i UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS ANALÍTICOS PARA DETERMINAÇÃO DE TETRACICLINA, DOXICICLINA, AZITROMICINA, NORFLOXACINA E CIPROFLOXACINA EM FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS JOSÉ LUIZ RUFINO Araraquara –SP 2009 ii JOSÉ LUIZ RUFINO DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS ANALÍTICOS PARA DETERMINAÇÃO DE TETRACICLINA, DOXICICLINA, AZITROMICINA, NORFLOXACINA E CIPROFLOXACINA EM FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Doutor em Química Orientador: Prof. Dr. Leonardo Pezza Co-orientadora: Profª. Drª. Helena Redigolo Pezza Araraquara - SP 2009 iii iv DADOS CURRICULARES 1. Formação Acadêmica / Titulação 1.1. Graduação em Química - Bacharelado Universidade Estadual de Londrina - UEL Período: 1995 – 2002 1.2. Mestrado em Química Analítica Departamento de Química - Universidade Federal do Paraná - UFPR Período: 08/2002 -12/2004 1.3. Doutorado em Química Instituto de Química - Universidade Estadual Paulista - UNESP Período: 08/2005 – 07/2009 2. Artigos Submetidos, Aceitos ou Publicados 2.1. Rufino, J. L.; Pezza, H. R.; Pezza, L.; Saraiva, M. L. M.F.S.; Lima, J. L. F.C.; Pinto, P. C. A. G. Sequential injection analysis system with spectrophotometric detection for determination of norfloxacin and ciprofloxacin in pharmaceutical formulations. J. Brazilian Chemical Society, 2009. Submetido. 2.2. Rufino, J. L.; Sequinel, R.; Lima, L. S.; Pezza, H. R.; Pezza, L. Spectrophotometric determination of tetracycline and doxycycline in pharmaceutical formulations using chloramine-T. Analytical Letters, 2009.Submetido. 2.3. Pollo, F.; Sequinel, R.; Rufino, J. L.; Weinert, P. L.; Pezza, H. R.; Pezza, L. An environmentally friendly reflectometric method for bumetanide determination in pharmaceuticals. Analytical Sciences, v. 25, p. 897-901, 2009. v 2.4. Rufino, J. L.; Weinert, P. L.; Pezza, H. R.; Pezza, L. Flow-injection spectrophotometric determination of tetracycline and doxycycline in pharmaceutical formulations using chloramine-T as oxidizing agent. Química Nova, 2009. aceito. 2.5. Rufino, J. L.; Santos, J. M.; Rodrigues, M. A.; Pezza, L.; Pezza, H. R. Determination of ambroxol in syrups using diffuse reflectance spectroscopy. Química Nova, 2009. no Prelo. 2.6. Santini, A. O.; Pezza, H. R.; Sequinel, R.; Rufino, J. L.; Pezza, L. Potentiometric sensor for furosemide determination in pharmaceuticals, urine, blood, serum and bovine milk. J. Brazilian Chemical Society, v. 20, p. 64-73, 2009. 2.7. Rufino, J. L.; Pezza, H. R.; Pezza, L. Flow-injection spectrophotometric determination of azithromycin in pharmaceutical formulations using p-chloranil in the presence of hydrogen peroxide. Analytical Sciences, v. 24, p. 871-876, 2008. 2.8. Gotardo, M. A.; Lima, L. S.; Sequinel, R.; Rufino, J. L.; Pezza, L.; Pezza, H. R. A simple spectrophotometric method for the determination of methyldopa using p-chloranil in the presence of hydrogen peroxide. Eclética Química (Araraquara), v. 33, p. 7-12, 2008. 3. Trabalhos Apresentados em Congressos 3.1. Rufino, J. L.; Sequinel, R.; dos Santos, J. M.; Pezza, H. R.; Pezza, L. Determinação de ambroxol em formulações farmacêuticas utilizando a combinação spot test - espectroscopia de reflectância difusa. In: 31ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2008, Águas de Lindóia. 3.2. Sequinel, R.; Rufino, J. L.; Pezza, H. R.; Pezza, L. Desenvolvimento de um novo método espectrofotométrico para determinação de paracetamol em formulações farmacêuticas. In: 31ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2008, Águas de Lindóia. vi 3.3. Rufino, J. L.; Pezza, L.; Pezza, H. R. Determinação de Azitromicina em medicamentos utilizando análise por injeção em fluxo com detecção espectrofotométrica. In: 14º Encontro Nacional de Química Analítica, 2007, João Pessoa. 3.4. Rufino, J. L.; Pezza, L.; Pezza, H. R. Determinação de tetraciclina e doxiciclina em formulações farmacêuticas utilizando análise por injeção em fluxo com detecção espectrofotométrica. In: 14º Encontro Nacional de Química Analítica, 2007, João Pessoa. 3.5. Rufino, J. L.; Weinert, P. L.; Pezza, H. R.; Pezza, L. Determinação espectrofotométrica de antibióticos da classe das tetraciclinas em formulações farmacêuticas com cloramina-T. In: 29ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2006, Águas de Lindóia. Livro de Resumos p. QA-065. 3.6. Rufino, J. L.; Aguiar, B. M.; Zamora, Patricio G. Peralta; Guimarães, O. M. Determinação simultânea de brometo de N-butilescopolamina e dipirona sódica em fármacos utilizando espectroscopia NIR e calibração multivariada. In: XI Encontro de Química da Região Sul, 2003, Pelotas. Anais do XI Encontro de Química da Região Sul. vii AGRADECIMENTOS Ao Instituto de Química e à Universidade Estadual Paulista, pela instalação e facilidades oferecidas. À Capes, pela bolsa concedida. Ao Prof. Leonardo Pezza, pelas discussões científicas, orientação e amizade. À Profa. Helena R. Pezza, pela co-orientação, discussões científicas e amizade. Ao Massao pela amizade, discussões e ensinamentos. Ao Prof. José Luís F. Costa Lima da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, pelo apoio logístico, confiança, amizade e pelos passeios por Portugal. Ás Profas. Lúcia Saraiva e Paula Pinto pelas orientações durante o estágio realizado. Aos amigos do laboratório GABAI da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, em especial às profas. Lúcia Saraiva e Paula Pinto pelas orientações e ao David e André pela amizade e pelos finos (chopp). Ao Daniel (de Valência), Prof. Jr. e Marcelo (Zóhio) da UFPE, pela amizade e pelo agradável convívio, sempre regado a muitos finos, durante minha estada na cidade do Porto. Aos amigos e colegas do laboratório Fritz Feigl: Mara, Patrícia, Alberto Santini (Fritz), Fernanda, Keity, Lili, Mayra, Marcão, Joel, Raquel, Carol, Rodrigo, Andréia, Aline e Rodrigo Sequinel. Aos amigos do LATIG: Adriano, Emanuel, Gilbert, Yuki, Cláudio pelo apoio e amizade. Aos técnicos de laboratório, Sandrinha e Marquinhos. Às bibliotecárias e funcionárias da Pós Graduação do Instituto de Química, pela excelente ajuda. À toda minha família, pelo carinho e confiança. Aos amigos de futebol e das cervejas no Casão; ao Rafael (Piá) amigo de convívio. E a todas as pessoas que direta ou indiretamente contribuíram na realização deste trabalho. viii RESUMO Neste trabalho foram desenvolvidos métodos analíticos com detecção espectrofotométrica na região visível para determinação de tetraciclina, doxiciclina, azitromicina, norfloxacina e ciprofloxacina em formulações farmacêuticas. As condições experimentais envolvidas em cada método foram cuidadosamente estudadas e otimizadas utilizando métodos multivariados (planejamentos fatoriais e metodologia de superfície de resposta), assim como método univariado. Para a determinação de tetraciclina e doxiciclina foi proposto método baseado na reação entre cloramina-T e os fármacos em meio alcalino de Na2CO3, produzindo compostos com coloração vermelha e absorbâncias em 535 e 525 nm para os produtos das reações da tetraciclina e doxiciclina, respectivamente. Posteriormente, este método foi automatizado utilizando sistema de análise por injeção em fluxo. Para a determinação de azitromicina foi proposto um método automatizado utilizando análise por injeção em fluxo com zonas coalescentes. O método é baseado na reação entre o fármaco e p-cloranil em meio metanólico na presença de H2O2 com formação de um complexo de transferência de carga de coloração roxa, o qual apresenta absorção em 540 nm. Para a determinação de norfloxacina e ciprofloxacina foi empregado um método utilizando análise por injeção sequencial. O referido método baseia-se na reação entre os fármacos e p-dimetilaminocinamaldeído em meio ácido (HCl) e micelar (sulfato de dodecil sódio). O produto formado apresentou coloração alaranjada com absorbância máxima em 495 nm. As substâncias comumente utilizadas como excipientes nas respectivas formulações farmacêuticas não interferiram nos métodos propostos. Todos os métodos propostos neste trabalho foram aplicados com sucesso na determinação destes fármacos em formulações farmacêuticas. Os resultados obtidos por estes métodos concordam muito bem com aqueles obtidos pelos métodos oficiais ou comparativos, com 95 % de nível de confiança. ix ABSTRACT In this work were developed analytical methods with spectrophotometric detection in the visible region for tetracycline, doxycycline, azithromycin, norfloxacin and ciprofloxacin determination in pharmaceutical formulations. The experimental conditions involved in each method were carefully studied and optimized utilizing multivariate methods (design factorials and response surface methodology), as well as univariated method. For the tetracycline and doxycycline determination was proposed method based in the reaction between chloramine-T and the drugs in alkaline medium of Na2CO3 producing red color compounds with absorbance in 535 and 525 nm for the products of the reactions of tetracycline and doxycycline, respectively. Subsequently, this method was automated utilizing system of flow injection analysis. For the determination of azithromycin was proposed a method utilizing flow injection analysis with coalescent zones. The method is based in the reaction between the drug and p-chloranil in methanol medium in the presence of H2O2 with formation of a purple color charge-transfer complex, which presents absorption in 540 nm. For norfloxacin and ciprofloxacin determination was employed a method utilizing sequential injection analysis. The referred method based itself in the reaction between the drugs and p-dimethylaminocinnamaldehyde in acid (HCl) and micelar (sulphate of dodecil sodium) medium. The formed product presented orange color with maximum absorbance in 495 nm. The common excipients used as additives in the respective pharmaceutical formulations do not interfere in the proposed methods. All the proposed methods in this work were applied successfully to the determination of these drugs in pharmaceutical formulations. The analytical results obtained by applying the proposed methods compared very favorably with those obtained by the official or comparative methods, at 95% confidence level. x LISTA DE FIGURAS Figura 1- Sistema em linha única: R, reagente (solução transportadora); A, .. 23 Figura 2 - Sistema com uma confluência e dois reagentes. ............................ 23 Figura 3 - Sistema com dois pontos de confluência e três reagentes. ............ 24 Figura 4 - Sistema com zonas coalescentes. IC, Injetor comutador; PP, bomba peristáltica. ...................................................................................... 24 Figura 5 - A) aspiração das zonas de reagente (R) e amostra (A); B) bombeamento das zonas e formação da zona de penetração (P). . 25 Figura 6 - Diagrama ilustrando os gradientes de concentração correspondentes à injeção de duas zonas adjacentes em um sistema SIA................ 26 Figura 7 - Sistema de análise por injeção sequêncial constituído por bomba peristáltica (PP); bobina coletora (HC); válvula seletora multiposição (SV); bobina de reação (RC); sistema de detecção. ....................... 27 Figura 8 - Estrutura molecular da tetraciclina e suas respectivas frações responsáveis pelos diversos pKas. ................................................. 29 Figura 9 - Estrutura molecular da doxiciclina................................................... 30 Figura 10 - Estrutura molecular da azitromicina. ............................................. 31 Figura 11 - Estrutura molecular do ácido nalidíxico......................................... 32 Figura 12 - Estrutura molecular do ácido pipemídico. ..................................... 