UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Campus do Litoral Paulista Análise dos efeitos antimicrobianos e ecotoxicológicos de nanopartículas fúngicas de ouro sobre bactérias Caterina do Valle Trotta SÃO VICENTE 2022 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Campus do Litoral Paulista Análise dos efeitos antimicrobianos e ecotoxicológicos de nanopartículas fúngicas de ouro sobre bactérias Caterina do Valle Trotta Orientadora: Profª. Drª. Cristiane Angélica Ottoni Trabalho de conclusão de curso apresentado ao Instituto de Biociências - Campus do Litoral Paulista da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas com habilitação em Biologia Marinha. SÃO VICENTE 2022 Câmpus do Litoral Paulista (CLP) - Unidade do Litoral Paulista Praça Infante D. Henrique s/nº - CEP 11330-900 - São Vicente (SP) - Brasil Tel. (13) 3569-7100 - Fax (13) 3569-7146 - coordenadoria@clp.unesp.br 2 Agradecimentos Agradeço à minha mãe, meu pai, meus irmãos e minha avó por tudo, por sempre me acolherem e apoiarem nas minhas decisões e questões da vida, À Carolina que sempre me apoiou e incentivou, À Profª. Drª. Cristiane Angélica Ottoni por ter me apoiado e orientado durante esse período, À minha família e amigos de fora da área por me perguntarem sempre como funcionam as coisas que faço, me ajudando a conseguir passar as informações científicas de uma forma mais acessível, Aos meus amigos e amigas que estiveram por perto me mantendo sã e estável emocionalmente durante todo o período de faculdade, À Universidade Estadual Júlio Mesquita Filho (UNESP) por me proporcionar a infraestrutura para meu experimento, Agradeço ao Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica (PIBIC) da Pró-Reitoria de Pesquisa da UNESP, pelo auxílio financeiro, Ao IEAMar pela infraestrutura e oportunidade de aprendizado, Ao Instituto de Pesquisa Tecnológica do Estado de São Paulo (IPT) pelas bactérias cedidas, Ao Banco de Microrganismos Aidar & Kutner (BMAK) do Instituto Oceanográfico da Universidade de São Paulo (IOUSP) pelas microalgas cedidas, E por fim, agradeço a mim, a todo o meu percurso e aos desafios que me propus para fazer este trabalho. Câmpus do Litoral Paulista (CLP) - Unidade do Litoral Paulista Praça Infante D. Henrique s/nº - CEP 11330-900 - São Vicente (SP) - Brasil Tel. (13) 3569-7100 - Fax (13) 3569-7146 - coordenadoria@clp.unesp.br 3 T858a Trotta, Caterina do Valle Análise dos efeitos antimicrobianos e ecotoxicológicos de nanopartículas fúngicas de ouro sobre bactérias / Caterina do Valle Trotta. -- São Vicente, 2022 24 p. : il., tabs. Trabalho de conclusão de curso (Bacharelado - Ciências Biológicas) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Biociências, São Vicente Orientadora: Cristiane Angélica Ottoni 1. Fungo filamentoso. 2. nanopartícula de ouro. 3. imobilização. 4. Escherichia coli. 5. Chlorella sp. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca do Instituto de Biociências, São Vicente. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. Resumo As nanopartículas de ouro (AuNPs) têm atraído enorme interesse científico e tecnológico devido à sua facilidade de síntese, apresentam propriedades distintas além das decorrentes de seu tamanho reduzido, apresentando aplicações como na construção de biossensores, no tratamento e diagnóstico de câncer, além de agir como agentes antimicrobianos. Métodos químicos e físicos são usados para sintetizar NPs; no entanto, os métodos biológicos são preferidos devido às suas fontes ecológicas, sendo a síntese verde de nanopartículas (NPs) uma ferramenta promissora e inovadora na bionanotecnologia. Os fungos filamentosos (Ffs) recebem destaque na literatura pela obtenção de nanopartículas metálicas por conta da diversidade, sendo considerados os mais promissores. Nesse contexto, o presente trabalho tem como objetivo avaliar a atividade antimicrobiana da bionanopartícula AuNP em suspensão sobre as bactérias Escherichia coli IPT245, Pseudomonas aeruginosa IPT236 e Staphylococcus aureus IPT246 e potenciais efeitos tóxicos sobre microalga marinha Chlorella minutissima e microalga de água doce Chlorella fusca. A AuNP foi caracterizada por espectrofotometría UV-vis, ‘Dynamic Light Scattering’ (DLS) e Índice de polidispersão (PDI) e a atividade antimicrobiana avaliada por concentração mínima inibitória utilizando as bactérias patogênicas Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus. As microalgas Chlorella minutissima e Chlorella fusca foram utilizadas para estudos de densidade celular. Em síntese, a AuNP em suspensão não apresentou atividade antibacteriana em nenhuma das concentrações em que as bactérias patogênicas foram expostas. Em contrapartida, a AuNP encapsulada com quitosana-alginato obteve atividade antibacteriana sobre a bactéria gram-negativa E. coli IPT245, e de acordo com os resultados do teste de densidade celular com as microalgas C. minutissima e C. fusca, pode-se dizer que o uso das AuNPs em meio aquático pode ser considerado um risco ambiental, portanto, o resíduo e descarte gerado deve ser devidamente encaminhado. Tendo em vista os resultados obtidos, a biossíntese ainda necessita ser otimizada, explorando principalmente fatores que influenciam no tamanho e tempo de obtenção do nanomaterial de estudo. Palavras-chave: Fungo filamentoso, nanopartícula de ouro, imobilização, Escherichia coli, Chlorella sp. Câmpus do Litoral Paulista (CLP) - Unidade do Litoral Paulista Praça Infante D. Henrique s/nº - CEP 11330-900 - São Vicente (SP) - Brasil Tel. (13) 3569-7100 - Fax (13) 3569-7146 - coordenadoria@clp.unesp.br 5 Sumário Introdução 7 Objetivos 10 Materiais e Métodos 10 Fungos 10 Biossíntese da nanopartícula biológica 10 Caracterização das nanopartículas metálicas 11 UV-Vis 11 Análise de tamanho de partícula, distribuição e carga das nanopartículas metálicas 11 Ação