Ainsworth (1991) em I. punctatus. À vitamina C também é atribuído aumento da resistência à infecção por Edwardsiella tarda e E. ictaluri em I. punctatus (Durve e Lovell, 1982; Li e Lovell, 1985), por Vibrio anguillarum em Salmo gairdneri (Navarre e Halver, 1989) e por Aeromonas salmonicida e Vibrio salmonicida em S. salar (Erdal et al., 1991; Hardie et al., 1991; Thompson et al., 1993). Para garantir uma ação eficaz do imunoestimulante é necessário o conhecimento sobre sua ação específica, o tipo de tratamento, a concentração administrada e o tempo de tratamento dos animais com a substância. Deve-se considerar, também, o modo de aplicação dos imunoestimulantes, que podem ser administrados por imersão do peixe em ambiente com a substância diluída, através de injeção intraperitoneal ou pela incorporação da substância na ração, sendo esta última alternativa de aplicação bastante eficaz e adequada em piscicultura (Sakai, 1999). Cuesta et al. (2002) estudaram os efeitos de altas concentrações de vitamina A (acetato de retinol) injetados intraperitonealmente e incorporados na dieta em algumas respostas inatas de Sparus aurata. Segundo estes autores, os peixes alimentados com dietas suplementadas com acetato de retinol apresentaram aumento na atividade respiratória de leucócitos. Mas, fatores humorais de imunidade, como atividade de lisozima sérica, não foram afetados 19 pela suplementação. Por outro lado, quando injetado intraperitonealmente, o acetato de retinol demonstrou-se tóxico e até mesmo letal. Dentre os imunoestimulantes estudados, os glicanos têm sido introduzidos na rotina de criação de peixes como uma medida profilática e, por não haver relatos de efeitos negativos em seu uso, estão sendo apresentados como uma excelente alternativa no controle de infecções bacterianas comuns no processo de produção (Anderson, 1992; Secombes, 1994). Os glicanos são polissacarídeos presentes na parede celular de bactérias, fungos e plantas e o tipo mais freqüentemente estudado deriva da parede celular de leveduras, conhecido por beta 1,3 glicano. Os glicanos podem ser diferenciados de outros polissacarídeos pela maneira na qual as moléculas de glicose estão ligadas. Geralmente, nos polissacarídeos, as moléculas de glicose estão unidas por ligações 1,4, enquanto que nos glicanos as ligações encontradas são 1,3 e 1,6. Assim, diferindo da conformação linear dos polissacarídeos, os glicanos apresentam estrutura especial, em forma de hélice e é esta conformação exclusiva que é reconhecida pelo sistema imune, resultando na sua estimulação (Robertsen et al., 1990). O modo de ação do beta 1,3 glicano tem início quando ele se liga a receptores específicos localizados na superfície dos macrófagos e cuja presença já foi sugerida para peixes. Engstad e Robertsen (1993) observaram que macrófagos pronéfricos de Salmo salar fagocitaram tanto partículas de glicano naturais como opsonizadas, sendo estas últimas fagocitadas mais rapidamente, e sugeriram diante de suas observações que esta espécie poderia ter receptores específicos para este imunoestimulante. Algumas moléculas derivadas de patógenos conhecidas como “padrões moleculares associados à patógenos” (PAMPs, do inglês, pathogen-associated 20 molecular patterns) podem ser detectadas nos organismos multicelulares. Seu reconhecimento inicial e resposta biológica são mediados por “receptores de reconhecimento ao patógeno” (PRRs, do inglês pathogen recognition receptors) codificados geneticamente, destacando-se neste grupo a família dos receptores toll like (Iliev et al., 2005). Os beta 1,3 glicanos são considerados clássicos PAMPs e, quando reconhecidos por receptores toll like, podem induzir respostas inflamatórias e antimicrobianas (Brown e Gordon, 2003). Na presença de um estímulo, a ligação beta 1,3 glicano com o receptor resulta no aumento na atividade respiratória destas células (burst oxidativo) que, por sua vez, desencadeia a produção de radicais superóxidos (O-2), peróxido de hidrogênio (H2O2), radicais hidroxilas (OH-) e oxigênio (O2) todos com atividade bactericida (Verlhac e Gabaudan, 1997). Alguns estudos in vitro sugerem que o beta 1,3 glicano apresente um efeito “preparador” nos leucócitos, ou seja, na presença de um estímulo, como o contato com bactéria, estas células estariam prontas para disparar as reações em cascata que culminariam na produção das EROs durante o burst (Brown e Gordon, 2003). Além disso, uma vez preparados pelo beta 1,3 glicano e havendo um estímulo, os macrófagos são capazes de secretar citocinas e enviar mensagens para outras células de defesa, como os linfócitos B, envolvidos na produção de anticorpos. Por este mecanismo, o glicano age estimulando parte do sistema imune inato, levando ao aumento de algumas respostas imunes não específicas dos peixes e à proteção contra uma variedade de doenças (Jeney e Anderson, 1993; Verlhac et al., 1996; Santarém et al., 1997; Bagni et al., 2005). Exemplares de Ictalurus punctatus tornaram-se resistentes à septicemia entérica quando injetados intraperitonealmente com 1,3 glicano antes de serem submetidos à infecção por Edwardsiella ictaluri (Chen e Ainsworth, 1992), enquanto Oncorhynchus tshawytsha 21 juvenis alimentados com uma forma comercial do glicano mostraram aumento da proteção contra infecção por Aeromonas salmonicida (Nikl et al., 1993). Vários estudos relatam os efeitos do beta 1,3 glicano no aumento da atividade respiratória de fagócitos e de alguns fatores solúveis de imunidade, como proteínas do sistema complemento e lisozima. Beta glicanos, quando injetados intraperitonealmente, induziram aumento na atividade respiratória de fagócitos em Oncorhyncus mykiss (Jorgensen et al., 1993) e Scophtalmus maximus L. (Santarém et al., 1997). Jeney e Anderson (1993) avaliaram a atividade respiratória de leucócitos em Oncorhyncus mykiss de outra forma, por meio da coloração com nitroblue tetrazolium (NBT), e observaram aumento no número de células NBT positivas 96 horas após injeção intraperitoneal de beta 1,3 glicano. Estudo similar de Castro et al. (1999), realizado in vitro, mostrou que concentrações crescentes de diferentes tipos de glicano induziram aumento na atividade respiratória de macrófagos de Psetta máxima e Sparus aurata após 1h de incubação. Entretanto, após 2h de incubação, a atividade respiratória diminuiu nos macrófagos incubados com as maiores concentrações de glicano. Por tratar-se de um estudo in vitro, os autores sugeriram que tais concentrações estimulariam demasiadamente as células, levando-as à exaustão, mas esclareceram que ainda não é conhecido se efeito similar ocorreria ou não in vivo e recomendam mais estudos para encontrar o efeito in vivo de altas concentrações deste imunoestimulante. A alimentação com beta 1,3 glicano induziu aumento significativo na atividade de lisozima e complemento séricos em Dicentrarchus labrax (Bagni et al., 2005), enquanto que em Pagrus auratus nenhuma diferença significativa foi encontrada na atividade das proteínas do sistema complemento, nem pela via clássica nem pela alternativa (Cook et al., 2003). 