32 Figura 13 - Estrutura molecular da norfloxacina. ............................................. 33 Figura 14 - Estrutura molecular da ciprofloxacina ........................................... 34 Figura 15 - Espectros de absorção dos produtos das reações de tetraciclina e doxiciclina com CAT. ..................................................................... 52 Figura 16 - Estabilidade do composto formado com a tetraciclina .................. 53 Figura 17 - Gráfico da estabilidade do composto formado com a doxiciclina após aquecimento de 5 minutos à 60ºC. ....................................... 54 Figura 18 - Gráfico dos principais efeitos e de interação estimados dos fatores estudados. ..................................................................................... 56 xi Figura 19 - Superfície de resposta otimizada com sua respectiva curva de nível para a medida de absorbância em 535 nm em função das variáveis: volume de solução de Na2CO3 e volume de solução de CAT. ...... 58 Figura 20 - Gráfico dos efeitos das variáveis individuais e suas interações.... 60 Figura 21 - Superfície de resposta otimizada com sua respectiva curva de nível para a medida de absorbância em 525 nm em função das variáveis: tempo e temperatura para doxiciclina............................................ 62 Figura 22 - Curva analítica para determinação da tetraciclina......................... 63 Figura 23 - Curva analítica para a determinação da doxiciclina. ..................... 64 Figura 24 - Sistema de injeção em fluxo com injetor-comutador manual: IC, injetor comutador; S, amostra; L, alça de amostra; (H2O), transportador da amostra; R1 e R2, bobinas de reação; R3, bobina de resfriamento; D, detector; W, descarte. .................................... 71 Figura 25 - Gráfico de barras dos efeitos individuais das variáveis................. 74 Figura 26 - Superfície de resposta obtida com sua respectiva curva de nível em função das variáveis: alça de amostra e concentração de Na2CO376 Figura 27- Gráfico de barras dos efeitos individuais das variáveis.................. 79 Figura 28 - Gráfico de barras dos efeitos individuais das variáveis................. 81 Figura 29 - Superfície de resposta com sua respectiva curva de nível em função das variáveis temperatura e concentração de Na2CO3. ..... 83 Figura 30 - Curva analítica para determinação de tetraciclina......................... 85 Figura 31- Curva analítica para determinação de doxiciclina .......................... 85 Figura 32 - Fiagrama dos padrões de calibração (1-7) e das amostras analisadas (A e B) de tetraciclina em três repetições.................... 87 Figura 33 - Fiagrama dos padrões de calibração (1-8) e das amostras analisadas (A-C) de doxiciclina em três repetições. ...................... 88 Figura 34 - Sistema de injeção em fluxo com comutador manual. A, amostra; R, reagente; L1, alça de amostra (volume de 485 μL); L2, alça de reagente (volume de 485 μL); C, transportador (metanol) com vazão de 2,0 mL min-1; RC, bobina de reação (140 cm de comprimento); W, descarte. .......................................................... 92 Figura 35 - Espectro do produto da reação entre azitromicina e p-cloranil na presença de peróxido de hidrogênio. ............................................ 95 xii Figura 36 - Esquema do provável mecanismo de reação de complexo de transferência de carga................................................................... 96 Figura 37 - Gráfico de barras dos efeitos individuais das variáveis................. 99 Figura 38 - Gráfico de barras dos efeitos individuais das variáveis............... 100 Figura 39 - Superfície de resposta com sua respectiva curva de nível em função das variáveis: Alças e concentração de p-cloranil. .......... 102 Figura 40 - Curva analítica para determinação de azitromicina..................... 103 Figura 41 - Fiagrama dos padrões de calibração (1-7) e das amostras analisadas (A-E) de azitromicina em três repetições................... 107 Figura 42 - Esquema do sistema SIA utilizado: C, transportador (solução de HCl 5.0 x 10-2 mol L-1); PP, bomba peristáltica; HC, bobina de armazenamento ( 0,8 mm de diâmetro interno e 4,0 m de comprimento); SV, válvula multiposição; R, reagente; S, amostras ou padrões; RC, bobina de reação (1,0 m em formato de 8); D, detector (� = 495 nm); W, descarte. ............................................ 113 Figura 43 - Espectos de absorção dos produtos formados da reação de norfloxacina e ciprofloxacina com p-DAC em meio micelar obtidos em batelada................................................................................. 115 Figura 44 - Provável mecanismo para a reação entre ciprofloxacina ou norfloxacina com p-DAC em meio ácido. .................................... 116 Figura 45 - Efeito do volume de amostra....................................................... 118 Figura 46 - Efeito do volume de reagente ..................................................... 119 Figura 47 - Efeito da concentração do reagente............................................ 119 Figura 48 - Efeito do tempo de parada de fluxo à 20 ºC................................ 120 Figura 49 - Efeito do tamanho do reator........................................................ 121 Figura 50 - Estudo do efeito da concentração de SDS.................................. 122 Figura 51 - Efeito da vazão do transportador após parada de fluxo. ............. 123 Figura 52 - Efeito da temperatura com 45 s de parada de fluxo.................... 124 Figura 53 - Curva analítica para determinação de ciprofloxacina.................. 126 Figura 54 - Curva analítica para determinação de norfloxacina .................... 126 xiii LISTA DE TABELAS Tabela 1- Figura de mérito de sistemas em fluxo para determinação de norfloxacina e/ou ciprofloxacina ...................................................... 44 Tabela 2 - Matriz do planejamento fatorial completo para triagem das variáveis com os respectivos valores de absorbância................................... 55 Tabela 3 - Matriz do planejamento composto central com suas respostas de absorbância..................................................................................... 57 Tabela 4 - Matriz do planejamento fatorial fracionário 2 (4-1) para triagem das variáveis com os respectivos valores de absorbância.................... 59 Tabela 5 - Matriz e resultados do planejamento composto central para doxiciclina........................................................................................ 61 Tabela 6 - Condições otimizadas do método para tetraciclina e doxiciclina .... 63 Tabela 7 - Resultados das figuras de mérito do método.................................. 64 Tabela 8 - Resultados da adição de padrão da Doxiciclina ............................. 65 Tabela 9 - Resultados da adição de padrão da tetraciclina ............................. 65 Tabela 10 - Resultados obtidos pela aplicação dos métodos .......................... 66 Tabela 11 - Variáveis e seus níveis estudados................................................ 73 Tabela 12 - Matriz do planejamento fatorial fracionário 2(7-3) com os respectivos valores de absorbância. ................................................................ 73 Tabela 13 - Matriz e resultados do planejamento composto central ................ 75 Tabela 14 - Condições otimizadas do método para determinação de tetraciclina76 Tabela 15 - Variáveis e seus níveis estudados................................................ 78 Tabela 16 - Matriz do planejamento fatorial fracionário 2(7-3) e seus respectivos valores de absorbância ................................................................. 78 Tabela 17 - Variáveis e seus níveis no planejamento fatorial fracionário 2 (4-1) 80 Tabela 18 - Matriz planejamento fatorial fracionário 2(4-1) e os resultados de absorbância................................................................................... 80 Tabela 19 - Matriz e resultados do planejamento composto central ................ 82 Tabela 20 - Condições otimizadas do método para determinação de doxiciclina83 xiv Tabela 21- Resultados das figuras de mérito do método................................. 86 Tabela 22 - Resultados obtidos pela aplicação dos métodos em amostras comerciais .................................................................................... 87 Tabela 23 - Variáveis e seus níveis ................................................................. 97 Tabela 24 - Matriz e resultados do planejamento fatorial fracionário 2(5-1) ...... 98 Tabela 25 - Matriz e resultados do planejamento fatorial fracionário 2(4-1) ...... 99 Tabela 26 - Matriz e resultados do planejamento composto central .............. 100 Tabela 27 - Condições otimizadas para o método......................................... 102 Tabela 28 - Resultados da figura de mérito do método para determinação de azitromicina. ............................................................................... 103 Tabela 29 - Resultados de recuperação da adição de padrão ...................... 105 Tabela 30 - Resultados obtidos pela aplicação do método em amostras comerciais .................................................................................. 106 Tabela 31 - Condições iniciais obtidas em testes preliminares...................... 117 Tabela 32 - Valores otimizados das variáveis................................................ 125 Tabela 33 - Ciclo analítico do método para determinação de norfloxacina e ciprofloxacina............................................................................... 125 Tabela 34 - Figuras de mérito do método proposto ....................................... 127 Tabela 35 - Determinação de ciprofloxacina e norfloxacina em amostras de formulações farmacêuticas comerciais........................................ 128 xv ABREVIATURAS E SIGLAS A – Absorbância. ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária. AZ – Azitromicina. CAT – Cloramina-T. CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. CPX – Ciprofloxacina. DMF – Dimetilformamida. DXC – Doxiciclina. FIA – Análise por Injeção em Fluxo. Fig – Figura. IUPAC – União Internacional de Química Pura e Aplicada. LOD – Limite de Detecção. LOQ – Limite de Quantificação. NFX – Norfloxacina. p-CL - p-Cloranil. p-DAC – p-dimetilaminocinamaldeído. RNA - Ácido Ribonucléico. RSD – Desvio Padrão Relativo Sd – Desvio Padrão. SDS – dodecil Sulfato de Sódio. SIA – Análise por Injeção Sequencial. TC – Tetraciclina. UV – Ultravioleta. Vis – visível. xvi SUMÁRIO I – INTRODUÇÃO ............................................................................................ 19 I.1. Considerações Gerais ................................................................................ 20 I.2. Análise por injeção em fluxo....................................................................... 21 I.3. Análise por injeção Sequencial .................................................................. 25 II – ASPECTOS GERAIS DOS FÁRMACOS ANALISADOS............................ 28 II.1. Tetraciclina e doxiciclina............................................................................ 29 II.2. Azitromicina............................................................................................... 30 II.3. Norfloxacina e ciprofloxacina..................................................................... 32 III – REVISÃO DA LITERATURA: ALGUNS MÉTODOS PARA DETERMINAÇÃO DOS FÁRMACOS ANALISADOS .................................................................... 35 III.1. Métodos para de determinação de tetraciclina e doxiciclina .................... 