RESSALVA Atendendo solicitação da autora, o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 28/08/2025. Câmpus de São José do Rio Preto Laura Luciana de Melo Moreira Silva Ação do óleo de Cannabis sativa na expressão de genes e proteínas envolvidas na via inflamatória PTGS2 São José do Rio Preto 2023 Laura Luciana de Melo Moreira Silva Ação do óleo de Cannabis sativa na expressão de genes e proteínas envolvidas na via inflamatória PTGS2 Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biociências, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biociências, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Financiadora: CAPES FAPERP Orientadora: Profª. Drª. Claudia Regina Bonini Domingos Coorientadora: Profª. Drª. Flávia Cristina Rodrigues Lisoni São José do Rio Preto 2023 Laura Luciana de Melo Moreira Silva Ação do óleo de Cannabis sativa na expressão de genes e proteínas envolvidas na via inflamatória PTGS2 Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biociências, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biociências, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Financiadora: CAPES FAPERP Comissão Examinadora Profª. Drª. Claudia Regina Bonini Domingos UNESP – Câmpus de São José do Rio Preto Orientadora Profª. Drª. Tiago Henrique FAMERP – Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto Prof. Dr. Ana Paula Girol UNESP – Câmpus de São José do Rio Preto São José do Rio Preto 28 de agosto de 2023 À minha família, que sempre esteve ao meu lado, sendo meu suporte e acreditando no meu potencial. À minha mãe Leonice, minha base, maior incentivadora e inspiração. Aos meus irmãos, Luan e Leonardo, companheiros em todas as fases da vida. E, ao meu noivo Guilherme, por todo o amor, compreensão e por cada sonho que nos move. Dedico este trabalho a todos que entendem ciência e educação como ferramentas para construção de uma sociedade igualitária. AGRADECIMENTOS O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001, à qual agradeço, a bolsa de estudos foi imprescindível durante toda a minha trajetória de formação. À Fundação de Apoio à Pesquisa e Extensão de São José do Rio Preto (FAPERP) pelo custeio de materiais de insumo essenciais para a execução do trabalho. Ao IBILCE, não só pela estrutura física, mas também pela rede de profissionais que tornam a ciência possível, como a equipe do restaurante universitário, os técnicos-administrativos, e os profissionais de limpeza. Ao programa de pós-graduação em Biociências, que me proporcionou tanto aprendizado, o contato com professores incríveis, e a participação em eventos científicos. Às minhas orientadoras, Profª. Drª Cláudia Bonini e Profª. Drª Flávia Lisoni, que gentilmente me receberam e encararam esse desafio comigo, por todos os ensinamentos e por terem aberto esse caminho da genética humana na minha formação. Aos orientadores que tive durante a graduação, Fabrício do Nascimento e Karina Martins, por estarem comigo nos meus primeiros passos acadêmicos, sempre farão parte do que me constrói como educadora e cientista. À todos os meus amigos. Aos amigos de longa data que mesmo à distância me proporcionam todo suporte e amor, especialmente Natália Woppe, Tainara Holanda, Vitor Talaia, Sheila Nepomuceno e Lucas Waughan, que já partilharam comigo tantas fases nessa vida. Às amigas que fiz durante esse percurso, Dayla Geraldini e Vitória Soares, por cada conversa e momento. Ao grupo de pesquisa, Luana Cardoso, Juliana Gusson, Stefanie Sousa, Julia Ricci e Ingrid Iris, que para além de todas as discussões científicas também serão lindas amizades, fizeram parte de cada nova técnica e análise que aprendi e do meu crescimento profissional com cada comentário e discussão. A cada membro do Laboratório de Hemoglobinas e Genética de Doenças Hematológicas pelas reuniões científicas semanais e por todo suporte. A todos que possibilitaram a realização desse trabalho, como a Associação Para Pesquisa e Desenvolvimento da Cannabis medicinal no Brasil (CANNAB) e o laboratório Grüne Labs Uruguai, que participaram de todos os trâmites para a obtenção do óleo de Cannabis. À Profª. Drª Sonia Oliani, por permitir a execução da pesquisa no laboratório de Imunomorfologia, e pelas reuniões científicas