22 A imunoestimulação dos peixes não somente promove uma resposta imunológica maior e mais efetiva a agentes infecciosos, mas também minimiza os efeitos do estresse (Anderson, 1992). Jeney et al. (1997) observaram que Oncorhynchus mykiss, alimentados com ração suplementada com glicano e submetidos a estresse de transporte por duas horas, apresentaram menores concentrações de cortisol plasmático, bem como alterações secundárias de estresse menos intensas, sugerindo que o beta 1,3 glicano atue não somente na imunoestimulação, mas também na supressão das respostas primárias e secundárias do estresse e que uma alimentação com baixos níveis deste imunoestimulante antes do transporte poderia ajudar a prevenir os efeitos negativos deste procedimento. A inclusão de substâncias com propriedades imunoestimulantes na ração pode ser uma estratégia para compensar a imunossupressão, conferindo ao animal melhor condição fisiológica para suportar o estresse. Não há dados na literatura que relatem a concentração de glicano necessária para resultar em uma imunoestimulação eficaz de peixes. Desta forma, estudo comparando as concentrações de glicano administrado por injeção intraperitoneal (tratamento mais eficaz) e incorporado na ração (tratamento mais adequado em piscicultura), pode ser útil para se estabelecer concentrações adequadas de beta 1,3 glicano a serem incorporadas na alimentação dos peixes. Além disso, não há estudos que relatem o uso do imunoestimulante beta 1,3 glicano em peixe tropical e seus efeitos no estresse e nas respostas imunológicas. O aprofundamento nessa linha de pesquisa poderá sugerir novas diretrizes no manejo dos peixes e dar início a uma linha de estudo com peixes tropicais. 23 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABREU, J. S., URBINATI, E. C. (2006). Physiological responses of matrinxã (Brycon amazonicus) fed different levels of vitamin C and submitted to air exposure. Acta Amazônica, 36(4): 519 – 524. ACERETE, L., BALASCH, J. C., ESPINOSA, E., JOSA, A., TORT, L. (2004). Physiological responses in Eurasian perch (Perca fluviatilis L.) subjected to stress by transport and handling. Aquaculture, 237: 167-178. ANDERSON, D. P. (1992). Immunostimulants, adjuvants, and vaccine carriers in fish: application to aquaculture. Annu. Rev. Fish Dis., 2: 281-307. ARENDS, R.J., MANCERA, J.M., MUNOZ, J.L., WENDELAAR BONGA, S.E., FLIK, G. (1999). The stress response of the gilthead sea bream (Sparus aurata L.) to air exposure and confinement. J. Endocrinology, 163: 149-157. BAGNI, M., ROMANO, N., FINOIA, M. G., ABELI, L., SCAPIGLIATI, G., TISCAR, P. G., SARTI, M., MARINO, G. (2005). Short and long term effects of a dietary yeast -glucan (Macrogard) and alginic acid (Ergosan) preparation on immune response in sea bass (Dicentrarchus labrax). Fish Shellfish Immunol., 18: 311- 325. BALFRY, S. K., IWAMA, G. K. (2004). Observations on the inherent variability of measuring lysozyme activity in coho salmon (Oncorhynchus kisutch). Comp. Biochem. Physiol. B, 138: 207-211. BARCELLOS, L.J.G., WOEHL, V.M., WASSERMANN, G.F., QUEVEDO, R.M., ITTZÉS, I., KRIEGER, M.H. (2001). Plasma levels of cortisol and glucose in response to capture and tank transference in Rhamdia quelen (Quoy & Gaimard), a South American catfish. Aquac. Res., 32:121-123. 24 BARCELLOS, L j. G., KREUTZ, L. C., SOUZA, C., RODRÍGUEZ, L. B., FIOREZE, I., QUEVEDO, R. M., CERICATO, L., SOSSO, A. B., FAGUNDES, M., CONRAD, J., LACERDA, L. A., TERRA, S. (2004). Hematological changes in jundiá (Rhamdia quelen Quoy and Gaimard Pimelodidae) after acute and chronic stress caused by ususal aquacultural management, with emphasis on immunosuppressive effects. Aquaculture, 237: 229-236. BARNETT, C. W., PANKHURST, N. W. (1998). The effects of common laboratory and husbandry practices on the stress response of greenback flounder Rhombosolea tapirina (Günther, 1862). Aquaculture, 162: 313-329. BARTON, B. A., IWAMA, G.K. (1991). Physiological changes in fish from stress in aquaculture with emphasis on the response and effects of corticosteroids. Ann. Rev. Fish Dis., 1: 3-26. BENFEY, T.J., BIRON, M. (2000). Acute stress response in triploid rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and brook trout (Salvelinus fontinalis). Aquaculture, 184: 167-176. BROWN, G. D., GORDON, S. (2003). Fungal - glucans and mammalian immunity. Immunity, 19: 311-315. CAREY, J. B., McCORMICK, S. D. (1998). Atlantic salmon smolts are more responsive to an acute handling and confinement stress than parr. Aquaculture, 168: 237-253. CARMICHAEL, G. J., WEDEMEYER, G. A., McCRAEN, J. D., MILLARD, J. L. (1983). Physiological effects oh handling and hauling stress on smallmouth bass. Prog. Fish Cult., 45: 110-113. 25 CARNEIRO, P. C. F., URBINATI, E. C. (2001a). Salt as a stress response mitigator of matrinxã Brycon cephalus (Teleostei: Characoidei) during transport. Aquac. Research. 32: 1-8. CARNEIRO, P. C. F., URBINATI, E. C. (2001b). Electrolyte disturbance in matrinxã Brycon cephalus following transport stress under benzocaine effect. J. Appl. Aquac. 