36 III.2. Métodos para de determinação de Azitromicina ...................................... 39 III.3. Métodos para determinação de norfloxacina e ciprofloxacina.................. 41 IV – OBJETIVO ................................................................................................ 45 Objetivo: ........................................................................................................... 46 V - DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO PARA DETERMINAÇÃO DE TETRACICLINA E DOXICICLINA ................................ 47 V.1. PARTE EXPERIMENTAL ......................................................................... 48 V.1.1. Materiais e Equipamentos .............................................................. 48 V.1.2. Reagentes e soluções .................................................................... 48 V.1.3. Preparo das soluções padrão e reagentes ..................................... 48 V.1.4. Amostras......................................................................................... 49 V.1.4.1. Preparo das amostras .............................................................. 49 V.1.5. Otimização das condições experimentais....................................... 50 V.1.6. Validação do método ...................................................................... 50 V.1.7. Estudo de efeito de matriz .............................................................. 50 V.1.8. Estudos de interferentes ................................................................. 51 V.1.9. Método Comparativo....................................................................... 51 V.2. RESULTADOS E DISCUSSÕES.............................................................. 51 V.2.1. Estudo da estabilidade óptica dos produtos ................................... 52 V.2.2. Otimização das variáveis para tetraciclina...................................... 54 V.2.3. Otimização das variáveis para doxiciclina ...................................... 59 V.2.4. Construção das curvas analíticas ................................................... 63 V.2.5. Estudo de Interferentes................................................................... 64 V.2.6. Estudo de efeito de matriz .............................................................. 65 V.2.7. Aplicações analíticas ...................................................................... 66 V.3. CONCLUSÃO ........................................................................................... 67 VI - DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO UTILIZANDO ANÁLISE POR INJEÇÃO EM FLUXO PARA DETERMINAÇÃO DE TETRACICLINA E DOXICICLINA... 68 VI.1. PARTE EXPERIMENTAL ........................................................................ 69 VI.1.1. Materiais e Equipamentos ............................................................. 69 VI.1.2. Preparo das soluções padrão e reagentes .................................... 69 VI.1.3. Preparo das amostras.................................................................... 70 VI.1.4. Esquema do Sistema FIA .............................................................. 70 VI.1.5. Otimização das condições experimentais...................................... 71 VI.1.6. Validação do método ..................................................................... 71 VI.1.7. Método Comparativo...................................................................... 72 VI.2. RESULTADOS E DISCUSSÕES............................................................. 72 VI.2.1. Otimização das condições para tetraciclina................................... 72 xvii VI.2.2. Otimização das condições para análise de doxiciclina .................. 77 VI.2.3. Construção das curvas analíticas .................................................. 84 VI.2.4. Aplicações analíticas ..................................................................... 86 VI.3. CONCLUSÃO .......................................................................................... 88 VII - DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO UTILIZANDO ANÁLISE POR INJEÇÃO EM FLUXO COM DETECÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA PARA DETERMINAÇÃO DE AZITROMICINA............................................................ 89 VII.1. PARTE EXPERIMENTAL ....................................................................... 90 VII.1.1. Materiais e Equipamentos ............................................................ 90 VII.1.2. Reagentes .................................................................................... 90 VII.1.3. Preparo das soluções e reagentes ............................................... 90 VII.1.4. Amostras....................................................................................... 91 VII.1.4.1. Preparo das amostras ............................................................ 91 VII.1.5. Esquema do sistema FIA.............................................................. 92 VII.1.6. Otimização das condições experimentais..................................... 92 VII.1.7. Validação do método .................................................................... 93 VII.1.8. Estudo de efeito de matriz ............................................................ 93 VII.1.9. Estudos de interferentes ............................................................... 93 VII.1.10. Método Comparativo................................................................... 93 VII.2. RESULTADOS E DISCUSSÕES............................................................ 94 VII.2.1. Mecanismo proposto para a reação.............................................. 94 VII.2.2. Otimização dos fatores envolvidos na reação .............................. 96 VII.2.3. Curva analítica ............................................................................ 103 VII.2.4. Estudo de interferentes............................................................... 104 VII.2.5. Estudo de efeito de matriz .......................................................... 104 VII.2.6. Aplicação analítica ...................................................................... 106 VII.3. CONCLUSÃO ....................................................................................... 107 VIII - DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DE NORFLOXACINA E CIPROFLOXACINA USANDO SISTEMA DE ANÁLISE POR INJEÇÃO SEQUÊNCIAL COM DETECÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA... 109 VIII.1. PARTE EXPERIMENTAL .................................................................... 110 VIII.1.1. Materiais e Equipamentos ......................................................... 110 VIII.1.2. Reagentes ................................................................................. 110 VIII.1.2.1. Preparo das soluções e reagentes...................................... 110 VIII.1.3. Amostras.................................................................................... 111 VIII.1.3.1. Preparação das Amostras................................................... 111 VIII.1.4. Procedimento............................................................................. 112 VIII.1.5. Otimização das condições experimentais.................................. 113 VIII.1.6. Validação do método ................................................................. 113 VIII.1.7. Estudos de interferentes ............................................................ 113 VIII.1.8. Método Comparativo.................................................................. 114 VIII.2. RESULTADOS E DISCUSSÕES......................................................... 114 VIII.2.1. Mecanismo proposto.................................................................. 114 VIII.2.2. Otimização das variáveis envolvidas ......................................... 117 VIII.2.2.1. Volume de amostra ............................................................. 117 VIII.2.2.2. Volume de reagente ............................................................ 118 VIII.2.2.3. Concentração do reagente.................................................. 119 VIII.2.2.4. Efeito do tempo de parada de fluxo (stopped-flow) ............. 120 VIII.2.2.5. Efeito do tamanho do reator ................................................ 120 VIII.2.2.6. Efeito da concentração de SDS .......................................... 121 xviii VIII.2.2.7. Efeito da vazão do transportador após a parada de fluxo ... 122 VIII.2.2.8. Efeito do aquecimento......................................................... 123 VIII.2.2.9. Efeito da concentração da solução transportadora (HCl).... 124 VIII.2.3. Construção das curvas analíticas .............................................. 125 VIII.2.4. Estudo de Interferentes.............................................................. 127 VIII.2.5- Aplicação Analítica .................................................................... 127 VIII.3. CONCLUSÃO ...................................................................................... 128 IX - CONCLUSÕES GERAIS ......................................................................... 130 X- REFERÊNCIAS ........................................................................................ 133 19 I – INTRODUÇÃO 20 I.1. Considerações Gerais Os antibióticos são substâncias produzidas por certas espécies de microorganismos e constitui importante classe de medicamentos devido à sua ação bactericida (inativação de bactérias) ou, por vezes bacteriostática (controle do crescimento bacteriano) e, portanto desde a descoberta da penicilina por Fleming em 1929, são objetos de relevantes estudos [1]. Esses medicamentos revolucionaram a história da medicina protegendo o homem do ataque de bactérias antes mortais, e são hoje indispensáveis na guerra mundial contra as doenças infecciosas bacterianas [2]. Dentre todas as descobertas voltadas ao bem-estar humano, esta foi a que transformou mais profundamente a nossa história, ao livrar-nos da maioria das infecções bacterianas que provocavam grande mortalidade no passado, como a tuberculose, a pneumonia, a meningite, a sífilis, a crupe, a gangrena e outras [1,2]. Atualmente é grande a quantidade de antibióticos de eficácia comprovada; mas o uso indiscriminado dessas substâncias ou o desconhecimento sobre o mecanismo de ação dos antibióticos, traz a pior consequência, que é a criação das chamadas “superbactérias”, microorganismos para os quais dificilmente existe cura [3,4]. Com as bactérias cada vez mais resistentes e o próprio progresso da farmacologia, há mais bactérias e consequentemente mais antibióticos, entre os quais, os de última geração sintetizados por engenharia genética; mas nem sempre há a correspondência óbvia entre eles. Por causa da crescente resistência, drogas antes muito eficientes contra determinada cepa de bactérias deixam de fazer o efeito desejado. Porém, as pesquisas nesta área continuam com o intuito de desenvolver medicamentos mais eficazes, em função do surgimento destas bactérias resistentes. Então, surgem novas famílias de antibióticos, mas as bactérias também se tornam mais resistentes. O fato de serem substâncias quimicamente diferentes permite a classificação dos antibióticos em classes com características comuns, tais como: os �-lactâmicos (penicilinas e cefalosporinas) [5], as tetraciclinas (oxitetraciclinas, tetraciclinas, clortetraciclina, doxiciclina, etc.), os aminoglicosídeos (estreptomicina, neomicina e gentamicina) [6], os macrolídeos (eritromicina, azitromicina) [7], as sulfonamidas (sulfametazina) e as quinolonas (norfloxacina, ciprofloxacina, lomefloxacina, perfloxacina, amifloxacina) [8]. 