semanais. Ao Prof. Dr. Anderson Ferreira da UFSCar e à Profª. Drª. Nicola Conran da UNICAMP, que gentilmente cederam alíquotas da linhagem celular K562. E à Drª. Carla Peres de Paula que me deu orientações sobre como trabalhar com células em suspensão. À Profª. Drª Cláudia Carareto, por permitir a utilização do NanoDrop para quantificação de ácidos nucleicos, além do uso da sala escura para revelação das membranas de western blotting. RESUMO Inflamação é um mecanismo acionado por complexas vias como resposta protetiva ao organismo, contudo, a inflamação crônica gera uma desregulação no metabolismo. O uso medicinal da Cannabis ganhou notoriedade devido ao conhecimento sobre Sistema Endocanabinoide (ECS), sistema endógeno relacionado à homeostasia. Os canabinoides da planta (fitocanabinoides) interagem com o ECS em receptores associados ao sistema nervoso e imunológico; dois desses fitocanabinoides são o Canabidiol (CBD) e o Tetrahidrocanabinol (THC). Há correlação entre ligantes do ECS e a via da Ciclooxigenase (PTGS2), mediadora de processos inflamatórios. Sendo assim, pode-se explorar essa relação e a potencial ação anti- inflamatória. Neste trabalho, analisamos o óleo de Cannabis full spectrum atuando nas linhagens celulares HUVEC (células endoteliais da veia umbilical humana), e K562 (células eritroeucêmicas humanas). Foi utilizado o óleo na proporção de 2:1 de CBD/THC, calculando concentrações entre 1 e 100 μM a partir dos dados do THC, por 4, 24, 48 e 72 horas nos ensaios de morfologia, proliferação celular e viabilidade. Nos ensaios de apoptose; migração; análise de citocinas; expressão dos genes da via inflamatória (PTGS2, MMP2, MMP9) e dos receptores canabinoides (CNR1 e CNR2); e expressão proteica (PTGS2), foi utilizado [10 μM] por 24 horas. Observou-se que, o tratamento não alterou a morfologia da HUVEC no tempo de 24 horas, mas para K562 houve uma redução da proliferação à [10μM]. Para o ensaio de migração, as células K562 tratadas apresentaram aumento na migração. Enquanto para análise de citocinas, foi reduzida IL-8 para K562 e IL-1β para a linhagem HUVEC. Não houve alteração significativa na análise da apoptose e na expressão dos genes PTGS2, MMP2 e MMP9, mas os genes CNR1 e CNR2 encontram-se negativamente expressos para K562 tratada. Quanto à expressão proteica, foi demonstrado aumento de PTGS2 para as duas linhagens. Nosso trabalho evidenciou os benefícios da utilização do óleo de Cannabis sativa full spectrum em baixas concentrações ao demonstrar que, esse não alterou a morfologia, proliferação e viabilidade da célula normal, mas teve ação na K562. Sabe-se que o uso de compostos isolados ou sintéticos da Cannabis induz à apoptose, e o resultado de não indução traz indícios da ação sinérgica de óleos full spectrum, bem como a redução encontrada na expressão de CNR1 e CNR2, super expressos em condições de doença. Portanto, há perspectiva futura para aplicação do óleo de Cannabis sativa full spectrum em doenças inflamatórias. Contudo, mais estudos são necessários, para entender os efeitos cumulativos, residuais e de tempo de exposição. Palavras–chave: Inflamação. PTGS2. Cannabis medicinal. ABSTRACT Inflammation is a mechanism triggered by complex pathways as a protective response to the body; however, chronic inflammation generates a dysregulation in metabolism. The medicinal use of cannabis has gained notoriety due to knowledge about the Endocannabinoid System (ECS), an endogenous system related to homeostasis. The plant's cannabinoids (phytocannabinoids) interact with the ECS at receptors associated with the nervous and immune systems; two of these phytocannabinoids are Cannabidiol (CBD) and Tetrahydrocannabinol (THC). There is a correlation between ECS ligands and the Cyclooxygenase (PTGS2) pathway, which mediates inflammatory processes. Therefore, this relationship and potential anti- inflammatory action could be explored. In this study, we analyzed the effects of full spectrum Cannabis oil on HUVEC (human umbilical vein endothelial cells) and K562 (human erythroid leukemia cells) cell lines. The oil was used in a ratio of 2:1 CBD/THC, calculating concentrations between 1 and 100 μM from the THC data, for 4, 24, 48 and 72 hours in the morphology, cell