11(4): 1-13. CARNEIRO, P. C. F., URBINATI, E. C., MARTINS, M. L. (2002). Transport with different benzocaine concentrations and its consequences on hematological parameters and gill parasite population of matrinxã Brycon cephalus (Günther, 1869) (Osteichthyes, Characidae). Acta Scientiarum, 24 (2): 555-560. CASTRO, R., COUSO, N., OBACH, A., LAMAS, J. (1999). Effect of different - glucans on the respiratory burst of turbot (Psetta maxima) and gilthead seabream (Spaurus aurata) phagocytes. Fish Shellfish Immunol., 9: 529-541. CHEN, D., AINSWORTH , A. J. (1992). Glucan administration potentiates immune defense mechanisms of channel catfish, Ictalurus punctatus Rafisneque. J. Fish Dis., 15: 295-304. CHOPIN, F.S., ARIMOTO, T., INOUE, Y. (1996). A comparison of the stress response and mortality of sea bream Pagrus major captured by hook and line and trammel net. Fish. Res., 28: 277-289. CLEARWATER, S. J., PANKHURST, N. W. (1997). The response to capture and confinement stress of plasma cortisol, plasma sex steroids and vitellogenic oocytes in the marine teleost, red gurnard. J. Fish Biol., 50: 429-441. COOK, M. T., HAYBALL, P. J., HUTCHINSON, W., NOWAK, B., F., HAYBALL, J. D. (2003). Administration of a commercial immunostimulant preparation, Eco 26 Ativa™ as a feed supplement enhances macrophage respiratory burst and the growth rate of snapper (Pagrus auratus, Sparidae (Bloch and Schneider)) in winter. Fish Shellfish Immunol, 14: 333-345. CUESTA, A., ORTUÑO, J., RODRIGUEZ, A., ESTEBAN, M. A., MESEGUER, J. (2002). Changes in some innate defence parameters of seabream (Sparus aurata L.) induced by retinol acetate. Fish Shellfish Immunol, 13: 279- 291. DURVE V.S., LOVELL R.T. (1982). Vitamin C and disease resistance in channel catfish (Ictalurus punctatus). Can. J. Fish. Aquat. Sci., 39: 948- 951. EDDY, F. B. (1981). Effects of stress on osmotic and ionic regulation in fish In: Pickering A.D. (Ed), Stress and fish. Academic Press, pp. 77-102. ELLIS, A. E. (1981). Stress and the modulation of defense mechanisms in fish. In: Pickering A. D. (Ed), Stress and fish. Academic Press, pp. 147-169. ENGSTAD, P. R., ROBERTSEN, B. (1993). Recognation of yeast cell wall glucan by Atlantic salmon (Salmo salar. L.) macrophages. Dev. Comp. Immunol., 17: 319- 330. ERDAL, J.I., EVENSEN, Ø., KAURSTAD, O. K., LILLEHAUG, A., SOLBAKKEN, R., THORUD, K. (1991). Relationship between diet and immune response in Atlantic salmon (Salmo salar) after feeding various levels of ascorbic acid and omega – 3 – fatty acids. Aquaculture, 98: 363-379. FLETCHER, T. C. (1997). Dietary effects on stress and health in aquaculture. In: Iwama, G.K., Pickering, A.D., Summer, J.P., Schreck, C.B. (Eds), Fish Stress and Health in Aquaculture. Cambridge University Press, Cambridge, pp. 223-246. 27 GOMES, L. C., ARAUJO-LIMA, C. A. R. M., ROUBACH, R., URBINATI, E. C. (2003) Avaliação dos efeitos da adição de sal e da densidade no transporte de tambaqui. PAB., 38 (2): 283-290. GRIFFITHS, S. P. (2000). The use of clove oil as an anaesthetic and method for sampling intertidal rockpool fishes. J. Fish Biol., 57: 1453-1464. HARDIE, L. J., FLETCHER, T.C., SECOMBES, C. J. (1991). The effect of dietary vitamin C on the immune response of the Atlantic salmon (Salmo salar L.). Aquaculture, 95: 201-214. HOFFMAYER, E. R., PARSONS, G. R. (2001). The physiological response to capture and handling stress in the Atlantic sharpnose shrak, Rhizoprionodon terraenovae. Fish Physiol. Biochem., 25: 277-285. HOLLAND, M. C. H., LAMBRIS, J. D. (2002). The complement system in teleosts. Fish Shellfish Immunol, 12: 399-420. HONTELA, A. (1997). Endocrine and physiological responses of fish to xenobiotics: role of glucocorticosteroid hormones. Rev. Toxicol., 1: 1-46. HOSOYA, S., JOHNSON, S.C., IWAMA, G.K., GAMPERL, A.K., AFONSO, L.O.B. (2007). Changes in free and total plasma cortisol levels in juvenile haddock (Melanogrammus aeglefinus) exposed to long-term handling stress. Comp. Biochem. Physiol., 146 (A): 78-86. HRUBEC, T. C., SMITH, S. A. (2000). Hematology of fish. In: Feldman, B.V., Zinkl, J.G., Jain N.C. Schalm’s veterinary hematology. Lippincott Williams & Wilkins. pp. 1120- 1125. 28 IIDA, T., KUROGI, J. (2001). Stress impairs non-specific defense activity of fish. Bull. Natl. Res. Inst. Aquacult., Suppl. 5: 61-64. ILIEV, D. B., ROACH, J. C., MACKENZIE, S., PLANAS, J. V., GOETZ, F. W. (2005). Endotoxin recognition: In fish or not in fish? FEBS Lett., 579: 6519-6528. JENEY, G., ANDERSON, D. P. (1993). Glucan injection or bath exposure given alone or in combination with a bacterin enhance the non-specific defence mechanisms in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture, 116: 315-329. JENEY, G., GALEOTTI, M., VOLPATTI, D., JENEY, Z., ANDERSON, D. (1997). Prevention of stress in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) fed diets containing different doses of glucan. Aquaculture, 154: 1-15. JOHNSON, M.R., AINSWORTH, A.J. (1991). An elevated dietary level of ascorbic acid fails to influence the response of anterior kidney neutrophils to Edwardsiella ictaluri in channel catfish. J. Aquat. Anim. Health, 3: 266-273. JORGENSEN, J. B., SHARP, G. J. E., SECOMBEST, C. J., ROBERTSEN, B. (1993). Effect of yeast cell wall glucan on the bactericidal activity of rainbow trout macrophages. Fish Shellfish Immunol., 3: 267-277. KLEIN, J. (1990). Immunology. Blackwell Scientific Publications Inc., Massachusetts, USA, pp.311-334. LI, Y., LOVELL, R.T. (1985). Elevated levels of dietary ascorbic acid increase immune response in channel catfish. J. Nutr., 115: 123 -131. LIE, O., EVENSEN, O., SORENSEN, A., FROYSADAL, E. (1989). Study of lysozyme activity in some fish species. Dis. Aquat. Org., 6: 1-5. 29 LOWE, T. E., WELLS, R. M. G. (1996). Primary and secondary stress responses to line capture in the blue mao mao. J. Fish Biol., 49: 287-300. MacAVOY S. E., ZAEPFEL, R. C. (1997). Effects of tricaine methanesulfonate (MS- 222) on hematocrit: first field measurements on blacknose dace. Trans. Am. Fish. Soc., 126: 500-503. MARTINS, M. L. (1995). Effect of ascorbic acid deficiency on the growth, gill filament lesions and behavior of pacu fry (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887). Braz. J. Med. Biol. Res., 28: 563-568. MARTINS, M. L., MORAES, F. R., MORAES, J. R. E., MALHEIROS, E. B. (2000). Falha da resposta do cortisol ao estresse por captura e por carragenina em Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887 (Osteichthyes, Characidae). Acta Scientiarium, 22 (2): 545-552. McDONALD, G., MILLIGAN, L. (1997). Ionic, osmotic and acid-base regulation in stress. In: Iwama, G. W., Pickering, A. D., Sumpter, J. P., Schreck, C. B. (Eds). Fish Stress and Health in Aquaculture. Cambridge: University