21 Muitos destes encontram-se entre os medicamentos genéricos aprovados pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) sob as formas de comprimido revestido, pó para suspensão oral, aquosa e oleosa. Desde aprovação da “Lei dos Genéricos”(Lei 9787 de 10 de fevereiro de 1999) que estabelece a comercialização de produtos farmacêuticos a partir de seus nomes genéricos, têm- se intensificado a fiscalização e com certa frequência são relatados casos de adulterações e falsificações em formulações farmacêuticas [9]. A legislação atual determina que as farmácias de manipulação assegurem as qualidades químicas, físicas e microbiológicas de todos os produtos manipulados. Também é exigência legal que as empresas apresentem relatórios de produção e de controle de qualidade, aos quais é obrigatória a descrição de todo o processo de produção do fármaco e seus excipientes incluindo identificação e métodos analíticos utilizados, bem como a validação dos mesmos (ANVISA – Resolução – RDC n 0 135 de 29 de maio de 2003) [10]. Assim, a necessidade de determinar o princípio ativo em formulações farmacêuticas tem grande importância para garantir a genuinidade dos produtos com denominação de origem, tornando-se indispensável à disponibilidade de métodos e equipamentos analíticos que ofereçam resultados confiáveis de maneira simplificada, rápida e com baixo custo. Dentro deste contexto, a química analítica é uma área que centraliza a responsabilidade pelo desenvolvimento de novas metodologias de análise aplicáveis nos mais variados campos da pesquisa científica. Esta contínua procura pelo estabelecimento de metodologias adequadas para os diversos tipos de necessidades tem propiciado um significativo desenvolvimento da área, assim como tem sido fundamental para o progresso científico de outras. Desta forma, é bastante significativo o aporte que a Química Analítica tem dado a indústria, principalmente no que diz respeito ao estabelecimento de ferramentas capazes de serem aplicadas em rotinas nos laboratórios de controle de qualidade e de processos de produção [11]. I.2. Análise por injeção em fluxo A análise por injeção em fluxo (FIA do inglês: Flow Injection Analysis) foi proposta por Ruzicka e Hansen [12] em 1975. Esta proposta surgiu diante da necessidade de minimizar a manipulação dos reagentes pelo analista, da rapidez 22 das análises e principalmente pela possibilidade de transformação dos processos manuais em automatizados. A análise por injeção em fluxo é um processo que permite a automatização de procedimentos analíticos, no qual a amostra em solução é introduzida em um fluído transportador que a transporta em direção ao detector. Durante o percurso, podem ser empregados processos analíticos preparativos como diluições, separações e reações químicas antes do analito atingir o detector [13-15]. Assim, a automatização e simplificação dos processos químicos de medida com monitoramento do analito via um sistema FIA constitui uma inovação em relação a alguns métodos analíticos existentes, apresentando vantagens como: diminuição de riscos (por exemplo: aqueles que surgem da manipulação de solventes e/ ou reagentes tóxicos), aumento da precisão como consequência da eliminação dos erros sistemáticos produzidos por “fatores humanos”, aumento da frequência de amostragem, diminuição significativa do consumo de reagente(s) e amostra, baixo custo do material e baixa geração de resíduos. Uma particularidade dos sistemas de análises por injeção em fluxo (FIA) que contribuiu para sua propagação como técnica analítica é a repetibilidade das operações envolvidas nos sistemas, como injeção, propulsão das soluções e a regulação do tempo dessas operações. Com isso, sistemas de análises por injeção em fluxo permitem que sejam realizadas análises químicas sem que a reação química tenha se completado o que é primordial para metodologias utilizadas em laboratórios que empregam análises de rotina. Considerando-se essas características dos sistemas em fluxo, podem-se empregar reagentes instáveis em diversas determinações analíticas com boa precisão e exatidão, uma vez que a velocidade de decomposição do reagente pode ser controlada. O tempo de residência de um reagente ou produto de uma reação no sistema de análise por injeção em fluxo é da ordem de 1 minuto, assim, o tempo de vida em que um reagente ou produto de uma reação necessita ser estável não deve ser muito superior a este tempo [16,17]. Desta forma, esses sistemas tem sido considerados como uma das principais ferramentas para a química analítica. A versatilidade dos sistemas de análise em fluxo permite desenvolver configurações com percursos analíticos variados. O percurso analítico é a unidade do sistema em fluxo onde ocorrem as misturas e/ou reações necessárias para a detecção. Sua composição não é complexa em sistemas em fluxo com 23 configurações em linha única, confluência ou coalescência; como os exemplos mostrados nas figuras 1 à 4. D R Ab o m b a DD R Ab o m b a Figura 1- Sistema em linha única: R, reagente (solução transportadora); A, amostra; D, detector. Neste sistema, o transportador contendo o reagente é continuamente bombeado através do percurso analítico. Uma alíquota da amostra é injetada no percurso analítico e no decorrer do processo, a amostra sofre dispersão na solução transportadora, produzindo uma zona de amostra caracterizada pela existência de gradientes de concentração. As reações químicas, caso necessário, podem ocorrer durante o transporte da zona de amostra em direção ao detector. Em função dos gradientes de concentração e da medida ser feita com a zona da amostra em movimento, obtém-se um sinal transiente, cuja altura é relacionada á concentração da espécie de interesse. A figura 2, mostra um sistema com dois reagentes. D R1 A b o m b a R2 DD R1 A b o m b a R2 Figura 2 - Sistema com uma confluência e dois reagentes. Nos sistemas com dois reagentes, a amostra é inserida na solução transportadora contendo o primeiro reagente e o produto desta reação conflui com o segundo reagente que é bombeado continuamente. Isto fornece uma mistura uniforme e frequentemente fornece melhor sensibilidade e desempenho do sistema. Para três estágios químicos (figura 3), a amostra é inserida no transportador contendo o primeiro reagente. O produto desta reação conflui com o segundo reagente formando um segundo produto intermediário que conflui com o terceiro reagente para formar o produto final que é medido pelo detector. 24 A R1 b o m b a R2 D R3 A R1 b o m b a b o m b a R2 DDD R3 Figura 3 - Sistema com dois pontos de confluência e três reagentes. Nos sistemas FIA com zonas coalescentes (figura 4), amostras e reagentes são inseridos em sincronia no percurso analítico por uma solução transportadora inerte. A inserção é realizada usando um injetor comutador proporcional e a mistura de amostras e reagentes ocorre por confluência, assim, os reagentes são consumidos somente na presença de amostras [18]. Figura 4 - Sistema com zonas coalescentes. IC, Injetor comutador; PP, bomba peristáltica. Estes sistemas foram inicialmente propostos para reduzir o consumo de reagentes e, consequentemente, o custo das análises e a produção de resíduos tóxicos [19]. Posteriormente, foram utilizados para efetuar neutralização de amostras com elevada acidez [20], determinações simultâneas [21], implementação da técnica de adições de padrão [22]. Em módulos que requeiram algum tratamento da amostra podem-se acoplar a unidades de aquecimento como banhos com temperatura controlada, bem como fornos de microondas [23-25]. O emprego de enzimas [26] e reagentes imobilizados em suporte sólidos tem sido bastante empregado, bem como câmaras de diluição, de extração por solventes, entre outros. Reator contendo espuma poliuretana foi acoplado no percurso analítico de um sistema em fluxo proposto para eliminação de interferência causada por metais, Fe(II), Cu(II) e Co(II), na determinação de Al(III) 25 [27]. Vieira et al. [28] acoplaram uma unidade para fotodegradação em linha de resíduos gerados em sistemas em fluxo para determinação de furosemida. I.3. Análise por injeção Sequencial Com a inserção de microcomputadores nos laboratórios e as tendências de novos desafios analíticos, culminou na concepção da análise por injeção sequencial (SIA do inglês: Sequential Injection Analysis), a qual foi proposta por Ruzicka e Marshall [29] nos anos 90. Esta técnica surgiu como uma alternativa versátil e robusta a automatização de procedimentos analíticos complexos. A análise por injeção sequencial, baseia-se na aspiração sequencial (não- segmentada) de volumes precisos de amostra e reagentes para uma bobina coletora. A aspiração das diferentes soluções é efetuada a partir de uma válvula seletora multiposição e os volumes são selecionados através do tempo de aspiração e vazão. Pela inversão do sentido do fluxo, as zonas da amostra e reagentes são transportadas em direção à cela de detecção através de uma bobina de reação, onde ocorre a sobreposição das zonas por uma combinação de efeitos de dispersão axial, dispersão radial e difusão [30,31], originando-se assim, uma zona composta resultante da penetração mútua de duas zonas, conforme evidencia a figura 5. Figura 5 - A) aspiração das zonas de reagente (R) e amostra (A); B) bombeamento das zonas e formação da zona de penetração mútua (P). Assim, a ocorrência da reação depende, além do grau de sobreposição das zonas de amostra e reagente, do tempo de residência no sistema; sendo necessário estudar cuidadosamente as relações dos volumes, bem como das concentrações dos reagentes, mantendo-os estequiométricamente em excesso na zona da reação. Outros parâmetros como comprimento e geometria do reator também devem ser estudados, pois também influenciam a sobreposição das zonas [31]. O grau de sobreposição das zonas adjacentes geralmente é determinado injetando-se corante no lugar de reagentes e amostras, registrando-se o sinal e 26 sobrepondo-os em um mesmo gráfico, conforme mostrado na figura 6. O grau de sobreposição (P) é definido pela expressão [31-33]: P = 2WP/(WA +WR) (equação 1) Figura 6 - Diagrama ilustrando os gradientes de concentração correspondentes à injeção de duas zonas adjacentes em um sistema SIA. onde WA e WR são as larguras de pico na linha de base dos gradientes de concentração da amostra e reagentes, respectivamente, enquanto WP é a largura da região de sobreposição das zonas. Quando ocorre a completa sobreposição das zonas P é igual a 1, porém na ausência de sobreposição completa observa-se o ponto de isodispersão no qual os coeficientes de dispersão da amostra e do reagente são idênticos, onde a razão das concentrações é igual das soluções puras antes de serem injetadas no sistema [31]. A instrumentação em um sistema SIA consiste de uma bomba peristáltica (ou de pistão), uma única linha de transmissão e uma válvula seletora. Esta válvula é o componente principal do sistema, contendo seis ou dez portas, além de uma porta central, a qual tem acesso a cada uma das outras com a rotação da válvula. A bomba e a válvula seletora são controladas através de computador com um software apropriado para controle sincronizado do movimento de ambas. A figura 7 ilustra um sistema SIA. 27 Figura 7 - Sistema de análise por injeção sequencial constituído por bomba eristáltica (PP); bobina coletora (HC); válvula seletora multiposição (SV); bobina de reação (RC) e sistema de detecção. Em cada entrada da válvula de seleção multiposição podem ser conectadas amostras, padrões, reagentes, saídas para o detector, etc. Isto oferece versatilidade ao sistema, pois diferentes procedimentos analíticos podem ser executados simplesmente com alterações no programa de controle sem qualquer alteração física no sistema. Os sistemas em fluxo podem ser acoplados a maioria dos detectores utilizados para análise química, tais como: voltamétricos, fluorimétricos, espectrofotométricos, potenciométricos, amperométricos e condutimétricos. A espectrofotometria UV-VIS é a técnica analítica mais empregada nos laboratórios de rotina em função de seu baixo custo relativo, da facilidade de operação, da sensibilidade atingida, economia no consumo de amostra/reagentes, velocidade de processamento etc. O acoplamento desta técnica a sistemas em fluxo tem se mostrado versátil em função da rapidez e sensibilidade atingida, da facilidade de operar etapas de separação e/ou pré-concentração em condições altamente repetitivas e do gerenciamento de reações não-equilibradas, a detecção, etapas de separação, dispersão, tempos de residência da amostra, adição de reagentes, etc [15]. Sendo assim, neste trabalho foram desenvolvidos métodos explorando a versatilidade dos sistemas FIA e SIA com detecção espectrofotométrica para a determinação de alguns antibióticos em formulações farmacêuticas. 