RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 18/12/2020. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Ciências Farmacêuticas Efeito do consumo diário de suco de laranja sobre a microbiota intestinal, composição corporal e perfil lipídico e glicídico de mulheres Melaine Priscila Fidélix Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Alimentos e Nutrição para obtenção do título de Doutor em Alimentos e Nutrição. Área de Concentração: Ciências Nutricionais Orientadora: Profa. Dra. Thaís Borges César Araraquara 2018 Efeito do consumo diário de suco de laranja sobre a microbiota intestinal, composição corporal e perfil lipídico e glicídico de mulheres Melaine Priscila Fidélix Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Alimentos e Nutrição para obtenção do título de Doutor em Alimentos e Nutrição. Área de Concentração: Ciências Nutricionais Orientadora: Profa. Dra. Thaís Borges César Araraquara 2018 Dedico Àqueles que me inspiraram a fazer esta tese, mas que jamais a lerão. AGRADECIMENTOS PESSOAIS À Deus, pela dádiva da vida, luz e força para vencer a todos os desafios. Aos meus pais, Valdecy e Idalina, que me criaram com muito amor e carinho e foram meus maiores exemplos. A vocês minha eterna gratidão, que vai além dos meus sentimentos. À minha tia Elaine, com muito carinho, pela paciência, apoio e contribuição para minha formação. Você foi e sempre será meu maior exemplo na área acadêmica. Aos meus familiares, por me ajudarem, direta ou indiretamente, nesta etapa. Em especial ao meu irmão Francis e minha cunhada Ana Paula, pela compreensão e apoio, além de me presentearem com o sorriso que é a alegria dos meus dias, meu sobrinho Raul. Ao meu namorado Kayque, que jamais me negou apoio, carinho e incentivo. Obrigada Mozão por aguentar tantas crises de estresse e ansiedade e compreender minha ausência pelo tempo dedicado aos estudos. Às amigas do Laboratório de Nutrição/DAN: Paula, Carolina, Renata, Fernanda, Olívia, Beatriz, Marina e Marília. Fоі com vocês que aprendi а refletir, duvidar е nunca encarar а realidade como pronta. А experiência dе υmа produção compartilhada cоm amigos foi а melhor experiência dа minha formação acadêmica. Uma vez Laranjete, sempre Laranjete! Às minhas amigas irmãs: Mariana Mara, Mariana Donda e Pâmela pеlаs alegrias, tristezas е dores compartilhas. Cоm vocês, аs pausas para “Os Encontros” entre υm parágrafo е outro dе produção melhorou tudo о qυе tenho produzido nа vida. À todos aqueles qυе dе alguma forma estiveram е estão próximos dе mim, fazendo esta vida valer cada vеz mais а pena! AGRADECIMENTOS À minha orientadora Profa. Dra. Thais Borges Cesar pela orientação, dedicação, paciência, amizade e acima de tudo pela confiança. À Profa. Dra. Katia Sivieri pela inestimável colaboração desde o planejamento até a análise de dados e discussão. Sem sua cooperação os achados sobre a microbiota não seriam possíveis. À Mestre Ana Carolina Delgado Lima pelo companheirismo e auxílio durante a execução deste projeto. À técnica do Laboratório de Nutrição/DAN, Danielli e a companheira de laboratório Paula, pela preciosa contribuição na execução da fase experimental. À secretária do Departamento de Alimentos e Nutrição/DAN Renata pelo suporte e atenção. À Citrosuco S/A, pelo apoio à esta pesquisa, representada pelo Sr. Helton Leão. Às voluntárias, pela disposição e generosidade. À equipe do Laboratório de Análises Clínicas São Lucas, em especial ao Sérgio Valadão, pelo suporte durante a coleta das amostras biológicas. Ao Professor PhD Dragan Milenkovic da UC Davis School of Medicine pela parceria na realização das análises de sequenciamento do gene RNAr 16S. Aos professores integrantes da comissão examinadora pelas valiosas sugestões ao trabalho. Às funcionárias da Pós-graduação e da Biblioteca pela atenção e competência. À Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP pela oportunidade. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. “Agradeço todas as dificuldades que enfrentei; não fosse por elas, eu não teria saído do lugar. As facilidades nos impedem de caminhar. Mesmo as críticas nos auxiliam muito” Chico Xavier viii Resumo Introdução: Aos compostos do suco de laranja 100% puro (SL) são atribuídos várias propriedades biológicas, como atividade antioxidante, anti- hipertensiva, redutora do colesterol e glicemia sanguíneos, e atualmente estudos in vitro têm mostrado que o suco de laranja pode ter ação seletiva sob a microbiota intestinal. Objetivo: Investigar o impacto do consumo diário de suco de laranja sobre a microbiota intestinal e no perfil glicídico e lipídico em mulheres. Métodos: Foram avaliadas 10 mulheres por período de 120 dias, distribuídos em três etapas: (1ª): dieta livre de citrus 30º dia (30 dias); (2ª) ingestão de 300 mL/dia de SL 90º dia (60 dias); (3ª) dieta livre de citrus 120º dia (30 dias). Avaliação dietética e antropometria foram realizadas quinzenalmente durante o período experimental. Foram colhidas amostras de sangue, urina e fezes, no início do estudo e a cada 30 dias, até o final do experimento. Foi realizado: analise dos parâmetros bioquímicos; identificação dos metabólitos urinários por UHPLC-UV-VIS; e análise da composição da microbiota por sequenciamento de gene RNAr 16S. Resultados: A avaliação da composição corporal e a excreção urinária não mostraram alterações durante as etapas experimentais. Os parâmetros bioquímicos mostraram diminuição da glicose (-6,25%), da insulina (-32,7%) e da resistência à insulina (-43,8%), além do colesterol total (-13,9%), LDL (- 16%) e triglicerídeos (-30%) com a ingestão de SL (90º dia). Após a parada do consumo de SL (120º dia), os parâmetros bioquímicos retornaram aos valores inicias. Foi observado um aumento dos filos Actinobacteria, bem como diminuição dos Firmicutes, Bacteroidetes e Proteobacteria após o consumo de SL (90º dia). As famílias Bifidobacterium, Lactobacillaceae e Streptococcaceae apresentaram aumento após o consumo de SL. Houve correlação positiva entre Bacteroidaceae, Porphyromonadaceae, Prevotellaceae, Ruminococcaceae e