antimicrobiana de bionanopartículas 11 Determinação de Concentração Inibitória mínima (CIM) e Concentração bactericida mínima (CBM) 11 Imobilização de bionanopartículas 12 Ação antimicrobiana de bionanopartículas imobilizadas 12 Análise ecotoxicológica 12 Ensaio de fitotoxicidade com Chlorella sp. 12 Densidade celular 12 Resultados e Discussão 13 Biossíntese e caracterização de nanopartículas de ouro 13 Ação antimicrobiana de bionanopartículas 14 Determinação de Concentração Inibitória mínima (CIM) e Concentração bactericida mínima (CBM) 14 Ação antimicrobiana de bionanopartículas imobilizadas 15 Análise ecotoxicológica 16 Chlorella minutissima 17 Chlorella fusca 18 Conclusão 19 Referências 20 Câmpus do Litoral Paulista (CLP) - Unidade do Litoral Paulista Praça Infante D. Henrique s/nº - CEP 11330-900 - São Vicente (SP) - Brasil Tel. (13) 3569-7100 - Fax (13) 3569-7146 - coordenadoria@clp.unesp.br 6 1. Introdução A nanotecnologia está associada a diversas áreas além da biologia, como medicina, física, química, e engenharia de materiais, sendo o estudo de manipulação da matéria em escala atômica e molecular, incluindo as nanopartículas, substâncias particuladas que abrangem o tamanho de 0 a 100 nanômetros e que contém de 20 a 15.000 átomos, sendo parte importante da nanociência [1-4]. Além disso, a nanotecnologia traz um grande interesse econômico pelo uso das nanopartículas, como por exemplo nanopartícula de prata (AgNP), nanopartícula de ouro (AuNP) e nanopartícula de dióxido de titânio (TiO₂NP), que possuem ação antimicrobiana comprovada para o tratamento de infecções bacterianas como uma alternativa aos antibióticos [5], sendo ainda um campo pouco explorado e muito promissor [6]. As nanopartículas de ouro (AuNPs) podem ter uma variedade de tamanhos, e com estabilidade e biocompatibilidade, foram inicialmente utilizadas como sistema de entrega de drogas, além disso podem transportar peptídeos, proteínas e ácidos nucleicos para terapia gênica por conta da afinidade de ligação às biomoléculas [7]. AuNPs têm atraído enorme interesse científico e tecnológico devido à sua facilidade de síntese [8]. Apresentam propriedades distintas além das decorrentes de seu tamanho reduzido, como as propriedades ópticas, eletrônicas, magnéticas e catalíticas. Sendo assim, a AuNP possui aplicações como na construção de biossensores, em sistema de liberação gradativa de drogas, lubrificantes, células solares, catálise, bioimagem, antioxidante e no tratamento e diagnóstico de câncer, além de agir como agentes antimicrobianos. Entretanto, AuNPs são termodinamicamente instáveis e tendem a coalescer, formando agregados de tamanhos maiores os quais resultam na perda de suas propriedades [9-11]. As AuNPs de tamanho de 1,5 a 10 nm são geralmente sintetizadas por tratamento químico e utilizadas para aplicações biomédicas, na imagem de tecidos por exemplo, além de serem utilizadas para tratamento de fibras de lã ou algodão trazendo uma coloração permanente de têxteis de valor econômico e industrial [12, 13] . As aplicações das nanopartículas de ouro são muito variadas, podendo também serem usadas na purificação de água e controle de poluição [14], além de componentes para cremes antienvelhecimento [15], desta forma, a quantidade de AuNPs consumidas anualmente é incerta, mas estima-se que seja em torno de 3 toneladas métricas, sendo assim muito utilizada na indústria [16]. A síntese verde de nanopartículas (NPs) usando células vivas é uma ferramenta promissora e inovadora na bionanotecnologia. Métodos químicos e físicos são usados para sintetizar NPs; no entanto, os métodos biológicos são preferidos devido às suas fontes ecológicas, limpas, seguras, econômicas, fáceis e eficazes de alta produtividade e pureza [17]. A biossíntese pode ser realizada através de microrganismos como bactérias e fungos filamentosos, tornando assim o processo menos tóxico, sendo que poucos microrganismos foram testados para a produção de AuNPs, e menos de 30 espécies de fungos utilizadas apesar da grande capacidade biossintética de AuNP por bactérias e fungos, que sugere a redução de Au³⁺ formando nanoconjugados de proteínas metálicas como uma resposta comum ao estresse tóxico, em que as enzimas necessárias estão prontamente disponíveis nesses microrganismos ambientais [18]. Além dos fungos filamentosos e bactérias, plantas, algas, leveduras, actinomicetos e vírus também possuem a capacidade de sintetizar diferentes tipos de Câmpus do Litoral Paulista (CLP) - Unidade do Litoral Paulista Praça Infante D. Henrique s/nº - CEP 11330-900 - São Vicente (SP) - Brasil Tel. (13) 3569-7100 - Fax (13) 3569-7146 - coordenadoria@clp.unesp.br 7 nanopartículas, uma forma de síntese que possui cada vez mais importância por ter um menor custo e serem mais ambientalmente benignos comparada com a síntese de nanopartículas sintéticas [19]. Desta forma, a biossíntese de nanomateriais é cada vez mais visada por ter a facilidade de redução dos seus sais à temperatura ambiente, econômica e não tóxica. Sendo um ótimo método de produção em grande escala, além de como já citado ambientalmente benigno e biocompatível [9]. Os fungos filamentosos recebem destaque na literatura pela obtenção de nanopartículas metálicas por conta da diversidade, são melhores agentes biogênicos além de secretarem enzimas extracelulares eficazes na biossíntese [20], e possuem capacidade de produzir maiores concentrações de proteínas, que auxiliam na redução de íons metálicos para formas menos tóxicas [2]. Ademais, o cultivo em laboratório e controle de crescimento é mais fácil, tendo assim escala de produção com potencial de ampliação [20]. Há uma maior dificuldade de caracterização dos fungos e das nanopartículas que eles produzem e acabam os tornando menos estudados em comparação aos demais microrganismos que também possuem a característica de