28 II – ASPECTOS GERAIS DOS FÁRMACOS ANALISADOS 29 II.1. Tetraciclina e doxiciclina São antibióticos da classe das tetraciclinas e caracterizam-se pelo esqueleto octaidronaftaceno, sistema formado por quatro anéis condensados e pelo seu amplo espectro de ação. A tetraciclina (figura 8), protótipo desta classe de antibióticos foi obtida pela primeira vez por hidrogenólise da 7-clortetraciclina [34] e recebe o nome químico de 4-(dimetilamino)-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-octaidro-3,6,10,12,12a-pentaidroxi- 6metil-1,11-dioxo-2-naftacenocarboxamida [35]. OH CONH2 CH3 H H H OH O OH OH O OH N(CH3)2 1 2 3 4567 8 9 10 11 12 pKa = 9,5 pKa = pKa = 3,5 7,7 Figura 8 - Estrutura molecular da tetraciclina e suas respectivas frações responsáveis pelos diversos pKas. As tetraciclinas são compostos anfóteros e muitas formam sais hidrossolúveis com ácidos e bases fortes. A protonação do grupo dimetilamino formam sais ácidos estáveis, enquanto os sais básicos são formados por reações com hidróxidos de cálcio, sódio ou potássio e são instáveis em soluções aquosas. Cada molécula possui três grupos ionizáveis, cujos pKas são 3,5, 7,7 e 9,5, respectivamente [35]. No entanto, ácidos e bases fortes inativam as tetraciclinas portadoras do grupo hidroxila na posição 6, por formarem anidrotetraciclinas e isotetraciclinas, respectivamente. Diante disto, na tentativa de evitar tal inativação, desenvolveram- se as 6-desoxitetraciclinas (doxiciclina, metaciclina e sanciclina) - estas, produzidas através de processos semi-sintéticos e de propriedades melhoradas; mais estáveis e de ação mais prolongada [35]. Na figura 9, está ilustrada a estrutura da molécula de doxiciclina. 30 (CH3)2N O OH OHOOH H OHCH3 OH CONH2 Cl Figura 9 - Estrutura molecular da doxiciclina. Devido a presença de grupos capazes de formar pontes de hidrogênio intramoleculares, elas tem propriedades quelantes, formando complexos insolúveis com ferro, cálcio, magnésio e alumínio. Sendo recomendável para uma boa absorção, que elas não sejam administradas com leite, antiácido, laticínios ou produtos ricos nestes sais. Entre outras propriedades químicas, as tetraciclinas apresentam-se como um pó amarelo, inodoro, pouco solúvel em água e estável ao ar, mas a exposição á luz forte provoca o seu escurecimento. É comercializada tanto na forma livre quanto na de cloridrato ou fosfato, enquanto a doxiciclina é empregada na forma de hiclato ou como monohidrato, além de na foram de sal de cálcio [35]. Os compostos desta classe são agentes bacteriostáticos de amplo espectro e representam uma das mais importantes famílias farmacológicas. Mostram-se eficientes no tratamento de infecções causadas por muitas espécies de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, espiroquetas, Rickettsiae, e alguns vírus maiores. São ainda frequentemente utilizadas em medicina veterinária, em nutrição animal e em aditivos alimentares destinados a uso pecuário [36]. II.2. Azitromicina A azitromicina (figura 10), (9-dioxo-9a-aza-9a-metil-9a-homoeritromicina) é um antibiótico macrolídeo semi-sintético obtido a partir da eritromicina, diferenciando-se desta última pela inclusão de um átomo de nitrogênio no anel lactônico, sendo o único representante desta família de antibióticos que apresenta quinze membros no anel [37]. 31 O N CH3 HOO O O OCH3 CH3 CH3 OH CH3H3C N CH3 H3C OH H3C HO OH O O CH3 CH3 H3C H3C Figura 10 - Estrutura molecular da azitromicina. Esta alteração confere a azitromicina melhor estabilidade em pH estomacal, maior poder de penetração nos tecidos e maior tempo de meia vida além de uma expansão no espectro de ação [38]. A azitromicina é primordialmente um antibiótico de ação bacteriostática, podendo exercer ação bactericida sobre microorganismos de alta sensibilidade. Esta substância foi descoberta por cientistas croatas do Laboratório Farmacêutico Pliva e desenvolvida nos Estados Unidos pela Pfizer sendo comunicada em 1986. Foi o primeiro antibiótico macrolídeo aprovado para uso clínico em 1991. Ela age no sentido de bloquear a síntese protéica, especificamente na subunidade 50S das bactérias suscetíveis, inibindo a síntese do RNA- dependente [39]. Este antibiótico apresenta então, ação contra bactérias Gram positivas e Gram negativas, bem como sobre clamídias, micoplasmas, treponemas e micobactérias. É menos potente que a eritromicina na ação contra cocos e bacilos Gram positivos. Entretanto, mostra-se duas a oito vezes mais potente que a eritromicina contra Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus ducreyi, Neisseria gonorrhoeae, Moraxella [Branhamella] catarrhalis, Brucella melitensis, Pasteurella multocida e algumas espécies de Campylobacter e Legionella, sendo particularmente ativa contra Gardenella vaginalis, microorganismo causador da vaginose bacteriana. Apresenta moderada atividade, comparável à da eritromicina, contra microorganismos anaeróbicos [40]. Entre outras propriedades químicas, os macrolídeos apresentam-se como um pó branco cristalino sendo pouco solúveis em água. São bases fracas que se tornam 32 inativas na presença de ácidos, por isso são utilizados sob a forma de sais e ésteres tornando-se mais resistentes aos ácidos. II.3. Norfloxacina e ciprofloxacina Essas substâncias pertencem à classe das quinolonas, as quais constituem um grupo de antimicrobianos de largo espectro de ação, sendo utilizadas no tratamento de infecções causadas por bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e contra microrganismos pouco sensíveis a muitos fármacos, como Chlamydia. As quinolonas estão relacionadas ao ácido nalidíxico (figura 11), fármaco sintetizado a partir da cloroquina em 1962. Desde então se tem desenvolvido grandes quantidades de componentes deste grupo terapêutico. A extensa modificação molecular levou à conclusão de que as posições 3 e 4 da estrutura básica dos quimioterápicos quinolônicos davam origem a compostos inativos e que as variações estruturais mais promissoras eram realizadas nas posições 6 e 7 [41,42]. NN OH OO 1 2 345 6 7 Figura 11 - Estrutura molecular do ácido nalidíxico. Uma das modificações promissoras foi a substituição do grupo metil ligado ao carbono 7 por um anel piperazínico, sendo obtido o ácido pipemídico (figura 12), pois acredita-se que o nitrogênio deste anel aumente a capacidade de quinolônicos que o contêm alcançarem o sítio ativo da enzima-alvo [41]. N N N COOH HN N O CH3 Figura 12 - Estrutura molecular do ácido pipemídico. 33 A modificação mais importante, entretanto, foi a substituição do hidrogênio na posição 6 por um átomo de flúor que resultou em acentuado aumento da atividade antibacteriana [43,44]. Foram também sintetizados compostos contendo cloro, bromo e iodo nessa posição, mas verificou-se que somente o flúor melhora as qualidades do fármaco. Esta é a razão pela qual todas as “novas quinolonas” ou melhor, as “quinolonas de segunda geração”, são derivados contendo o átomo de flúor na posição 6 e consequentemente são também denominadas “fluorquinolonas”. Assim, um dos grandes avanços na potência antimicrobiana contra bactérias gram-negativas e gram-positivas ocorreu em 1978, com a síntese da norfloxacina, a primeira quinolona fluorada para uso clínico em humanos. Apesar de seu espectro de ação mais ampliado, sua indicação clínica limitou-se às infecções urinárias, prostáticas e intestinais, à semelhança do ácido pipemídico, sendo classificada, portanto, como uma quinolona de segunda geração [43,45,46]. Posteriormente, novas quinolonas foram obtidas, sendo que em 1983 surgiu a ciprofloxacina, conhecida como quinolona de terceira geração [43]. N COOH O F HN N CH3 Figura 13 - Estrutura molecular da norfloxacina. A norfloxacina, ácido 1-etil-6-fluor-1,4-dihidro-7-(1-piperazinil)-4-oxo- quinolona-3-carboxílico (figura 13), é um pó cristalino com coloração branca ou amarelo-pálida, higroscópica, ligeiramente solúvel em água, ligeiramente solúvel em acetona e em álcool e solúvel em N,N-dimetilformamida. Fotossensível, a norfloxacina deve ser armazenada em um recipiente fechado, protegido da luz [47]. Ciprofloxacina, ácido 1-ciclopropil-6-fluor-1,4-dihidro-7-(piperazinil)-4-oxo- quinolona-3-carboxílico (figura 14), é pouco solúvel em água; ligeiramente solúvel em ácido acético e metanol; muito pouco solúvel álcool desidratado; praticamente insolúvel em acetona, acetonitrila, acetato de etila, hexano e cloreto de metileno [47]. 34 HN N N COOH O F Figura 14 - Estrutura molecular da ciprofloxacina. 35 III – REVISÃO DA LITERATURA: ALGUNS MÉTODOS PARA DETERMINAÇÃO DOS FÁRMACOS ANALISADOS 36 III.1. Métodos para de determinação de tetraciclina e doxiciclina A Farmacopéia Americana USP [48] preconiza o uso de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com detecção UV para determinação destes compostos em formulações farmacêuticas. No entanto, na literatura existem vários métodos descritos utilizando as mais variadas técnicas. EMARA et al. [49] empregaram um método indireto para determinação espectrofotométrica de tetraciclina em medicamentos. O método é baseado na reação da tetraciclina com 2,2-difenil-1-picril-hidrazina, onde o decréscimo na intensidade da coloração violeta do reagente foi usada para determinar a concentração de tetraciclina. O procedimento envolve complexação do analito com cloreto de cálcio, extração com acetato de etila, seguido por evaporação a pressão reduzida e dissolução do analito em metanol. Posteriormente, uma alíquota é transferida para um balão volumétrico, adicionado tampão acetato pH 6, o reagente e aquecido a 60ºC por 12 minutos. A medida do decaimento de intensidade da cor violeta foi realizada em 520 nm e apresentou uma curva analítica com linearidade no intervalo de 2,5-15 μg mL-1. KHALECK e MAHROUS [50] determinaram algumas tetraciclinas em preparações farmacêuticas por oxidação com solução de vanadato de amônio em ácido sulfúrico. As drogas foram aquecidas à ebulição com vanadato de amônio e ácido sulfúrico concentrado por 10 minutos, resfriado e a absorbância da cor desenvolvida foi medida em 750 nm. O método apresentou faixa linear no intervalo de 20-100 μg mL-1. SULTAN et al. [51] propuseram um método para determinação de tetraciclinas em formulações farmacêuticas. O método é baseado na complexação das tetraciclinas com ferro (III) em ácido sulfúrico diluído com detecção espectrofotométrica em 423 nm. A curva analítica foi linear no intervalo de 10-200 μg mL-1. SASTRY et al. [52] desenvolveram um método indireto para determinação de tetraciclina em formulações farmacêuticas. O mesmo é baseado na reatividade destes compostos com cloramina-T em meio ácido. O método envolve a adição de excesso de cloramina-T de concentração conhecida na presença de 0,25 mol