Enterobacteriaceae com glicose, colesterol total, triglicérides, LDL-C, insulina e HOMA-IR, e uma correlação negativa com o HDL-C. Bifidobacterium, Coriobacteriaceae, Lachnospiraceae e Lactobacillaceae tiverão correlação negativa com glicose, colesterol total, triglicerídeos, LDL-C, insulina e HOMA-IR, e correlação positiva com HDL-C. Conclusão: O suco de laranja mostrou efeito modulador positivo sobre a microbiota intestinal e no perfil glicídico e lipídico de mulheres. Palavras-chave: Prebioticos, Microbiota Intestinal, Suco de Laranja 100% puro, Marcadores Metabólicos, Composição Corporal. ix Abstract Introduction: 100% pure orange juice (OJ) compounds are assigned to various biological properties, such as antioxidant, antihypertensive, blood cholesterol lowering and glycemia activity. Currently, in vitro studies have shown that orange juice can present selective action of intestinal microbiota. Objective: To investigate the impact of daily consumption of orange juice on the intestinal microbiota and on the lipid and glucose profile in women. Methods: Ten women were evaluated for 120 days at three differen stages: (1st) citrus-free diet 30th day (30 days); (2nd) intake of 300 mL / day SL 90th day (60 days); (3rd) citrus-free diet 120th day (30 days). Dietary assessment and anthropometry were performed biweekly during the experimental stages. Samples of blood, urine and feces were taken at the beginning of the study, and every 30 days until the end of the experiment. It was carried out: analysis of the biochemical parameters; identification of urinary metabolites by UHPLC-UV-VIS; and analysis of the composition of the microbiota by 16S rRNA gene sequencing. Results: Changes during the experimental stages were not found in evaluation of body composition and urinary excretion. Biochemical parameters showed a decrease in glucose (-6.25%), insulin (- 32.7%) and insulin resistance (-43.8%), total cholesterol (-13.9%), LDL (- 16%) and triglycerides (-30%) with ingestion of OJ (90th day). After stopping OJ intake (120th day), the biochemical parameters returned to the initial values. An increase of Actinobacteria phyla, as well as a decrease of Firmicutes, Bacteroidetes and Proteobacteria after consumption of OJ (90th day) were observed. The families Bifidobacterium, Lactobacillaceae and Streptococcaceae showed an increase after consumption of OJ. There was a positive correlation between Bacteroidaceae, Porphyromonadaceae, Prevotellaceae, Ruminococcaceae and Enterobacteriaceae with glucose, total cholesterol, triglycerides, LDL-C, insulin and HOMA-IR, and a negative correlation with HDL-C. Bifidobacterium, Coriobacteriaceae, Lachnospiraceae and Lactobacillaceae will have negative correlation with glucose, total cholesterol, triglycerides, LDL-C, insulin and HOMA-IR, and a positive correlation with HDL-C. Conclusion: Orange juice showed a positive modulating effect on the intestinal microbiota and on glucose and lipid profile of women. Key words: Prebiotic, Intestinal Microbiota, 100% pure Orange Juice, Metabolic biomarkers, Body Composition x Lista de Tabelas Página Capítulo 1. Table 1. Baseline characteristics of female volunteers: body composition, metabolic biomarkers, and urinary flavanones (n=10) 65 Table 2A. Nutritional and physicochemical composition in 300 mL of commercial processed orange juice 66 Table 2B. Flavanones in the pellets and supernatant fractions in 300 mL of commercial processed orange juice 66 Table 3. Body composition and metabolic biomarkers of women during clinical trial with citrus-free diet and orange juice supplemented diet (n=10) 67 Table 4. Intake of energy, macronutrients and micronutrients of women during clinical trial with citrus-free diet and orange juice supplemented diet (n=10) 68 Table 5. Metabolites of hesperitin (HSPT) and naringenin (NRGN) in the urine 24 h of women during clinical trial with citrus-free diet and orange juice supplemented diet (n=10) 69 xi Lista de Figuras Página Introdução Expandida Figura 1. Estrutura básica dos Flavonoides 17 Figura 2. Estrutura molecular dos flavonoides 18 Figura 3. Estruturas glicosiladas das flavanonas 19 Figura 4. Metabolismo das flavanonas adaptado 22 Figura 5. Partes que compõem a laranja 24 Capítulo 1. Figure 1. Trial design 58 Figure 2: Area under the curve (AUC) and maximum concentration (Cmax) of the glycemic and insulin curves at before and after 60 days of consumption of 100% orange juice (300 mL/d) * p 0.01 (Citrus-free: 30th x Trial with Orange Juice: 90th) (n=10) 59 Figure 3: Principle coordinate analyses of the intestinal microbiota of healthy women at before and after 60 days of consumption of 100% orange juice (300 mL/d) (Citrus-free: 30th x Trial with Orange Juice: 90th) (n=10) 60 Figure 4: The main bacterial phylum determined in the microbiota from health women at before and after 60 days of consumption of 100% orange juice (300 mL/d) (Citrus-free: 30th x Trial with Orange Juice: 90th) (n=10) 61 Figure 5: Microbiota composition at a family level before and after 60 days of consumption of 100% orange juice (300 mL/d) (Citrus-free: 30th x Trial with Orange Juice: 90th) (n=10) 62 Figure 6: Relative abundance of bacterial genera in the women microbiota before and after 60 days of consumption of 100% orange juice (300 mL/d) (Citrus-free: 30th x Trial with Orange Juice: 90th) (n=10) 63 Figure 7: Correlation between biochemical parameters and bacterial genera. Significant correlations are indicated by asterisk (p < 0.05) (Spearman correlation) (n=10) 64 Sumário Página Resumo viii Abstract ix Lista de Tabelas x Lista de Figuras xi Introdução 13 Capítulo 1. Daily consumption of orange juice causes modulation of intestinal microbiota and affects the levels of blood glucose blood glucose and lipids of women: controlled clinical trial 30 Abstract 31 Introduction 32 Materials and Methods 34 Results 41 Discussion/Conclusion 45 References 51 Considerações Finais 70 Referências 71 Apêndices A – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido 78 Apêndice B – Questionário de seleção 80 Apêndice