biossíntese de nanopartículas, como por exemplo, dificuldades financeiras em conseguir equipamentos e técnicas complexas de caracterização de fungos. Apesar disso, os fungos possuem vantagens sobre as bactérias no bioprocesso como a possibilidade de biossíntese de AuNPs, por secretar uma grande quantidade de enzimas extracelulares os tornando melhores candidatos para a síntese verde de AuNPs [18]. Consideradas como alternativa aos antibióticos as nanopartículas podem prevenir a resistência microbiana aos medicamentos [21], as nanopartículas de ouro, AuNPs, são facilmente sintetizadas, possuindo um efeito bactericida comprovado e que de acordo com estudos a nanopartícula induz a formação de vesículas que produzem orifícios na membrana da bactéria Escherichia coli, em contrapartida na bactéria Staphylococcus aureus, tendem a aumentar a concentração de espécies reativas de oxigênio (ROS) intracelulares, assim as AuNPs se ligam e inibem a transcrição [22]. A atividade antibacteriana e efeito antifúngico são influenciados por diversos parâmetros como a forma, o tamanho e a área da superfície da nanopartícula [21]. As AuNPs já mostraram resultados promissores de efeitos antimicrobianos, com ótimos resultados de inibição devido às suas características de tamanho e carga [5, 23]. Em contraponto, de acordo com o estudo de Zhang et al.(2015) as nanopartículas de ouro não possuem ação antibacteriana contra S. aureus e E. coli na faixa de tamanho de 20-30 nm [23]. As AuNPs possuem propriedades físico-químicas que as tornam eficientes veículos de entrega de fármacos, aumentando assim a atividade antimicrobiana em conjunto com outras moléculas. Desta forma, a nanopartícula de ouro sintética possui uma melhora na eficiência antimicrobiana de antibióticos lidando até com bactérias resistentes [23]. Como exemplo, as AuNPs reduzidas pelo antibiótico cefaclor, possui uma alta atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas S. aureus e Gram-negativas E.coli comparado com a mesma substância ou nanopartícula de ouro separadamente [24]. Quanto aos efeitos em bactérias Gram-negativas ou Gram-positivas, as bactérias Gram-negativas se demonstraram mais sensíveis à desinfecção fotocatalítica do que as bactérias Gram-positivas em estudo com TiO₂NP [25]. Câmpus do Litoral Paulista (CLP) - Unidade do Litoral Paulista Praça Infante D. Henrique s/nº - CEP 11330-900 - São Vicente (SP) - Brasil Tel. (13) 3569-7100 - Fax (13) 3569-7146 - coordenadoria@clp.unesp.br 8 Em relação aos estudos de ecotoxicologia de nanomateriais, as microalgas do gênero Chlorella são muito utilizadas para experimentos de fitotoxicidade por terem um cultivo mais rápido em laboratório e apresentarem grande produtividade celular, sendo as espécies C. minutissima e C. vulgaris as mais frequentemente vistas e estudadas, possuindo grande valor econômico [26]. Além disso, elas são importantes indicadores biológicos para a detecção de nutrientes e substâncias tóxicas. Contudo, as microalgas podem reduzir o efeito estufa absorvendo CO₂ dos processos de queima de combustíveis fósseis e de práticas agrícolas como a queima podendo também produzir biocombustíveis (como o biodiesel) [27]. A remoção do gás carbônico da atmosfera se deve em parte pelas microalgas que apesar de retirarem o CO₂ apenas durante o dia, à noite, parte dele é transportado para as profundezas do oceano para a recirculação do carbono nas cadeias alimentares, desta forma são responsáveis por mais de 50% da fotossíntese do planeta, e por estarem em contato direto com a coluna d’água ou sedimentos são muito sensíveis a contaminação além de possuírem ciclo de vida curtos [28]. As microalgas são microrganismos que podem ser encontrados em ambientes aquáticos, dulcícolas ou marinhos, e no solo, possuem clorofila e demais pigmentos fotossintéticos. São microrganismos muito utilizados em laboratório por conta da importância na base da cadeia alimentar, já que servem como alimento para peixes, pós-larvas de organismos aquáticos, moluscos e crustáceos, além disso, possuem facilidade no cultivo, com alto e rápido crescimento [27, 29]. Os impactos dos nanomateriais em ecossistemas aquáticos por conta do desenvolvimento das indústrias que levam à soltura de nanopartículas de óxidos metálicos nesses ecossistemas ainda precisam ser melhor estudados [30]. Apesar da ecotoxicologia ser uma ciência inquestionável, para entender o destino, comportamento e toxicidade ambiental de nanopartículas, é preciso uma maior integração entre ambientalistas, químicos e físicos [16]. Contudo, por serem parte da base da cadeia trófica, os produtores primários microscópicos ao serem expostos a poluentes tendem a afetar o restante do ecossistema, e sendo organismos unicelulares, as microalgas possuem danos inteiramente, afetando assim todo indivíduo [16]. O estresse tóxico causado pela presença de nanopartículas metálicas em ambientes aquáticos sobre as microalgas pode afetar a fisiologia celular desse microrganismo, porém algumas NPs são mais tóxicas que outras, já que dependem o tamanho e metal precursor para definir sua toxicidade além das diferenças da sensibilidade entre as espécies e habitats das microalgas [28]. Em síntese, a bioacumulação na cadeia trófica aquática é muito preocupante, resíduos orgânicos e nanomateriais como óxidos metálicos podem causar danos na fisiologia, comportamento e reprodução de organismos aquáticos, por esses resíduos serem despejados no ecossistema aquático tendo assim um acúmulo na cadeia alimentar desses organismos, e, contudo em sua maioria são resíduos de origem antropológica [31]. De acordo com o estudo de Moreno-Garrido et al.