L-1 de HCl e determinação da cloramina-T não reagida, pela medida do decréscimo da 37 absorbância do corante galocianina em 540 nm. A curva analítica apresentou uma curta faixa linear compreendendo o intervalo de 0,4-4,8 μg mL-1. SULTAN [53] desenvolveu um método espectrofotométrico para determinação de tetraciclina em preparações farmacêuticas. O método é baseado na reação da tetraciclina com molibdato de sódio em ácido clorídrico com aquecimento durante 15 minutos em banho maria à 100 ºC. A absorbância do produto formado foi monitorada em 430 nm. O referido método apresentou curva analítica com linearidade no intervalo de 10-140 μg mL-1. SAHA et al. [54] propuseram um método espectrofotométrico utilizando acetato de uranila como reagente para determinação de antibióticos do grupo das tetraciclinas em formulações farmacêuticas. O reagente forma complexo de coloração alaranjado com as drogas em meio de N,N-dimetilformamida e os produtos das reações são monitorados em 414 nm e 405 nm para tetraciclina e doxiciclina, respectivamente. A Lei de Beer’s é obedecida nas faixas de concentrações de 0-115 μg mL-1 e 0-135 μg mL-1, para tetraciclina e doxiciclina, respectivamente. SALINAS et al. [55] desenvolveram um método usando espectrofotometria derivativa usando a primeira derivada para determinar simultaneamente doxiciclina e oxitetraciclina. O método foi aplicado em amostras farmacêuticas, urina e mel sem qualquer pré-tratamento das amostras. A oxitetraciclina foi determinada utilizando a primeira derivada em 344,5 nm e a doxiciclina em 351,5 nm utilizando-se o espectro da mistura dos dois compostos. MAMANI et al. [56] desenvolveram um método usando eletroforese capilar e modelo experimental para determinação simultânea de tetraciclinas em formulações farmacêuticas. O método apresentou linearidade no intervalo de concentração de 10-250 μg mL-1 para determinação de tetraciclina e 10-100 μg mL-1para doxiciclina. GIL et al. [57] desenvolveram um método para determinação de doxiciclina em amostras comerciais por eletroforese capilar. O método foi linear na faixa de concentração de 250-3000 μg mL-1 e o limite de quantificação foi de 1,2 μg mL-1com desvio padrão relativo de 12,6%. PALAHARN et al. [58] propuseram um sistema de análise por injeção em fluxo com detecção amperométrica pulsada para análise de tetraciclina em formulações farmacêuticas. O método apresentou curva linear na faixa de concentração de 0,005- 0,6 mM. 38 MEDINA et al. [59] propuseram um sistema de análise em fluxo contínuo combinando o método de extração em fase sólida com detecção espectrofotométrica na região UV para determinação de tetraciclina, doxiciclina, oxiciclina e clorotetraciclina em formulações farmacêuticas. Um sistema de análise por injeção em fluxo contínuo com detecção espectrofotométrica foi proposto por SOLICH et al. [60]. O método baseia-se na formação do corante iminoquinona, obtido pela reação das tetraciclinas com 4- aminofenazona e hexacianoferrato (III) com monitoramento em 520 nm. As curvas analíticas foram linear no intervalo de 1-20 μg mL-1 e 20-250 μg mL-1 para a tetraciclina e doxiciclina, respectivamente. LIAWRUANGRARH et al. [61] propuseram um procedimento de análise em fluxo com detecção espectrofotométrica para determinação de tetraciclina em preparações farmacêuticas. O método é baseado na complexação da tetraciclina com alumínio (III), em meio tamponado (pH 7.0), sendo o complexo Al(III)-tetraciclina monitorado em 376 nm. O método foi linear no intervalo de 0,5-10,0 μg mL-1 e apresentou frequência analítica de 165 amostras h-1. Um sistema de análise por injeção em fluxo com detecção quimiluminescente para determinação de tetraciclina em formulações comerciais foi proposto por Li et al. [62]. O método proposto é baseado na quimiluminescência da reação redox MnO4-TCs em meio ácido (HCl) na presença de solução micelar de éter octilfenilpoliglicol (OP). A curva de calibração de tetraciclina foi linear na faixa de 1- 1000 μg mL-1, com limite de detecção para tetraciclina, oxitetraciclina e clorotetraciclina 0,40, 0,52 e 0,60 μg mL-1, respectivamente. WANGFUENGKANAGUL et al. [63] desenvolveram um método em fluxo com detecção amperométrica usando um eletrodo de diamante dopado com filme fino de boro para determinação de tetraciclinas. O método foi baseado na oxidação eletroquímica da tetraciclinas e apresentou limite de detecção de 10 nM e a faixa linear de calibração encontrada foi 0,1-50 mM e 0,5-50 mM para tetraciclina e doxiciclina, respectivamente. ZHENG et al. [64] desenvolveram um método em fluxo para determinação de tetraciclinas em formulações farmacêuticas por quiluminescência. Neste método as tetraciclinas aumentam o sinal quiluminescente produzido pela reação do H2O2 com o reagente Br2 que é produzido “in situ” na superfície do eletrodo de platina por oxidação de KBr em meio ácido. O método apresentou curvas analíticas com 39 linearidade nas faixas de concentrações de 0,03-50 μg mL-1, 0,2-24 μg mL-1 e 0,1-50 μg mL-1para tetraciclina, oxitetraciclina e clorotetraciclina, respectivamente. III.2. Métodos para de determinação de Azitromicina A Farmacopéia Americana USP [48] recomenda o uso de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com detecção amperométrica, fase móvel com pH elevado (pH 11) e coluna específica “Gamma-alumina” para determinação de azitromicina em formulações farmacêuticas. No entanto, alguns métodos espectrofotométricos com detecção na região visível estão descritos na literatura; estes baseados em diferentes tipos de reações químicas. SUHAGIA et al. [65] propuseram um método com detecção espectrofotométrica para determinação de azitromicina em formulações farmacêuticas. No método proposto, azitromicina é oxidada com permanganato de potássio liberando formaldeído, que é determinado em situ usando acetil cetona, na presença de acetato de amônio. O produto formado apresentou coloração amarela com absorção máxima em 412 nm e o método é linear na faixa de concentração de 10-75 μg mL-1 com porcentagem de recuperação de 98,3 -101,7 %. SIVASUBRAMANIAN et al. [66] desenvolveram dois métodos com detecção espectrofotométrica para determinação de azitromicina em forma pura e formulações farmacêuticas. Um dos métodos é baseado reação da azitromicina com cloreto férrico e 1,10-fenantrolina com formação de um composto de coloração vermelha com absorbância máxima em 490 nm. Este método apresenta linearidade no intervalo de concentração de 2,5-15 μg mL-1. O outro método é baseado na reação da azitromicina com o reagente de Folin-Ciocalteau formando um produto de coloração azul, o qual mostra máxima absorbância em 720 nm. O método obedece a lei de Beer na faixa de concentração de 25-150 μg mL-1. SULTANA et al. [67] propuseram um método para determinação de azitromicina em formulações farmacêuticas baseado na hidrólise ácida da droga com ácido sulfúrico 27 N . O produto de degradação obtido após aquecimento à 60 ºC por 30 minutos é monitorado espectrofotometricamente em 482 nm. A curva analítica foi linear no intervalo de concentração de 2,0 x 10-5 – 2,0 x 10-4 mol L-1. ABDELMAGEED [68] determinou azitromicina em formulaçôes farmacêuticas através do método de condensação de 2,4-difenilhidrazina com a droga em meio ácido. Neste método, a mistura foi aquecida em banho maria até a secura e o 40 resíduo resfriado à temperatura ambiente; solubilizado em solução metanólica de hidróxido de potássio, seguido por diluição em dimetilformamida (DMF) e o sinal de absorbância do produto formado foi monitorado espectrofotometricamente em 542 nm. A curva analítica apresentou linearidade na faixa de concentração de 5-40 μg mL-1. WALASH et al. [69] propuseram um método para determinação de azitromicina em formulações farmacêuticas e fluidos biológicos com detecção espectrofotométrica. O método proposto é baseado na formação de um complexo binário entre a droga e eosina em meio tamponado com absorbância máxima em 542 nm. O método apresentou linearidade na faixa de concentração 1-10 μg mL-1 e porcentagem média de recuperação de 99,5-100,4 %. RACHIDI et al. [70] desenvolveram um método espectrofotométrico para determinação de azitromicina em formulações farmacêuticas. O método é baseado na formação do par iônico entre a droga e o complexo inorgânico Mo(V)-tiocianato, seguido por extração com dicloroetano. O complexo de cor alaranjada exibe absorbância máxima em 469 nm. A curva analítica foi linear no intervalo de 10-6-10-5 mol L-1. Sistemas de análise por injeção em fluxo também estão descritos. No entanto, aqueles encontrados na literatura e que apresentam boa performance são apenas dois sistemas: um com detecção amperométrica e o outro quimiluminescente, citados a seguir. Um sistema de análise por injeção em fluxo com detecção amperométrica para determinação de azitromicina em formulações farmacêuticas foi proposto por PALOMEQUE E ORTÍZ [71]. O método é baseado na oxidação eletroquímica da azitromicina à + 0,9 V em solução tamponada de Britton-Robinson (pH 8,0), que é determinada usando um eletrodo de carbono vítreo e um eletrodo de referência de Ag/AgCl/NaCl (3,0 M). O método apresentou curva analítica com linearidade na faixa de 1,0-10,0 μg mL-1 e limite de detecção de 0,7 μg mL-1. SONG e WANG [72] propuseram um método quimiluminescente utilizando sistema de análise por injeção em fluxo para determinação de azitromicina. Neste método a azitromicina provoca um aumento significativo na quimiluminescência do sistema luminol-peróxido de hidrogênio. A curva analítica é linear no intervalo de concentração de 0,1 pg mL-1 à 1,0 ng mL-1. O método foi aplicado na determinação 41 de azitromicina em amostras farmacêuticas, urina humana e soro sem qualquer pré- tratamento. III.3. Métodos para determinação de norfloxacina e ciprofloxacina Estes fármacos são fortes absorventes de luz na região do ultravioleta do espetro, portanto, muitos métodos foram desenvolvidos baseando-se nas medidas de suas absorbâncias nesta região. Um método espectrofotométrico para determinação simultânea de norfloxacina e timidazol foi descrito por SRINIVASA et al. [73] medindo-se o sinal de absorbância de suas soluções em DMF à 275,6 e 317,8 nm ou medindo a diferença em suas absorbância de 275,6 para 353,6 nm e de 317,8 para 254,2 nm para norfloxacina e timidazol, respectivamente. DAHIBHATE et al. [74] descreveram um método similar para a mesma mistura. A absorbância da solução dos dois fármacos em 0,01 mol L-1 de ácido acético foi obtida no intervalo de 200 a 400 nm e os sinais de absorbância em 227 e 316 nm foram utilizados. CÓRDOBA-BORREGO et al. [75] determinaram norfloxacina na presença de diferentes antiácidos (derivados de Al e Mg) por medidas espectrofotométricas em 276 nm. PATEL et al. [76] determinaram ciprofloxacina em amostra contendo ornidazole por espectrofotometria na região do ultravioleta. Neste método a concentração de norfloxacina foi determinada usando equação simultânea. A reação de quinolonas com íons metálicos para produzir complexos coloridos foi utilizada por muitos autores para desenvolver métodos para suas determinações. BHOWAL et al. [77] propuseram um método baseado na reação de norfloxacina, ciprofloxacina, cinoxacina e ácido nalidíxico com cloreto férrico em DMSO/metanol produzindo complexos de cor alaranjado com máximos de absorbâncias em 440, 442, 490 e 430 nm, respectivamente. As curvas analíticas apresentaram linearidades nas faixas de 50-125, 40-100, 4-100 e 40-100 μg mL-1, respectivamente. RAO et al. [78] descreveram dois métodos espectrofotométricos para determinação de ciprofloxacina. O primeiro envolvendo o uso de 0,2% FeCl3 / 0,5 mol L-1 de HCl, enquanto o segundo foi baseado no uso de 3-metilbenzotiazolin- 2-ona hidrazona/sulfato cérico. Nitrato férrico também foi usado para determinação de ciprofloxacina, um produto de coloração amarelo-alaranjado com máximo de absorbância em 435 nm foi obtido em 0,1% de ácido nítrico [79]. 