C – Modelo de registro alimentar 82 Apêndice D – Questionário de frequência alimentar 84 Anexo A – Parecer de aprovação do Comitê de Ética 87 Anexo B – Parecer ClinicalTrials 88 13 Introdução Expandida Microbiota O corpo humano é um ecossistema que sustenta trilhões de microrganismos que vivem principalmente, embora não exclusivamente, dentro do trato gastrointestinal(1). O trato gastrointestinal humano é um ecossistema muito complexo, no qual a microbiota intestinal interage com células hospedeiras e componentes alimentares(2). O estômago e o intestino delgado apresentam um ambiente desfavorável para a colonização de bactérias devido a ação bactericida do suco gástrico. Enquanto isso, na região do cólon as bactérias encontram condições favoráveis para a sua proliferação, decorrente do abundante suprimento nutricional e ausência de secreções(3,4). Estima-se que o trato gastrointestinal seja habitado por 1011 células por mL de conteúdo luminal, compreendendo cerca de 400 a 500 espécies bacterianas(5). Nos indivíduos saudáveis as bactérias são encontradas de forma heterogênea em todo o trato gastrointestinal. Este é composto por bactérias anaeróbias estritas, que superam as bactérias anaeróbias e aeróbicas facultativas(6). Embora mais de 100 filos bacterianos tenham sido descritos, os principais filos encontrados são Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria e Actinobacteria(7). Entretanto, a microbiota intestinal do adulto é dominada por dois filos: Bacteroidetes e Firmicutes(2,8). Durante muitos anos acreditou-se que o bebê era estéril ao nascimento e que a colonização microbiana do intestino começava imediatamente após o nascimento(9). No entanto, estudos recentes mostram que a colonização pode começar antes do nascimento com colonização microbiana na placenta, no 14 fluido amniótico e no cordão umbilical(10). Além disso, outros fatores contribuem para a colonização intestinal precoce, como a idade gestacional ao nascimento e o tipo de parto(9,10). No parto vaginal normal, a microbiota vaginal desempenha um papel fundamental na colonização do bebê ao nascer(11), no qual anaeróbios facultativos, como enterobactérias, enterococos e lactobacilos são os primeiros colonizadores(12). Outra grande influência na microbiota neonatal é a dieta infantil, pois lactentes alimentados no peito têm microbiota enriquecida em Lactobacillus , Staphylococcus e Bifidobacterium, em contrapartida, os bebês alimentados com fórmula têm microbiota dominada por Roseburia , Clostridium , e Anaerostipes(10). Alguns estudos sugerem que a microbiota intestinal atinge composição relativamente estável e semelhante aos adultos, por volta dos 3 anos de idade(12-14), enquanto outros estudos demonstram que o desenvolvimento é contínuo desde a infância até a adolescência(15-17). Além disso, novas alterações aparecem na senescência, diferindo a microbiota de idosos da microbiota central e dos níveis de diversidade de adultos mais jovens(13,14). A composição da microbiota intestinal é influenciada por fatores intrínsecos (fatores genéticos e imunológicos) e extrínsecos (uso medicamentos, dieta e estilo de vida)(5,6). A microbiota é responsável por proteger a mucosa intestinal contra microrganismos patógenos, modular o sistema imunológico, sintetizar algumas vitaminas, degradar os componentes não digeríveis da dieta e produzir metabólitos, tais como os ácidos graxos de cadeia curta, que são as principais fontes de energia para os colonócitos(18-21). Para assegurar esses benefícios à saúde do hospedeiro, a microbiota deve https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/amnion-fluid https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/gestational-age https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/breast-milk https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/lactobacillus https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/bifidobacterium https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/roseburia https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/clostridium 15 permanecer em homeostase, ou seja, em equilíbrio entre as bactérias comensais e patogênicas(22). Como já citado, o metabolismo e a composição da microbiota podem ser influenciados pela dieta(5,18-20,22-24). A ingestão de microrganismos probióticos, ingredientes prebioticos ou combinações simbióticas está fortemente relacionada com a modulação da microbiota intestinal(5,18-20,22-25). Como prebioticos entende-se como um substrato que é utilizado seletivamente por microrganismos hospedeiros conferindo benefício à saúde. A seletividade não significa necessariamente efeitos em apenas um grupo microbiano; pode se estender a vários grupos microbianos, mas não a todos. Além disso, os microrganismos afetados e os metabólitos produzidos estão associados à efeitos fisiológicos, tais como inibição de patógenos, estimulação imunológica, redução dos níveis lipídicos no sangue, produção de metabolitos que influenciam a função cerebral, energética e cognição, biodisponibilidade mineral, entre outros(26). Um dos componentes dietéticos prebióticos, capazes de modificar microbiota intestinal, são as fibras alimentares. Isso porque, as fibras provenientes da dieta são compostas, principalmente, por polissacarídeos e em menor parte por oligossacarídeos que não são digeridos pelas enzimas intrínsecas do estômago e do intestino humano. Por isso, grande parte das fibras que passam pelo trato gastrointestinal é degradada pela microbiota intestinal, ocorrendo a formação e liberação de ácidos graxos de cadeia curta (ácido acético, ácido propiônico e ácido butírico) como produto do metabolismo microbiano(26,27). 