[16], a toxicidade das AuNPs pode ocorrer pela liberação de íons metálicos livres no ambiente aquático. Muito embora, o ouro seja referenciado como um metal de baixa toxicidade, estudos com o material em nanoescala devem ser explorados em diferentes organismos. Câmpus do Litoral Paulista (CLP) - Unidade do Litoral Paulista Praça Infante D. Henrique s/nº - CEP 11330-900 - São Vicente (SP) - Brasil Tel. (13) 3569-7100 - Fax (13) 3569-7146 - coordenadoria@clp.unesp.br 9 2. Objetivos Avaliar a atividade antimicrobiana da bionanopartícula AuNP em suspensão e imobilizada sobre as bactérias Escherichia coli IPT245, Pseudomonas aeruginosa IPT236 e Staphylococcus aureus IPT246 e potenciais efeitos tóxicos sobre microalga marinha Chlorella minutissima e microalga de água doce Chlorella fusca. 3. Materiais e Métodos 3.1. Fungos Os fungos marinhos dos gêneros Aspergillus e Penicillium e outros encaminhados para identificação a nível de espécie, Margem Q3 Sedimento (IBCLP1212), Apicum Q3 Sedimento (IBCLP1213), Margem Q1 Solo (IBCLP1214), Margem Q1 Solo B (IBCLP1215), Margem Q1 Solo V (IBCLP1216), Margem Q1 Solo D (IBCLP1217) e Apicum Q4 Sedimento (IBCLP1218), utilizados na biossíntese foram isolados de sedimentos de manguezal e apicum da Estação Ecológica de Juréia-Itatins coletados em 2019 e mantidos na Coleção de Cultura do Laboratório de Micologia e Aplicações Biotecnológicas e Nanotecnológicas (MICOBIO-NANOTEC) do Instituto de Biociências do Câmpus do Litoral Paulista (IB-CLP). O fungo Rhizopus arrhizus IPT1011 foi cedido pela Coleção de Cultura do Instituto de Pesquisa Tecnológica do Estado de São Paulo (IPT) e, também, utilizado no estudo. A manutenção da viabilidade desses microrganismos foi realizada em placas de Extrato de Malte e Agar (MEA) modificado, composição final (g/L): extrato de malte (20,0), glicose monohidratada (20,0), peptona bacteriológica (1,0), agar (15,0) sendo mantidas a 4ºC com renovação mensal das culturas. Os fungos foram testados de forma individualizada. Foi feita a caracterização a partir das técnicas de Espectrofotometria de luz (UV-Vis), Potencial Zeta e Índice de Polidispersão (PDI). 3.2. Biossíntese da nanopartícula biológica Foram testadas oito linhagens de fungos para biossíntese das nanopartículas de ouro. Para cada linhagem foram inseridos 5 discos de 6 mm em um frasco Erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL de meio Methylglucose lipopolysaccharide (MGLP líquido). Estes frascos Erlenmeyer foram incubados por um período de 72 horas à temperatura de 30ºC e agitação de 180 rpm. Após este período, a biomassa foi filtrada e lavada com água deionizada por três vezes. Cerca de 10 g de biomassa úmida foi transferida a um frasco Erlenmeyer de 250 mL preenchido com 100 mL de água deionizada estéril, permanecendo à temperatura de 30ºC e agitação de 180 rpm por um período de 72 horas. Após este período, a biomassa foi separada novamente por filtração em papel filtro Whatman Nº1 e, ao filtrado foi adicionada uma solução de concentração de ouro, feita a partir do precursor químico ácido tetracloroáurico(III) tri-hidratado 99% (HAuCl₄ * 3 H₂O), 1 mM, em um frasco Erlenmeyer de 250 mL, que permaneceu à temperatura de 30ºC e agitação de 180 rpm, por um período de 72 horas. Para o controle, o mesmo procedimento foi adotado, contudo, a biomassa foi autoclavada após crescimento em MGLP líquido. Câmpus do Litoral Paulista (CLP) - Unidade do Litoral Paulista Praça Infante D. Henrique s/nº - CEP 11330-900 - São Vicente (SP) - Brasil Tel. (13) 3569-7100 - Fax (13) 3569-7146 - coordenadoria@clp.unesp.br 10 3.3. Caracterização das nanopartículas metálicas 3.3.1. UV-Vis Os espectros de UV-visível foram determinados em um espectrofotômetro (U-2000 Hitachi) no intervalo de comprimento de onda de 200-800 nm. 3.3.2. Análise de tamanho de partícula, distribuição e carga das nanopartículas metálicas A distribuição de tamanho das nanopartículas (DLS) e índice de polidispersão (PDI) foram obtidos utilizando o equipamento Dynamic Light Scattering (Zetasizer Nano, ZS90). 3.4. Ação antimicrobiana de bionanopartículas 3.4.1. Determinação de Concentração Inibitória mínima (CIM) e Concentração bactericida mínima (CBM) Para o ensaio de determinação das CIM foi utilizada a metodologia adaptada proposta por Mann e Markham [32] utilizando as bactérias Gram-negativas Escherichia coli IPT245, Pseudomonas aeruginosa IPT236 e Gram-positiva Staphylococcus aureus IPT246 cedidas pelo Instituto de Pesquisa Tecnológica do Estado de São Paulo (IPT). As bactérias foram crescidas em meio de cultura Trypticase Soy Broth (TSB), composição final (g/L): peptona bacteriológica (17,0), peptona de soja (3,0), glicose (2,0), cloreto de sódio (5,0), fosfato de dipotássio (2,0), “overnight”. Foi ajustada a concentração celular de 1,0x10⁵ UFC. Para o ensaio foram utilizadas placas de 96 poços, onde as colunas 1 e 12 continham 200μL de água destilada, para evitar qualquer contato externo com a placa. As colunas 1 a 11 continham 150 μL de meio de cultura Trypticase Soy Broth (TSB). A coluna 3 continha 20 μL de meio de cultura, além dos 150μL, para manter todos os poços com a mesma quantidade total de μL, total final em cada poço de 200μL. Em todas as colunas continham 20 μL do inóculo. As colunas 2 e 4 a 11 continham 20 μL da bionanopartícula AuNP, ou seu metal precursor, HAuCl₄ * 3 H₂O, nas concentrações compreendidas entre 2 a 200 μg/mL (2; 5; 10; 20; 50; 75; 100; 200). E as colunas 2 e 3 foram utilizadas como controle positivo, com 20 μL da solução de AgNO₃ e controle negativo respectivamente. Um volume de 10 µL de solução de Resazurina a 0,01% foi adicionado a todos os poços. O tempo de incubação total foi de 48 horas a 37°C e o teste foi realizado em triplicata, após este período, foi determinada a concentração mínima inibitória (CIM). As CIMs são definidas como a menor concentração necessária para impedir o crescimento microbiano. Dessa forma os dados obtidos foram indicados como IC50, levando em conjunto as diversas concentrações de exposição do composto. Um