42 Um método espectrofotométrico foi proposto para norfloxacina e ciprofloxacina baseado na formação do complexo ternário com eosina e Pd(II) em tampão acetato pH 4,0 ou 4,2 e medida de absorbância do produto colorido em 545 nm sobre a faixa de concentração de 3-10 μg mL-1 [80]. RAHMAN et al. [81] descreveram um método espectrofotométrico cinético para determinação de norfloxacina. O método é baseado na oxidação da norfloxacina com permanganato de potássio alcalino. A formação de complexos de transferência de carga entre quinolonas como elétron doadores e alguns �-aceptores também são base para alguns métodos espectrofotométricos. MOSTAFA et al. [82] desenvolveram métodos para determinação de norfloxacina, erofloxacina e pefloxacina através da formação de complexo de transferência de carga com três aceptores; ácido cloranílico (CL), tetracianoetileno (TCNE) e 2,3-dicloro-5,5-diciano-p-benzoquinona (DDQ). Norfloxacina foi determinada em comprimidos por AL-KAMEES [83] usando p-benzoquinona (BQ), o complexo formado apresentou absorbância máxima em 495 nm e o método foi linear na faixa de 15-40 μg mL-1. Um método utilizando p-nitrofenol como reagente foi descrito por XUAN et al. [84] para a determinação de ácido pipemídico, norfloxacina e ciprofloxacina em meio aquoso para produzir complexos com absorbâncias em 404, 407 e 403 nm, respectivamente, a faixa linear foi 0,1-12, 0,3-16, 0,1-18 μg mL-1, respectivamente. WALILY et al. [85] determinaram norfloxacina em formulações farmacêuticas usando 2,4-dinitrofluorbenzeno com reagente cromogênico. DARWISH et al. [86] desenvolveram um método cinético com detecção espectrofotométrica para determinação de norfloxacina em formulações farmacêuticas. O método é baseado na reação do N-vinilpiperazino formado pela interação do grupo piperazinil na norfloxacina e acetaldeído com 2,3,5,6-tetracloro-1,4-benzoquinona, dando um produto colorido que foi monitorado espectrofotometricamente em 625 nm. Alguns métodos em fluxo são descritos na literatura para determinação destes fármacos. PASCUAL-RUGUERA et al. [87] descreveram um método em fluxo com concentração em sephadex SP C-25 na cela de fluxo e detecção espectrofotométrica para determinação de ciprofloxacina em amostras farmacêuticas. 43 Outro método em fluxo, neste caso utilizando análise por injeção sequêncial (SIA) com detecção espectrofotométrica foi proposto por SULIMAN et. al [88] para determinação de norfloxacina e ciprofloxacina em formulações farmacêuticas. O método é baseado na reação de complexação da norfloxacina e ciprofloxacina com Fe(III) em meio de ácido sulfúrico diluído com absorbâncias em 430 e 447 nm, respectivamente. WANG et al. [89] propuseram um método baseado no realce quimiluminescente do sistema luminol-peróxido de hidrogênio catalisado por nanopartículas (NPs) de ouro pelas fluorquinolonas. O método foi aplicado para determinação de algumas fluorquinolonas, entre elas, norfloxacina e ciprofloxacina em urina humana. YU e BAO [90] determinaram norfloxacina em urina humana utilizando um método quimiluminescente. O método é baseado no aumento da fraca quimiluminescência da reação redox Ce(IV)-Na2SO3 catalisada por nanopartículas de ouro pela norfloxacina. LIANG et al [91] descreveram um método para determinação de algumas fluorquinolonas incluindo ciprofloxacina, norfloxacina e ofloxacina em formulações farmacêuticas. O método é baseado no aumento da fraca quimiluminescência do sistema NaNO2-H2SO4/H2O2 por estes compostos. Na tabela 1, estão mostradas as figuras de mérito dos métodos em fluxo para determinação de norfloxacina e ciprofloxacina citados. Ta be la 1 - Fi gu ra d e m ér ito d e si st em as e m fl ux o pa ra d et er m in aç ão d e no rfl ox ac in a (N FX ) e /o u ci pr of lo xa ci na (C P X ). D et ec çã o R ea ge nt es C ur va a na lít ic a Li m ite d e de te cç ão R ef er ên ci a *F IA -E sp ec tro fo to m et ria Á ci do fó rm ic o / N aO H 1, 75 M (p H 2 ,2 ) C P X = 0 ,5 -1 0 μg m L-1 0, 03 5 μg m L-1 87 S IA -E sp ec tro fo to m et ria Fe (II I) / H 2S O 4 0 ,0 05 M C P X = 5 O -5 00 μ g m L-1 N FX = 5 0- 40 0 μg m L-1 - - 88 FI A -Q ui m ilu m in es ce nt e Lu m in ol -H 2O 2- N P s( A u) N FX = 0 ,0 8- 1, 28 μ g/ m L C P X = 0 ,0 13 -1 ,3 2 μg /m L N FX = 3 ,2 n g m L-1 C P X = 9 ,5 n g m L-1 89 FI A -Q ui m ilu m in es ce nt e C e( IV )-N a 2 SO 3- N P s( A u) N FX = 7 ,9 x 1 0-7 -1 ,9 x1 0-5 m ol L -1 N FX = 8 ,2 x 1 0-8 m ol L -1 90 FI A -Q ui m ilu m in es ce nt e N aN O 2- H 2S O 4/H 2O 2 N FX e C P X 1, 0 × 10 �7 -1 ,0 × 1 0�5 m ol L -1 N FX = 5 ,9 × 1 0�8 m ol L -1 C P X = 4 ,5 × 1 0�8 m ol L -1 91 * pr é- co nc en tra çã o em s ep ha de x S P C -2 5 45 IV – OBJETIVO 46 Objetivo: O objetivo desse trabalho compreende o desenvolvimento e otimização de métodos analíticos envolvendo derivatização e análise espectrofotometria na região visível para determinação de tetraciclina, doxiciclina, azitromicina, norfloxacina e ciprofloxacina. Automatização utilizando procedimentos de análise por injeção em fluxo (FIA) para determinação de tetraciclina, doxiciclina e azitromicina; e análise por injeção sequencial (SIA) para determinação de norfloxacina e ciprofloxacina em formulações farmacêuticas. 47 V - DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO PARA DETERMINAÇÃO DE TETRACICLINA E DOXICICLINA 48 V.1. PARTE EXPERIMENTAL V.1.1. Materiais e Equipamentos � Micropipetas “Eppendorf” (10 -100 �L) e “Sealpette” (100 -1000�L); � Balança analítica Metler, modelo H10; � Banho de ultra-som, marca Thornton; � Espectrofotômetro USB 4000 (Ocean Optics, Dunedin, USA) munido de cubeta de vidro com caminho ótico de 10 mm; � Banho termostático equipado com controlador digital N322-T e sensor de temperatura PT-100 com resolução de 0,1°C. V.1.2. Reagentes e soluções � Na2CO3 de grau analítico (Reagen); � Cloramina-T Trihidratada (J.T.Baker, Mexico, 13% de cloro livre); � Cloridrato de tetraciclina (Purifarma, Brasil, pureza 99,7%); � Cloridrato de doxiciclina (Deg, Brasil, pureza 99%); � H20 deionizada; � Excipientes de grau farmacêutico. � Papel de filtro qualitativo Whatman 41. V.1.3. Preparo das soluções padrão e reagentes a) Solução de tetraciclina (1,04 x 10-2 mol L-1): Foram preparadas diariamente soluções estoques pela dissolução de 50 mg do fármaco em balão volumétrico de 10 mL com H2O deionizada. b) Solução de doxiciclina (1,75 x 10-3 mol L-1): Foram preparadas diariamente soluções estoques pela dissolução de 10 mg do fármaco em balão volumétrico de 10 mL com H2O deionizada. c) Solução de cloramina-T trihidratada (6% m/v): Foi preparada pela dissolução de 6 g do sólido em balão volumétrico de 100 mL com H2O deionizada. A solução foi mantida em refrigerador a 4°C por no máximo uma semana. 49 d) Solução de Na2CO3 (1 % m/v): Foi preparada pela dissolução de 1g do sólido em balão volumétrico de 100 mL com H2O deionizada. V.1.4. Amostras As amostras comerciais de medicamentos contendo cloridrato de tetraciclina e cloridrato de doxiciclina foram adquiridas em farmácias locais e analisadas pelo método proposto e por CLAE [48]. V.1.4.1. Preparo das amostras Doxiciclina comprimidos: vinte comprimidos de um mesmo lote da amostra comercial foram pesados em balança analítica e determinou-se o valor da massa média. Posteriormente, os mesmos foram pulverizados em gral de ágata e uma porção equivalente a aproximadamente 10 mg do fármaco foi pesada, dissolvida em H2O deionizada, transferida para balão volumétrico de 10 mL, colocou-se no ultrassom por 5 minutos para auxiliar na dissolução do analito e o volume foi completado com H2O deionizada. Posteriormente, a mistura foi filtrada em papel de filtro qualitativo Whatman 41. Transferiu-se com micropipeta 0,50 mL do filtrado para um tubo de 10 mL com tampa de rosca, adicionou-se 1,30 mL de H2O, 0,70 mL de solução de Na2CO3, 2,50 mL de solução de cloramina-T. O tubo foi fechado e aquecido em banho termostatizado à 65°C por 5 minutos, após aquecimento, o mesmo foi resfriado à temperatura ambiente e o sinal de absorbância foi medido em 525 nm contra um branco de reagentes preparado da mesma forma como descrito anteriormente. Tetraciclina cápsulas: vinte cápsulas de um mesmo lote foram pesadas em balança analítica, seu conteúdo retirado e então a cápsula vazia pesada a fim de se obter a massa do pó contido dentro da cápsula. Determinou-se o valor da massa média do pó contido dentro da cápsula e uma porção equivalente a aproximadamente 10 mg do fármaco foi pesada, dissolvida em H2O deionizada, transferida para balão volumétrico de 10 mL e o volume completado com H2O deionizada. Posteriormente, a mistura foi filtrada em papel de filtro qualitativo 50 Whatman 41. Transferiu-se com micropipeta 0,50 mL do filtrado para balão volumétrico de 10 mL, adicionou 0,70 mL de solução de Na2CO3 e 2,50 mL de solução de cloramina-T. Posteriormente, o volume foi completado com H2O deionizada e após 12 minutos o sinal de absorbância foi medido em 535 nm contra um branco de reagentes preparado da mesma forma como descrito anteriormente. V.1.5. Otimização das condições experimentais As condições experimentais foram otimizadas através de métodos multivariados (planejamentos fatoriais e metodologia de superfície de resposta) [92,93] e os resultados obtidos foram analisados utilizando o programa Statistica, versão 6.0. V.1.6. Validação do método Para a validação do método proposto foram avaliados parâmetros como: seletividade, sensibilidade, exatidão, precisão, linearidade, limite de detecção (LOD), limite de quantificação (LOQ) [94-96]. Os limites de detecção e de quantificação foram determinados de acordo com a recomendação da IUPAC [95], isto é: LOD = 3 � / b (equação 2) LOQ = 10 � / b (equação 3) onde ”�” corresponde ao desvio padrão das dez medidas do branco e “b”, o coeficiente angular da reta. V.1.7. Estudo de efeito de matriz Para estudos da probabilidade de efeitos de matriz foi utilizado o método de adição de padrão. Para este estudo, incrementos de 0, 50, 100, 150 e 200% de solução-padrão foram adicionadas à alíquotas das amostras de mesmo volume [94]. 51 V.1.8. Estudos de interferentes O efeito dos interferentes em potencial na determinação de tetraciclinas em amostras farmacêuticas foi avaliada para os excipientes comumente existentes em formulações farmacêuticas. Nesse estudo, foram comparados os sinais analíticos obtidos empregando-se soluções de referência de tetraciclina e os sinais analíticos obtidos empregando-se soluções de tetraciclina com os respectivos excipientes em concentração 10 vezes a concentração de tetraciclina. V.1.9. Método Comparativo O sistema de HPLC empregado no método comparativo consiste de um cromatógrafo líquido Shimadzu SPD-10A, com detector UV-Vis (SDR-10A, Shimadzu), loop de 20�L e coluna analítica Microsorb-MV C-18 (250 x 4.6 mm, Varian, USA), empacotada com partícula de 5 μm. V.2. RESULTADOS E DISCUSSÕES Cloramina-T (CAT; N-cloro-p-toluenosulfonamida sódio) é o mais importante membro da família orgânica de haloamina e comporta-se como um agente oxidante em meio ácido ou alcalino [97]. Isto tem aumentado o interesse no papel da CAT como reagente analítico na determinação de muitos compostos orgânicos [52,98-100]. Em testes preliminares realizados em nosso laboratório foi constatada que a tetraciclina e doxiciclina em meio alcalino de Na2CO3 reagem com CAT formando um produto colorido. Diante desta constatação foi desenvolvido um método para determinação destes fármacos em amostras farmacêuticas. A figura 15, ilustra os espectros dos produtos das reações entre tetraciclina e doxiciclina com CAT. 52 400 500 600 700 800 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 Ab so rb ân ci a Comprimento de onda Branco Tetraciclina Doxiciclina Figura 15 - Espectros de absorção dos produtos das reações de tetraciclina e doxiciclina com CAT. V.2.1. Estudo da estabilidade óptica dos produtos Para este estudo, 1,0 ml de solução estoque dos padrões foram transferidos para balões volumétricos de 10 mL, seguido por adição de 1,0 mL de solução de Na2CO3 1% m/v, 2,0 mL de solução de CAT 6% m/v e o volume completado com H2O deionizada. Na sequência, os valores de absorbância dos produtos foram monitorados durante 60 minutos, em intervalo de 2 minutos, no comprimento de onda de máxima absorbância (�DXC= 525 nm e �TC = 535 nm). Pode ser visualizado na figura 16, que após 12 minutos, o produto formado da reação da tetraciclina permaneceu estável por pelo menos 40 minutos, pois não houve variação significativa nos valores de absorbância medidos neste intervalo de tempo. Entretanto, o produto formado da reação de doxiciclina após 60 minutos não se estabilizava. Sendo assim, foi realizado um estudo mediante aquecimento com o intuito de aumentar a cinética da reação - promovendo assim, a estabilidade do produto formado. 