UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Instituto de Biociências de Botucatu INFLUÊNCIA DO JEJUM SEGUIDO DE REALIMENTAÇÃO NO ANABOLISMO E CATABOLISMO DO MÚSCULO VERMELHO DO PACU (Piaractus mesopotamicus) BRUNA TEREZA THOMAZINI ZANELLA Botucatu, 2016 Bruna Tereza Thomazini Zanella INFLUÊNCIA DO JEJUM SEGUIDO DE REALIMENTAÇÃO NO ANABOLISMO E CATABOLISMO NO MÚSCULO VERMELHO DO PACU (Piaractus mesopotamicus) Orientadora: Prof.ª Dr.ª Maeli Dal-Pai Trabalho de Conclusão de Curso de Ciências Biológicas, Modalidade Bacharelado, apresentado ao Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, UNESP, Botucatu. Orientadora: Maeli Dal-Pai Co-orientadora: Tassiana Gutierrez de Paula Botucatu, 2016 Agradecimentos Agradeço primeiramente à minha família por todo apoio, incentivo e compreensão nos momentos de ausência, em especial ao meu pai Alexandre, minha mãe Claudia, minha avó Claudete e meu companheiro Kaick, sem vocês nada disso teria sido possível. A todos os professores que contribuíram para a minha formação e me serviram de exemplo, em especial a minha orientadora, Prof.ª Dr.ª Maeli Dal- Pai, por ter me aberto às portas do laboratório, por todo o tempo cedido, pela confiança depositada não só na realização das atividades do laboratório, mas no meu processo de graduação como um todo, obrigada pelo incentivo e reconhecimento. A todos os colegas do Laboratório de Biologia do Músculo Estriado – LBME, que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho, em especial à Jéssica, Francielle e Caroline por percorrermos este caminho juntas, a Tassiana por todo o aprendizado, pela amizade e pela segurança oferecida, ao Bruno Duran pela ajuda com os experimentos, discussões e paciência durante todo esse processo, ao Leonardo pelas experiências compartilhadas e pelos questionamentos que me levaram a buscar respostas cada vez mais completas e a todos que dividiram seus dias comigo na sala de estudos do laboratório, contribuindo seja cientificamente ou com os momentos de descontração que tornaram esse processo menos árduo. Por fim, agradeço a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP, pelo apoio financeiro concedido. Resumo O músculo esquelético nos peixes corresponde a maior parte da massa corporal nesses animais. O desenvolvimento, crescimento e o fenótipo muscular envolvem a ativação ou inibição de vias de sinalização, responsáveis pelo controle das atividades anabólicas e catabólicas deste tecido. Uma das principais vias envolvidas no crescimento muscular é a via do IGF-1, que atua estimulando a síntese de proteínas e inibindo a expressão de sistemas relacionados à degradação proteica, como o sistema ubiquitina-proteassoma da qual participam atrogenes, entre eles, o MAFbx. As vias de síntese e degradação proteica são moduladas por pequenos RNAs não codificantes (miRNAs), que atuam na desestabilização ou inibição da tradução do RNA mensageiro desses genes. Além disso, essas vias também sofrem influência de fatores externos como a indisponibilidade de alimentos. Com base nessas informações e considerando que a maior parte dos estudos avaliam a expressão dessas moléculas em situações de jejum somente na musculatura branca, são necessários estudos que busquem elucidar a real contribuição dessas vias e de seus moduladores na manutenção da musculatura vermelha em condições que ocorre uma alteração no balanço energético. Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar a expressão dos miRNAs, miR-1, miR-206, miR-199 e miR-23a e dos genes alvos IGF-1, mTOR, PGC-1α e MAFbx, respectivamente, na musculatura esquelética vermelha de juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus) submetidos a um período de jejum seguido de realimentação. A expressão dos miRNAs e dos genes alvos selecionados foi realizada por Reação em Cadeia da Polimerase após Transcrição Reversa em Tempo Real (RT-qPCR) nos grupos C (grupo controle), J (após 10 dias de jejum) e R (após 60 horas de realimentação). De uma maneira geral, encontramos uma maior alteração nos genes relacionados à degradação proteica e ao metabolismo energético. Em conclusão, nossos dados indicam que situações de restrição alimentar não promovem grandes perturbações nas vias relacionadas ao anabolismo muscular, assim como nos miRNAs que modulam a expressão das vias de síntese e degradação proteica, e que, em situações desfavoráveis, o aumento do metabolismo oxidativo possivelmente atua na manutenção dessa musculatura, evidenciando a sua preservação em condições que promovem a perda de massa muscular. 