proliferation and viability assays. In the apoptosis; migration; cytokine analysis; expression of inflammatory pathway genes (PTGS2, MMP2, MMP9) and cannabinoid receptors (CNR1 and CNR2); and protein expression (PTGS2) assays, [10 μM] was used for 24 hours. It was observed that the treatment did not alter HUVEC morphology at 24 hours, but for K562 there was a reduction in proliferation at [10μM].For the migration assay, treated K562 cells showed increased migration. While for cytokine analysis, IL-8 was reduced for K562 and IL-1β for the HUVEC strain. There was no significant change in the analysis of apoptosis and in the expression of the PTGS2, MMP2 and MMP9 genes, but the CNR1 and CNR2 genes were downregulated for treated K562. As for protein expression, an increase in PTGS2 was demonstrated for both strains. Our work showed the benefits of using Cannabis sativa full spectrum oil in low concentrations by demonstrating that it did not alter the morphology, proliferation and viability of the normal cell, but did act on K562. The use of isolated or synthetic Cannabis compounds is known to induce apoptosis, and the result of non-induction is indicative of the synergistic action of full spectrum oils, as well as the reduction found in the expression of CNR1 and CNR2, which are upregulated in disease conditions. Therefore, there are future prospects for the application of full spectrum Cannabis sativa oil in inflammatory diseases. However, more studies are needed to understand the cumulative, residual and exposure time effects. Keywords: Inflammation. PTGS2. Medicinal Cannabis. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1- Esquema da ação dos receptores canabinoides 17 Figura 2- Representação da estrutura química do Canabidiol e Tetrahidrocanabinol 18 Figura 3- Fitocanabinoides e PTGS2 19 Figura 4- Fotomicrografia de morfologia celular de HUVEC e K562 29 Figura 5- Gráfico de proliferação celular das linhagens HUVEC e K562 30 Figura 6- Gráfico do ensaio de viabilidade celular das linhagens HUVEC e K562 32 Figura 7- Gráficos da análise de morte celular apoptótica 34 Figura 8- Ensaios de Migração celular Transwell HUVEC e K562. 36 Figura 9- Gráficos do ensaio colorimétrico ELISA das células HUVEC e K562. 38 Figura 10- Gráficos de expressão gênica e proteica em HUVEC e K562 39 LISTA DE TABELAS Tabela 1- Primers utilizados na qPCR 26 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 2-AG 2-Araquidonilglicerol AEA Anandamida ANOVA Análise de variância a dois critérios ATCC American Tissue Cell Culture Ca+ Cálcio CBG cannabigerol CBVN Cannabidivarin cAMP Adenosina monofosfato cíclica (do inglês, Cyclicadenosine monophosphate) CBD Canabidiol CB1 Receptor Canabinoide 1 CB2 Receptor Canabinoide 2 CDC Center for Disease Control and Prevention cDNA DNA complementar CNR1 Gene do Receptor Canabinoide 1 CNR2 Gene do Receptor Canabinoide 2 DAMP’S Padrões moleculares associados ao dano (do inglês, Damage associated molecular pattern) DMSO Dimetilsulfóxido DNA Ácido desoxirribonucleico ECL Kit quimioluminescente ECS Sistema endocanabinoide (do inglês, Endocannabinoid system) ELISA Ensaio de imunoabsorção enzimática (do inglês, Enzyme Linked Immunosorbent Assay) FAAH Amida hidrolase de ácido graxo (do inglês, Fatty acid amide hydrolase) GAPDH Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase GPCR Receptores acoplados à proteína G (do inglês, G protein coupled receptor) HRP Peroxidase Horseradish HUVEC Células endoteliais da veia umbilical humana (do inglês, Human umbilical vein endothelial cells) IgG Imunoglobulina G IL-1β Interleucina 1β IL-6 Interleucina 6 IL-8 Interleucina 8 LCM Leucemia mieloide Crônica K562 Células eritroleucêmicas humanas MAGL Monoacilglicerol lipase MAPK Proteínas quinase dependentes de mitógeno (do inglês, mitogen-actived protein kinase) MCP-1 Proteína quimioatraente de monócitos 1 (do inglês, Monocyte Chemoattractant Protein-1) MMP Metaloproteinases de matriz MMP9 Metaloproteinase de matriz 9 MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) -5-(3-carboximetoxifenil) -2-(4-sulfofenil) -2H- tetrazólio) MTT 1-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -3,5-diphenylformazan PAMP’S Padrões moleculares associados a patógenos (do