segundo teste foi realizado de acordo com o protocolo adaptado descrito por Abbaszadeh et al. [33] e Li et al. [34] sendo denominado Concentração bactericida mínima (CBM). Foram retirados 10 μL de cada poço com ausência de crescimento visível e transferida para placas com meio TSA (Tryptic Soy Agar) composição final (g/L): peptona bacteriológica (15,0), cloreto de sódio (15,0), peptona de soja (5,0), e ágar (15,0), por um período de 24 horas. Após o período de incubação, foram considerados como bactericida os compostos que inibem 100% do crescimento do microrganismo. O teste CBM foi realizado em triplicata. Câmpus do Litoral Paulista (CLP) - Unidade do Litoral Paulista Praça Infante D. Henrique s/nº - CEP 11330-900 - São Vicente (SP) - Brasil Tel. (13) 3569-7100 - Fax (13) 3569-7146 - coordenadoria@clp.unesp.br 11 3.5. Imobilização de bionanopartículas As microcápsulas foram obtidas por gelificação ionotrópica com alginato de sódio de acordo com Pereira et al. [35, 36]. A solução do biopolímero foi preparada solubilizando 3,1% (p/v) de alginato de sódio em 10mL de NP biológica. Posteriormente, a solução de biopolímero (10mL) foi gotejada em 100mL de uma solução aquosa de cloreto de cálcio (0,14M) e 0,2% (p/v) de quitosana usando uma seringa de infusão intravenosa de 20mL e 27g de um dispositivo de infusão intravenoso. O sistema foi mantido em agitação magnética (500 rpm) por 1 minuto. Após o processo de gelificação, as microcápsulas foram armazenadas a 4ºC. 3.6. Ação antimicrobiana de bionanopartículas imobilizadas Em frascos Erlenmeyers de 250 mL de capacidade foi adicionado um volume de 17,5 mL de água destilada estéril, 2,5 mL de E. coli IPT245 na concentração de 1,0x107 UFC e 0,5-3,0 g de bionanopartícula imobilizada. Os frascos foram acondicionados em plataforma agitada a 180 rpm e 37ºC por 2 dias. Uma solução de 10 mg L-1 de AgNO3 foi utilizada como controle positivo, pois foram realizados outros testes no laboratório MICOBIONANOTEC e comprovada ação antibacteriana da solução de AgNO3. E como controle negativo foi utilizada água estéril. O experimento foi realizado em triplicata. 3.7. Análise ecotoxicológica 3.7.1. Ensaio de fitotoxicidade com Chlorella sp. As microalgas Chlorella fusca e Chlorella minutissima foram cedidas pelo Banco de Microrganismos Aidar & Kutner (BMAK) do Instituto Oceanográfico da Universidade de São Paulo (IOUSP). A renovação e manutenção da cultura foi realizada utilizando o meio de cultura líquido Bold Basal para microalga dulcícola e meio Guillard 35% para microalga marinha, sob condições controladas de 24±1°C, iluminado com um fluxo de fótons de aproximadamente 50 µmol de fóton⋅m⁻²⋅s⁻¹, sob um ciclo claro:escuro de 12:12 horas. Diariamente, ocorreu contagem celular com o auxílio de uma Câmara de Neubauer para a construção da curva de crescimento e determinação da fase exponencial. 3.7.2. Densidade celular Os testes de inibição de densidade celular foram realizados em placas de 96 poços, onde as colunas 1 e 12 continham 200 μL de água destilada estéril para evitar a evaporação e contaminação dos poços, as colunas 4 a 11, continham 170 μL de inóculo ajustado para a densidade celular de 1,0x10⁴ cel⋅mL⁻¹ em meio de cultura Bold Basal, microalga dulcícola, ou Guillard 35%, microalga marinha, e 20 μL nanomaterial, AuNP, ou seu metal precursor HAuCl₄ * 3 H₂O, nas concentrações compreendidas entre 2 a 200 μg/mL. E as colunas 2 e 3 foram utilizadas como controle positivo, com 20 μL da solução de AgNO₃, e controle negativo respectivamente. A resposta tóxica foi avaliada em 24, 48, 72 e 96 horas, após exposição por meio da densidade óptica das microalgas em um espectrofotômetro UV-Vis. A absorbância espectrofotométrica foi medida no comprimento de onda de 670 nm [37, 38] possibilitando acompanhar o crescimento da microalga durante o experimento. A incubação total decorreu em um período de 96 horas, mantendo a temperatura 24±1°C. O teste foi realizado em triplicata. Câmpus do Litoral Paulista (CLP) - Unidade do Litoral Paulista Praça Infante D. Henrique s/nº - CEP 11330-900 - São Vicente (SP) - Brasil Tel. (13) 3569-7100 - Fax (13) 3569-7146 - coordenadoria@clp.unesp.br 12 4. Resultados e Discussão 4.1. Biossíntese e caracterização de nanopartículas de ouro Foram testados oito fungos para formação de nanopartículas de ouro (AuNP). Dentre eles, apenas dois apresentaram coloração arroxeada (IPT1011 e IBCLP1212), logo, apenas estes foram levados para caracterização das nanopartículas por DLS (Tabela 1). A coloração da nanopartícula de ouro varia de acordo com seu diâmetro médio, podendo ser apresentadas colorações de rosa até roxo [13]. Os fungos, IBCLP1213, IBCLP1214, IBCLP1215 e IBCLP1216 não apresentaram mudança de cor, sugerindo que não houve produção de nanopartículas de ouro. Os fungos IBCLP1217 e IBCLP1218 apresentaram mudança de coloração, porém o fungo IBCLP1217 precipitou antes de conseguir uma data para caracterização e o fungo IBCLP1218 contaminou no transporte para caracterização. Tabela 1. Linhagens fúngicas utilizadas e caracterização das nanopartículas de ouro. Fungo DLS (nm) PDI IPT1011 98,48 0,330 Margem Q3 Sedimento IBCLP1212 248,30 0,669 Apicum Q3 Sedimento IBCLP1213 não formou - não caracterizado Margem Q1 Solo IBCLP1214 não formou - não caracterizado Margem Q1 Solo B IBCLP1215 não formou - não caracterizado Margem Q1 Solo V IBCLP1216 não formou - não caracterizado Margem Q1 Solo D IBCLP1217 formou - não caracterizado Apicum Q4 Sedimento IBCLP1218 formou - não caracterizado As nanopartículas de ouro apresentaram índice de polidispersão (PDI) relativamente baixo (Tabela 1). A linhagem IPT1011 apresentou o menor tamanho, 98,48 nm, sendo assim selecionada para os demais estudos propostos no presente projeto. Câmpus do Litoral Paulista (CLP) - Unidade do Litoral Paulista Praça Infante D. Henrique s/nº - CEP 