16 Ainda, estudos sugerem que alimentos ricos em compostos fenólicos também podem atender aos critérios de prebióticos, tendo um impacto significativo sobre a microbiota intestinal, uma vez que grande parte (90-95%) dos polifenóis da dieta não são absorvidos no intestino delgado(26,28-30). As bactérias presentes no cólon atuam na bioconversão destes compostos, dando origem a uma variedade de metabólitos bioativos, entre estes, os ácidos graxos de cadeia curta, que promovem a manutenção da homeostase intestinal(31). Os ácidos graxos de cadeia curta exercem funções no metabolismo humano. Estão relacionados à síntese dos ácidos graxos de cadeia longa (lipogênese), cetogênese (síntese de corpos cetônicos), inibição da síntese de colesterol e atuam como substrato para a via de formação do piruvato da gliconeogênese. Além de serem uma das principais fontes de energia para os colonócitos (mucosa intestinal), os quais estimulam a proliferação celular do epitélio e intensificam a absorção de sódio e água(26,32-36). Compostos Fenólicos Compostos fenólicos são substâncias amplamente distribuídas na natureza com mais de 8.000 compostos polifenólicos já identificados em plantas, incluindo flavonoides, álcoois fenólicos, lignanas, estilbenos e ácidos fenólicos(37,38). Podem ser pigmentos, que dão a aparência colorida aos alimentos, ou produtos do metabolismo secundário, normalmente derivados de reações de defesa das plantas contra agressões por radiação ultravioleta, radicais livres e agentes patogênicos(37,39,40). De acordo com estudos epidemiológicos quando ingeridos, esses compostos exercem proteção ao organismo humano contra algumas doenças(39,41). 17 Os principais polifenóis encontrados na dieta humana são os ácidos fenólicos e os flavonoides, os quais representam aproximadamente 2/3 e 1/3 do total da ingestão diária de polifenóis, respectivamente(42,43). Os flavonoides compõem um grupo de polifenóis com estrutura básica comum compreendendo 15 átomos de carbono (C6-C3-C6) no seu núcleo fundamental, com dois anéis aromáticos (anel A e B) unidos por uma cadeia de três átomos de carbono, que pode ou não formar um terceiro anel (anel C) (Figura 1)(44-46). Figura 1. Estrutura básica dos Flavonoides(46) Uma grande diversidade estrutural ocorre nos flavonoides em função das pequenas modificações químicas ocorridas na estrutura básica destes compostos, que podem ser por meio de hidroxilação, metilação, acilação, glicosilação, hidrogenação, malonilações e sulfatações(47). Com essas derivações os flavonoides dietéticos são classificados em 6 subclasses: flavonóis, flavonas, flavanonas, catequinas, isoflavonas e antocianidinas (Figura 2)(45). 18 Figura 2. Estrutura molecular dos flavonoides(45) Nas frutas cítricas, as flavanonas são a classe mais comum de flavonoides, sendo aproximadamente 95% dos flavonoides totais das frutas. Na laranja as flavanonas estão presentes predominantemente nas formas glicosídicas, naringina e hesperidina; mas também são encontradas nas formas agliconas, naringenina e hesperitina(38,48). A forma glicosídica é caracterizada pela presença de uma cadeia de três carbonos saturados e um átomo de oxigênio no C4, sendo geralmente glicosiladas por um dissacarídeo na posição C7(46). Este dissacarídeo pode ser uma neohesperidose, que confere o sabor 19 amargo, encontrada na naringina em grapefruit, ou uma rutinose, insípida, encontrada na hesperidina em laranjas(43). As flavanonas contém vários glicosídeos, sendo os principais nas laranjas, da hesperidina: hesperitina-7-O-rutinosídeo, hesiperitina-7-O- glicuronídeo; e da naringina: naringenina-7-O-rutinosídeo, naringenina-7-O- glicuronídeo, naringenina-4-O-glicuronídeo(46,49,50) (Figura 3). Figura 3. Estruturas glicosiladas das flavanonas(50) A composição das flavanonas na laranja varia de acordo com a parte do fruto, sendo que as partes sólidas da fruta, como o albedo (parte branca) e as membranas que separam os segmentos, são os mais ricos em flavanonas, em comparação com as vesículas de suco (polpa). Além disso, os estágios de maturidade e pós-colheita também afeta os níveis de flavonoides cítricos(50-52). 20 Metabolismo e Biodisponibilidade das Flavanonas A garantia da eficácia biológica das flavanonas depende de serem absorvidas e metabolizadas, e terem os metabólitos bioativos distribuídos aos tecidos sensíveis à sua ação(53). Do ponto de vista nutricional, a biodisponibilidade representa os efeitos gerais da absorção, distribuição, metabolismo e excreção de um nutriente presente nos alimentos(52). As flavanonas são resistentes ao suco gástrico do estômago, sendo absorvidas no trato gastrointestinal após extensiva metabolização por enzimas intestinais e hepáticas e deglicosilação por enzimas de bactérias intestinais, desde o intestino delgado e terminando no intestino grosso(39,54,55). Além disso, alguns fatores podem interferir na absorção das flavanonas, entre os quais está a composição química, pois a molécula de glicose é um dos principais determinantes do local de absorção e da biodisponibilidade dos flavonoides, sendo reconhecido que a biodisponibilidade dos monoglicosídeos de flavonoides é muito maior do que os rutinosídeos(56-58). Este comportamento se deve ao intestino delgado humano conter β-glicosidases capazes de hidrolisar glicosídeos de flavanonas, mas não rutinosídeos (ramnoglucósidos), que precisam alcançar o cólon e serem expostos a α-ramnosidase provenientes de algumas das bactérias residentes(59). Primeiramente, após a ingestão do suco de laranja, por exemplo, os monoglicosídeos de flavanonas são absorvidos no intestino delgado após hidrólise pela lactase-florizina hidrolase, e então, a aglicona livre, por ser hidrofóbica, difunde-se através das células epiteliais por transporte passivo ou por difusão facilitada(60,61). Porém, algumas flavanonas conjugadas à glicose podem ser absorvidas através do transportador de glicose sódio dependende 21 (SGLT1) para o interior do enterócito e deglicosiladas pelas β-glicosidases presentes intracelularmente. Ambas as vias de absorção originam agliconas intracelulares que, posteriormente, são metabolizadas em conjugados glicurônicos ou sulfatados e liberados na corrente sanguínea(58,60). Entretanto, a maior parte dos glicosídeos não são hidrolisados ou não apresentam afinidade pela SGLT1, tais como os rutinosídeos. Estes são transportados na forma intacta em direção ao cólon, onde são hidrolisados pela α-ramnosidase, produzida pela microbiota do local, liberando