2 Sumário 1. Introdução ............................................................................................................... 3 2. Objetivo ................................................................................................................... 7 3. Material e métodos ................................................................................................ 8 3.1. Condições experimentais ............................................................................... 8 3.2. Extração, quantificação e análise da integridade do RNA.......................... 9 3.3. Análise da expressão dos genes e dos miRNAs ......................................... 9 4. Análise estatística dos dados ............................................................................. 10 5. Resultados ............................................................................................................ 11 6. Discussão ............................................................................................................. 12 7. Referências........................................................................................................... 16 3 1. Introdução Em peixes, a maior parte da massa corporal é constituída pelo músculo estriado esquelético que representa de 40 a 75% do peso total do animal (Bone, 1978). O músculo esquelético nesses animais, além de ter um papel importante na locomoção, também representa uma das principais reservas de proteínas principalmente em longos períodos de deslocamento, como por exemplo, períodos de migração, e em situações de restrição alimentar, quando as fontes externas de nutrientes são escassas (Weatherley & Gill, 1985). Diferente do que ocorre nos mamíferos, nos peixes, esse tecido está distribuído em três compartimentos bem delimitados (branco, vermelho e intermediário), que possuem características metabólicas distintas (Driedzic & Hochachka, 1976; Sänger & Stoiber, 2001). O recrutamento desses compartimentos ocorre durante a realização de diferentes movimentos. O recrutamento das fibras vermelhas ocorre durante a locomoção contínua e de baixa velocidade, como a migração, enquanto a musculatura branca é recrutada durante a realização de movimentos rápidos, como a fuga de predadores e a captura de alimento (Driedzic & Hochachka, 1976; Johnston & Goldspink, 1977). As fibras vermelhas são caracterizadas por possuírem um alto suprimento sanguíneo, uma grande quantidade de mitocôndrias e um metabolismo predominantemente oxidativo, utilizando preferencialmente carboidratos e lipídeos como fonte de energia. As fibras brancas possuem maiores diâmetros em comparação às fibras vermelhas, menor quantidade de mitocôndrias, baixo suprimento sanguíneo e um metabolismo predominantemente glicolítico (Crabtree & Newsholme,1972; Johnston & Goldspink, 1977). As fibras intermediárias se localizam entre os compartimentos branco e vermelho e apresentam contração rápida e metabolismo oxidativo/glicolítico (Johnston & Goldspink, 1977; Sänger & Stoiber, 2001). O fenótipo muscular, incluindo a massa muscular e o tamanho das fibras musculares, varia de acordo com estímulos extrínsecos e intrínsecos. O aumento da massa muscular resultante da síntese proteica, processo denominado anabolismo, pode ocorrer devido a fatores como o exercício físico, devido à ablação de músculos sinergistas, por estímulos anabólicos hormonais 4 e durante o processo de desenvolvimento (Schiaffino et al., 2013). Nos peixes teleósteos, em sua maioria, esse crescimento ocorre de maneira indeterminada, desta maneira, o aumento da massa muscular pode ocorrer durante toda a vida, embora ocorra uma diminuição da taxa de crescimento muscular ao longo do tempo, o que os diferenciam dos mamíferos (Johnston et al, 2011). A via do IGF-1 tem sido descrita como uma das principais vias envolvidas no crescimento muscular (Schiaffino et al, 2013). A interação do IGF-1 (insulin like growth factor 1) ao seu receptor leva à estimulação da síntese proteica através da ativação de PI3K (phosphatidyl-inositol-3 kinase), que promove um sítio de ligação à membrana para Akt (serine-threonine kinase). Quando ativa, essa quinase leva a fosforilação de mTOR (mammalian target of rapamycin) que atua estimulando a síntese proteica através da ativação da proteína p70S6K (Fig. 1) (Vivanco & Sawyers, 2002; Glass, 2003; Schiaffino et al, 2013). O catabolismo proteico ou a perda de massa muscular, também pode ocorrer devido à ação