53 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 Ab so rb ân ci a Tempo (min) Figura 16 – Gráfico da estabilidade do composto formado com a tetraciclina. Para este estudo, 1,0 ml de solução estoque do padrão de doxiciclina foi transferido para um tubo de ensaio com tampa de rosca; em seguida foram adicionados 1,0 mL de solução de Na2CO3 (1% m/v), 2,0 mL de solução de CAT (6% m/v) e 1,0 mL de H2O deionizada. O tubo foi fechado e submetido ao aquecimento em banho termostatizado à 60 ºC por 10 minutos. Posteriormente, o mesmo foi resfriado à temperatura ambiente e novamente realizado o teste de estabilidade. Observou-se que o composto apresentou estabilidade por pelo menos 60 minutos, pois não ocorreu variação significativa nos valores de absorbância medida neste intervalo de tempo, o que pode ser visualizado no gráfico da figura 17. 54 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 A bs or bâ nc ia ( 52 5 nm ) Tempo (minuto) Figura 17 - Gráfico da estabilidade do composto formado com a doxiciclina após aquecimento de 10 minutos à 60ºC e resfriado à temperatura ambiente. V.2.2. Otimização das variáveis para tetraciclina A otimização das variáveis foi realizada utilizando métodos multivariados, onde as variáveis, volume de CAT e volume de Na2CO3 foram estudadas através do planejamento fatorial completo (22), em dois níveis [baixo (-1) e alto (+1)] resultando em 4 experimentos. Os experimentos foram realizados utilizando balões volumétricos de 10 mL e a concentração final de tetraciclina em 2,07 x 10-4 mol L-1. Neste planejamento, os experimentos foram executados em duplicata e os resultados mostraram que o experimento 3 (tabela 2) apresentou uma maior resposta de absorbância. 55 Tabela 2 - Matriz do planejamento fatorial completo para triagem das variáveis com os respectivos valores de absorbância. Experimento Na2CO3 CAT A1 A2 1 - (1 mL) - (1 mL) 0,343 0,324 2 + (2 mL) - (1 mL) 0,295 0,292 3 - (1mL) + (2 mL) 0,536 0,504 4 + (2 mL) + (2 mL) 0,379 0,421 Como resultado do planejamento fatorial completo, o gráfico de Pareto (Figura 18) foi obtido para visualização dos efeitos estimados dos fatores principais. O gráfico de Pareto fornece uma representação gráfica para estes fatores e permite olhar a magnitude e a importância de cada efeito. Neste gráfico, as barras (fatores) que ultrapassam a linha de significância exercem uma influência estatisticamente significativa sobre o resultado. Assim, pode ser claramente observado na figura 18, que os dois fatores exerceram efeito significativo sobre a resposta. De acordo com a figura, o fator mais importante é o volume do reagente CAT, com um efeito de sinal positivo, indicando que uma melhor resposta é obtida quando este fator está ajustado no nível alto (+1). O volume de Na2CO3 também exerce certa influência sobre a resposta, porém seu efeito de sinal é negativo, indicando que uma melhor resposta é obtida quando este está ajustado no nível baixo (-1). 56 -5,69 10,43 p = 0,05 Efeito Estimado Volume de Na2CO3 Volume de CAT Figura 18 - Gráfico dos principais efeitos dos fatores estudados. Com base nos resultados obtidos no planejamento fatorial completo, um planejamento composto central foi então delineado visando obter as melhores condições para a reação. Neste planejamento, o volume de solução de Na2CO3 e o volume de solução de CAT foram estudados em cinco níveis. Os pontos (níveis) de um planejamento composto central estão a uma distância de 2 unidade codificada do ponto central (codificado como ponto zero); desta forma todos os pontos estão sobre uma circunferência com raio 2 . Realizados os ensaios do planejamento composto central, os resultados foram analisados usando o programa Statistica versão 6.0. Na Tabela 3 está representada a matriz utilizada e a média de seus respectivos valores de absorbância. 57 Tabela 3 - Matriz do planejamento composto central com suas respostas de absorbância. Fatores codificados Fatores não codificados Experimento Na2CO3 CAT Na2CO3 CAT A 535 nm 1 - - 0,560 1,975 0,707 2 + - 0,840 1,975 0,685 3 - + 0,560 2,825 0,713 4 + + 0,840 2,825 0,693 5 0 0 0,700 2,400 0,730 6 0 0 0,700 2,400 0,748 7 0 0 0,700 2,400 0,730 8 0 0 0,700 2,400 0,742 9 -1,41 0 0,500 2,400 0,693 10 +1,41 0 0,900 2,400 0,710 11 0 -1,41 0,700 1,800 0,676 12 0 +1,41 0,700 3,000 0,705 Concentração de tetraciclina = 2,07 x 10-4 mol L-1 A metodologia de superfície de resposta (RSM) é uma poderosa ferramenta experimental para otimizar parâmetros múltiplos e inter-relacionados. Na implementação deste método, experimentos foram conduzidos de forma a alcançar valores de cada um dos fatores estudados (variáveis independentes) que dariam maiores valores de absorbância (variável dependente). Os valores da variável dependente foram medidos para cada uma das condições das variáveis independentes (volume de solução de Na2CO3 1% m/v e volume de solução de CAT 6% m/v). Em seguida, uma superfície de resposta foi obtida. Na Figura 19 está ilustrada a superfície de resposta juntamente com sua respectiva curva de nível, nela a região do valor máximo de absorbância está situada na área mais escura do gráfico, que representa as condições experimentais ótimas para a realização da reação. 58 Figura 19 - Superfície de resposta otimizada com sua respectiva curva de nível em função das variáveis: volume de solução de Na2CO3 e volume de solução de CAT. Após a realização de toda a análise estatística dos dados e definida a superfície de resposta determinou-se matematicamente que as melhores condições experimentais seriam 0,69 mL de solução de Na2CO3 e 2,46 mL de solução de CAT. Os resultados obtidos a partir deste planejamento (Tabela 3) foram ajustados a um modelo matemático quadrático descrito pela Eq. 4, utilizando o programa Statistica, versão 6.0. Z = - 4,24 x 10-2 + 1,17 x - 8,58 x 10-2 x2 + 6,15 x 10-2 y - 1,26 x 10-2 y2 + 5,04 x 10-3 xy (Eq. 4) Onde Z representa o sinal de absorbância, x volume de Na2CO3 e y volume de CAT. Posteriormente, foram realizados experimentos em replicata (n = 4) utilizando-se 0,70 mL de solução de Na2CO3 e 2,50 mL de solução de CAT e 59 verificado a concordância entre o resultado obtido com àquele predito matematicamente. O resultado predito pelo modelo matemático foi 0,738 e o encontrado experimentalmente foi 0,742 ± 0,0018 (R.S.D. = 0,24 %), a um nível de confiança de 95,0%. Diante desses resultados, foi determinado como condição ótima 0,70 mL de solução de Na2CO3 e 2,50 mL de solução de CAT, o que corresponde à concentração final de 0,07% m/v de Na2CO3 e 1,50% m/v de CAT. V.2.3. Otimização das variáveis para doxiciclina Como foi observado em testes realizados, a cinética da reação de formação do produto da doxiciclina é lenta e necessita ser acelerada por aquecimento por um determinado tempo. Diante desta observação, foi realizado planejamento para estudar além dos fatores Na2CO3 e CAT, os fatores tempo e temperatura de aquecimento. Neste caso, com 4 fatores foi realizado planejamento fatorial fracionado 2 (4-1) em duplicata nos níveis baixo (-) e alto (+), resultando em 8 experimentos. Na tabela 4 estão representados a matriz do planejamento e seus resultados. Tabela 4 - Matriz do planejamento fatorial fracionário 2 (4-1) para triagem das variáveis com os respectivos valores de absorbância. Variáveis A (525 nm) Experimento Na2CO3 CAT T / °C t / min A1 A2 1 (-) 0,7 (-) 2,0 (-) 60 (-) 5 1,036 1,029 2 (+) 1,0 (+) 2,5 (-) 60 (-) 5 1,076 1,057 3 (+) 1,0 (-) 2,0 (+) 80 (-) 5 0,926 0,939 4 (-) 0,7 (+) 2,5 (+) 80 (-) 5 0,891 0,888 5 (+) 1,0 (-) 2,0 (-) 60 (+) 10 0,978 0,977 6 (-) 0,7 (+) 2,5 (-) 60 (+) 10 1,070 1,076 7 (-) 0,7 (-) 2,0 (+) 80 (+) 10 0,765 0,765 8 (+) 1,0 (+) 2,5 (+) 80 (+) 10 0,727 0,724 Concentração de Doxiciclina = 3,46 x 10-4 mol L-1 60 Pode ser observado no gráfico da figura 20, que os fatores tempo e a temperatura apresentam efeitos significativos de sinal negativo, isso indica que uma melhor resposta é obtida quando estes fatores estão ajustados no nível baixo (-1). O volume de solução de CAT apresenta um efeito não significativo de sinal positivo e, portanto fixado em 2,50 mL que corresponde à concentração de 3,0 % m/v. O volume de solução de Na2CO3 também exerce certa influência não significativa sobre a resposta, porém seu efeito de sinal é negativo, sendo fixado em 0,70 mL, nível (-1), que corresponde à concentração de 0,14% m/v. 3,73 -4,61 -30,18 -66,48 p = 0,05 Efeito Estimado Volume de CAT Volume de Na 2CO3 tempo Temperatura Figura 20 - Gráfico dos efeitos individuais das variáveis. Posteriormente, os fatores (variáveis) tempo e temperatura foram otimizados através de um planejamento composto central, onde os mesmos foram estudados em cinco níveis, conforme tabela 5. Os resultados obtidos a partir deste planejamento (Tabela 5) foram ajustados a um modelo matemático quadrático descrito pela Eq. 5, utilizando o programa Statistica, versão 6.0. Z = - 2,47 + 9,09 x10-2 x – 5,85 x10-4 x2+ 2,10 x 10-1y – 4,25 x 10-3 y2 – 2,50 x10-3xy (Eq. 5) Onde Z representa o sinal de absorbância, x a temperatura e y o tempo. 61 Após a realização dos experimentos, a análise estatística dos dados foi realizada e obtida a superfície de resposta (figura 21), onde foi determinada matematicamente que as melhores condições experimentais são: tempo de aquecimento de 4,85 minutos e temperatura de 67,5°C. Tabela 5 - Matriz e resultados do planejamento composto central para doxiciclina. Variáveis codificadas Valores das variáveis Experimento Temperatura Tempo Temperatura Tempo A 525 nm 1 - - 45 3 0,750 2 + - 75 3 1,164 3 - + 45 9 0,957 4 + + 75 9 0,920 5 0 0 60 6 1,094 6 0 0 60 6 1,090 7 0 0 60 6 1,086 8 0 0 60 6 1,094 9 -1,41 0 40 6 0,715 10 +1,41 0 80 6 0,923 11 0 -1,41 60 2 0,897 12 0 +1,41 60 10 1,072 62 Figura 21 - Superfície otimizada com sua respectiva curva de nível em função das variáveis: tempo e temperatura para doxiciclina de resposta. Foram realizados experimentos em replicata (n = 4) nas condições de 5 minutos e 65º C e verificado uma concordância entre os valores de absorbância obtida (1,049 ± 0,0006) (R.S.D. = 0,06 %) com o valor predito matematicamente (1,137). Sendo assim, aquecimento por 5 minutos à temperatura de 65° C foi considerado ideal para a realização dos experimentos. Na tabela 6 estão mostradas as condições otimizadas para o método de determinação de tetraciclina e doxiciclina. 63 Tabela 6 - Condições otimizadas do método para tetraciclina e doxic