Press, pp. 119-144. MAZEAUD, M..M., MAZEAUD, F. (1981). Adrenergic responses to stress in fish. In: Pickering A.D. (Ed), Stress and fish. Academic Press, pp. 49-76. M MILLIGAN, C.L., HOOKE, G.B., JOHNSON, C. (2000). Sustained swimming at low velocity following a bout of exhaustive exercises enhances metabolic recoverey in rainbow trout. J. Exp. Biol.,.203: 921-926. MONTERO, D., MARRERO, M., IZQUIERDO, M. S., ROBAINA, L., VERGARA, J.M., TORT, L. (1999). Effect of vitamin E and C dietary supplementation on 30 some immune parameters of gilthead seabream (Spaurus aurata) juveniles subjected to crowding stress. Aquaculture, 171: 269-278. MORGAN, J.D., IWAMA, G. K. (1997). Measurement of stressed states in the field. In: Iwama, G.K., Pickering, A.D., Summer, J.P., Schreck, C.B. (Eds), Fish Stress and Health in Aquaculture. Cambridge University Press, Cambridge, pp. 247-270. NAVARRE, O., HALVER, J.E. (1989). Disease resistance and humoral antibody production in rainbow trout fed high levels of vitamin C. Aquaculture, 79: 207- 221. NIKL, L., EVELYN, P. T., ALBRIGHT, L. J. (1993). Trials with an orally and immersion – administered 1,3 glucan as an immunoprophylactic against Aeromonas salmonicida in juvenile Chinook salmon Oncorhynchus tshawytscha. Dis. Aquat. Org., 17: 191-196. NONAKA, M. (2001). Evolution of the complement system. Cur. Opin. Immunol., 13: 69-73. ORTUÑO, J, ESTEBAN, M.A., MESEGUER, J. (2002). Lack of effect of combining diferent stressors on innate immune responses of seabream (Spaurus aurata). Vet. Immunol. Immunopathol., 84:17-27 PAULSEN, S. M., ENGSTAD, R. E., ROBERTSEN, B. (2001). Enhanced lysozyme production in Atlantic salmon (Salmo salar L.) macrophages treated with yeast - glucan and bacterial lipopolysaccharide. Fish Shellfish Immunol., 11: 23-37. PAULSEN, S. M., LUNDE, H., ENGSTAD, R. E., ROBERTSEN, B. (2003). In vivo effects of - glucan and LPS on regulation of lysozyme activity and mRNA expression in Atlantic salmon (Salmo salar). Fish Shellfish Immunol., 14: 39-54. 31 PICKERING, A.D. (1981). Introduction: the Concept of Biological Stress. In: Pickering A.D. (Ed), Stress and fish. Academic Press, 1: 1-10. PICKERING, A.D., POTTINGER , T.G. (1989). Stress response and disease resistance in salmonid fish: Effects of chronic elevation of plasma cortisol. Fish Physiol. Biochem., 7: 253-258. POTTINGER , T.G. (1998). Changes in blood cortisol, glucose and lactate in carp retained in angler’s keepnets. J. Fish Biol., 53: 728-742. RAA, J. (2000). The use of immune-stimulants in fish and shellfish feeds. In: Cruz - Suárez, L.E., Ricque-Marie, D., Tapia-Salazar, M., Olvera-Novoa, M.A. y Civera- Cerecedo, R., (Eds.). Avances en Nutrición Acuícola V. Memorias del V Simposium Internacional de Nutrición Acuícola. 19-22 Noviembre, 2000. Mérida, Yucatán, Mexico. ROBERTS, M. L., DAVIES, S. J., PULSFORD, A. L. (1995). The influence of ascorbic acid (vitamin C) on non-specific immunity in the turbot (Scophthalmus maximus L.) Fish Shellfish Immunol., 5: 27-38. ROBERTSEN, B., ROERSTAD, G., ENGSTAD, R. E., RAA, J. (1990). Enhancement of non- specific disease resistance in Atlantic salmon, Salmo salar L., by a glucan from Saccharomyces cerevisiae cell walls. J. Fish Dis., 13: 391-400. ROCHA, R. M., CARVALHO, E. G., URBINATI, E. C. (2004). Physiological responses associated with capture and crowding stress in matrinxã Brycon cephalus (Gunther, 1869). Aquac. Res., 35: 245-249. ROITT, I., BROSTOFF, J., MALE, D. (1998). Immunology. 5º ed. London, Mosby. 423p. 32 ROSS, L.G., ROSS, B. (1999). Anesthetic and sedative techniques for aquatic animals. Blackwell Science, Oxford, UK. 176p. ROTLLANT, J., PAVLIDIS, M., KENTOURI, M., ABAD, M.E., TORT, L. (1997). Non-specific immune responses in the red porgy Pagrus pagrus after crowding stress. Aquaculture, 156: 279-290. SADLER, J., WELLS, R.M.G., PANKHURST, P.M., PANKHURST, N.W. (2000). Blood oxygen transport, rheology and hematological responses to confinement stress in diploid and triploid Atlantic salmon, Salmo salar. Aquaculture, 184: 349- 361. SAKAI, M. (1999). Current research status of fish immunostimulants. Aquaculture, 172: 63-92. SANKARAN, K., GURNANI, S. (1972). On the variation in the catalytic activity of lysozyme in fishes. Ind. J. Biochem. Biophys. 9: 162-165. SANTARÉM, M., NOVOA, B., FIGUERAS, A. (1997). Effects of -glucans on the non-specific immune responses of turbot (Scophthalmus maximus L.). Fish Shellfish Immunol., 7: 429-437. SCHRECK, C.B. (2000). Accumulation and long-term effects os stress in fishes. In: Moberg, G. P., Manch, J.A (Eds.) The biology of animal stress. CAB International, pp. 147–158. SECOMBES, C. J. (1994). Enhancement of fish phagocyte activity. Fish Shellfish Immunol, 4: 421-436. SLOMAN, K. A., TAYLOR, A. C., METCALFE, N. B., GILMOUR, K. M. (2001). Stress from air emersion fails to alter chloride cell numbers in the gills of rainbow trout. J. Fish Biol., 59: 186-190 33 TAKEMURA, A., TAKANO, K. (1995). Lysozime in the ovary of tilapia (Oreochromis mossambicus): its purification and some biological properties. Fish. Physiol. Biochem., 14: 415-421. TAVARES-DIAS, M., SANDRIM, E. F. S., SANDRIM, A. (1998). Características hematológicas do tambaqui (Colossoma macropomum) Cuvier, 1818 (Osteichthyes: Characidae) em sistema de monocultivo intensivo. I. Série eritrocitária. Rev. Brasil. Zool., 58 (2): 197-202. TAVARES-DIAS, M., MORAES, F. R. (2004). Hematologia de peixes teleósteos. Villimpress Complexo Gráfico, 144p. THOMPSON, I., WHITE, A., FLETCHER, T.C., HOULIHAN, D.F., SECOMBES, C. J. (1993). The effect of stress on the immune response of Atlantic salmon (Salmo salar) fed diets containing different amounts of vitamin C. Aquaculture, 114: 1- 18. TOMASSO, J. R., DAVIS, K. B., PARKER, N.C. (1980). Plasma corticosteroid and electrolyte dynamics oh hybrid striped bass (white bass x striped bass) during netting and hauling. Proc. World Maricul. Soc., 11: 303-310. TORT, L., SUNYER, J.O., GÓMEZ, E., MOLINERO, A. (1996). Crowding stress induces changes in serum haemolytic and aglutinating activity in the gilthead sea bream Spaurus aurata. Vet. Immunol. Immunopathol., 51: 179-188. TORT, L., BALASCH, J. C., MACKENZIE, S. (2003). Fish immune system. A crossroads between innate and adaptive responses. Imunología, 22(3): 277-286. URBINATI, E. C., CARNEIRO, P. C. F. (2001). Metabolic and hormonal responses of the matrinxã Brycon cephalus (Teleostei: Characidae) to the stress of transport under the influence of benzocaine. J. Aquac. Trop., 16 (1): 75-85. 