inglês, Phatogen associated molecular pattern) PBS Tampão salino-fosfato (do inglês, Phosphate buffer saline) PCR Reação em cadeia da polimerase (do inglês, Polymerase Chain Reaction) PG Prostaglandinas PGE2 Prostaglandina E2 PKA Proteína quinase A (do inglês, Protein kinasse A activity) POS Preparação para o estresse oxidativo (do inglês, Preparation for oxidative stress) PTGS2 Ciclooxigenase-2 (do inglês, Prostaglandin-endoperoxide synthase) PTGER Receptor de prostaglandina E (do inglês, Prostaglandin E Receptor) RCF Força centrífuga relativa (do inglês, Relative centrifugal force) ROS Espécies reativas de oxigénio (do inglês, Reactive oxygen species) RT-qPCR PCR quantitativo em tempo real (do inglês, Real Time Quantitative PCR) RIPA Radioimunoprecipitação SDS Dodecil sulfato de sódio SFB Soro fetal bovino TBS Solução Salina Tamponada com Tris TBS-T TBS-T com tween TCM Triglicerídeo de cadeia média THC Tetrahidrocanabinol TNF-α Fator de necrose tumoral α (do inglês, Tumor necrosis factor α) LISTA DE SÍMBOLOS µM Micromolar µL Microlitro µm Micrômetro µg Micrograma M Molar SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 13 1.1 Inflamação 13 1.2 Inflamação crônica e tratamentos 14 1.3 Cannabis e Sistema Endocanabinoide 15 1.4 PTGS2 e Sistema endocanabinoide 18 2 OBJETIVOS 21 2.1 Objetivo geral 21 2.2 Objetivos específicos 21 3 MATERIAIS E MÉTODOS 22 3.1 Materiais 22 3.1.1 Linhagens celulares 22 3.1.2 Óleo de Cannabis 22 3.2 Métodos 23 3.2.1 Cultivo e análise da morfologia celular 23 3.2.2 Ensaio de proliferação 23 3.2.3 Viabilidade celular 24 3.2.4 Análise de Apoptose 24 3.2.5 Ensaio de migração 24 3.2.6 Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) 25 3.2.7 Análise da expressão gênica 25 3.2.7.1 Extração de RNAs 25 3.2.7.2 Genes escolhidos 25 3.2.7.3 PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR) 26 3.2.8 Análise da expressão proteica 26 3.2.8.1 Extração e quantificação de proteínas 26 3.2.8.2 Western Blotting 27 4 RESULTADOS E DISCUSSÕES 28 4.1 Morfologia, proliferação, e viabilidade celular 28 4.2 Ensaio de Apoptose 34 4.3 Ensaio de migração 35 4.4 Ensaio colorimétrico ELISA 37 4.5 Expressão de genes e proteínas 38 5 CONCLUSÕES 43 REFERÊNCIAS 44 13 1 INTRODUÇÃO 1.1 Inflamação A inflamação é um mecanismo de proteção aos danos causados no organismo, onde há o acionamento de complexas vias de sinalização. De forma geral, é desencadeada devido a lesões das células/tecidos ou quando há invasão por microrganismos, resultando no envio de células e moléculas de defesa para os locais onde é necessária a reação. Compõem o processo inflamatório as células do sistema imune, os mediadores inflamatórios e a interação desses com os vasos sanguíneos. Além disso, existe o papel de balanço da resposta inflamatória realizado pela classe de moléculas denominadas de lipídeos bioativos, entre eles os eicosanoides e os endocanabinoides (ABBAS, 2019; LEUTI et al., 2020). São células do sistema imunológico os fagócitos, os mastócitos, os basófilos, os eosinófilos, os linfócitos, as células natural killer e as células linfoides inatas, secretoras de citocinas. Entre os mediadores estão as prostaglandinas, citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas. O papel do sistema circulatório é dado pela dilatação das vênulas e arteríolas, com a necessidade do aumento do fluxo e permeabilidade dos vasos sanguíneos (ABBAS, 2019). Contudo, os quadros inflamatórios podem ser classificados entre agudos ou crônicos. A inflamação aguda é uma resposta em curto prazo, seu acionamento ocorre via resposta imune inata. Esse tipo de reação ocorre quando há o reconhecimento de padrões moleculares associados a patógenos (Pathogen Associated Molecular Patterns, PAMPs) ou de padrões moleculares associados a danos (Damage-associated molecular pattern, DAMPs). Essa cascata envolve a liberação de citocinas pró-inflamatórias como a interleucina 1β (IL-1β), o fator de necrose tumoral α (Tumor necrosis factor, TNF-α) e eicosanoides pró-inflamatórios derivados do ácido araquidônico, essas moléculas amplificam o sinal inflamatório e recrutam células do sistema imune. Para finalização dessa resposta as células endoteliais e imunes param a produção de eicosanoides e passam a produzir