11330-900 - São Vicente (SP) - Brasil Tel. (13) 3569-7100 - Fax (13) 3569-7146 - coordenadoria@clp.unesp.br 13 4.2. Ação antimicrobiana de bionanopartículas 4.2.1. Determinação de Concentração Inibitória mínima (CIM) e Concentração bactericida mínima (CBM) Foi realizado um teste antimicrobiano (Fig 1, 2 e 3), em que as três bactérias patogênicas, Escherichia coli IPT245, P. aeruginosa IPT236 e S. aureus IPT246, com concentrações ajustadas a 1,0x10⁵ UFC, foram expostas à bionanopartícula AuNP IPT1011 com o tamanho de partículas de 98,48 nm, determinado após caracterização, além de serem expostas ao seu metal precursor, HAuCl₄ * 3 H₂O, nas concentrações de 2; 5; 10; 20; 50; 100; 200 µg/mL por um período de 48 horas a 37ºC. As concentrações não tiveram efeito em nenhuma das espécies sendo que a Resazurina a 0,01%, corante utilizado, teve a alteração de sua coloração de azul para rosa, demonstrando assim que ainda está ocorrendo respiração celular, já que o corante reage com o oxigênio (O₂) [39]. Figura 1. Placas de 96 poços no início da exposição, hora 0. (a) (b) (c) Figura 2. Placas de 96 poços após 24 horas de exposição (a) bactéria Escherichia coli; (b) bactéria Pseudomonas aeruginosa; (c) bactéria Staphylococcus aureus. (a) (b) (c) Figura 3. Placas de 96 poços após 48 horas de exposição (a) bactéria Escherichia coli; (b) bactéria Pseudomonas aeruginosa; (c) bactéria Staphylococcus aureus. O teste de concentração bactericida mínima (CBM), foi realizado após as 48 horas de exposição ao nanomaterial biológico e ao seu metal precursor. Porém, conforme o resultado apresentado pelo teste CIM, após 24 horas se observou o crescimento das colônias bacterianas nas placas de meio TSA, confirmando a inatividade antibacteriana da nanopartícula de AuNP (IPT1011) no tamanho de 98,48 nm (Figura 4). Câmpus do Litoral Paulista (CLP) - Unidade do Litoral Paulista Praça Infante D. Henrique s/nº - CEP 11330-900 - São Vicente (SP) - Brasil Tel. (13) 3569-7100 - Fax (13) 3569-7146 - coordenadoria@clp.unesp.br 14 (a) (b) (c) Figura 4. Placas de Petri após 48 horas de exposição ao metal precursor (a) bactéria Escherichia coli; (b) bactéria Pseudomonas aeruginosa; (c) bactéria Staphylococcus aureus. Em alguns artigos as AuNPs não mostraram efeito antibacteriano independente da concentração, alegando que atividade antibacteriana não consiste nas características das AuNPs [40, 41]. No entanto, existem artigos mais recentes que demonstram toxicidade de AuNPs para bactérias Gram-negativas como E. coli [16, 42, 43] e S. epidermidis [44], tendo causas diferentes, por exemplo, enfraquecendo as membranas e causando respostas de choque térmico, no caso de Moreno-Garrido et al. [16]; e para Cui et al. [42] as AuNPs exercem sua ação antibacteriana principalmente de duas maneiras, uma indicando um declínio geral no metabolismo, outra indicando um colapso do processo biológico. Além disso, estudos com bactérias Gram-positivas e Gram-negativas mostraram forte atividade antibacteriana de AuNPs [43, 45], contudo seus tamanhos são menores que a apresentada neste trabalho, em torno de 50 nm [44-46] e 2 a 10 nm [43]; Basiratnia et al. [46] sugeriram que a atividade ocorreu devido à adsorção e penetração das AuNPs nas células. Já no estudo de Hernández-Sierra et al. [47] com AuNP de 80 nm contra S. aureus, as AuNPs mostraram atividade antibacteriana apenas em uma concentração muito alta, de 197 μg/mL, este estudo tem o tamanho e concentração mais próximo do trabalho atual e resultado semelhante, pois concentrações menores que 197 μg/mL não tiveram antibacteriana, neste caso não houve atividade antibacteriana, visto que a AuNP em questão tem o tamanho de 98,48 nm. Em todos os artigos mencionados previamente os testes utilizados seguiram o método Kirby-Bauer [48], de difusão em disco. O atual trabalho não foi feito de acordo com esse método, por fazer parte de um projeto maior que pretende ver os efeitos antibacterianos no meio aquático, portanto a aplicação das AuNPs em placas de 96 poços. Talvez, por esse motivo, os resultados antibacterianos foram de encontro aos estudos que não houveram atividade, apesar de ter maior exatidão quando feito em placas de 96 poços. 4.3. Ação antimicrobiana de bionanopartículas imobilizadas Existe ainda o questionamento das AuNPs serem mais eficazes contra bactérias Gram-negativas devido à fina camada de peptidoglicano na parede celular [49]. Portanto, o teste foi realizado com a bactéria patogênica Gram-negativa, Escherichia coli IPT245, microrganismo que já resultou em sérios problemas de saúde pública e perdas econômicas [50, 51], na concentração celular de 1,0x10⁷ UFC e com as concentrações, 0,5 g; 1,0 g e 3,0 g de bionanopartícula AuNP IPT1011 imobilizada com microcápsulas de quitosana-alginato. Cada concentração e os controles, Câmpus do Litoral Paulista (CLP) - Unidade do Litoral Paulista Praça Infante D. Henrique s/nº - CEP 11330-900 - São Vicente (SP) - Brasil Tel. (13) 3569-7100 - Fax (13) 3569-7146 - coordenadoria@clp.unesp.br 15 positivo, com a solução de 10 mg/L de AgNO₃, e negativo, com água destilada estéril, foram colocados em frascos Erlenmeyer de 250 mL de capacidade, sendo o teste feito em triplicata. A resposta antimicrobiana foi avaliada inicialmente 24 e 48 horas após exposição à bionanopartícula imobilizada, por meio da densidade óptica da bactéria em um espectrofotômetro UV-Vis. A absorbância espectrofotométrica foi medida no comprimento de onda de 600 nm (Figura 5). Figura 5. Ação antibacteriana de AuNP encapsulada contra E. coli IPT245. Gráfico de absorbância (abs) por tempo (h) da bactéria E.coli exposta a nanopartícula biológica AuNP encapsulada, em que C+ (controle positivo), C- (controle negativo), C1 (0,5g), C2 (1g) e C3 (3g). Em 24 horas, as concentrações C1, C2 e C3 apresentaram absorbância de aproximadamente 20% do valor