34 URBINATI, E. C., CARNEIRO, P. C. F. (2004). Práticas de manejo e estresse dos peixes em piscicultura. In Cyrino, J. E. P., Urbinati, E. C., Farcalossi, D. M., Castagnolli, N. (Eds). Tópicos Especiais em Piscicultura de Água Doce Tropical Intensiva. Editora TecArt, pp. 171-193. URBINATI, E. C., ABREU, J. S., CAMARGO, A. C. S., LANDINES, M. A. P. (2004). Loading and transport stress of juvenile matrinxã (Brycon cephalus, Characidae) at various densities. Aquaculture, 229: 389-400. VERLHAC, V., GABAUDAN, J., OBACH A., SCHÜEP W., HOLE, R. (1996). Influence of dietary glucan and vitamin C on non-specific and specific immune response of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture, 143, 123- 133. VERLHAC, V., GABAUDAN, J. (1997). The effect of vitamin C on fish health. Brochure nº 51002. Roche Vitamins, 4070 Basle, Switzerland. VERLHAC, V., OBACH, A., GABAUDAN, J., SCHÜEP W., HOLE, R. (1998). Immunomodulation by dietary vitamin C and glucan in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Fish Shellfish Immunol., 8, 409-424. WAAGBO R., GLETTE J., RAA-NILSEN E., SANDNES K. (1993). Dietary vitamin C, immunity and disease resistance in Atlantic salmon (Salmo salar). Fish Physiol. Biochem., 12 (1): 61-73. WAHLI, T., VERLHAC, V., GIRLING, P., GABAUDAN, J., AEBISCHER, C. (2003). Influence of dietary vitamin C on the wound healing process in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture, 225: 371-386. WENDELAAR BONGA, S.E. (1997). The stress response in fish. Physiol. Rev., 77 (3): 591-625. 35 WEDEMEYER, G. A., McLEAY, D. J. (1981). Methods for determining the tolerance of fishes to environmental stressors. In: Pickering A.D. (Ed), Stress and fish. Academic Press, pp. 247-275. WEDEMEYER, G. A. (1996). Physiology of fish in intensive culture systems. Chapman & Hall. 2: 10-59. WOJTASZEK, J., DZIEWULSKA-SZWAJKOWSKA, D., LOZINSKA-GABSKA, M., ADAMOWICZ, A., DZUGAJ, A. (2002). Hematological effects of high dose of cortisol on the carp (Cyprinus carpio L.): cortisol effect on the carp blood. Gen. Comp. Endocrinol., 125: 176-183. WEYS, F. A. A., VERBURG-VAN KEMENADE, B. M. L., FLIK, G. (1998). Characterisation of glucocorticoid receptors in peripheral blood leukocytes of carp, Cyprinus carpio L. Gen. Comp. Endocrinol., 111: 1-8. WURTS, W. A. (1995). Using salt to reduce handling stress in channel catfish. World Aquac. Mag., 26 (3): 80-81. 36 RESUMO GERAL O sistema imune é dividido em duas partes que se complementam: o sistema imune inato (não específico) e o adquirido (específico). O sistema imune inato é considerado como a primeira linha de defesa e inclui barreiras físicas (pele e muco) e componentes celulares e moleculares (macrófagos, células killer e fatores solúveis de imunidade, como lisozima, proteínas do sistema complemento, peptídeos antimicrobianos, entre outros). No processo de criação, o sistema imune dos peixes pode ser prejudicado por vários fatores, mas efeitos benéficos podem ser observados com o uso de substâncias conhecidas como imunoestimulantes. Dentre os imunoestimulantes estudados, os glicanos vêm sendo amplamente utilizados como importantes indutores de mecanismos não específicos de defesa. Em algumas espécies de peixes tropicais, como o pacu (Piaractus mesopotamicus) e matrinxã (Brycon amazonicus), estudos observaram o papel da vitamina C como imunoestimulante avaliando a hematologia dos peixes como indicador das alterações imunológicas. O número de leucócitos e de trombócitos é considerado importante indicador de seu estado de saúde. Entretanto, não são conhecidos estudos que avaliem outros parâmetros imunológicos bem como os efeitos do glicano nas respostas imunológicas inatas de peixes tropicais. O pacu, por ser uma espécie onívora, de fácil cultivo e adaptada a ampla variedade de alimentos, tem grande importância na piscicultura brasileira e por esta razão foi escolhido como modelo experimental nesta pesquisa. O objetivo deste trabalho foi testar, inicialmente, técnicas para avaliação de alguns mecanismos inatos de defesa (atividade respiratória de leucócitos e concentração e atividade de lisozima) nesta 37 espécie tropical, cujos resultados são apresentados no capítulo 2 desta tese. Este estudo registrou essas respostas imunes inatas no pacu e estabeleceu metodologias apropriadas para sua determinação. Posteriormente, avaliou-se o efeito do imunoestimulante glicano, administrado por injeção intraperitoneal e incorporado à ração, na estimulação de componentes do sistema imune do pacu. Além disso, verificou-se também as respostas de estresse após captura em pacus alimentados com ração enriquecida com o imunoestimulante glicano. Os resultados são apresentados no capítulo 3 desta tese, que mostra que, independente da forma de administração, o imunoestimulante glicano estimulou parte do sistema imune inato do pacu, não sendo capaz, porém, de minimizar as alterações fisiológicas provocadas pelo estresse de captura. Esta pesquisa contribui para o entendimento de alguns mecanismos envolvidos nas respostas imunes inatas de peixes e dá início a uma linha de estudo ainda não explorada na pesquisa básica e aplicada à criação de peixes tropicais do Brasil. Palavras-chave: Piaractus mesopotamicus, glicano, resposta imune inata, estresse. 