mediadores lipídicos pró-resolução (LEVY et al., 2001; MEDZHITOV et al., 2008; DENNIS, NORRIS, 2015; LEUTI et al., 2020). Entretanto, quando a inflamação progride de forma exacerbada ou há a permanência do estímulo inflamatório, ocorre o desequilíbrio dos sinais anti e pró-inflamatórios levando ao cenário precedente da inflamação crônica, sendo este um estado geralmente associado e/ou precursor de doenças. Esse processo pode ser caracterizado pela produção ininterrupta de citocinas e eicosanoides pró-inflamatórios, pela insuficiência da biossíntese de lipídeos pró- resolução ou ainda pela produção desbalanceada de esfingolipídios e endocanabinoides 14 (CHIURCHIÙ, LEUTI, MACCARRONE, 2018; LEUTI et al., 2020). Desse modo, ocorre o contínuo recrutamento de células imunes como, por exemplo, os macrófagos pró-inflamatórios, células T efetoras, linfócitos B, ou ainda a inativação de células T regulatórias (LEUTI et al., 2020). Nesse caso a resposta desregulada e prolongada ocasiona o dano tecidual. Alguns exemplos de doenças e condições associadas a inflamação crônica são: Alergias, aterosclerose, câncer, artrite, doenças autoimunes (WEISS, 2008), diabetes, doenças cardiovasculares, distúrbios oculares, obesidade, doença inflamatória intestinal (ARULSELVAN et al., 2015) e doença falciforme (KATO, 2018; SUNDD, GLADWIN, NOVELLI, 2019). Porém, doenças como a anemia falciforme apresentam uma forma específica de inflamação crônica, denominada de inflamação estéril. Esse tipo de inflamação ocorre no lúmen dos vasos sanguíneos em razão da alteração da reologia dos eritrócitos, é caracterizada pela agregação de neutrófilos, plaquetas e hemácias ao endotélio dos vasos; causando danos por reperfusão e o quadro de dor pela crise vaso-oclusiva (BUNN, 1997; RESS, WILLIAMS, GLADIN, 2010; NOVELLI, GLADWIN, 2016; SUNDD, GLADWIN, NOVELLI, 2019). Os mediadores inflamatórios estão intimamente relacionados à indução da nocicepção, ou seja, sinalizam o estímulo nocivo aos neurônios sensoriais ocasionando dor. O estímulo à dor quando crônico é prejudicial, sendo este mais um dos componentes agravantes do estado inflamatório crônico (MATSUDA; HUH; JI, 2019). Portanto, é recorrente a busca por medicações que atenuem as manifestações de inflamação crônica, com a necessidade de maior qualidade de vida para pacientes com doenças associadas, considerando um menor efeito colateral possível e maior efetividade de ação. 1.2 Inflamação crônica e tratamentos Como exemplo da busca por novas medicações em doenças associadas ao estado inflamatório crônico, destaca-se a anemia falciforme. Esses pacientes podem sofrer crises agudas de dor como consequência da inflamação, e até o momento, as melhores medicações disponíveis para o controle dessas crises são a base de opioides, sendo esses pacientes erroneamente associados com a epidemia do uso de opioides (BALLAS, 2020). Conforme Brousseau e colaboradores (2010), a população afro-americana é a mais afetada pela anemia falciforme, e segundo Crowley-Matoka (2013), é a faixa mais estigmatizada diante da epidemia de opioides. Sinha et al. (2019) trazem a problemática da epidemia em decorrência do uso abusivo de medicamentos opioides nos Estados Unidos e quais as implicações para pacientes que necessitam dessas medicações. Os autores observaram que, para os entrevistados, o impacto 15 das novas diretrizes estabelecidas pelo Center for Disease Control and Prevention (CDC) dos Estados Unidos, diante da epidemia de uso de opioides no país, tem seus pontos de impacto negativos. São mencionadas, a dificuldade na aquisição dos medicamentos, a estigmatização dos pacientes em atendimentos públicos e o crescente interesse na busca por terapias alternativas. Discute-se quanto ao uso de compostos oriundos da Cannabis sativa como uma das possibilidades. Zhang & Ho (2015), apontam que, apesar da necessidade de mais estudos, são obtidas cada vez mais evidências sobre os benefícios do uso clínico da Cannabis, e mencionam a viabilidade de compostos da planta aplicados ao tratamento de alguns tipos de transtornos de desenvolvimento e comportamento (HADLAND; KNIGHT; HARRIS, 2015), e certas condições neurológicas (BENBADIS, 2014). A medicina tradicional tem sido uma fonte para busca de novos fármacos investigando as propriedades físico-químicas, farmacocinéticas e farmacodinâmicas dos produtos naturais (CHOPRA; DHINGRA, 2021). Os medicamentos fitoterápicos tradicionais foram utilizados em diferentes culturas, sendo a Cannabis sativa um dos mais antigos; esses não necessariamente substituem o tratamento convencional, mas possibilitam o alívio dos sintomas com redução dos efeitos colaterais, e melhora na qualidade de vida dos pacientes (RUSSO, 2011; ZHANG et al., 2021) O uso terapêutico da Cannabis é proposto nesse sentido. 