de diversos fatores como envelhecimento, diabetes e períodos de jejum (Schiaffino et al, 2013). Além de atuar na síntese proteica, Akt também atua desestimulando o catabolismo muscular via fosforilação do FOXO (fator transcricional da família Forkhead box O), fator fortemente relacionado à degradação proteica (Witt et al, 2005; Johnston et al, 2011; Bonaldo e Sandri, 2013). Quando não há estímulos para a ativação de Akt, FOXO é desfosforilado e translocado para o núcleo, onde estimula a transcrição de genes relacionados ao catabolismo muscular como o MuRF (Muscle RING Finger protein) e o MAFbx (Muscle Atrophy F-box ou atrogin-1), atrogenes classificados como E3 ubiquitna-ligases que participam do sistema ubiquitina-proteassoma (Bonaldo e Sandri, 2013, Schiaffino et al, 2013). A degradação proteica via esse sistema se inicia com a ligação das proteínas a serem degradadas a uma cadeia de moléculas de ubiquitinas, processo denominado ubiquitinização e mediado por enzimas E3 ubiquitina-ligases, responsáveis por catalisar a transferência das proteínas de uma forma ativa da molécula de ubiquitina para uma molécula de ubiquitina carreadora (classificada como E2); posteriormente essas proteínas são carreadas até o proteassoma 26S onde são degradadas (Gomes et al, 2001; Bower e Johnston, 5 2010; Bonaldo e Sandri, 2013). Além disso, a atividade do FOXO também é modulada por outros fatores como o fator transcricional PGC-1α (peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1 alpha), um cofator essencial para a biogênese mitocondrial (Puigserver, et al, 2003, Schiaffino, et al., 2013). A interação entre PGC-1α e FOXO previne a ativação excessiva dos processos relacionados ao catabolismo muscular, levando à inibição da atividade transcricional do FOXO, sem afetar a síntese proteica (Fig. 1) (Schiaffino et al, 2013). Além disso, o gene PGC-1α também tem um importante papel no estímulo à produção de energia via aumento do número de mitocôndrias e síntese de ATP (Wu et al, 1999; Fuentes et al, 2013). Diversos estudos tem mostrado que as vias de sinalização envolvidas no desenvolvimento e manutenção do fenótipo muscular são controladas por pequenas moléculas chamas de microRNAs. MicroRNAs ou miRNAs, são pequenos RNAs com aproximadamente 22 nucleotídeos que podem regular a expressão do RNA mensageiro (mRNA) de genes alvos, seja inibindo a tradução desses genes ou levando à desestabilização do mRNA correspondente através do reconhecimento da região complementar 3' UTR do alvo (Bartel, 2004; Guo et al, 2010). Em relação às vias de síntese proteica, estudos indicam que tanto o miR-1 quanto o miR-206 regulam negativamente a expressão de IGF-1. Em cultura de células musculares cardíacas e esqueléticas, Elia et al, 2009, observaram uma regulação da expressão de IGF-1 pelo miR-1, na qual a superexpressão deste miRNA resultou em uma inibição da expressão de IGF-1 em ambos os cultivos celulares. Além disso, Yan et al, 2013, também encontraram um padrão de expressão inverso entre o miR-206 e o IGF-1 em tilápias (Oreochromis niloticus) transfectadas com esse miRNA, indicando uma inibição desse gene pelo miR-206. Além desses dois miRNAs, também foi demonstrado em cultura de células musculares C2C12 que o miR-199 também atua inibindo a via do IGF1 e o crescimento muscular, suprimindo tanto a expressão de IGF1, quanto a expressão de mTOR, outro componente dessa via (Jia et al., 2014). Outro miRNA que tem sido descrito em diversos processos envolvidos com a atrofia e a hipertrofia muscular é o miR-23a (Wang, 2013). Safdar, et al, 2009, encontraram uma associação entre a diminuição desse miRNA e o 6 aumento, tanto dos níveis proteicos quanto de mRNA, do gene PGC-1α no músculo esquelético de ratos submetidos a exercício físico, indicando que o miR-23a pode regular negativamente a expressão desse gene. Além dessa regulação, esse miRNA, em condições normais, inibe também a expressão de atrogenes como o MAFbx e o MuRF e uma superexpressão deste miRNA resultou em uma resistência a atrofia, tanto em ratos adultos, quanto em cultura de células submetidas ao tratamento com dexametasona (Wada et al, 2011) (Fig. 1). Protocolos envolvendo modelos jejum e realimentação em peixes tem sido utilizados para investigar o envolvimento dos miRNAs no controle da massa muscular durante a transição do catabolismo para anabolismo celular (Yan et al, 2013, Zhu et al, 2014, 2015). Zhu et al, 2015, após construírem uma biblioteca de miRNAs para a espécie de peixe Siniperca