38 ABSTRACT The immune system is divided in two parts that complement each other: the specific and non-specific immune system. The non-specific immune system is the primary defence line and includes natural barriers (skin and mucus) and cellular and molecular components (macrophages, natural killer cells, immune soluble factors, like lysozyme, complement, antimicrobials peptides, among others). In all farming, the immune system of fish may be damaged by many factors, but the benefic effects may be observed using immunostimulants. It has been of common knowledge that glucans are the most known of them and are being used like non- specific defence mechanisms stimulants. In some tropical fish species, such as pacu (Piaractus mesopotamicus) and matrinxã (Brycon amazonicus), studies evaluated vitamin C effect as immunostimulant, considerating the fish hematology as immune alterations indicator. The leucocytes and trombocytes number is considerated an important health indicator. However, there are no studies evaluating different immune parameters and the glucan effect in innate immune response of tropical fish. The pacu is an omnivore specie of great importance to Brazilian fish farming. For this reason, it was chosen as experimental model in this research. The aim of this work was to test some techniques for evaluation of some defence innate mechanisms (burst oxidative and lysozyme) in this tropical specie, whose results are showed in chapter 2 of this work. This research recorded these immune responses of pacu and established adequate methodologies for its determination. After, this study evaluated the effect of glucan, administered to intraperitoneal injection and incorporated in the diet, in stimulation of some immune systems components of pacu. Besides, it was also verified 39 the stress responses after the capture of pacu fed with diets supplemented with glucan. These results are shown in the chapter 3 of this work, and, independent on the administration form, the glucan stimulated part of innate immune system of pacu, but, it was not able to reduce the physiologic alterations caused by capture stress. This research contributes to the comprehension of some mechanisms involved in innate immune responses of fish and starts a study line not yet investigated in basic research and applied to tropical fish farming in Brazil. Key-words: Piaractus mesopotamicus, glucan, innate immune system, stress. 40 CAPÍTULO 2 ATIVIDADE RESPIRATÓRIA DE LEUCÓCITOS E LISOZIMA EM JUVENIS DE PACU (Piaractus mesopotamicus HOLMBERG, 1887): METODOLOGIAS DE AVALIAÇÃO. 41 RESUMO O presente trabalho teve como objetivo testar técnicas para avaliação da atividade respiratória de leucócitos in vitro e concentração e atividade de lisozima sérica e plasmática do pacu (Piaractus mesopotamicus). Foram realizados três experimentos utilizando-se 88 juvenis com peso médio de 90g, distribuídos em 11 aquários na proporção de oito peixes/aquário. Nos dois primeiros experimentos, foi avaliada a produção de radicais oxidativos (atividade respiratória) por leucócitos, através do ensaio de quimioluminescência (experimento 1) e redução do corante nitroblue tetrazolium (NBT) (experimento 2). No terceiro experimento, avaliou-se a atividade de lisozima sérica e plasmática através de ensaio turbidimétrico. O ensaio de redução NBT foi mais adequado para avaliação da atividade respiratória de leucócitos quando comparado ao de quimioluminescência. Quanto à análise de lisozima, as amostras de soro e plasma foram submetidas ao calor (banho a 56ºC por 30 minutos), para a inativação das proteínas do sistema complemento. Este tratamento provocou turvação das amostras de plasma, interferindo na metodologia, uma vez que se tratava de ensaio turbidimétrico. Além disso, a atividade da lisozima no plasma apresentou-se menor quando comparada à do soro, sugerindo que este seria mais indicado para a análise. De acordo com a curva padrão obtida com os diferentes volumes de soros, o ideal a ser utilizado é 175µl. Este estudo concluiu que a atividade respiratória de leucócitos e concentração e atividade de lisozima podem ser avaliadas no pacu e estabeleceu metodologias apropriadas para sua avaliação. Trata-se de uma pesquisa que contribui para o entendimento de alguns mecanismos envolvidos nas respostas imunes inatas de peixes e dá início a uma linha de estudo ainda não explorada na pesquisa básica e aplicada à criação de peixes tropicais do Brasil. 42 Palavras – chave: Piaractus mesopotamicus, respostas imunológicas inatas, atividade respiratória, lisozima. 1. INTRODUÇÃO O sistema imune é dividido em dois sistemas que se diferenciam pelo mecanismo de ação e tipo de resposta: o sistema não específico ou inato e o específico ou adquirido. Os fagócitos (neutrófilos, eosinófilos, monócitos e macrófagos) desempenham papel importante nos mecanismos de defesa, pois participam de respostas inatas e adquiridas (Verlhac e Gabaudan, 1997). O sistema imune inato é a primeira linha de defesa e, como parte das respostas inatas, os leucócitos, após diapedese e quimiotaxia até o foco lesado, são capazes de reconhecer patógenos, fagocitá-los e degradá-los. O processo de fagocitose tem início com o englobamento do patógeno por meio de pseudópodos, internalização com formação de fagossoma, fagolisossoma com ínício de eventos microbicidas e degradação (Roitt, et al., 1998). Quando a fagocitose é iniciada, ocorre um aumento no consumo de oxigênio molecular, conhecido como “explosão” oxidativa (do inglês oxidative burst). O oxigênio é reduzido, via sistema NADPH oxidase, a ânion superóxido que, por sua vez, é precursor de várias espécies reativas de oxigênio (EROs), como peróxido de hidrogênio (H2O2), radicais hidroxila (OH-) e ânions oxigênio (1 O2 -). Todas estas EROs são altamente oxidantes aos microorganismos e contribuem ativamente com sua destruição (Klein, 1990; Verlhac e Gabaudan, 1997). Em peixes teleósteos, a literatura relata algumas metodologias utilizadas na avaliação de EROs produzidas durante o burst, como ensaio de quimioluminescência (Verlhac et al., 1996; Verlhac et al., 1998; Cuesta et al., 2002) e redução do 43 ferricitocromo C (Jorgensen et al., 1993; Jeney et al., 1997; Santarém et al., 1997; Lee et al., 2004), mas o ensaio de redução do corante nitroblue tetrazolium (NBT) é o mais utilizado (Jeney e Anderson, 1993; Jeney et al., 1997; Castro et al, 1999; Cook et al., 2003; Sahoo et al., 2005). Além de células, existem várias moléculas envolvidas nos mecanismos de defesa conhecidas como mediadores químicos solúveis. Normalmente estão presentes no soro na forma inativa ou de precursores e cujas concentrações elevam-se rapidamente durante infecção (Verlhac e Gabaudan, 1997). O sistema complemento representa uma cascata de reações enzimáticas que quando ativadas participam de respostas inespecíficas e/ou adquiridas. Em peixes, a ativação de uma das vias do sistema complemento, a via alternativa, é bem mais alta do que a de mamíferos, indicando a importância desta resposta inata nestes animais (Holland e Lambris, 2002). A lisozima, por sua vez, é importante agente bacteriolítico encontrado em várias espécies de peixes marinhos e de água doce (Lie et al., 1989). O ensaio para detecção desta enzima tem como base a bactéria gram-positiva, Micrococcus lysodeikticus, cuja lise pode ser medida turbidimetricamente, sendo esta a metodologia mais utilizada na avaliação da atividade de lisozima em peixes (Sankaran e Gurnani, 1972; Lie et al., 1989; Jorgensen et al., 1993; Verlhac et al., 1996; Jeney et al., 1997; Santarém et al., 1997; Verlhac et al., 1998; Cuesta et al., 2002; Balfry e Iwama, 2004). Assim, a intensidade de resposta de leucócitos e seus produtos à agressão do organismo, bem como a ação de várias substâncias biologicamente ativas têm sido usadas como indicadores de resposta ao estresse e resistência à doenças em peixes (Jeney e Anderson, 1993; Jeney et al, 1997). 