do controle negativo, sendo respectivamente, 13,5%, 21,5% e 26%. O controle positivo apresentou absorbância de 13% do valor do controle negativo. Em 48 horas, as concentrações C1, C2 e C3 apresentaram absorbância de aproximadamente 24% do valor do controle negativo, sendo respectivamente, 19%, 21,5% e 33%. O controle positivo apresentou absorbância de 14% do valor do controle negativo. O valor em 24h e 48h não alterou significativamente em nenhuma das concentrações. Pode-se afirmar com esse teste que as concentrações testadas se assemelham ao controle positivo, havendo atividade antibacteriana tal qual a solução de 10 mg/L de AgNO₃. Não foi feito um estudo prévio sobre a nanocápsula de quitosana-alginato, porém, de acordo com a literatura, esta possui baixa toxicidade e não tem atividade antibacteriana [52], apesar disso há um estudo com o nanoencapsulamento que demonstra ter ocorrido uma alteração no tamanho da nanopartícula biológica, ocasionando sua redução, aumentando a eficiência da nanopartícula [53], logo tal resultado pode ter ocorrido no experimento em questão. 4.4. Análise ecotoxicológica Previamente ao teste de densidade celular, foram feitas as curvas de crescimento das microalgas Chlorella minutissima e Chlorella fusca, para estabelecer a concentração celular ideal, ou seja, a concentração celular analisada um dia antes da fase exponencial, para assim realizar os testes de fitotoxicidade [34]. Câmpus do Litoral Paulista (CLP) - Unidade do Litoral Paulista Praça Infante D. Henrique s/nº - CEP 11330-900 - São Vicente (SP) - Brasil Tel. (13) 3569-7100 - Fax (13) 3569-7146 - coordenadoria@clp.unesp.br 16 As espécies foram colocadas na plataforma agitadora, a 150 rpm, sob condições controladas de 24±1°C, iluminadas com um fluxo de fótons de aproximadamente 50 µmol de fóton⋅m⁻²⋅s⁻¹, sob um ciclo claro:escuro de 12:12 horas durante 15 dias. Diariamente foram feitas as contagens de células totais com o auxílio de uma Câmara de Neubauer, sendo a padronização da contagem de quatro quadrantes (superior esquerdo e direito, inferior esquerdo e direito). Após o período de contagem, foi determinado o dia em que a espécie C. minutissima teve o maior crescimento (exponencial), sexto dia, já a espécie C. fusca teve seu maior crescimento no oitavo dia, desta forma as concentrações ideais são encontradas no quinto e sétimo dia respectivamente, estando de acordo com demais estudos [26, 38, 54, 55]. A interação entre as NPs e as microalgas é incerta, sendo o fator de crescimento e densidade celular o mais monitorado na literatura [56]. Com isso, foi feita a análise dos gráficos apresentados abaixo (Figuras 6, 7, 8 e 9), onde é possível afirmar que a maioria das concentrações da nanopartícula biológica AuNP e do metal precursor, HAuCl₄ * 3 H₂O, sob as duas espécies de microalgas, C. minutissima e C. fusca, pelo período de 96 horas, apresentaram efeito inibitório no crescimento celular, da espécie exposta, estando de acordo com estudos que afirmam que as microalgas são sensíveis a compostos tóxicos, podendo assim, comprometer a produtividade desses microrganismos [57]. 4.4.1. Chlorella minutissima Os testes de inibição de densidade celular foram realizados em placas de 96 poços e a resposta tóxica nas concentrações de 2; 5; 10; 25; 50; 75; 100; e 200 µg/mL, foi avaliada em 24, 48, 72 e 96 horas, após exposição por meio da densidade óptica das microalgas em um espectrofotômetro UV-Vis. O gráfico foi gerado pelo Excel após cálculo da média dos valores obtidos em triplicata. Para cada gráfico, a absorbância de 0,140±0,03; corresponde à concentração celular de 1x10⁴ cel µL⁻¹, nas figuras 6 e 7. Com base nas figuras 6 e 7, pode-se dizer que a microalga C. minutissima apresentou inibição da densidade celular em todas as concentrações testadas, tanto pela nanopartícula biológica AuNP, quanto pelo metal precursor HAuCl₄ * 3 H₂O, tendo valores de absorbância sem diferença significativa do controle positivo. Figura 6. Fitotoxicidade de Chlorella minutissima exposta a nanopartícula biológica AuNP. Gráfico de absorbância (abs) por tempo (h) da microalga Chlorella minutissima exposta a nanopartícula biológica AuNP, onde C+ (controle positivo), C- (controle negativo), C1 (2,0 µg/mL), C2 (5,0 µg/mL), C3 (10,0 µg/mL), C4 (25,0 µg/mL), C5 (50,0 µg/mL), C6 (75,0 µg/mL), C7 (100,0 µg/mL), C8 (200,0 µg/mL). Câmpus do Litoral Paulista (CLP) - Unidade do Litoral Paulista Praça Infante D. Henrique s/nº - CEP 11330-900 - São Vicente (SP) - Brasil Tel. (13) 3569-7100 - Fax (13) 3569-7146 - coordenadoria@clp.unesp.br 17 Figura 7. Fitotoxicidade de Chlorella minutissima exposta ao metal precursor HAuCl₄ * 3 H₂O. Gráfico de absorbância (abs) por tempo (h) da microalga Chlorella minutissima exposta ao metal precursor HAuCl₄ * 3 H₂O, onde C+ (controle positivo), C- (controle negativo), C1 (2,0 µg/mL), C2 (5,0 µg/mL), C3 (10,0 µg/mL), C4 (25,0 µg/mL), C5 (50,0 µg/mL), C6 (75,0 µg/mL), C7 (100,0 µg/mL), C8 (200,0 µg/mL). A toxicidade de NPs tem sido mais associada à redução de tamanho e agregação celular [30, 58], e os efeitos na espécie Chlorella têm como pretexto o fato de serem unicelulares e, portanto, mais propensas aos efeitos deletérios das NPs. [59] 4.4.2. Chlorella fusca Os testes de inibição de densidade celular foram realizados em placas de 96 poços. A resposta tóxica nas concentrações de 2; 5; 10; 25; 50; 75; 100; e 200 µg/mL, foi avaliada em 24, 48, 72 e 96 horas, após exposição por meio da densidade óptica das microalgas em um espectrofotômetro UV-Vis. O gráfico foi gerado pelo Excel após cálculo da média dos valores obtidos em triplicata. Para cada gráfico, a absorbância de 0,315±0,04; corresponde à concentração celular de 1x10⁴ cel µL⁻¹, nas figuras 8 e 9. Com base nas figuras 8 e 9, pode-se dizer que a microalga C. fusca apresentou inibição da densidade celular em