1.3 Cannabis e Sistema Endocanabinoide Apesar de haver registros milenares sobre seu uso em diversas culturas, em países como Índia e China (MECHOULAM, 1986; RUSSO, 2008), o potencial medicinal da Cannabis está em maior evidência nas últimas décadas, principalmente pelo destaque obtido a partir da descoberta do Sistema Endocanabinoide (Endocannabinoid system, ECS). O ECS é um sistema endógeno, que forma uma rede intracelular de sinalização, sua ação está relacionada a homeostasia do organismo e processos fisiológicos como a dor e inflamação. Possui três componentes principais: (a) Os receptores canabinoides; (b) os canabinoides endógenos, com seus dois exemplos mais bem descritos sendo a anandamida (N-arachidonoylethanolamine, AEA) e a 2-araquidonilglicerol (2-AG), pequenos lipídeos derivados do ácido araquidônico; (c) e o aparato enzimático de degradação e síntese, com destaque para a amida hidrolase de ácido graxo (Fatty acid amide hydrolase, FAAH) e monoacilglicerol lipase (MAGL) (MARZO, BIFULCO, PETROCELLIS, 2004; AGGARWAL, 2009; BRUSTON, WOODHAMS, 2014; JARVIS, RASSMUSSEN, WINTERS, 2017). Quanto aos receptores, os dois subtipos mais estudados são os canabinoides do tipo 1 (CB1) e canabinoides do tipo 2 (CB2), dos quais são distintos tanto pelas sequências de 16 aminoácidos como pela ação e proporção na qual estão distribuídos nos diferentes tecidos. Os receptores CB1 encontram-se no cérebro, sistema cardiovascular, pulmões, músculos, trato gastrointestinal, sistema reprodutivo, fígado, medula óssea e pâncreas; enquanto os receptores CB2 prevalecem no sistema imune, ossos, baço, pele, fígado, medula óssea e pâncreas (PERTWEE, 1997; KHANOLKAR, PALMER, MAKRIYANNIS, 2000; HOWLETT, ABOOD, 2017, REZENDE, 2023). Ambos fazem parte da família de receptores acoplados ao complexo de proteínas G (G protein-coupled receptors, GPCR), geralmente encontrados na membrana plasmática. Esses receptores inibem a adenilato ciclase, diminuindo a disponibilidade de monofosfato cíclico de adenosina (Cyclic adenosine monophosphate, cAMP) e de proteína quinase A (Protein kinase A activity, PKA), e, consequentemente, atuam na resposta celular (MCCARBERG; BARKIN, 2007; PERTWEE et al. 2010). Além disso, outros efeitos são o acúmulo de calcio (Ca+) intracelular (KANO et al., 2009) e o estímulo a via de sinalização por proteínas quinase dependentes de mitógeno (mitogen-activated protein kinase, MAPK), sendo este último, um mecanismo associado majoritariamente aos receptores CB1 (TURU; HUNYADY, 2010; ZOU; KUMAR, 2018). O receptor CB1 foi clonado em 1990, inicialmente encontrado em ratos e somente depois foi descrito em tecidos humanos (MATSUDA et al., 1990; GÉRARD et al., 1990; GÉRARD et al., 1991); é ativado pelo gene CNR1, sendo expressos principalmente nos neurônios, e em menor proporção nos astrócitos, oligodendrócitos e micróglia (HERKENHAM et al., 1991; TAO et al., 2020). Quanto ao receptor CB2, foi primeiramente clonado em 1993, em linhagem celular de leucemia promielocítica (HL-60) (MUNRO; THOMAS; ABU-SHAAR, 1993); é expresso pelo gene CNR2, e sua sequência de aminoácidos possui cerca de 44% de homologia à sequência de CB1 (ZHANG et al., 2015a); modulam analgesia e nocicepção, e ocorrem principalmente em células do sistema imune, como neutrófilos, eosinófilos, natural killer, linfócitos, mas podem ser encontrados em neurônios, microglia, macrófagos e em células endoteliais vasculares (RAJESH et al., 2007; RAJESH, et al. 2008; CHIURCHIÙ, BATTISTINI, MACCARRONE, 2015; ZOU; KUMAR, 2018; LI et al., 2020). O mecanismo de ação dos receptores é evidenciado na Figura 1: 17 Figura 1- Esquema da ação dos receptores canabinoides. Subtítulo: Os receptores