44 O pacu (Piaractus mesopotamicus) tem grande importância na piscicultura brasileira, pelo hábito alimentar onívoro, fácil cultivo e adaptação à ampla variedade de alimentos, que possibilitam bons rendimentos. Estudos com esta espécie foram realizados considerando o efeito da vitamina C como imunoestimulante (Martins, 1995; Martins, 1998) e neles, as alterações no sistema imune foram avaliadas através da hematologia dos animais, sendo o número de leucócitos e trombócitos considerados importantes indicadores do estado de saúde dos peixes. Considerando a importância do pacu na piscicultura brasileira e o fato de não haver estudos que avaliem parâmetros imunes não específicos em peixes tropicais, o presente trabalho teve como objetivo avaliar algumas metodologias descritas na literatura para peixes teleósteos para determinação da atividade respiratória de leucócitos e da concentração e atividade de lisozima em pacu. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Reagentes Os reagentes utilizados nos experimentos foram adquiridos na Sigma Chemical CO (St. Louis, MO, USA) e são os seguintes: Tampão PBS Dulbecco, Histopaque 1119, Luminol, acetato de forbol miristato (PMA, do inglês, phorbol 12-myristate 13-acetate), nitroblue tetrazolium (NBT), lisozima liofilizada de clara de ovo de galinha e Micrococcus lysodeikticus liofilizado. 2.2. Animais Foram utilizados 88 juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus), provenientes de reprodução induzida, no Centro de Aqüicultura da UNESP – CAUNESP, 45 Jaboticabal, SP, com peso médio de 90g. Os peixes foram mantidos em 11 aquários experimentais de 100 litros (8 peixes/aquário) com aeração e renovação constante de água e alimentados com ração comercial (28% de proteína bruta e 3600 kcal de energia bruta.kg-1) durante o período de adaptação. O período de adaptação terminou quando todos os peixes já estavam se alimentando normalmente e, neste momento, eles já estavam aptos para serem utilizados nos experimentos, como mostrado a seguir. 2.3. EXPERIMENTO 1: Avaliação da atividade respiratória de leucócitos pelo ensaio de quimioluminescência em pacu. 2.3.1. Protocolo experimental Um total de 48 peixes, distribuídos nos aquários experimentais nas condições descritas no item 2.2, foram anestesiados em benzocaína (66mg.l-1 água) após 12 horas de jejum e submetidos à coleta de sangue por punção caudal com seringas banhadas com anticoagulante (EDTA). A cada dois peixes amostrados, era formado um pool com o sangue retirado (n=24), que foi mantido em gelo e conduzido à Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara (FCFAR/UNESP), Araraquara/SP, para análise da atividade respiratória de leucócitos por quimioluminescência. 2.3.2. Separação de leucócitos do sangue A separação de leucócitos foi realizada centrifugando-se o sangue amostrado com um gradiente de densidade para separação de leucócitos como descrito por Jeney et al. (1997). Em tubos plásticos cônicos de 15ml, foi adicionado sangue total diluído volume a volume (3 ml de sangue total + 3 ml de tampão) em tampão PBS Dulbecco pH 7,2. Em seguida, foi acrescentado à mistura, 3ml do gradiente de densidade para 46 separação de leucócitos (Histopaque 1119), totalizando um volume final de 9ml. Os tubos foram submetidos à centrifugação por 30 minutos a 700 x g à temperatura ambiente. Após a centrifugação, o plasma foi descartado e as camadas celulares foram recolhidas e colocadas em tubos plásticos cônicos limpos de 15 ml. As células foram lavadas três vezes com 10 ml de solução balanceada de Hanks pH 7,2 e centrifugadas por 10 minutos a 200 x g à temperatura ambiente. Após as lavagens, o pelete de células foi ressuspenso em 1ml de solução balanceada de Hanks/gelatina 0,1% e a concentração de células foi ajustada em 2 x 106 células viáveis.ml-1 neste mesmo meio. Para este ajuste, as amostras de suspensões celulares foram diluídas em líquido de Lázarus, na proporção de 1:20 (20 l da suspensão celular + 380 l de líquido de Lázarus) e as células contadas em câmara de Neubauer. A viabilidade celular foi analisada pela exclusão do corante azul de trypan. As amostras de suspensões celulares foram diluídas na solução de azul de trypan, na proporção de 180 l do corante e 20 l de amostra da suspensão celular. As células foram observadas por microscopia de luz comum em câmara de Neubauer, sendo as células com coloração azul consideradas não viáveis. 2.3.3. Atividade respiratória de leucócitos A quimioluminescência é uma técnica que se baseia na amplificação da quimioluminescência natural que surge quando os radicais de oxigênio são liberados durante a fagocitose. A amplificação é conseguida por meio da adição de sonda luminescente, como o luminol, à suspensão celular, sendo a detecção da quimioluminescência realizada em luminômetro durante a fagocitose executada pelas células ou sob estimulação (PMA, zimozan, entre outros). (Alves et al., 2003). A 47 atividade respiratória de leucócitos de P. mesopotamicus foi avaliada segundo esta metodologia adaptada de Verlhac et al. (1998). Leucócitos foram isolados do sangue como descrito no item 2.3.2. e a resposta de quimioluminescência foi medida em luminômentro automático (Bio Orbit LKB 1251, Turku, Finlândia). Os leucócitos foram estimulados com acetato de forbol miristato (PMA) e o luminol foi utilizado como sonda luminescente para avaliar a resposta de quimioluminescência. O luminol foi estocado à 10-2M em dimetilsulfóxido (DMSO), sendo esta solução obtida diluindo a solução estoque a 1:1000. Em tubos de polietileno, foram adicionados 10 l do luminol 10-2 M, 280 l da suspensão de leucócitos e 10 l de PMA 10-5 M. O volume final foi ajustado para 1ml com solução balanceada de Hanks/gelatina 0,1%, sendo o PMA o último componente adicionado, por ser ele o estímulo necessário para disparar o burst oxidativo. Para cada amostra, foi realizado um controle negativo, que consistiu do mesmo procedimento descrito anteriormente, porém sem a adição do PMA à mistura. Os controles negativos foram realizados com o objetivo de quantificar e descontar qualquer estimulação espontânea que ocorresse nos leucócitos, que não fosse pelo PMA. Em seguida, os tubos foram imediatamente levados ao luminômetro à 22ºC e a resposta de quimioluminescência avaliada pela contagem da taxa de fótons emitida em um intervalo constante de tempo (10 minutos). 