todas as concentrações testadas, exceto a concentração 7 na figura 8, tanto pela nanopartícula biológica AuNP, quanto pelo metal precursor HAuCl₄ * 3 H₂O. Fora a C7 da figura 8, todas as outras concentrações não apresentaram diferenças significativas em comparação ao controle positivo. Pode-se observar o crescimento celular na C7 da figura 8, mas este pode estar ligado à uma resposta de adaptação fisiológica da microalga aos efeitos da nanopartícula, como visto em Matouke [31]. Câmpus do Litoral Paulista (CLP) - Unidade do Litoral Paulista Praça Infante D. Henrique s/nº - CEP 11330-900 - São Vicente (SP) - Brasil Tel. (13) 3569-7100 - Fax (13) 3569-7146 - coordenadoria@clp.unesp.br 18 Figura 8. Fitotoxicidade de Chlorella fusca exposta a nanopartícula biológica AuNP. Gráfico de absorbância (abs) por tempo (h) da microalga Chlorella fusca exposta a nanopartícula biológica AuNP, onde C+ (controle positivo), C- (controle negativo), C1 (2,0 µg/mL), C2 (5,0 µg/mL), C3 (10,0 µg/mL), C4 (25,0 µg/mL), C5 (50,0 µg/mL), C6 (75,0 µg/mL), C7 (100,0 µg/mL), C8 (200,0 µg/mL). Figura 9. Fitotoxicidade de Chlorella fusca exposta ao metal precursor HAuCl₄ * 3 H₂O. Gráfico de absorbância (abs) por tempo (h) da microalga Chlorella fusca exposta ao metal precursor HAuCl₄ * 3 H₂O, onde C+ (controle positivo), C- (controle negativo), C1 (2,0 µg/mL), C2 (5,0 µg/mL), C3 (10,0 µg/mL), C4 (25,0 µg/mL), C5 (50,0 µg/mL), C6 (75,0 µg/mL), C7 (100,0 µg/mL), C8 (200,0 µg/mL). Pode-se ainda observar que a sensitividade da C. fusca à tanto o metal precursor como à AuNP ao longo dos dias diminuiu, tendo valores mais altos de absorbância conforme os dias, resultado corroborado pelo resultado de Monteiro [60], com Chlorella vulgaris exposta a nanorods de ouro. O motivo da toxicidade de AuNPs em microalgas ainda é incerto pois não houve um teste posterior de análise celular das microalgas e na literatura ainda não há um consenso, sendo necessários mais estudos para evidenciar o real malefício dessas nanopartículas não só nas microalgas como no ecossistema. [28, 56, 61] 5. Conclusão Em síntese, a AuNP sintetizada pelo fungo IPT1011 com tamanho de 98,48 nm em suspensão não apresentou atividade antibacteriana em nenhuma das concentrações em que as bactérias patogênicas E. coli IPT245, P. aeruginosa IPT236 e S. aureus IPT246 foram expostas. Em contrapartida, a AuNP encapsulada com quitosana-alginato obteve atividade antibacteriana sobre a bactéria gram-negativa E. coli IPT245. Câmpus do Litoral Paulista (CLP) - Unidade do Litoral Paulista Praça Infante D. Henrique s/nº - CEP 11330-900 - São Vicente (SP) - Brasil Tel. (13) 3569-7100 - Fax (13) 3569-7146 - coordenadoria@clp.unesp.br 19 Tendo em vista os resultados obtidos, a biossíntese ainda necessita ser otimizada, explorando principalmente fatores que influenciam no tamanho e tempo de obtenção do nanomaterial de estudo. Ademais, o comportamento de AuNPs em cada ambiente, marinho ou dulcícola é diferente, assim como, espécie-específico, portanto, serão necessários mais estudos para averiguar a os mecanismos exatos envolvidos entre as nanopartículas e cada espécie ou cada ambiente. Além disso, testes com microalgas devem ser realizados em maior escala além de testes antibacterianos segundo o método de Kirby-Bauer, para confirmação dos dados apresentados neste estudo, pois a escala e métodos feitos podem ter colaborado para resultados divergentes da literatura. Por fim, com os resultados do teste de densidade celular com as microalgas C. minutissima e C. fusca, pode-se dizer que o uso das AuNPs em meio aquático pode ser considerado um risco ambiental, portanto, o resíduo e descarte gerado deve ser devidamente encaminhado. Concluindo-se que devem ser feitos testes com nanopartículas comerciais para assim comparar o efeito tóxico da nanopartícula de ouro biológica em relação à sintética, além de estudos de longo termo, pouco encontrados na literatura, que podem servir de base para estudos de risco ambiental, uma vez que os efeitos de testes de toxicidade de curto prazo podem subestimar ou superestimar o risco representado pelas AuNPs. 6. Referências 1. Ganguly, R., Singh, A. K., Kumar, R., Gupta, A., Pandey, A. K., & Pandey, A. K. (2019). Nanoparticles as modulators of oxidative stress. In Nanotechnology in modern animal biotechnology (pp. 29-35). Elsevier. 2. Dhillon, G. S., Brar, S. K., Kaur, S., & Verma, M. (2011). Green approach for nanoparticle biosynthesis by fungi: current trends and applications. Critical Reviews in Biotechnology, 32(1), 49–73. 3. Nanotecnologia. MCTI governo federal. Disponível em: https://www.gov.br/mcti/pt-br/rede-mcti/cetene/areas-de-atuacao/nanotecnolog ia. 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(13) 3569-7100 - Fax (13) 3569-7146 - coordenadoria@clp.unesp.br 24 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Instituto de Biociências Câmpus do Litoral Paulista PARECER FINAL DO TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO APRESENTAÇÃO REMOTA Discente: CATERINA DO VALLE TROTTA Título: “Análise dos efeitos antimicrobianos e toxicológicos de nanopartículas fúngicas de ouro sobre bactérias” Orientadora: Profa. Dra. Cristiane Angélica Ottoni Curso/Habilitação: Bacharelado em Ciências Biológicas/Biologia Marinha COMISSÃO EXAMINADORA CONCEITO Profa. Dra. Cristiane Angélica Ottoni APROVADO Dra. Marta Filipa Jesus de Freitas Simões APROVADO CONCEITO FINAL: A Comissão Examinadora abaixo assinada conclui que a discente Caterina do Valle Trotta obteve o seguinte conceito: x APROVADO REPROVADO São Vicente, 24 de janeiro de 2022. Profa. Dra. Cristiane Angélica Ottoni (Orientadora) Dra. Marta Filipa Jesus de Freitas Simões Instituto de Biociências - Câmpus do Litoral Paulista Praça Infante D. Henrique s/nº - CEP 11330-900 - São Vicente (SP) - Brasil Tel. (13) 3569-7100 - graduacao.clp@unesp.br