chuatsi, destacaram que 21 miRNAs apresentaram uma alta abundância no músculo esquelético. Os autores analisaram a expressão desses 21 miRNAs em juvenis desta espécie, após um período de jejum seguido de realimentação e observaram um padrão variado de expressão dos miRNAs entre os períodos analisados. Grande parte dos estudos que utilizam modelos de jejum e realimentação para avaliar a expressão de genes relacionados à síntese e degradação proteica, analisam somente a expressão dessas vias na musculatura esquelética branca (Seilliez et al, 2008b; Bower & Johnston, 2010; Johnston et al, 2011; Fuentes et al, 2013; Valente et al, 2012). Tendo em vista que em peixes, os compartimentos musculares são bem delimitados, o que possibilita avaliar a expressão e o papel dos reguladores do tecido muscular em musculaturas com características fisiológicas e fenotípicas distintas, e a carência de estudos que avaliam a expressão dessas vias na musculatura vermelha, são necessários estudos que busquem compreender o real papel tanto dos genes quanto dos miRNAs na musculatura vermelha em situações de desequilíbrio energético, como a privação alimentar. 7 Fig. 1: Vias de sinalização envolvidas na síntese (em verde) e degradação proteica (em rosa). miRNAs estão representados em azul. Estímulo intrínseco ou extrínseco (roxo) induz a liberação de IGF-1, que se liga ao receptor na superfície celular e ativa uma série de eventos através da via PI3K --> AKT -->mTOR --> p70S6K, aumentando a síntese proteica e inibindo fatores envolvidos com a via de degradação. A inativação da via AKT leva à desfosforilação do FOXO que regula a transcrição de fatores atrogênicos, como o MuRF e o MAFbx, desencadeando a degradação proteica. Quando ativo, PGC-1α inibe FOXO, desestimulando a ativação dos fatores atrogênicos e estimulando a biogênese mitocondrial. Os miRNAs atuam inibindo os diferentes genes, influenciando tanto nas taxas de síntese quanto de degradação proteica. (Adapatado: Bonaldo e Sandri 2013). 2. Objetivo Esse trabalho teve como objetivo avaliar a expressão dos miRNAs, miR- 1, miR-206, miR-199 e miR-23a e a expressão dos seus genes alvos IGF-1, mTOR, PGC-1α e MAFbx, respectivamente, na musculatura esquelética vermelha de juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus) submetidos a um período de jejum seguido de realimentação. 8 3. Material e métodos 3.1. Condições experimentais O cultivo dos peixes foi conduzido no Polo Regional da Alta Sorocabana, da Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios (APTA), com sede em Presidente Prudente-SP. Juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus), de aproximadamente 150 g, foram distribuídos em caixas d’água (0,5 m³), em sistemas de recirculação distintos. O oxigênio dissolvido na água foi monitorado diariamente e os parâmetros, amônia, nitrito e nitrato, semanalmente. Os peixes foram alimentados três vezes ao dia, até a saciedade aparente com ração comercial apropriada para a fase de desenvolvimento durante sete dias para adaptação ao delineamento experimental. Após esse período, os animais foram submetidos a um período de jejum de 10 dias, seguido de um período de realimentação de 60 horas. As coletas foram realizadas conforme o delineamento experimental (Fig. 2). Figura 2: Grupos utilizados na análise da expressão gênica e dos miRNAs: C (controle): antes do jejum; J (jejum): após 10 dias de jejum; R (realimentação): após 60 horas de realimentação. Em cada coleta, os peixes (n=8) foram anestesiados com benzocaína (100-200 mg/L de água) e eutanasiados. Amostras musculares foram retiradas e armazenadas em freezer a -80ºC até o processamento. 9 3.2. Extração, quantificação e análise da integridade do RNA O RNA total das amostras musculares foi extraído com o reagente TRIzol® (Invitrogen Life Technologies, USA), conforme instruções do protocolo. Para a quantificação do RNA extraído foi utilizado o espectrofotômetro NanoVue™ Plus (GE Healthcare, USA), que permite uma estimativa da qualidade da extração pela medida da densidade óptica a 260 nm (quantidade de RNA) e 280 nm (quantidade de proteínas). A pureza do RNA foi garantida pela obtenção de uma razão 260/280 nm superior a 1.8. A integridade do RNA total extraído foi avaliada por eletroforese em gel de agarose 1% e pelo sistema 2100 Bioanalyzer (Agilent, USA). Amostras com um RIN (integridade do RNA) superior a 7.0 foram consideradas íntegras. 