endógenos ou endocanabinoides (AEA e 2-AG), interagem com seus receptores (respectivamente, CB1 e CB2), acionando GPCR, o que acarreta no desprendimento das subunidades α de β/ γ, desencadeando na inibição de cAMP, reduzindo a resposta celular pela redução de PKA. Esse mecanismo nos receptores CB1 associados ao sistema nervoso interrompe a liberação de neurotransmissores. O desprendimento da subunidade β/ γ altera o balanço de canais iônicos, levando ao acúmulo de Ca+ nas células. Além disso, essa cascata aciona a via MAPK, envolvida no controle de ciclo e morte celular. Fonte: ELABORADA PELA AUTORA, 2023. Trabalhos sugerem a ação de moléculas do ECS em outros receptores além de CB1 e CB2, como em receptores vaniloides (TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4, TRPA1 e TRPM8) e em receptores metabotrópicos (GPR55, GPR3, GPR6, GPR12 e GPR19) (PETROCELLIS, 2011; MULLER, MORALES, REGGIO, 2019; YE, 2019; REZENDE, 2023). Recentemente foi proposto o termo endocanabinoidoma para abranger todo o conjunto de enzimas, proteínas e lipídios que estejam envolvidos na modulação do ECS (LEUTI et al., 2020) A Cannabis contém moléculas denominadas fitocanabinoides, essas possuem afinidade aos receptores do ECS. Dois desses fitocanabinoides mais amplamente descritos e estudados são o canabidiol (CBD) e o tetrahidrocanabinol (THC), sendo que o segundo possui propriedades psicoativas. O THC teve sua estrutura descoberta em 1964, sendo essencial na descoberta do ECS em razão da proposição de um receptor para essa molécula (MCCARBERG, 18 BARKIN, 2007; CRISTINO, BECKER, MARZO, 2014; REZENDE, 2023). Suas estruturas são representadas a seguir: Figura 2- Representação da estrutura química do Canabidiol e Tetrahidrocanabinol. Fonte: NCBI, 2023a; NCBI, 2023b. O potencial analgésico e anti-inflamatório da Cannabis é relatado, sendo essa a principal via de interesse deste trabalho. São descritos, na literatura, o papel da sinalização do receptor canabinoide como regulador da expressão gênica de células imunes (KLEIN et al., 2003), e sua influência sobre adesão de leucócitos, ativação de mastócitos e no estresse oxidativo (ELIKKOTTIL, GUPTA, GUPTA, 2009; VINCENT et al., 2016). E, apesar de necessária maior investigação, tem-se descoberto a relação entre ligantes do ECS com a via da ciclooxigenase-2 (Prostaglandin-endoperoxide synthase, PTGS2), sendo esta responsável por acionar uma cascata mediadora de processos inflamatórios (KOZAK et al., 2002; FOWLER, 2007). As evidências da relação podem ser um dos pontos de partida para explorar a ação da Cannabis na inflamação. 1.4 PTGS2 e Sistema endocanabinoide Como descrito anteriormente, os endocanabinoides atuam na regulação da resposta inflamatória. Sendo assim, este trabalho explorou sua relação com a via da PTGS2, anteriormente conhecida pela sigla COX-2. A PTGS2 é uma enzima oxidante da cascata do ácido araquidônico, sendo responsável por catalisar a produção de prostaglandinas (PG) culminando na liberação de citocinas (ZMIGRODZKA et al., 2018; SCHAEUBLE et al., 2019), sua ação ocorre pela interação de PG, principalmente prostaglandina E2 (PGE2), a 19 GPCRs específicos (Prostaglandin E Receptor, PTGER) (CALLAGHAN; HOUSTON, 2015). A PTGS2 reconhece endocanabinoides que contém ácidos graxos poli-insaturados (LEUTI et al., 2020). Em tratamentos com óleo de Cannabis do tipo full spectrum compostos como CBD, THC, e terpenos como β-mirceno, α-Pineno, β-cariofileno também atuam reduzindo PTGS2 (MAAYAH et al., 2020). A interação entre PTGS2 e fitocanabinoides é demonstrada na Figura 3: Figura 3- Fitocanabinoides e PTGS2. Subtítulo: A via da PTGS2 faz parte da cascata do ácido araquidônico, onde fosfolipídios de membrana são clivados pela enzima Fosfolipase A, gerando ácido araquidônico que é posteriormente convertido pela enzima PTGS2 em prostaglandina H2, essa pode formar diferentes isomerases, sendo PGE2 a mais abundante. PGE2 atua ligando-se a GPCRs específicos, e sua ação irá depender do receptor ao qual se ligou, podendo tanto diminuir como aumentar adenilato ciclase, bloqueando ou ativando PKA. Já os fitocanabinoides, interagem com seus GPRCs específicos, e afetam a PTGS2 pela inibição de PGE1/E2 e produção de endocanabinoides (AEA e 