a forma aglicona, que pode então ser absorvida pelo intestino(28,58,61,62). No intestino delgado e no epitélio do cólon, os flavonoides poderão sofrer reações de conjugação, como a glicuronidação e a metilação(28,63,64). Uma vez absorvidas, as flavanonas são conduzidas ao fígado pela circulação entero-hepática ligadas à albumina ou via linfática, onde sofrerão outras biotransformações envolvendo reações de fase I (oxidação, redução, hidrólise) e, principalmente, reações de fase II (metilação, sulfatação e glicuronidação), formando metabólitos com ácidos glicurônicos através da UDP- glicuronosiltransferases (UGTs) e grupos sulfatos por meio das sulfotransferases (SULTs)(28,38,63). A glicuronidação e a sulfatação são especialmente importantes porque aumentam substancialmente o peso molecular e a solubilidade do composto original para que possa ser eliminado através da urina ou da bile(24,65-60). Por fim, esses metabólitos conjugados aos glicuronídeos e sulfoglicuronídeos tanto irão para a corrente sanguínea e exercer a função sistêmica, quanto serão excretados pela bile e/ou urina, dependendo do metabólito formado (Figura 4)(28,69). Os compostos não absorvidos, bem como 22 aqueles excretados juntamente com a bile no lúmen intestinal, seguem para o cólon onde serão catabolizados pela microbiota, produzindo uma variedade de compostos fenólicos de baixo peso molecular(70-72). Figura 4. Metabolismo das flavanonas adaptado(28) 23 Devido a via de absorção distinta das flavanonas, a meia vida desses compostos também é diferente. A concentração sanguínea máxima dos compostos produzidos no cólon tem sido captada em média 6 h após a ingestão do suco de laranja(58,69,73). Em contraste, os compostos absorvidos no intestino delgado, local onde a absorção ocorre mais rapidamente, a meia vida é de aproximadamente 1 h(58). A excreção urinária das flavanonas ocorre principalmente durante as 24 h após a ingestão com um pico entre 6 a 12 h. Estudos anteriores sugerem, no entanto, que é suficiente a coleta de urina em um único dia, porque a variação diária no nível individual é limitada(74). Após o consumo de suco de laranja, a excreção relativa urinária de hesperitina pode variar de 1,7 até 8,1%(50,59,70,73,75-79). A excreção de naringenina após o consumo de suco de laranja é encontrada entre 0,7 até 20,3% da ingestão(50,59,70,73,75-79). A excreção fecal das flavanonas é bem citada em estudos experimentais e in vitro. Parte das flavanonas são excretadas na forma inalterada, sendo estimado 33% para hesperitina e 15% para hesperidina. Além disso, também é encontrado nas fezes a naringina, naringenina e naringenina glicuronídeo. Adicionalmente, nas fezes humanas, devido a extensa metabolização da microbiota, são encontrados os catabólitos fenólicos capazes de elevar a recuperação das flavanonas a 100%(70,71,78,80). Laranja e Suco de Laranja A laranja é uma das frutas mais cultivadas em todo o mundo, produzida pela laranjeira (Citrus x sinensis), uma árvore da família Rutaceae de porte médio e copa densa, arredondada e perene. Essencialmente, a laranja é composta por diversas vesículas de suco protegidas por uma película de cera, 24 a casca (Figura 5). É na casca (flavedo) que estão as substâncias responsáveis pelo aroma e pela cor da fruta. Já a parte comestível é composta por segmentos que possuem vesículas de suco e pela parte sólida que é fonte de fibras e compostos bioativos (membranas e albedo), além de sementes(81,82). Existem mais de 100 variedades de laranjas cultivadas pelo mundo. No Brasil, as mais comuns são as laranjas Bahia, Pêra, Rubi e Valência(81). Figura 5. Partes que compõem a laranja(82) Originada na Ásia, provavelmente na China, por volta de 4.000 anos, a laranja foi trazida para as Américas pelos exploradores no final dos anos 1400 e início de 1500. No Brasil, as mudas de laranjeiras foram introduzidas durante o período da colonização e com o tempo, a citricultura destacou-se em vários estados. Posteriormente, em Araraquara no ano de 1950, estendendo-se ao norte e noroeste do Estado de São Paulo(83). 25 Atualmente, o país responde por 34% da laranja e 56% do suco produzido em todo o mundo, considerando a média das últimas cinco safras, sendo 97% dessa produção destinada à exportação. Ainda, o Brasil é responsável por 76% de participação no comércio mundial de suco de laranja, consolidando-se como o mais importante fornecedor global desse produto(84). Entretanto o consumo de laranja no Brasil, identificado pela POF 2008-2009(85), é bem menos que uma laranja por dia. Enquanto uma laranja média tem 180 g(86), o consumo médio encontrado foi de 20 g/d(85). Em adição, o consumo de suco de laranja no Brasil, saiu de 42 mil toneladas de Suco Concentrado Congelado (FCOJ, sigla em inglês), equivalente a 66º Brix em 2003, para 69 mil toneladas em 2016(84). Porém, nosso consumo ainda é baixo se comparado, por exemplo, com os Estados Unidos, que apresentou um consumo de 624 mil toneladas de FCOJ equivalente a 66º Brix em 2016(84). Na fabricação do suco de laranja existem diferentes processos de extração e processamento do suco, e estes influenciam na concentração dos nutrientes e nas quantidades dos flavonoides(51,75). Entre os sucos de laranja prontos para o consumo encontra-se o NFC, do termo inglês “non-frozen concentrated”. É um suco pasteurizado que não passou pelo processo de concentração ou diluição durante a produção, e ainda, não é acrescido de açúcares. Além disso, em termos de sabor é o que mais se assemelha ao suco fresco, segundo o consumidor brasileiro(81). O suco de laranja fresco apresenta maiores quantidades de vitamina C e ácido fólico, aproximadamente 125 mg e 76 μg, respectivamente, enquanto que os sucos pasteurizados apresentaram 86 mg de vitamina C e 46 μg de folato. Por outro lado, os sucos integrais e industrialmente pasteurizados apresentam 26 aproximadamente o dobro da quantidade de flavonoides cítricos quando comparados ao suco fresco(51). Isso porque, no processo de extração do suco, são usadas também as partes sólidas das laranjas, tendo maior aproveitamento