3.3. Análise da expressão dos genes e dos miRNAs O RNA total extraído das amostras musculares foi submetido ao tratamento com o kit DNase I Amplification Grade (Invitrogen Life Technologies, USA), para eliminar qualquer possível resíduo de DNA genômico contaminante das amostras. Para as análises de expressão dos genes selecionados foi realizada a transcrição reversa do RNA extraído objetivando a síntese do cDNA, pelo kit GoScript™ Reverse Transcription System (Promega, USA), seguindo as orientações do fabricante. A análise da expressão dos miRNAs selecionados, foi realizada através da transcrição reversa do RNA extraído para a síntese do cDNA pelo kit TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription (Life Technologies, USA) combinado com o kit TaqMan® MicroRNA Assays (Life Technologies, USA), conforme instruções do fabricante. Os níveis de expressão dos miRNAs e dos genes selecionados foram detectados por RT-qPCR, através da plataforma QuantStudio™ 7 Flex Real- Time PCR System (Applied Biosystems, USA). O cDNA dos miRNAs foi amplificado utilizando-se o kit TaqMan® small RNA assay (Life Technologies, USA), contendo primers e sondas de hidrólise específicos para os miRNAs miR-1, miR-206, miR-199 e miR-23a (Tabela 1). O cDNA dos mRNAs dos genes foram amplificados utilizando-se GoTaq® qPCR Master Mix (Promega, USA) e primers específicos para cada gene (Tabela 2). A quantificação relativa 10 da expressão, tanto dos miRNAs quanto dos genes, foi realizada pelo método do CT comparativo (Livak & Schmittgen, 2001). A expressão dos miRNAs foi normalizada pela expressão do RNA não codificante U6 (U6 snRNA) e a expressão dos genes foi normalizada pela expressão do gene GAPDH. Tabela 1: Sequências dos miRNAs analisados e número de acesso no miRBase ID no miRBase Sequência Número de acesso (miRBase) dre-miR-1 UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU MIMAT0001768 dre-miR-206-3p UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG MIMAT0001866 dre-miR-23a-3p AUCACAUUGCCAGGGAUUUCCA MIMAT0001790 dre-miR-199-3p UACAGUAGUCUGCACAUUGGUU MIMAT0003155 U6 snRNA Número de acesso NCBI: NR_004394 Tabela 2: Sequência dos primers utilizados na amplificação dos genes analisados. F: forward, R: reverse. Genes Sequência dos primers IGF-1 F: ATTTCAGCAAGCCAACAGGT R: CGCACAATACATCTCAAGTCG mTOR F: TTGGGAGAGACGTACTGC R: CACAGGACTGGTGTAGGAA PGC-1α F: GAGGGTGAGCGTTCAAAGAG R: ATGAGGCTGAGCAGAGAGGA MAFbx F: TCTTTGGTGCTCCCCTTGTG R: TAAAACCGAGGACGGCTGG GAPDH F: ACACACGACGACAAGACCAA R: GTCCCTCTCGCTGAAAACTG 4. Análise estatística dos dados Após a realização dos testes de normalidade, foi realizado o teste de Kruskal-Wallis tanto para a análise da expressão dos genes alvos quanto dos miRNAs. Para todos os testes, o intervalo de confiança adotado foi de 95%. (Zar, 2009). 11 5. Resultados Em relação aos genes IGF-1 e mTOR, relacionados à síntese proteica, não encontramos diferença estatística em suas expressões durante os períodos analisados, sendo que a expressão de IGF-1 tendeu a aumentar somente durante o jejum (grupo J) (Figs. 3 e 4). No que se refere à expressão dos miRNAs que controlam essa via, a expressão dos miRNAs -1 e -206 diminuiu após a realimentação quando comparado aos grupos controle (C) e jejum (J) (Fig. 3), enquanto que a expressão do miR-199 não sofreu alteração durante os períodos analisados (Fig. 4). Figura 3: Expressão dos miRNAs -1 e -206 e dos genes alvos IGF-1 e mTOR nos grupos: C: controle, J: jejum e R: realimentação. Dados apresentados em Fold Change. Letras diferentes indicam diferença estatística entre os grupos. Figura 4: Expressão do miR-199 e dos genes alvos IGF-1 e mTOR nos grupos: C: controle, J: jejum e R: realimentação. Dados apresentados em Fold Change. Letras diferentes indicam diferença estatística entre os grupos. 12 A expressão do gene MAFbx, gene participante do processo de catabolismo muscular, aumentou após 10 dias de jejum (grupo J) e após 60 horas de realimentação (grupo R) a expressão desse gene diminuiu, se igualando a expressão do grupo controle (C) (Fig. 5A). O mesmo padrão de expressão também foi observado para o gene PGC-1α, com um aumento após o jejum (grupo J) e diminuição a níveis estatisticamente semelhantes ao da expressão basal no grupo controle (C) após a realimentação (grupo R) (Fig. 5B). Em relação ao miR-23a, não houve diferença estatística em sua expressão durante os períodos analisadas (Fig. 5) Figura 5: Expressão do miR-23a e dos genes alvos MAFbx e PGC-1α nos grupos: C: controle, J: jejum e R: realimentação. Dados apresentados em Fold Change. Letras diferentes indicam diferença estatística entre os grupos. 