2.4. EXPERIMENTO 2: Avaliação da atividade respiratória de leucócitos pelo ensaio de redução do nitroblue tetrazolium (NBT) em pacu. 2.4.1. Protocolo experimental 48 Um total de 24 peixes distribuídos nos aquários experimentais nas condições descritas no item 2.2, foram anestesiados em benzocaína (66mg.l-1 água) após 12 horas de jejum e submetidos duas vezes à coleta de sangue por punção caudal, sendo a primeira punção realizada com seringas banhadas com o anticoagulante heparina e a segunda com seringas banhadas com o anticoagulante EDTA. Em cada punção, era formado um pool com o sangue de dois peixes amostrados (n=12). Após a coleta, o sangue foi mantido em gelo e conduzido à Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara (FCFAR/UNESP), Araraquara/SP, para análise da atividade respiratória de leucócitos pelo ensaio de redução do NBT. 2.4.2. Atividade respiratória de leucócitos O ensaio da redução do corante nitroblue tetrazolium (NBT) baseia-se no fato de que este corante é capaz de captar elétrons de várias espécies reativas de oxigênio, convertendo-se à forma reduzida. Como conseqüência desta redução, precipitados azul escuros são formados no citoplasma do fagócito, denominados grânulos de formazan (Klein, 1990), e podem ser analisados por espectrofotometria ou visualizados em extensões sangüíneas. A atividade respiratória de leucócitos de P. mesopotamicus foi avaliada por meio deste ensaio, seguindo o protocolo de Glasser e Fiederlein (1990), com algumas modificações. Primeiramente, 100µL do sangue coletado com heparina foram colocados em tubos tipo “eppendorff” nos quais 100µL de solução de nitroblue tetrazolium (NBT) (0,1% em tampão PBS) foram adicionados. Em seguida, 1µL de PMA 10-5 M foi adicionado à amostra. A mistura foi incubada por vinte minutos, em temperatura ambiente (aproximadamente 26ºC), sendo homogeneizada a cada cinco minutos. Terminado o tempo de incubação, extensões sangüíneas de cada amostra 49 foram realizadas e coradas com Leishman. As extensões foram observadas em microscópio de luz (aumento de 1000x) e as células NBT positivas e NBT negativas foram contadas no total de 100 células. Foram consideradas células NBT positivas aquelas que possuíam grânulos de formazan em seu citoplasma e as NBT negativas aquelas nas quais estes grânulos estavam ausentes. Da mesma forma que no experimento anterior, foi realizado um controle negativo para cada amostra que consistiu no mesmo procedimento descrito anteriormente, porém sem a adição do PMA à mistura. Tendo em vista a ação quelante do EDTA em relação aos íons Ca+2 e considerando a possibilidade deste fato interferir nas reações químicas da respiração, optou-se por preparar um tampão PBS enriquecido com glicose, Ca+2 e Mg+2. Em seguida, a solução de NBT a 0,1% foi preparada com o tampão PBS enriquecido e o mesmo procedimento descrito anteriormente foi repetido com o sangue retirado com EDTA. 2.5. EXPERIMENTO 3: Ensaio turbidimétrico da atividade de lisozima em soro e plasma de pacu. 2.5.1. Protocolo experimental Um total de 16 peixes, distribuídos nos aquários experimentais nas condições descritas no item 2.2, foram anestesiados em benzocaína (66mg.l-1 água) após 12 horas de jejum e submetidos duas vezes à coleta de sangue por punção caudal, sendo a primeira realizada com seringas sem anticoagulante e a segunda com seringas banhadas com EDTA. Em cada punção, era formado um pool com o sangue retirado. Após a coleta, os pools de sangue (com e sem anticoagulante) eram centrifugados (600 x g; 10 50 minutos) para separação do soro e plasma, cujas alíquotas foram estocadas a -20ºC para posterior análise da atividade de lisozima realizada na Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP/USP), Ribeirão Preto, SP. 2.5.2. Ensaio da atividade de lisozima A lisozima lisa a parede celular de bactérias, atuando nas ligações beta 1,4 glicosídicas entre o ácido N-acetilmurâmico e o ácido N-acetilglicosamínico (Paulsen et al., 2003). O ensaio para detecção de lisozima utiliza como substrato bactérias gram- positivas, como Micrococcus lysodeikticus, e a atividade da lisozima é medida por meio da redução da densidade óptica verificada durante a lise da parede celular da bactéria pela enzima. 2.5.3. Curva de calibração para lisozima Para curva de calibração utilizou-se lisozima liofilizada (1mg de lisozima.ml-1) de clara de ovo de galinha, além de tampão fosfato de sódio (NaH2PO4; 0,05M; pH 6,2) e suspensão de 10mg de Micrococcus lysodeikticus em 50ml de tampão fostafo de sódio (0,05M; pH 6,2). Primeiramente, solução estoque de lisozima padrão (100mg.ml-1) foi diluída 100 vezes em tampão fosfato de sódio (0,05M; pH 6,2), resultando na concentração final de 1mg.ml-1 (1 g. l-1). Em seguida, a concentração de lisozima foi avaliada usando ensaio turbidimétrico segundo o protocolo de Ellis (1990), com algumas modificações. Em cubetas plásticas de 1ml, foram adicionadas diferentes concentrações de solução de lisozima padrão a 1 g/ l (50, 80, 100, 160, 200 e 300 l) e o volume completado para 300 l com tampão fosfato de sódio (0,05 M; pH 6,2). A mistura foi levada ao espectrofotômetro (Beckman DU-70S) onde permaneceu incubada 51 por dois minutos a 26ºC e após este período, 300 l da suspensão de Micrococcus lysodeikticus 0,2 mg.ml-1 foram adicionados à mistura, totalizando um volume final de 600 l. Um branco foi realizado contendo apenas tampão fosfato (600 l). A redu