do fruto(81). Efeitos Benéficos do Suco de Laranja Estudos anteriores de suplementação com suco de laranja, ou com flavanonas na forma isolada, tem demonstrado várias propriedades de proteção à saúde. As ações são relatadas como: antioxidantes, hipolipidêmicas, anti-hipertensivas e anti-inflamatórias(87-91). Estudo crossover com 16 indivíduos (homens e mulheres) mostrou que placebo com hesperidina e suco de laranja, aumentou significativamente a capacidade antioxidante no soro sanguíneo. Evidenciando que os compostos fenólicos da laranja contribuem diretamente para a proteção oxidativa pós- prandial, que é um importante contribuinte para o desenvolvimento de doenças crônicas(88). Pesquisa que comparou o perfil lipídico de homens e mulheres que consumiam suco de laranja por pelo menos 12 meses a indivíduos não consumidores, encontrou concentrações de colesterol total, LDL-c, ApoB e a razão LDL/HDL significativamente menores nos consumidores de suco de laranja do que nos indivíduos não consumidores. Concluindo, que o consumo de suco de laranja ao longo tempo está associado a baixos fatores de risco para doença cardiovascular(87). Além disso, um estudo com consumo menor (4 semanas) em homens de meia-idade e com excesso de peso, evidenciou a diminuição da pressão arterial diastólica(89). 27 Outro estudo demonstrou que o consumo oral diário durante três semanas de hesperidina melhora a função endotelial, reduz a circulação de biomarcadores da inflamação e altera favoravelmente o perfil lipídico em indivíduos com síndrome metabólica, mostrando o efeito anti-inflamatório da hesperidina isolada(90). Pacientes com hepatite C sob terapia antiviral que beberam 500 mL de suco de laranja diariamente por 8 semanas tiveram uma melhora da capacidade antioxidante, perfil lipídico, marcadores inflamatórios do fígado e nível de aspartato transaminases, quando comparados aos pacientes nas mesmas condições, mas que não consumiam suco de laranja. Os resultados indicam que o suco de laranja é um alimento adequado para pacientes com hepatite C crônica, com a vantagem da falta de toxicidade e alta oferta de antioxidante dietético(91). Interações entre Suco de Laranja e Microbiota Intestinal Evidências de estudos em humanos tem mostrado que alguns compostos fenólicos podem contribuir para a manutenção da saúde intestinal, preservando o equilíbrio microbiano através da estimulação do crescimento de bactérias benéficas e inibição de bactérias patogênicas, exercendo efeitos prebióticos(28,29,92). Estudo in vitro mostrou o potencial envolvimento da microbiota colônica na biodisponibilidade global dos flavonoides do suco de laranja. Foi observado aumento na quantidade de catabólitos através da produção de ácidos fenilpropiônicos e subsequentes conversões hepáticas que levam ao ácido hipúrico e os análogos hidroxilados(93). Além disso, já foi demonstrado 28 o potencial enzimático de Bifidobacterium longum e Lactobacillus rhamnosus. Ambas podem estar envolvidas no catabolismo do cólon das flavononas presente no suco de laranja(94). Ainda, estudo in vitro, demonstrou em Simulador do Ecossistema Microbiano Intestinal Humano (SHIME®) que o suco de laranja teve influência positiva na microbiota humana, sugerindo um efeito prebiótico seletivo deste alimento na mucosa intestinal(95). Estudo in vivo identificou metabólitos da naringina na urina e fezes de ratos e cachorros, além da identificação de ácidos graxos de cadeia curta decorrente da biotransformação da naringina(96). Após suplementação de hesperitina em ratos foi identificado aumento da excreção de ácidos graxos de cadeia curta, além da diminuição da proporção de Clostridium XIVa nas fezes(72). Em humanos, estudo examinou os efeitos de suplementação da Bifidobacterium longum, administrada por via oral e biodisponibilidade de flavanonas. A suplementação do probiótico mostrou efeito positivo, aumentando a biodisponibilidade de flavanonas do suco de laranja(97). Um ensaio clínico recente, com mulheres que consumiram suco de laranja por dois meses, apresentou melhorou do colesterol, da glicose e da sensibilidade à insulina. Além disso, foi observada uma modulação positiva na composição da microbiota e na atividade metabólica, com o aumento de Bifidobacterium spp. e Lactobacillus spp e produção de ácido graxos de cadeia curta(98). Entretanto, as informações disponíveis ainda são limitadas sobre quanto os componentes dietéticos do suco de laranja, podem influenciar a microbiota intestinal. Até o momento, poucos estudos se concentraram nas interações entre ingestão do suco de laranja e microbiota. 29 Dado estas evidências, formulou-se a hipótese de que o consumo de suco de laranja pode melhorar a colonização microbiana, modulando-a beneficamente, além de controlar parâmetros antropométricos e bioquímicos. Com isso, este estudo teve o objetivo de explorar a associação entre a ingestão diária de suco de laranja e microbiota intestinal. Para isso foi avaliado a composição da microbiota intestinal, recuperação urinária das flavanonas e parâmetros nutricionais e bioquímicos, após 60 dias de consumo de suco de laranja em mulheres. 70 Considerações Finais O consumo de 60 dias seguidos de suco de suco de laranja apresentou efeito prebiotico, modulando positivamente a microbiota intestinal. Além de promover uma ação benéfica no controle do perfil glicêmico e lipídico de mulheres. 71 REFERÊNCIAS 1. Sender R, Funchs S, Milo R. 