6. Discussão Em uma análise geral dos nossos resultados, observamos uma diminuição na expressão dos miRNAs -1 e -206 durante o período de realimentação (grupo R) e aumento na expressão dos genes MAFbx e PGC-1α durante o período de jejum (grupo J) comparado aos grupos controle (C) e realimentação (R). Durante períodos de jejum, em peixes, pode ocorrer a mobilização das reservas de proteína através da degradação proteica do músculo esquelético. O processo de degradação proteica envolve diferentes sistemas, entre eles o 13 sistema ubiquitina-proteassoma (Johnston et al, 2011). O gene MAFbx, componente desse sistema, tem um papel importante tanto na iniciação quanto na manutenção da degradação proteica (Gomes et al, 2001). Em nosso trabalho, encontramos um aumento na expressão desse gene nos animais submetidos a um período de 10 dias de jejum com posterior diminuição após 60 horas de realimentação. Esse mesmo padrão de expressão também foi encontrado para outras espécies de peixes submetidos à restrição alimentar como salmão (Valente et al, 2012) e truta arco-íris (Cleveland & Weber, 2013). Assim, acreditamos que o aumento de MAFbx durante o jejum seja devido à ausência de fontes externas de nutrientes, o que estimulou o aumento da expressão desse gene para a mobilização das reservas energéticas provenientes do catabolismo do musculo esquelético, e que o período de 60 horas de realimentação, quando as condições energéticas foram reestabelecidas, foi suficiente para desestimular a degradação proteica assim como a atividade desse gene, como observado no grupo R, no qual houve uma diminuição da expressão de MAFbx. Além do aumento de MAFbx durante o jejum, também encontramos um aumento na expressão de PGC-1α, nesse mesmo período. O aumento de PGC-1α em situação de restrição alimentar também foi encontrado em juvenis de Paralichthys adspersus, submetidos a um período de 3 semanas de jejum (Fuentes et al, 2013). O fator transcricional PGC-1α atua estimulando tanto a biogênese mitocondrial quanto a respiração celular em células musculares, consequentemente aumentando a síntese de ATP (Wu et al, 1999). Durante o jejum, quando não há fontes externas de energia disponíveis, sistemas alternativos de produção de energia são ativados, tanto por meio da degradação proteica quanto através da síntese de ATP via estimulação da biogênese mitocondrial (Fuentes et al, 2013). Assim acreditamos que o aumento de PGC-1α no presente estudo, durante o período de jejum, possa ter contribuído com a manutenção da massa muscular nessa situação de restrição alimentar, através da utilização dos ATPs gerados na respiração celular como fonte de energia alternativa à degradação proteica. A retomada de nutrientes, pela alimentação, possivelmente levou à redução da expressão desse gene. Experimentos envolvendo modelos de jejum e realimentação foram utilizados para avaliar a expressão dos componentes da via do IGF-1 em 14 diversas espécies de peixes como Hippoglossus hippoglossus (Hagen et al, 2008), Salmo salar (Valente et al, 2012), Oncorhynchus mykiss (Seiliez et al, 2008b), entre outros. Em geral, nesses estudos, os autores encontraram um aumento na expressão dos componentes da via do IGF-1 nas primeiras horas de realimentação com uma posterior diminuição da expressão desse gene ao longo do tempo. Em nosso trabalho, não encontramos diferença estatística na expressão de mTOR e IGF-1 entre os grupos analisados, sendo que a expressão de IGF-1 tendeu a aumentar somente durante o jejum. O aumento da expressão desse gene foi encontrado em juvenis de pacu após aproximadamente 6 horas de realimentação, com posterior diminuição após um dia de realimentação (Mareco et al, 2015), assim acreditamos que o aumento da expressão dos componentes dessa via, IGF-1 e mTOR, em nosso trabalho, possa ter ocorrido antes do período analisado de 60 horas de realimentação (grupo R). Da mesma maneira a expressão do miR-199, miRNA relacionado ao controle desses genes (Jia et al, 2014) e do miR-23a, relacionado ao controle de PGC-1α e MAFbx (Safdar et al, 2009; Wada et al, 2011), também não se alterou durante os períodos analisados. Acreditamos que os resultados encontrados para a expressão desses miRNAs, sejam devido às características da musculatura analisada neste trabalho, a musculatura vermelha, que tende a ser mantida em situações de restrição alimentar em detrimento das musculaturas branca e intermediária que são prioritariamente utilizadas como fonte de proteínas