2-AG). Fonte: ELABORADA PELA AUTORA, 2023. Na cascata iniciada pela PTGS2, entre os receptores específicos das prostaglandinas encontra-se PTGER4 (NARUMIYA; FITZGERALD, 2001), regulador da expressão de metaloproteinases da matriz (MMPs). As MMPs são uma família de enzimas, geralmente utilizadas como marcadores inflamatórios, em sua forma extracelular estão ligadas ao desencadeamento e regulação da inflamação ao ter ação proteolítica sobre citocinas e 20 quimiocinas inflamatórias (MANICONE; MCGUIRE, 2008). São reguladoras metabólicas e possuem capacidade de clivar lipoproteínas e receptores de lipoproteínas, as MMP-2 podem modular vias inflamatórias intracelulares e o metabolismo de lipídeos (FERNANDEZ- PATRON; KASSIRI; LEUNG, 2016). Enquanto as MMP-9 intracelulares podem atuar na imunidade inata e na inflamação mediada por receptor do tipo Toll 4 (ZHANG et al., 2015b). Entre os exemplos de sua atuação, as MMP-2 e 9, demonstram potencial tanto em promover como reprimir a interleucina IL-1β (ITO et al., 1996); e MMP-9 processa o domínio N-terminal IL-8, produzindo uma molécula capaz de ser quimioatraente (STEEN et al., 2000; STEEN et al., 2003). Além disso, MMP2 é descrita como moduladora de TNF-α. A TNF-α é uma citocina envolvida com ativação e expressão de MMPs, exercendo um papel de retroalimentação que mantém quadros inflamatórios (VU; WERB, 2000; MCQUIBBAN et al., 2002). TNF-α foi utilizada em estudos in vivo como estímulo inflamatório em camundongos (HIDALGO et al., 2009) e para análises da fisiopatologia da dor vaso-oclusiva decorrente do quadro inflamatório crônico da anemia falciforme (LI et al., 2014). Como exemplo do papel das citocinas no agravamento de doenças inflamatórias crônicas, o estudo de Domingos et al. (2020) demonstra os altos níveis de IL-6 e IL-8 em pacientes de anemia falciforme durante crise característica da doença; e a associação ao risco aumentado de desdobramentos como síndrome torácica aguda, osteonecrose e úlceras nas pernas; os autores argumentam sobre a semelhança com feridas crônicas causadas por diabetes e o papel das interleucinas, em que a resposta inflamatória persistente impede uma recuperação adequada. O trabalho de Sesti-Costa et al. (2021), encontrou níveis significativos das citocinas IL-6, IL-8 e MCP-1 em pacientes de anemia falciforme, e destaca que isso pode indicar a atuação dessas citocinas no recrutamento de monócitos e neutrófilos no processo inflamatório. Portanto, é destacada a correlação entre os mediadores relacionados à cascata inflamatória e os mecanismos de atuação do ECS. Este trabalho se propõe a fazer essa análise verificando como o óleo da Cannabis atua sobre a expressão de genes e proteínas que fazem parte da cascata de inflamação, em linhagens celulares. 43 5 CONCLUSÕES Os resultados de morfologia, proliferação e viabilidade celular evidenciaram que, o óleo em baixas concentrações e no tempo de 24 horas não surtiu efeitos sobre a linhagem normal, mas alterou morfologia e proliferação celular de K562. Não houve redução significativa da proliferação celular a 10 µM por 24 horas em ambas as linhagens. A linhagem K562 teve a migração celular aumentada nas células tratadas a 10 µM por 24 horas. Para a secreção de citocinas, foi encontrada a diminuição de IL-8 para K562 e HUVEC, redução de IL-1β para a linhagem HUVEC. A expressão gênica de PTGS2, MMP2 e MMP9 não foi significativa nas células HUVEC e K562, enquanto para os receptores canabinoides (CNR1 e CNR2) houve diminuição da expressão nas células K562 tratadas com o óleo. A expressão proteica de PTGS2 foi aumentada significativamente nas células K562 tratadas com óleo de Cannabis. Sendo assim, foi possível evidenciar a correlação entre a via PTGS2 e o tratamento com óleo de Cannabis nos modelos utilizados pela alteração nas citocinas moduladoras da via PTGS2. Contudo, há a necessidade de análises complementares para entender quais vias bioquímicas podem ter sido alteradas pela redução da expressão de CB1 e CB2. 44 REFERÊNCIAS ABBAS, A. K. Imunologia Celular e Molecular. Grupo GEN, 2019. 9788595150355. ABIDI, A. H. et al. Phytocannabinoids regulate inflammation in IL ‐1β‐stimulated human gingival fibroblasts. 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