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O trabalho “Influência do efeito prebiótico do suco de laranja na biodisponibilidade das flavanonas após ingestão crônica de suco de laranja” tem por finalidade investigar a biodisponibilidade das flavanonas (compostos bioativos) e seus metabólitos nas fezes, sangue e urina, após a ingestão crônica do suco de laranja; 2. Ao participar desse trabalho ajudarei na identificação de um alimento altamente acessível com efeito prebiótico; 3. Doarei para a realização dessa pesquisa, os seguintes materiais biológicos: sangue, urina e fezes. Será coletado 30 mL de sangue depois de jejum de 12 horas e depois de 2, 4, 8, 24 horas. Isso se repetirá 5 vezes durante o projeto, com intervalo de 30 dias. A coleta de todas as amostras será realizada no Laboratório de Análises Clínicas São Lucas de Araraquara. A urina de 24 horas será coletada, na véspera do início do experimento e a cada 30 dias até a data final. Será fornecido aos voluntários recipientes apropriados para coleta. As fezes totais das últimas 24 horas serão coletadas na véspera do início do experimento e a cada 30 dias até a data final. Sera fornecido aos voluntários recepiente apropriado para coleta. Todos os materiais serão utilizados exclusivamente para essa pesquisa, não podendo ser reutilizado em pesquisa posterior; 4. A minha participação como voluntário terá a duração de 120 dias (4 meses); 5. Ao participar dessa pesquisa poderei ter o incomôdo das coletas de sangue. As coletas de urina e fezes não são invasivas e podem causar algum desconforto; 6. Todas as vezes que houver necessidade de retorno, voltarei ao Laboratório de Análises Clínicas São Lucas de Araraquara para coletas de sangue e no 79 Laboratório de Nutrição (FCFAR – UNESP- Araraquara) para entrega da urina e fezes e retirada do suco; 7. Não terei nenhuma despesa com os exames ou para receber o suco ao participar desse estudo. Receberei lanches e almoço no dia da coleta de sangue e serei ressarcida com o valor do transporte até o laboratório; 8. Meu nome será mantido em sigilo, assegurando assim a minha privacidade e se desejar, serei informado sobre os resultados dessa pesquisa (pela instituição ou profissional competente); 9. Estou ciente de que o material a ser doado será utilizado exclusivamente nesta pesquisa, não podendo ser armazenado para uso posterior sem o meu consentimento; 10. Poderei me recusar a participar ou mesmo retirar meu consentimento a qualquer momento da realização dessa pesquisa, sem nenhum prejuízo ou penalização (isto é, sem interrupção do meu tratamento, quando for o caso); 11. Qualquer dúvida ou solicitação de esclarecimentos, poderei entrar em contato com a equipe científica do projeto: pesquisadora Melaine Priscila Fidélix pelo telefone (0XX16) 3301-6766/99660-9322 no Laboratório de Nutrição da FCFar – UNESP Araraquara; 12. Para notificação de qualquer situação, relacionada com a ética, que não puder ser resolvida pelos pesquisadores deverei entrar em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Farmacêuticas do Câmpus de Araraquara da UNESP, pelo telefone (0XX16) 3301-6897; 13. Este documento será assinado em duas vias, na qual serei portador de uma via e a outra ficará com o pesquisador. Diante dos esclarecimentos prestados, concordo em participar, como voluntária(o), do estudo “Influência do efeito prebiótico do suco de laranja na biodisponibilidade das flavanonas após ingestão crônica de suco de laranja”. Araraquara, ____________________________________ _____________________ _____________________ Assinatura do Voluntário Assinatura do Pesquisador 80 APÊNDICE B - Questionário de seleção Data: ____/____/_____ Nome: ____________________________________________________________________________ Telefone: _______________________ celular: _________________________ Sexo: M ( ) F( ) Profissão: ____________________________ DN ______/______/______ Idade: __________ e-mail: ____________________________________________________________________________ I–Antropometria Peso : __________________ Altura ______________ IMC______________ Obs_______________________________________________________________________ II- História Clínica 1 – Você tem ou teve alguma destas doenças citadas abaixo: ( ) Ataque cardíaco ( ) Derrame ( ) Diabetes ( ) Hipertensão ( ) Câncer ( ) Outras: ___________________________________________________ 2- Alguém da sua família (pai, mãe, irmãos, avós) já teve algumas destas doenças abaixo: ( ) Ataque cardíaco ( ) Hipertensão ( ) Derrame ( ) Câncer ( ) Diabetes ( ) Outras: ___________________________________________________ 3 – Você está atualmente grávida ou amamentando? ( ) Não ( ) Sim (grávida) ( ) Sim (amamentando) 4 - Você faz uso de algum remédio? ( ) Não ( ) Sim. Qual (s): _________________________________________________ 5 - Você fez uso de algum antibiótico nos últimos 6 meses? ( ) Não ( ) Sim. Qual (s): _________________________________________________ 6 – Você fuma ? ( ) Não ( ) Sim. Qual (s): _________________________________________________ Quantos cigarros (ou outro tipo de fumo) por dia? _______________________ 7 – Você consome álcool? 81 ( ) Não ( ) Sim. Qual (s): _________________________________________________ Quantidade por semana: ___________________________________________ 8 - Como é o seu funcionamento intestinal? ( )regular ( )irregular Quantidade por dia/semana: ___________________________________________ II – Informações Dietéticas 8 – Quantos copos de água você bebe diariamente? _______________________________________ 9 – Você está atualmente seguindo alguma dieta? ( ) Não ( ) Sim. Qual tipo: _________________________________________________ ( ) prescrita por profissional de nutrição ou médico ( ) prescrita por você mesmo 10 – Você utiliza alguma forma de suplemento alimentar? (ex: vitaminas, minerais, proteínas, etc.) ( ) Não ( ) Sim. Qual (s): _____________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ 11 – Você utiliza ou utilizou probiótico ou prebiótico nos últimos 3 meses? ( ) Não ( ) Sim. Qual (s): _____________________________________________________________________________ 12- Outras observações importantes sobre sua alimentação. _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ 82 APÊNDICE C - Modelo do registro alimentar Dia [1] [2] [3] – Registro Alimentar 24h Data: ___/___/____ Dia semana: ____________________ Nome:_________________________________________________________ HORARIO/LOCAL REFEIÇÕES ALIMENTOS/QUANTIDADES 83 INSTRUÇÕES PARA REGISTRO ALIMENTAR DE 3 DIAS As instruções abaixo irão auxiliar no procedimento do seu registro alimentar. Siga-as corretamente e releia-as sempre que tiver alguma dúvida. 