nessas situações (Johnston, 1981). Sendo assim, nosso dados indicam que o período de jejum de 10 dias promoveu uma menor alteração na expressão dos moduladores das vias que regulam o fenótipo do músculo esquelético, na muscula vermelha. Além disso, o fato de que o curto período de 60 horas de realimentação foi o suficiente para o retorno à expressão basal dos dois genes que se alteraram durante o jejum (MAFbx e PGC-1α) reflete a capacidade dessa musculatura de recuperar o equilíbrio energético quando as condições externas de nutrientes são reestabelecidas. A diminuição na expressão dos miR-1 e miR-206, durante o período de realimentação, não coincidiu com a expressão de seu gene alvo, IGF-1. A expressão de um único gene pode ser regulada por diferentes miRNAs e um único miRNA pode regular a expressão de diversos genes (Stark, 2005; van 15 Rooij et al, 2008). Um exemplo disso é que além de regular a expressão de IGF-1 (Yan et al, 2006; Elia et al, 2009) acredita-se também que em pacus adultos, o miR-1 possa ter silenciado a expressão de HDAC4 e que o miR-206 possa ter silenciado a expressão de Pax7, promovendo a diferenciação de mioblastos (Duran et al, 2015). Dessa maneira, acreditamos que a diminuição da expressão desses miRNAs, no presente estudo, após a realimentação, pode estar relacionada a regulação de outros genes alvos não analisados neste trabalho. Em conclusão, nossos dados indicam que em situações de restrição alimentar, a musculatura vermelha não sofre grandes alterações nos componentes que regulam a síntese proteica, bem como nos miRNAs que modulam as vias de catabolismo e anabolismo muscular e que o aumento do metabolismo oxidativo durante esse período possivelmente atua na manutenção dessa musculatura durante o jejum, evidenciando a sua preservação em situações desfavoráveis. 16 7. Referências Bartel, DP. MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function. Cell, vol. 116, 281–297. 2004. Bonaldo, P., Sandri, M. Cellular and molecular mechanisms of muscle atrophy. Disease Models & Mechanisms 6, 25-39. 2013 Bone, Q. Locomotor muscle. In: Hoar, W.S., Randall, D.J. (Eds.), Fish Physiology. Academic Press, New York, pp. 361-424. 1978 Bower, NB., Garcia de la serrana, D., Johnston., IA. Characterization and differential regulation of MAFbx/Atrogin-1 a and b transcripts in skeletal muscle of Atlantic salmon (Salmo salar). Biochemical and Biophysical Research Communications 396, 265–271. 2010 Cleveland, BM., Weber, GM. Effects of triploidy on growth and protein degradation in skeletal muscle during recovery from feed deprivation in juvenile rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Comparative Biochemistry and Physiology, Part A 166, 128– 137. 2013 Crabtree, B., Newsholme, EA. The activities of phosphorylase, hexokinase, phosphofructokinase, lactate dehydrogenase and glycerol-3 phosphate dehydrogenase in muscles from vertebrates and invertebrates. Biochem. J. 126, 49-58. 1972 Driedzic, WR., Hochachka, PW. Control of energy metabolism in fish white muscle. Am. J. Physiol. 230, 579-582. 1976 Duran BOS., Fernandez GJ., Mareco EA., Moraes LN., Salomão RA., Gutierrez de Paula T., Santos VB., Carvalho RF., Dal-Pai-Silva M. Differential microRNA Expression in Fast- and Slow-Twitch Skeletal Muscle of Piaractus mesopotamicus during Growth. PLOS ONE. 2015. Elia, L., Contu, R., Quintavalle, M., Varrone, F., Chimenti, C. Russo, MA., Cimino, V., De Marinis, L., Frustaci, A., Catalucci, D., Condorelli, G. Reciprocal regulation of microRNA-1 and IGF-1 signal transduction cascade in cardiac and skeletal muscle in physiological and pathological conditions. Circulation, 120(23): 2377–2385. 2009 Fuentes, NF., Safian, D., Einarsdottir, IE., Valdés, JA., Elorza, AA., Molina, A., Björnsson, BT. Nutritional status modulates plasma leptin, AMPK and TOR activation, and mitochondrial biogenesis: Implications for cell metabolism and growth in skeletal muscle of the fine flounder. General and Comparative Endocrinology 186, 172–180. 2013 Glass, DJ. Signalling pathways that mediate skeletal muscle hypertrophy and atrophy. Nature Cell Biology, vol. 5. 2003 Gomes, MD., Lecker, SH., R. Jagoe, T., Navon, A., Goldberg, AL. Atrogin-1, a muscle- specific F-box protein highly expressed during muscle atrophy. 14440–14445. PNAS, vol. 98, no. 25. 2001. 17 Guo, H., Ingolia, NT., Weissman, JS., Bartel, DP., Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature, 466(7308): 835–840. 2010 Hagen, O., Fernandes, JMO., Solberg, C., Johnston, IA. Expression of growth-related genes in muscle during fasting and refeeding of juvenile Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus L. Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 152, 47–53. 2009 Jia L., Li YF., Wu GF., Song ZY., Lu, HZ., Song CC., Zhang QL., Zhu JY., Yang GS., Shi XE. MiRNA-199a-3p regulates C2C12 myoblast differentiation through IGF- 1/AKT/mTOR signal pathway. Int. J. Mol. Sci., 15, 296-308. 2014 Johnston, I.A., Bower, NI., Macqueen, DJ. Growth and the regulation of myotomal muscle mass in teleost fish. The Journal of Experimental Biology. v. 214, p. 1617-1628. 2011 Johnston, IA., Davison, W., Goldspink, G. Energy metabolism of carp swimming muscles. J. Comp. Physiol. 114, 203-216. 1977 Johnston, IA. Quantitative Analysis of Muscle Breakdown During Starvation in the Marine Flatfish Pleuronectes platessa. Cell Tissue Res, 214:369-386.1981 Livak, K.J., Schmittgen, T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCt method. Methods. v. 25(4), p. 402-408. 2001. Mareco, EA., Garcia de la Serrana, D., Johnston, IA., Dal-Pai-Silva, M.. Characterization of the transcriptome of fast and slow muscle myotomal fibres in the pacu (Piaractus mesopotamicus). BMC Genomics, 16:182. 2015 Puigserver P, Rhee J, Donovan J, Walkey CJ, Yoon JC, Oriente F, Kitamura, Y., Altomonte, J., Dong, H., Accili. D., Spiegelman, BM. Insulin-regulated hepatic gluconeogenesis through FOXO1-PGC-1alpha interaction. Nature; 423:550–5. 2003 Safdar A, Abadi A, Akhtar M, Hettinga BP, Tarnopolsky MA. miRNA in the Regulation of Skeletal Muscle Adaptation to Acute Endurance Exercise in C57Bl/6J Male Mice. PLoS ONE 4(5). 2009 Sänger, A.M., Stoiber, W. Muscle fiber diversity and plasticity In: Johnston, I.A. (Ed.), Muscle Development and Growth. Academic Press London, pp. 187-250. 2001 Schiaffino, S., Dyar, K., Ciciliot, S., Blaauw, B., Sandri. M. Mechanisms regulating skeletal muscle growth and atrophy. FEBS J.; 280:4294–314. 2013. Seiliez, I., Panserat, S., Skiba-Cassy, S., Fricot, A., Vachot, C., Kaushik, S., Tesseraud, S. Feeding status regulates the polyubiquitination step of the ubiquitin – proteasome -dependent proteolysis in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) muscle. J. Nutr. 138, 487–491. 2008b Stark, A., Brennecke, J., Bushati, N., Russell, RB., Cohen, SM. Animal MicroRNAs Confer Robustness to Gene Expression and Have a Significant Impact on 3'UTR Evolution. Cell 123, 1133–1146. 2005 Valente, LM., Bower, NI.; Johnston, IA. Postprandial expression of growth-related genes in Atlantic salmon (Salmo salar L.) juveniles fasted for 1 week and fed a single meal to satiation. British Journal of Nutrition 108, 2148–2157. 2012. 18 van Rooij, E., Liu, N., Olson, EN. MicroRNAs flex their muscles. Trends in Genetics Vol.24, No.4. 2008 Vivanco, I., Sawyers, CL. The phosphatidylinositol 3-Kinase AKT pathway in human cancer. Nature Rev. Cancer 2, 489–501. 2002. Wada, S., Kato, Y., Okutsu, M., Miyaki, S., Suzuki, K., Yan, Z., Schiaffino, S., Asahara, H., Ushida, T., Akimoto, T. Translational Suppression of Atrophic Regulators by MicroRNA-23a Integrates Resistance to Skeletal Muscle Atrophy. The Journal of Biological Chemistry, 286(44), 38456–38465. 2011 Wang, XH. MicroRNA in myogenesis and muscle atrophy. Curr Opin Clin Nutr Metab Care.; 16(3): 258–266. 2013. Weatherley, AH., Gill, HS. Dynamics of increase in muscle fibers in fishes in relation to size and growth. Experientia 41: 353-354.1985 Witt, S. H., Granzier, H., Witt, C. C. and Labeit, S. MURF-1 and MURF-2 target a specific sub-set of myofibrillar proteins redundantly: towards understanding MURF- dependent ubiquitination. J. Mol. Biol. 350, 713-722. 2005 Wu, Z., Puigserver, P., Andersson, U., Zhang, C., Adelmant, G., Mootha, V., Troy, A., Cinti, S., Lowell, B., Scarpulla, RC., Spiegelman, BM. Mechanisms Controlling Mitochondrial Biogenesis and Respiration through the Thermogenic Coactivator PGC- 1. Cell, Vol. 98, 115–124. 1999. Yan, B., Zhu, C.D., Guo, J.T., Zhao, L.H., Zhao, J.L. miR-206 regulates the growth of the teleost tilapia (Oreochromis niloticus) through the modulation of IGF-1 gene expression. The Journal of Experimental Biology 1, 216:1265-9. 2013 Zar J. H. Biostatistical analysis. Editora prentice – Hall: New Jersey, 5rd ed. 2009. Zhu X, Chen D, Hu Y, Wu P, Wang K, Zhang J, Chu W, Zhang J. The microRNA Signature in Response to Nutrient Restriction and Refeeding in Skeletal Muscle of Chinese Perch (Siniperca chuatsi). Mar Biotechnol 17:180–189. 2015