1. Anote tudo o que você comer em três dias não consecutivos sendo dois dias da semana (exemplo: terça e quinta-feira) e um dia do final de semana (sábado ou domingo); 2. Quando você relatar um alimento ou bebida, seja o mais claro e preciso possível. Anote tudo no momento em que estiver comendo. Evite reconstruir as refeições de memorias, não deixe para anotar depois que tiver acabado de comer. Coloque a marca do produto se for o caso; 3. Registre todos os alimentos que ingerir durante o dia inteiro, até mesmo uma bala, chicletes, etc. exceto água; 4. Forneça o máximo de informações como, por exemplo, se na preparação foi utilizado molho (creme de leite, molho de tomate, molho branco, etc), se a carne é a milanesa, assada ou frita. Indique se os legumes e verduras são cozidos ou crus, servidos com margarina, manteiga, azeite, etc; 5. Informe com precisão, sempre que possível, o volume dos líquidos e peso de alimentos. Informe a colher utilizada nas medidas: café, chá, sobremesa, sopa, de servir, escumadeira e concha e se estas eram cheias ou rasas. Tente descrever bem as porções: a. - 1 coxa média de frango, fruta com pele. b. - 4 colheres de sopa de cenoura crua ralada. 6. Coloque o tamanho dos alimentos caso não saiba o peso (pequeno, médio, grande). Por exemplo: uma maçã pequena, uma pera grande, uma fatia média de abacaxi. 7. Informe o tipo de pão que você costuma comer (forma, francês, branco, integral, de leite etc). Anote tudo o que foi utilizado no pão (manteiga, margarina, geléia, requeijão, queijo, etc.). 8. Anote todos os ingredientes utilizados para adoçar alguma refeição como, por exemplo, açúcar ou adoçante no café. 9. Informe o tipo de leite que você costuma comer (integral, desnatado, semidesnatado, de soja, etc.). 84 APÊNDICE D – Questionário de frequência alimentar Produtos Quantas vezes você come (de 0 a 10) Unidade (Dia, Semana, Mês) Porção Média (M) Sua porção P M G GG Leites e derivados Leite desnatado ½ copo de requeijão – 125 ml Leite semidesnatado ½ copo de requeijão – 125 ml Leite integral ½ copo de requeijão – 125 ml Iogurte Natural 1 unidade pequena – 140 g Iogurte com Frutas 1 unidade pequena – 140 g Queijo branco (minas/ frescal/ricota) 1 fatia média - 30 g Queijo amarelo (prato/mussarela/provolone/parmesão) 1,5 fatias grossas – 30 g Carnes e peixes Carne de boi (bife,cozida,assada), miúdos,vísceras. 1 bife médio ou 2 pedaços (100 g) Carne de porco (lombo,bisteca) fatia média (100g) Carne seca, carne de sol, bacon 2 pedaços pequenos (40 g) Linguiça 1 gomo médio (60g Frango (cozido, frito, grelhado, assado) 1 pedaço ou 1 filé pequeno (60g) Peixe (cozido,frito,assado), frutos do mar 1 filé peq ou 1 posta peq (100 g) Embutidos (salsicha, salame, presunto, mortadela) 2 fatias médias (30g) Hamburguer,nuggets, almondega 1 unidade média (60g) Molhos e temperos Azeite, óleo ou vinagre para tempero de salada 1 fio (5 ml) Maionese,molho para salada, patê e chantilly 1 colher de chá (0,35 g) Sal para tempero de salada e condimentos 1 pitada (0,35 g) Leguminosas e ovos Ovo (cozido,frito) 1 unidade (50g) Feijão (carioca,roxo,preto,verde) 1 concha média (86g) Lentilha,ervilha seca, grão de bico, soja 1 colher de servir (35g) Feijoada, feijão tropeiro 1 concha média (210g) 85 Frutas/Verduras/Legumes Alface 3 folhas médias (30g) Tomate 3 fatias médias (40g) Cenoura 1 colher de sopa (25) Outros legumes (abobrinha,berinjela,chuchu,pepino) 1 colher de sopa cheias (30g) Outras verduras cruas (acelga,rúcula,agrião) 1 prato de sobremesa (38g) Outras verduras cozidas (acelga,espinafre,escarola, couve) 1 colher de servir (30g) Brócolis 1 ramo ou 2 colheres de sopa (30g) Couve-flor,repolho 1 ramo ou 2 colheres de sopa (30g) Mexerica, abacaxi 1 unidade média ou 1 fatia grande (180g) Laranja 1 unidade media (180g) Limão (para tempero) ½ unidade (3 mL) Banana 1 unidade média (86g) Maçã, pera 1 unidade média (110g) Melão, melancia 1 fatia média (150g) Mamão 1 fatia média ou ½ unidade média (160g) Goiaba 1 unidade grande (225g) Abacate 2 colheres de sopa cheias (50 g) Arroz e Tubérculos Arroz branco ou integral cozido com óleo temperos 2 escumadeiras médias (120 g) Batata frita ou mandioca frita 2 colheres de servir cheias (100g) Batata,mandioca,inhame (cozida ou assada), purê 1 escumadeira cheia (90g) Salada de maionese com legumes 3 colheres de sopa (90g) Farinha de mandioca, farofa,cuscuz,aveia,tapioca 3 colheres de sopa (40g) Pães e biscoitos Pão francês,pão de forma,integral,pão doce,torrada 1 unidade ou 2 fatias (50g) Biscoito sem recheio (doce, salgado) 4 unidades (24g) Biscoito recheado, wafer, amanteigado 3 unidades (41g) 86 Bolo (simples, recheado) 1 fatia média (60g) Manteiga ou margarina passada no pão comum 3 pontas de faca (15g) Manteiga ou margarina passada no pão light 3 pontas de faca (15g Sanduiche (cachorro quente, hambúrguer) 2 unidades simples (220g) Sopas e Massas Sopas (de legumes,canja,creme,etc) 1 concha média (150g) Salgados fritos (pastel,coxinha,rissoles,bolinho) 1 unidade grande (80g) Salgados assados(esfiha,bauruzinho,torta) 2 unidades ou 2 Pedaços médias (140g) Macarrão com molho, sem carne 1 prato raso (200g Macarrão com molho com carne, lasanha,nhoque 1 escumadeira ou 1 pedaço pequeno (110g) Pizza, panqueca 2 fatias peq ou 2 unidades (180g) Polenta cozida ou frita 2 colheres de sopa ou 2 fatias pequenas (70g) Sobremesas e Doces Açúcar, mel, geleia 1/2 colher de sopa (6g) Chocolates,bombom, brigadeiro 1 barra pequena (25g) Achocolatado em pó (adicionado ao leite) 2 colheres de sopa (25g) Sobremesas, doces, tortas e pudins 1 pedaço ou 1 fatia média (60g) Bebidas Café ou chá com açúcar 2 xícaras de café (50 ml) Café ou chá sem açúcar 2 xícaras de café (50 ml) Suco natural com açúcar 1/2 copo americano (80ml) Suco natural sem açúcar 1/2 copo americano (80ml) Suco de laranja puro sem açúcar 1/2 copo americano (80ml) Suco artificial 1 copo de requeijão (240 ml) Refrigerante comum 1 copo de requeijão (240ml) Refrigerante diet/light 1 copo de requeijão (240ml) Cerveja 2 latas (700ml) Vinho 1 taça (150 mL) 87 ANEXO A – Parecer de aprovação do Comitê de Ética 88 ANEXO B – Parecer ClinicalTrials